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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Seleção das proteínas de camada S de Lactobacillus e
produção de antisoros policlonais contra as mesmas.
ORIENTADO: Brenda de Toledo Bueno
ORIENTADOR: Prof. Dr. Álvaro Cantini Nunes
BELO HORIZONTE
Abril - 2010
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BRENDA DE TOLEDO BUENO
Seleção das proteínas de camada S de Lactobacillus e
produção de antisoros policlonais contra as mesmas.
.
ORIENTADOR: ÁLVARO CANTINI NUNES
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Biologia Geral
Belo Horizonte, MG
2010
Dissertação apresentada ao Departamento de
Biologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito para obtenção do grau
de mestre em Genética.
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iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço muito ao meu orientador, Álvaro Cantini Nunes, pela confiança, paciência,
pelos ensinamentos e pelo grande apoio que me foi dado.
Agradeço também aos professores que tanto colaboraram para o andamento do
trabalho, Jacques Robert Nicoli, Maria de Fátima Martins Horta e Santuza Maria Ribeiro
Teixeira, e também aos seus alunos que estavam sempre dispostos a ajudar.
A todos do Laboratório de Genética Molecular de Protozoários Parasitas, que além
de ajudar, foram amigos e torceram sempre para tudo dar certo.
Ao aluno de Iniciação Científica Pedro Henrique, que acompanhou todo o desenrolar
dos experimentos, estando sempre de prontidão para ajudar.
Aos funcionários da Secretaria de Pós Graduação do Departamento de Biologia
Geral – Genética, da limpeza, do biotério.
Ao coordenador do curso e a todos os professores que ajudaram na minha formação.
À minha família e aos meus amigos pessoais que sempre deram muita força.
Ao meu noivo Murilo, parceiro, incentivador, amigo e amor para toda a vida.
À minha mãe, querida, que nunca mediu esforços para me ajudar a chegar até aqui.
Muito obrigada a todos!
iv
SUMÁRIO
Agradecimentos ................................................................................................................... iii
Lista de Figuras ..................................................................................................................... v
Lista de Tabelas ................................................................................................................... vi
Abreviaturas e Símbolos .................................................................................................... vii
Resumo .................................................................................................................................. 8
Abstract ................................................................................................................................. 9
Introdução ........................................................................................................................... 10
1. Lactobacillus ............................................................................................................. 10
2. A camada S da parede celular de bactérias ............................................................. 12
Objetivos .............................................................................................................................. 18
1. Objetivo geral ............................................................................................................ 18
2. Objetivos específicos ................................................................................................ 18
Material e Métodos .............................................................................................................. 19
1. Linhagens bacterianas e condições de cultivo .......................................................... 19
2. Obtenção de extrato de proteínas totais ................................................................... 20
3. Obtenção de extrato de proteínas de camada S semi-purificadas ........................... 20
4. Concentração das proteínas por ultrafiltração .......................................................... 20
5. Quantificação das proteínas ..................................................................................... 21
6. Análise por SDS-PAGE ............................................................................................. 21
7. Análise por “Western blotting” ................................................................................... 21
8. Análise por “Dot blot” ................................................................................................ 22
9. Imunização dos animais ............................................................................................ 22
Resultados ........................................................................................................................... 23
1. Obtenção das proteínas totais e de camada S semi-purificadas .............................. 23
2. Quantificação da proteína por Bradford .................................................................... 27
3. Imunização dos camundongos com proteínas de camada S de lactobacilos .......... 27
4. Reação cruzada dos anticorpos contra proteína de camada S ................................ 28
Discussão ............................................................................................................................ 39
Conclusões e Perpectivas ................................................................................................. 40
Referências Bibliográficas ................................................................................................. 41
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árvore filogenética dos grupos de bactérias da família Lactobacillaceae ............ 11
Figura 2. Representação esquemática da parede celular de uma Archaea ........................ 16
Figura 3. Representação esquemática da parede celular de bactéria Gram-positiva ......... 17
Figura 4. Representação esquemática do segmento cromossômico slp de 6kb de L.
acidophilus ATCC 4356 ........................................................................................................ 18
Figura 5. Microscopia Eletrônica de L. crispatus DSM 20584 ............................................. 18
Figura 6A. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos
isolados da moela de frangos de 14 dias (L. reuteri 1M14C, L. johnsonii 1M14E, L. reuteri
2M14C, L. reuteri 3M14C, L. johnsonii 3M14L, L. reuteri 4M14C, L. reuteri 4M14L) ........... 24
Figura 6B. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos da
moela e intestino delgado de frangos (L. acidophilus 4M14E, L. reuteri 5M14C, L. vaginalis
5M14E, L. salivarius 1D14C, L. acidophilus 2D14E, L. reuteri 3D14C, L. crispatus 3D14L) .25
Figura 6C. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos de
intestino de frangos (L. reuteri 4D14C, L. reuteri 4D14L, L. acidophilus 5D14E, Lactobacillus
1G14E, L. acidophilus 2G14E, L. reuteri 3G14C, L. reuteri 3G14L, L. vaginalis 4G14C) .... 25
Figura 7A. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos da moela .......................................... 26
Figura 7B. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos da moela e intestino delgado ........... 27
Figura 7C. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos dos intestinos delgado e grosso ...... 27
Figura 7D. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos do intestino grosso e cecos ............. 28
Figura 8. Teste dos antisoros anti proteína S semi-purificada de extratos de LiCl da parede
dos isolados L. acidophilus 2G14E, L. acidophilus 5C14E e L. crispatus 3D14L. Legenda:
2G14Ea – proteína injetada nos camundongos, 2G14Eb – extrato protéico semi-purificado;
5C14Ea – proteína injetada nos camundongos, 5C14Eb – extrato protéico semi-purificado;
3D14La – proteína injetada nos camundongos, 3D14Lb – extrato protéico semi-purificado 29
Figura 9A. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com antisoro
contra proteína de camada S de Lactobacillus acidophilus 2G14E ..................................... 30
Figura 9B. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com
anticorpo contra proteína de camada S de Lactobacillus crispatus 3D14L .......................... 31
Figura 9C. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com
anticorpo contra proteína de camada S de Lactobacillus acidophilus 5C14E ...................... 32
vi
Figura 10A-B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E ....................................................... 34
Figura 10C-D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E ....................................................... 35
Figura 11A-B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. crispatus 3D14L ........................................................... 36
Figura 11C-D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. crispatus 3D14L ........................................................... 37
Figura 12A-B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. crispatus 5C14E ........................................................... 38
Figura 12C-D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo
contra proteína de camada S de L. crispatus 5C14E ........................................................... 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Isolados de Lactobacillus spp. de diferentes porções do trato gastrointestinal de
frangos caipiras de 14 dias de vida (M - moela, D - intestino delgado, G - intestino grosso e
C - cecos), tipados por PCR-RFLP dos espaçadores 16S-23S rRNA ................................. 20
Tabela 1. continuação .......................................................................................................... 21
vii
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
8
RESUMO
Os Lactobacillus possuem na parede celular arranjos cristalinos compostos de
subunidades protéicas ou glicoprotéicas, chamados camada S, compostas de proteína S,
com massa molecular variando de 25 a 71 kDa com função de adesão a diferentes
superfícies. Estudos indicam que as proteínas de camada S possuem grande potencial para
atuar como adjuvantes em vacinas. Em estudos anteriores, a injeção em camundongos
Balb/c de proteínas de camada S e também sua administração por via oral/nasal provocou
uma resposta de hipersensibilidade retardada comparáveis às respostas do hidróxido de
alumínio, mostrando que o conjunto natural de proteínas de camada S possui propriedades
adjuvantes intrínsecas. Sabendo disso e com o objetivo de identificar as proteínas da
superfície celular de novas linhagens de Lactobacillus spp. (camada S) isoladas de frangos
caipiras e suas reatividades imunes cruzadas, os antisoros produzidos em camundongos
contra três proteínas da camada S dos isolados 2G14E e 5C14E de L. acidophilus, e do
isolado 3D14L de L. crispatus, foram caracterizados por dot blot e western blot. Os
resultados obtidos nesse trabalho mostram que os anticorpos contra proteínas de camada S
de linhagens bacterianas específicas são capazes de reconhecer as mesmas proteínas de
diversas outras linhagens, tornando mais fácil a escolha de uma delas como adjuvantes
eficazes para vacinas. Os resultados indicam que o anticorpo de L. acidophilus 5C14E
possui uma especificidade menor quando comparado aos outros dois e que o de maior
especificidade foi o de L. acidophilus 2G14E. Esses resultados permitem futuros estudos
para utilização dessas proteínas como adjuvantes vacinais.
9
ABSTRACT
Lactobacillus have cell walls composed of subunits arranged crystalline protein or
glycoprotein, called S layer, composed of S protein with molecular mass ranging from 25 to
71 kDa with the function of adhesion to different surfaces. Studies indicate that the S-layer
proteins have great potential to act as adjuvant in vaccines. In a study conducted by others,
injection in Balb/c S-layer proteins as well as its administration via oral/ nasal caused a
delayed-type hypersensitivity response comparable to aluminum hydroxide, showing that the
set of natural S-layer proteins have intrinsic adjuvant properties. Knowing this and in order to
identify cell surface proteins of new strains of Lactobacillus spp. (S-layer) isolated from
chickens and their immune cross-reactivity, the antisera produced in mice against three S-
layer proteins of isolates 2G14E and 5C14E from L. acidophilus, and 3D14L from L.
crispatus, were characterized by dot blot and western blot. The present results show that
antibodies against S-layer proteins of specific bacterial strains are able to recognize the
same protein from several other strains, making it easier to choose one of them as effective
adjuvant for vaccines. The results indicate that the antibody of L. acidophilus 5C14E has a
lower specificity compared to the other two and the highest specificity is L. acidophilus
2G14E. These results enable future studies to use these proteins as vaccine adjuvant.
10
INTRODUÇÃO
1. Lactobacillus
Os lactobacilos são bastonetes ou cocobacilos Gram-positivos, geralmente imóveis, não
formadores de esporos, anaeróbios aerotolerantes e, em sua maioria, catalase-negativos.
São bactérias fermentadoras que convertem glicose em ácido lático, característica que,
entre outras, as inclui no grupo das bactérias do ácido lático (BAL). Esse grupo de bactérias
Gram-positivas é amplamente utilizado na confecção, processamento e preservação de
diversos produtos alimentícios.
Lactobacillus spp. constituem um grupo bastante diverso, com 106 espécies validamente
descritas (Felis e Dellaglio, 2007), e encontrado em variados habitat, como cavidade oral,
trato respiratório, gastrointestinal e urogenital de humanos e outros animais; associado aos
vegetais, à matéria orgânica, além de solos, água, ou quaisquer outras fontes de substratos
fermentáveis com alguns nutrientes especiais, como certas vitaminas, sais e aminoácidos.
Os lactobacilos também estão presentes em muitos tipos de alimentos, como por exemplo,
iogurtes, carnes e derivados, queijos, bebidas fermentadas, cereais, sorvetes, manteigas,
dentre outros (Hammes e Hertel, 2003).
A estrutura filogenética da família é bastante complexa, uma árvore representativa é
mostrada na figura 1. As combinações de diferentes metodologias e modelos de inferências
filogenéticas permitiram o reconhecimento de uma série de grupos filogenéticos. Além disso,
a descrição de um grande número de espécies, nos últimos anos, mudou dramaticamente a
estrutura filogenética do gênero, mesmo em um pequeno intervalo de tempo. A principal
discrepância na taxonomia do gênero é a não-correlação entre posição filogenética e
características metabólicas (Felis e Dellaglio, 2007).
Vários efeitos têm sido associados com a presença dos lactobacilos no trato
gastrointestinal, por exemplo, estimulação de produção de imunoglobulina (Perdigon et al.,
1993), a indução da expressão de interferon nos macrófagos (Kitazawa et al., 1992), e
efeitos hipocolesterolêmicos (Fernandes et al. 1987) e a prevenção de bactérias
patogênicas como Salmonella typhimurium e Neisseria gonorreae (Coconnier et al 1993).
Essas propriedades probióticas e o potencial dos lactobacilos como veículos de compostos
de interesse, por exemplo, antígenos ou imunomoduladores, para a mucosa tem estimulado
a investigação sobre o papel das proteínas de superfície na aderência e nas propriedades
adjuvantes.
11
Figura 1. Árvore filogenética dos grupos de bactérias da família Lactobacillaceae.
A árvore consenso baseia-se em análise de máxima parcimônia de seqüências completas
do gene de RNA ribossômico 16S (Hammes e Hertel, 2003).
12
2. A camada S da parede celular de bactérias
Os Lactobacillus, assim como todo o grupo Archaea (figura 2) e várias bactérias
Gram-positivas (figura 3), possuem na parede celular arranjos cristalinos compostos de
subunidades protéicas ou glicoprotéicas, chamados camada S, compostas de apenas de
proteína S, com massa molecular variando de 25 a 71 kDa, uma característica peculiar, pois
em outros organismos essa massa varia de 40 a 200 kDa (Beveridge, 1994; Smit et al.,
2001). Em geral, a proteína S dos lactobacilos não é glicosilada (Bahl, Scholz et al., 1997). A
proteína de camada S representa de 10 a 15% do total de proteínas das células bacterianas
(Chen et al., 2009).
As funções biológicas da camada S são: adesão, determinação e manutenção da
morfologia celular, infecção, barreiras moleculares e arcabouço de enzimas e proteínas de
superfície, mas, para lactobacilos, apenas a adesão a diferentes superfícies foi confirmada
(Smit et al., 2001; Avall-Jääskeläinen, Palva, 2005).
As proteínas de camada S de Lactobacillus possuem, além do tamanho reduzido,
outras particularidades. O ponto isoelétrico da proteína S de L. acidophilus, calculada a
partir da sequência de aminoácidos deduzida, é 9,4 (Bahl, Scholz et al., 1997), e para os
lactobacilos em geral varia de 9,35 a 10,4, e em outros organismos são consideradas
fracamente ácidas. Enquanto na maioria das bactérias Gram-positivas as proteínas de
camada S são glicosiladas, isso não é comumente observado em Lactobacillus, tendo sido
descrito apenas em L. buchneri (Avall-Jääskeläinen, Palva, 2005).
A composição de aminoácidos nas proteínas de camada S de lactobacilos é bem
parecida com a de outros organismos, com algumas características específicas. Possuem
um alto conteúdo de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e baixo conteúdo de
aminoácidos com enxofre. Um único resíduo de cisteína tem sido observado e uma alta
porcentagem de resíduos de aminoácidos com grupos hidroxila (33% em lactobacilos e 15%
em outras bactérias). O número de resíduos de aminoácidos carregados positivamente pode
ser superior a 12,5% e é sempre maior que o número de resíduos carregados
negativamente, levando ao alto pH dessas proteínas (Avall-Jääskeläinen, Palva, 2005). A
composição de aminoácidos da proteína de camada S purificada de L. acidophilus é típica
para proteínas de camada S, ou seja, uma relativa abundância de treonina, serina e
aminoácidos hidrofóbicos, e ausência de resíduos de cisteína e metionina (Boot, Kolen et
al., 1993).
Em adição ao peptideoglicano, a rígida parede celular dos lactobacilos é composta
de polímeros de parede celular secundários (PPCS). Muitas bactérias Gram-positivas
possuem na parte N-terminal da proteína de camada S um motivo homólogo à camada S
(SLH), que é responsável pelo ancoramento da proteína de camada S ao PPCS e em
13
alguns casos diretamente ao peptideoglicano. Nas proteínas de camada S de Lactobacillus
não são encontrados motivos SLH, mas a ligação da proteína de camada S à parede celular
parece envolver apenas o PPCS.
A ultraestrutura da camada S é conhecida em algumas espécies de lactobacilos, como
em L. acidophilus ATCC 4356. Estruturalmente, o domínio responsável pela cristalização e
organização dessa camada S é os 2/3 amino-terminal da proteína SlpA, sendo o terço final
carboxi-terminal o responsável pela ancoragem da proteína S na parede celular (Smit et al.,
2001). Essas propriedades estruturais da proteína S e também da camada S oferecem
novas e diferentes vias de aplicação em biotecnologia: já foram sugeridas utilizações como
matrizes de imobilização de moléculas funcionais, membranas de ultrafiltração, e também,
carreadores de vacinas (Jakava-Viljanen et al., 2002).
As proteínas de camada S de Lactobacillus variam na região dois terços N-Terminal
(SAN), mas são conservadas na região um terço C-Terminal (SAC) (Sillanpaa, Martinez et
al., 2000; Smit, Oling et al., 2001; Antikainen, Anton et al., 2002; Chen, Xu et al., 2007). A
região SAN é responsável pela cristalização e aderência a células hospedeiras, enquanto a
região SAC ancora moléculas às células bacterianas (Smit, Oling et al., 2001).
Estudos revelam que a presença de múltiplos genes codificadores da proteína da
camada S é comum em lactobacilos, como em L. brevis que parece possuir três genes
codificadores da proteína de camada S e L. crispatus e L. acidophilus que possuem dois
genes para essa proteína (Avall-Jääskeläinen, Palva, 2005).
A sequência de nucleotídeos do gene de proteína S clonado de L. acidophilus
mostrou 79% de similaridade ao de L. helveticus slpA (GenBank X91199), mas pouquíssima
semelhança com o gene slpA de L. brevis (Boot, Kolen et al., 1993). Além disso, a
sequência de aminoácidos deduzidos da proteína S de L. acidophilus é muito similar à de L.
helveticus (75% de aminoácidos idênticos). Essa similaridade das proteínas S de L.
acidophilus e L. helveticus em comparação com L. brevis está de acordo com suas
proximidades evolutivas (Bahl, Scholz et al., 1997).
O gene da proteína de camada S de L. acidophilus, assim como o de L. helveticus e
L. brevis, codifica uma pré-proteína constituída de uma sequência sinal com um sítio de
clivagem após o aminoácido 24. Várias repetições diretas têm sido encontradas na
sequência de DNA de genes slp de L. acidophilus e L. brevis e resultam em aminoácidos
repetidos (Boot, Kolen et al., 1993). Proteínas S são expressas em alto nível. Assim como
para outras espécies, é observado o uso de códons tendenciosos para mRNAs de
lactobacilos que são traduzidos em taxa elevada (Pouwels e Leunissen, 1994). Mais de 50%
das proteínas S desses organismos são codificadas por apenas sete tripletes. Rearranjos
randômicos dos tripletes codificadores de proteína S de L. acidophilus e L. brevis produzem
aproximadamente o mesmo número de repetições diretas, resultando também em repetidos
14
resíduos de aminoácidos, argumentando contra um papel funcional para essas repetições
(Boot, Kolen, Pot et al., 1996). Ainda de acordo com Boot et al. (1996), todas as cepas de L.
acidophilus investigadas contêm dois genes slp, uma vez que duas bandas de hibridização
do mesmo tamanho são encontradas quando o gene slpA é usado para detectar o
cromossomo. A sequência de nucleotídeos do segundo gene (slpB) é muito similar ao slpA.
A região 5‟ não traduzida e a sequência que codifica a sequência de sinais até a maturidade
da proteína de camada S são muito semelhantes. O mesmo vale para a região 3‟ dos dois
genes, mas as regiões médias diferem (Boot et al., 1995). As duas proteínas codificadas
pelos genes slp também são muito parecidas. O primeiro terço das regiões C-terminais são
os mesmos, enquanto as regiões N-terminais e as partes do meio da proteína são
diferentes. A conclusão de que o gene slpA, em L. acidophilus, codifica a proteína de
camada S enquanto o slpB é um gene silencioso é baseada em algumas considerações. (i)
slpA, diferente de slpB foi isolado de uma biblioteca de expressão sondada com anticorpo
contra proteína S, (ii) a sequência de aminoácidos da região N-terminal da proteína de
camada S correspondem ao da slpA, (iii) o RNA é transcrito de slpA, mas não de slpB, (iv)
uma sequência promotora está presente antes do slpA, mas está faltando antes do slpB
(Boot et al., 1995).
Por uma combinação de análise de enzimas de restrição e experimentos de PCR, os
genes slpA e slpB foram localizados, um de frente para o outro, em um fragmento de DNA
de 6kb (Boot, Kolen e Pouwels, 1996; Boot e Pouwels, 1996). Quatro ORFs estão
localizadas na região de 3,0 Kb entre os genes slpA e splB (>150 nt) (figura 4). Nenhuma
sequência de regulação transcricional (promotor, operon, terminador) foi detectada nessa
região. Estudos indicam que as ORFs 1 e 2 são transcritas em nível baixo, sugerindo que
são parte de um operon silencioso, juntamente com o gene slpB. A sequência de
aminoácidos codificada pela ORF-1 mostra considerável homologia com IcaI de
Staphylococcus epidermis e com HmsR de Yersinia pestis. IcaI é responsável pela formação
do polissacarídeo intracelular adesina PIA de Staphylococcus epidermidis (Boot, Kolen e
Pouwels, 1996). HmsR é uma transactina, regulador positivo para expressão do lócus de
armazenamento de hemina (hms – hemin storage locus) (Pendrak e Perry, 1993). O locus
hms está envolvido na transmissão de Yersinia por pulgas, alterando o curso da infecção
por Y. pestis no seu inseto vetor levando a uma mudança no comportamento alimentar de
sangue e transmissão eficiente da praga (Hinnebusch et al., 1996). Para a sequencia de
aminoácidos codificada pela ORF-2 não foi encontrada nenhuma homologia significante. A
suposta proteína (79 aminoácidos) codificada pela ORF-3 tem sua parte 3/5 C-terminal com
homologia a uma proteína transportadora ligante de ATP, cujo gene foi identificado no
genoma de Aeromonas salmonicida, na qual um domínio ligante de ATP está presente em
uma proteína envolvida na regulação da expressão da proteína de camada S. Essa proteína
15
(AbcA) atua, em um sistema heterólogo, como um regulador positivo de um dos dois
promotores presentes na frente do gene que codifica a proteína S (Noonan e Trust, 1995).
Não foi encontrada homologia com nenhuma proteína conhecida para a ORF-4.
Em L. crispatus, os dois genes slpA e slpB também foram encontrados, com 1.329 e
1.346 pb, respectivamente. O primeiro codifica um polipeptídeo de 443 aminoácidos e a
massa molecular da proteína madura é 44.310 Da. O polipeptídeo codificado pelo segundo
possui 461 aminoácidos com a proteína madura possuindo massa molecular de 45.115 Da.
Existe 47% de similaridade entre as proteínas SlpA e SlpB nas suas sequências de
aminoácidos, com 86,9% de identificação da região C-terminal e variabilidade substancial
nas partes mediana e N-terminal (Chen et al., 2009). Chen et al. (2009) mostraram que a
SlpB de L. crispatus possui alta similaridade a 56% da SlpA de L. acidophilus ATCC 4356.
Assim como em L. acidophilus, o gene slpB provavelmente é um gene silencioso em L.
crispatus ZJ001, e em ambos ele pode ser translocado a um sítio de expressão por meio de
uma inversão de um segmento cromossômico por meio de um sistema de recombinação
sítio específica na região 5‟ homóloga (Boot, Kolen e Pouwels, 1996; Chen et al., 2009).
Entretanto, Jakava-Viljanen e Avall-Jaaskelainen (2002) mostraram que, em L. brevis ATCC,
a expressão dos genes slp é diferente sob diferentes condições de crescimento.
De acordo com Chen et al. (2009), a cepa estudada de L. crispatus é um bom
candidato a vetor de vacina de mucosa, colocando um gene heterólogo dentro do slpA, por
causa do padrão de expressão e pela alta capacidade da proteína SlpA de se ligar a células.
Além da sua capacidade de adesão, Xu et al. (2007) mostraram que a aderência de S.
typhimurium e E. coli a células HeLa foi fortemente inibida pela adição de 50mg de proteína
de camada S de L. crispatus.
Os lactobacilos, assim como outras bactérias probióticas intestinais, desempenham
uma forte influência nas células dendríticas, que são células apresentadoras de antígenos e
possuem um papel essencial na tolerância de mucosa. A principal proteína de camada S,
SlpA, de L. acidophilus é o primeiro ligante de bactérias probióticas a células dendríticas
identificado que é funcionalmente envolvido na modulação dessas células. Konstantinov,
Smidt et al. (2008) mostraram que L. acidophilus se liga a células dendríticas e induz a
produção de IL-10 e baixo nível de IL-12p70. Um mutante de L. acidophilus faltando a
proteína SlpA teve a ligação a células dendríticas significantemente reduzida. Este mutante
efetua uma inversão cromossômica levando a expressão dominante de SlpB e a natureza
da interação desta bactéria com as células dendríticas muda dramaticamente, levando a
produção de diferentes citocinas em maiores concentrações, como IL-12p70, TNF- e IL-1.
De acordo com Smit et al. (2002), a capacidade de SlpA de L. acidophilus apresentar
epitopos, de aproximadamente 19 aminoácidos em linha, na superfície bacteriana de uma
forma geneticamente estável, torna-a adequada para aplicação como veículo de vacina oral.
16
Figura 2. Representação esquemática da parede celular de uma Archaea.
A maioria das células archaea são cobertas por uma camada de superfície (S-layer) que
consiste em subunidades de glicoproteína organizadas hexagonal ou tetragonalmente com
uma estrutura cristalina, com poros que são permeáveis a solutos e pequenas proteínas
(Albers et al, 2006).
Figura 3. Representação esquemática da parede celular de bactéria Gram-positiva.
A membrana plasmática lipoprotéica é coberta por várias camadas de peptídeoglicano onde
se encontram ligadas outras moléculas constituintes como, ácido teicóico, lipoteicóico e
polissacarídeos. Externamente há ainda um envelope de proteínas, chamado camada S,
além de inúmeras proteínas associadas, não representadas neste esquema (Adaptado de
Delcour et al., 1999).
17
Como as proteínas de camada S são ligadas à parede celular de forma não
covalente, elas podem ser facilmente removidas por agentes desnaturantes, como o
hidrocloreto de guanidina (Ramiah et al., 2008) e o cloreto de lítio (Frece et al., 2005;
Garrote et al., 2004). Isso pode ser visualizado por microscópio eletrônico, como na figura 5.
Assim sendo, as proteínas de camada S podem ser estudadas com o intuito de
utilizá-las, juntamente com os Lactobacillus ou isoladamente, como adjuvantes e/ou até
mesmo carreadores vacinais. A proposta desse estudo é verificar as reatividades imunes
cruzadas dessas proteínas para uma posterior utilização das mesmas como adjuvantes ou
carreadores vcinais.
Figura 4. Representação esquemática do segmento cromossômico slp de 6kb de L.
acidophilus ATCC 4356 (Bahl et al., 1997).
Figura 5. Microscopia Eletrônica de L. crispatus DSM 20584. A seta mostra a presença
da camada S. Adaptado de Deepika e Charalampopoulos, 2010.
18
OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Selecionar as proteínas da superfície celular de novas linhagens de Lactobacillus spp.
(camada S) isoladas de frangos caipiras e suas reatividades imunes cruzadas.
.
Objetivos Específicos:
1. Obter extratos protéicos totais de lactobacilos de frangos e identificar por eletroforese
em SDS-PAGE a presença de proteínas majoritárias que podem ser oriundas da
camada S;
2. Obter extratos protéicos enriquecidos com proteínas associadas a parede bacteriana
por tratamento com altas concentrações de cloreto de lítio e caracterizá-los por
eletroforese em SDS-PAGE;
3. Imunizar camundongos com a proteína dominante dos extratos protéicos de LiCl
enriquecidos com proteínas da camada S;
4. Caracterizar por dot blot e western blot os antisoros produzidos em camundongos
contra três proteínas da camada S dos isolados 2G14E e 5C14E de L. acidophilus, e
do isolado 3D14L de L. crispatus.
19
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Linhagens bacterianas e condições de cultivo
Foram utilizadas 38 linhagens de Lactobacillus previamente isoladas do trato gastrointestinal
de frangos (Mota, Moreira et al., 2006), cultivadas em meio MRS (Difco™ Lactobacilli MRS
Broth) em câmara de anaerobiose a 37˚C por 18h. A tabela 1 apresenta todas as linhagens
e a respectiva espécie de Lactobacillus tipada por PCR-RFLP.
Das 38 linhagens de Lactobacillus utilizadas, 12 eram L. reuteri, 11 L. acidophilus, 4 L.
johnsonii, 4 L. vaginalis, 4 L. salivarus, 2 L. crispatus, e um de uma espécie de Lactobacillus
não identificada.
Tabela 1. Linhagens de Lactobacillus spp. de diferentes porções do trato gastrointestinal de
frangos caipiras de 14 dias de vida (M - moela, D - intestino delgado, G - intestino grosso e
C - cecos), tipados por PCR-RFLP dos espaçadores 16S-23S rRNA.
LINHAGEM
ESPÉCIE
1M14C
L. reuteri
1M14E
L. johnsonii
2M14C
L. reuteri
2M14L
L. acidophilus
2M14E
L. acidophilus
3M14C
L. reuteri
3M14L
L. johnsonii
4M14C
L. reuteri
4M14L
L. reuteri
4M14E
L. acidophilus
5M14C
L. reuteri
5M14E
L. vaginalis
1D14C
L. salivarius
2D14C
L. vaginalis
2D14E
L. acidophilus
3D14C
L. reuteri
3D14L
L. crispatus
4D14C
L. reuteri
4D14L
L. reuteri
5D14E
L. acidophilus
1G14E
Lactobacillus spp.
2G14E
L. acidophilus
20
Tabela 1. continuação
3G14C
L. reuteri
3G14L
L. johnsonii
4G14C
L. vaginalis
4G14L
L. reuteri
4G14E
L. vaginalis
5G14C
L. salivarius
5G14L
L. crispatus
2C14E
L. acidophilus
2C14L
L. acidophilus
3C14C
L. reuteri
3C14L
L. johnsonii
3C14E
L. acidophilus
4C14C
L. salivarius
4C14L
L. acidophilus
5C14C
L. salivarius
5C14E
L. acidophilus
2. Obtenção de extrato de proteínas totais
Para a obtenção de um extrato com proteínas totais bacterianas, 2,4 mL de cultura crescida
até uma OD
600
de 0,5 eram centrifugados a 14.000 RPM por 3 min, o pellet bacteriano era
lavado com 3 mL de solução salina e novamente centrifugado a 14.000 RPM por 3 min. O
pellet era suspenso em 375 µL de água ultra pura e 125 µL de tampão da amostra 4X para
SDS-PAGE e fervido por 10 min.
3. Obtenção de extrato de proteínas de camada S semi-purificadas
Para a obtenção de um extrato enriquecido com proteínas da parede bacteriana, 2,4 mL de
cultura crescida até uma OD
600
de 0,5 eram centrifugados a 14.000 RPM por 3 min, o pellet
bacteriano era lavado com 3 mL de solução salina e centrifugado a 14.000 RPM por 3 min.
O pellet era então suspenso em 500 µL de cloreto de lítio 5 M e incubado por uma hora e
meia sob agitação leve à temperatura ambiente e novamente centrifugado a 14.000 RPM
por 3 min. O sobrenadante era congelado a -20ºC para posteriores análises.
4. Concentração das proteínas por ultrafiltração
As frações protéicas eram concentradas para posterior utilização por centrifugação dos
sobrenadantes de cloreto de lítio 5 M a 3.000 xg por 15 min a 4ºC em Amicon
®
Ultra-4
10.000 NMWL (Millipore Co.).
21
5. Quantificação das proteínas
A quantificação das proteínas purificadas era realizada pelo método de Bradford (1976),
com modificações. Em microplaca de 96 poços de fundo chato eram colocados 20 μl de
solução de proteínas ou do padrão de soro albumina bovina em duplicata. A cada poço
eram adicionados 180 μl da solução de Bradford, diluída conforme especificação do
fabricante. Após 10 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a densidade óptica
era determinada em leitor de ELISA em filtro de 595 nm. Calculava-se a quantidade da
proteína de interesse em relação à curva padrão de soro albumina bovina.
6. Análise por SDS-PAGE
As proteínas eram separadas por eletroforese vertical em SDS-PAGE utilizando-se um gel
de separação de 12,5% de acrilamida. Estes eram preparados a partir de uma solução de
40% de acrilamida/bisacrilamida 29:1 em Tris-HCl 375 mM pH 8,8 e SDS 0,1%. O gel de
“empacotamento” era preparado com Tris-HCl 125 mM pH 6,8, contendo 4% de
acrilamida/bisacrilamida 29:1 e 0,1% de SDS.
A eletroforese era realizada em tampão de corrida (Tris-HCl 25 mM; Glicina 192 mM, pH
8,3; SDS 0,1%) a 200 V por 1 h aproximadamente. As proteínas eram coradas em solução
de Azul de Coomassie ou Nitrato de Prata, de acordo com os protocolos descritos a seguir,
ou transferidas para membrana de nitrocelulose, conforme a técnica de “Western blotting”.
Coloração por Azul de Coomassie: os géis eram corados em solução de Azul de
Coomassie a 0,1% em Metanol:Ácido acético:Água (5:2:5) por 3 h, descorados em solução
Metanol 30%:Ácido acético 10%, incubados em solução preservativa (Etanol 25%; Glicerol
1,5 %) por 1 h e montados em papel celofane previamente umedecido em água.
Coloração por Nitrato de Prata: os géis eram incubados em solução fixadora (Etanol
40%; Ácido acético 10%) por 30 min e posteriormente tratados como descrito no protocolo
fornecido pelo fabricante do kit PlusOne SILVER STAINING (Pharmacia Co.), esta
metodologia é baseada naquela descrita por Heukeshoven e Dernick (1985).
7. Análise por “Western blotting”
As proteínas submetidas à eletroforese em SDS-PAGE eram transferidas para membranas
de nitrocelulose (GE Healthcare) a 100 V por 1 h (no gelo) ou 30 V por 16 h (4C) em
tampão de transferência (Tris 25 mM; Glicina 192 mM; Metanol 20 %; pH 8,3). Em seguida
as membranas eram incubadas em solução TBS-T (Tris-HCl 20 mM pH 7,6; NaCl 137 mM;
Tween20 0,05%) com 5% p/v de leite em pó desnatado para bloqueio durante 2 h
aproximadamente. Após o bloqueio as membranas eram incubadas em soluções de TBS-T
com 5% de leite e os respectivos soros nas diluições indicadas durante 2 h, sendo depois
lavadas com TBS-T 3 vezes de 15 min. As membranas eram então incubadas em nova
22
solução TBS-T com 5% de leite e o segundo anticorpo, anti-IgG de camundongo conjugado
com peroxidase, em diluições variadas por 1,5 h. Em seguida as membranas eram
novamente lavadas em solução TBS-T 3 vezes de 15 min. Outras duas lavagens de 5 min
eram feitas em solução TBS. As revelações eram feitas utilizando-se o substrato
cromogênico DAB (diaminobenzidina, 4-cloro-1-naftol em metanol com adição de peróxido
de hidrogênio).
8. Análise por “Dot blot”
As proteínas eram transferidas para membranas de nitrocelulose (GE Healthcare) por vácuo
por 10 segundos. Em seguida as membranas eram incubadas em solução TBS-T (Tris-HCl
20 mM pH 7,6; NaCl 137 mM; Tween20 0,05%) com 5% p/v de leite em pó desnatado para
bloqueio durante 2 h aproximadamente. Após o bloqueio as membranas eram incubadas em
soluções de TBS-T com 5% de leite e os respectivos soros nas diluições indicadas durante 2
h, sendo depois lavadas com TBS-T 3 vezes de 15 min. As membranas eram então
incubadas em nova solução TBS-T com 5% de leite e o segundo anticorpo, anti-IgG de
camundongo conjugado com peroxidase, em diluições variadas por 1,5 h. Em seguida as
membranas eram novamente lavadas em solução TBS-T 3 vezes de 15 min. Outras duas
lavagens de 5 min eram feitas em solução TBS. As revelações eram feitas utilizando-se o
substrato cromogênico DAB (diaminobenzidina, 4-cloro-1-naftol em metanol com adição de
peróxido de hidrogênio).
9. Imunização dos animais
Fêmeas de camundongos BALB/c com 4 a 5 semanas de vida eram imunizadas com as
proteínas semi-purificadas para obtenção de anticorpos policlonais (proteínas da camada S
dos isolados 2G14E e 5C14E de L. acidophilus, e do isolado 3D14L de L. crispatus). Para
isso, as proteínas presentes no extrato de LiCl 5 M eram previamente submetidas à
eletroforese (SDS-PAGE), coradas com azul de Coomassie e a banda de interesse excisada
do gel. Em seguida, a banda era triturada manualmente com auxílio de N
2
líquido,
ressuspendida em PBS e acrescido de hidróxido de alumínio, como adjuvante (realizadas 3
imunizações com um intervalo de 14 dias cada). Em cada imunização eram injetados
aproximadamente 10 g de proteína e 30 g do adjuvante, por via subcutânea. Uma
semana após a terceira imunização os animais eram parcialmente sangrados pelo plexo
retrorbital para avaliação da resposta humoral, por “Western blotting”. O sangue era
incubado a 37
o
C por 30 min, o coágulo era retirado por centrifugação e o soro coletado no
sobrenadante.
23
RESULTADOS
1. Obtenção das proteínas totais e de camada S semi-purificadas
Utilizou-se a análise por SDS-PAGE para selecionar as proteínas de camada S de
Lactobacillus a serem utilizadas para produção de anticorpos e para verificar a possível
presença desta proteína nos extratos proteicos analisados.
Os perfis de proteínas no extrato bacteriano total obtido das linhagens de lactobacilos em
SDS-PAGE 12,5% podem ser visualizados na figura 6 (A-D) e os perfís de proteína de
camada S semi-purificada por tratamento com LiCl 5 M em SDS-PAGE podem ser vistos na
figura 7 (A-D).
As proteínas utilizadas para a imunização dos camundongos e para os posteriores western
blotting e dot blot foram extraídas de 38 cepas de Lactobacillus listados a seguir. O critério
de escolha foi baseado na quantidade de proteína S produzida e nas diferenças de tamanho
entre proteínas de duas linhagens de bactérias de mesma espécie, com o objetivo de
identificar diferenças em suas reações imunes cruzadas.
Figura 6A. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos
isolados da moela de frangos de 14 dias (L. reuteri 1M14C, L. johnsonii 1M14E, L. reuteri
2M14C, L. reuteri 3M14C, L. johnsonii 3M14L, L. reuteri 4M14C, L. reuteri 4M14L).
24
Figura 6B. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos da
moela e intestino delgado de frangos (L. acidophilus 4M14E, L. reuteri 5M14C, L. vaginalis
5M14E, L. salivarius 1D14C, L. acidophilus 2D14E, L. reuteri 3D14C, L. crispatus 3D14L).
Figura 6C. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos de
intestino de frangos (L. reuteri 4D14C, L. reuteri 4D14L, L. acidophilus 5D14E, Lactobacillus
1G14E, L. acidophilus 2G14E, L. reuteri 3G14C, L. reuteri 3G14L, L. vaginalis 4G14C).
25
Figura 6D. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico total dos lactobacilos
isolados da moela de frangos de 14 dias (L. reuteri 4G14L, L. vaginalis 4G14E, L. reuteri
3C14C, L. johnsonii 3C14L, L. acidophilus 3C14E, L. salivarius 4C14C, L. salivarius 5C14C,
L. acidophilus 5C14E).
Figura 7A. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos da moela.
26
Figura 7B. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos da moela e intestino delgado.
Figura 7C. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos dos intestinos delgado e grosso.
27
Figura 7D. Eletroforese em SDS-PAGE 12,5% do extrato protéico de camada S semi-
purificadas com LiCl 5M dos isolados de lactobacilos do intestino grosso e cecos.
2. Quantificação da proteína por Bradford
As proteínas a serem injetadas nos camundongos foram quantificadas por meio Bradford. O
resultado foi uma concentração de 2,74 mg/mL para a proteína de camada S da bactéria
2G14E; 0,62 mg/mL para a 3D14L e 1,55 mg/mL para a 5C14E. Assim, para uma aplicação
de 10 µg por camundongo, deveríamos aplicar 3,65 µL da proteína de camada S da bactéria
2G14E; 16,13 µL da proteína 3D14L e 6,45 µL da 5C14E.
3. Imunização dos camundongos com proteínas de camada S de lactobacilos
Foram aplicados, na região subcutânea do pescoço, 10 µg de proteína de camada S
acrescido de 30 µg de hidróxido de alumínio (Al(OH)
3
) por camundongo:
Grupo A – 5 camundongos injetados com a proteína de camada S semipurificada de 2G14E;
Grupo B – 5 camundongos injetados com a proteína de camada S semipurificada de 3D14L;
Grupo C – 5 camundongos injetados com a proteína de camada S semipurificada de 5C14E.
O soro resultante da imunização (após 3 aplicações espaçadas por 14 dias) foi testado por
Western Blot com as mesmas proteínas injetadas nos camundongos, o extrato protéico
semipurificado com cloreto de lítio da bactéria correspondente e um controle negativo com
BSA (Figura 8).
28
Figura 8. Teste dos antisoros anti proteína S semi-purificada de extratos de LiCl da parede
dos isolados L. acidophilus 2G14E, L. acidophilus 5C14E e L. crispatus 3D14L. Legenda:
2G14E a – proteína injetada nos camundongos, 2G14E b – extrato protéico semi-purificado;
5C14E a – proteína injetada nos camundongos, 5C14E b – extrato protéico semi-purificado;
3D14L a – proteína injetada nos camundongos, 3D14L b – extrato protéico semi-purificado.
4. Reação cruzada dos anticorpos contra proteína de camada S
Utilizou-se a técnica de Dot Blot para testar as reações cruzadas dos antisoros obtidos com
os extratos protéicos total e semipurificado dos Lactobacillus (Figura 9, A-C).
Os resultados dos Dot Blots foram semelhantes entre si. Todos os antisoros reconheceram
as proteínas 1G14E e 2M14E no extrato total e 2D14C, 3D14L, 5D14E, 2M14L e 3M14L no
extrato semi purificado. Os anticorpos para as proteínas 2G14E e 5C14L tiveram reação
positiva em comum para os extratos protéicos totais de 4C14L, 5C14E, 2G14E e 5D14E e
para os extratos semipurificados de 2C14E, 2C14L, 4C14L, 5C14E e 2G14E. Os anticorpos
para as proteínas 3D14L e 5C14L tiveram reação positiva em comum para o extrato protéico
total de 4C14C e para os extratos protéicos semipurificados de 2D14E e 5M14E. Os
anticorpos para as proteínas de camada S 2G14E e 3D14L não tiveram reações positivas
em comum, exceto as que também eram comuns de 5C14E.
29
Figura 9A. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com
antisoro contra proteína de camada S de Lactobacillus acidophilus 2G14E.
Legenda: 1A – 2C14E; 2A – 2C14L; 3A – 3C14C; 4A – 3C14E; 5A – 3C14L; 6A – 4C14C;
7A – 4C14L; 8A – 5C14C; 9A – 5C14E; 10A – 1D14C; 1B – 2D14C; 2B – 2D14E; 3B –
3D14C; 4B – 3D14L; 5B – 4D14C; 6B – 4D14L; 7B – 5D14E; 8B – 1G14E; 9B – 2G14E;
10B – 3G14C; 1C – 3G14L; 2C – 4G14C; 3C – 4G14E; 4C – 4G14L; 5C – 5G14C; 6C –
5G14L; 7C – 1M14C; 8C – 1M14E; 9C – 2M14C; 1D – 2M14E; 2D – 2M14L; 3D – 3M14C;
4D – 3M14L; 5D – 4M14C; 6D – 4M14E; 7D – 4M14L; 8D – 5M14C; 9D – 5M14E; 11A e
11B – controle positivo com a proteína usada para imunização dos camundongos; 11C e
11D – controle negativo com BSA; As linhas de A a D são de extrato protéico total e as
linhas de E a H possuem o mesmo padrão das linhas de A a D, porém com extrato semi
purificado.
30
Figura 9B. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com
anticorpo contra proteína de camada S de Lactobacillus crispatus 3D14L.
Legenda: 1A – 2C14E; 2A – 2C14L; 3A – 3C14C; 4A – 3C14E; 5A – 3C14L; 6A – 4C14C;
7A – 4C14L; 8A – 5C14C; 9A – 5C14E; 10A – 1D14C; 1B – 2D14C; 2B – 2D14E; 3B –
3D14C; 4B – 3D14L; 5B – 4D14C; 6B – 4D14L; 7B – 5D14E; 8B – 1G14E; 9B – 2G14E;
10B – 3G14C; 1C – 3G14L; 2C – 4G14C; 3C – 4G14E; 4C – 4G14L; 5C – 5G14C; 6C –
5G14L; 7C – 1M14C; 8C – 1M14E; 9C – 2M14C; 1D – 2M14E; 2D – 2M14L; 3D – 3M14C;
4D – 3M14L; 5D – 4M14C; 6D – 4M14E; 7D – 4M14L; 8D – 5M14C; 9D – 5M14E; 11A e
11B – controle positivo com a proteína usada para imunização dos camundongos; 11C e
12C – controle negativo com BSA; As linhas de A a D são de extrato protéico total e as
linhas de E a H possuem o mesmo padrão das linhas de A a D, porém com extrato semi
purificado.
31
Figura 9C. Membrana de Dot Blot dos extratos protéicos total e semipurificado com
anticorpo contra proteína de camada S de Lactobacillus acidophilus 5C14E.
Legenda: 1A – 2C14E; 2A – 2C14L; 3A – 3C14C; 4A – 3C14E; 5A – 3C14L; 6A – 4C14C;
7A – 4C14L; 8A – 5C14C; 9A – 5C14E; 10A – 1D14C; 1B – 2D14C; 2B – 2D14E; 3B –
3D14C; 4B – 3D14L; 5B – 4D14C; 6B – 4D14L; 7B – 5D14E; 8B – 1G14E; 9B – 2G14E;
10B – 3G14C; 1C – 3G14L; 2C – 4G14C; 3C – 4G14E; 4C – 4G14L; 5C – 5G14C; 6C –
5G14L; 7C – 1M14C; 8C – 1M14E; 9C – 2M14C; 1D – 2M14E; 2D – 2M14L; 3D – 3M14C;
4D – 3M14L; 5D – 4M14C; 6D – 4M14E; 7D – 4M14L; 8D – 5M14C; 9D – 5M14E; 11A e
11B – controle positivo com a proteína usada para imunização dos camundongos; 11C e
11D – controle negativo com BSA; As linhas de A a D são de extrato protéico total e as
linhas de E a H possuem o mesmo padrão das linhas de A a D, porém com extrato semi
purificado.
32
Essa reação cruzada também foi realizada utilizando-se da técnica de Western Blot,
porém apenas com o extrato protéico semipurificado das mesmas bactérias (Figura 10 A-D;
Figura 11A-D e Figura 12A-D).
Os extratos protéicos semipurificados das bactérias 1D14C, 2G14E, 1G14E, 5D14E, 3D14L,
2G14E, 2D14C, 3G14L, 5M14E e 2M14L reagiram positivamente com os três anticorpos
utilizados.
Os extratos protéicos semipurificados das bactérias 5C14E, 4C14L, 3C14E, 2C14L,
2C14E e 2M14E reagiram apenas com os dois anticorpos contra proteína S de L.
acidophilus.
O extrato protéico semipurificado da bactéria 3G14C reagiu com os anticorpos da
bactéria L. acidophilus 2G14E e da bactéria L. crispatus 3D14L.
Os extratos protéicos semipurificados das bactérias 4D14L, 4D14C, 3D14C, 2M14C,
1M14E, 1M14C, 4G14L, 5M14C, 4M14L, 4M14E, 4M14C, 3M14L e 3M14C reagiram com os
anticorpos da bactéria L. acidophilus 5C14E e da bactéria L. crispatus 3D14L.
Reagiram apenas com o anticorpo contra a bactéria L. crispatus 3D14L os extratos
protéicos das bactérias 5G14L, 5G14C, 4G14E e 4G14C.
Reagiram apenas com o anticorpo contra a bactéria L. acidophilus 5C14E os extratos
protéicos das bactérias 3C14L e 3C14C.
Apenas não houve reação com os extratos protéicos das bactérias 4C14C e 5C14C.
33
Figura 10A. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 2G14E usado para imunizar os
camundongos.
Figura 10B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 2G14E usado para imunizar os
camundongos.
34
Figura 10C. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 2G14E usado para imunizar os
camundongos.
Figura 10D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 2G14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 2G14E usado para imunizar os
camundongos.
35
Figura 11A. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. crispatus 3D14L.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. crispatus 3D14L usado para imunizar os
camundongos.
Figura 11B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. crispatus 3D14L.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. crispatus 3D14L usado para imunizar os
camundongos.
36
Figura 11C. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. crispatus 3D14L.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. crispatus 3D14L usado para imunizar os
camundongos.
Figura 11D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. crispatus 3D14L.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. crispatus 3D14L usado para imunizar os
camundongos.
37
Figura 12A. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 5C14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 5C14E usado para imunizar os
camundongos.
Figura 12B. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 5C14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 5C14E usado para imunizar os
camundongos.
38
Figura 12C. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 5C14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 5C14E usado para imunizar os
camundongos.
Figura 12D. Western Blot de proteínas de camada S semi purificadas com anticorpo contra
proteína de camada S de L. acidophilus 5C14E.
+ = controle positivo com o extrato protéico de L. acidophilus 5C14E usado para imunizar os
camundongos.
39
DISCUSSÃO
Estudos indicam que as proteínas de camada S possuem grande potencial para atuar
como adjuvantes em vacinas. Em um estudo realizado por Smit e colaboradores (1993), a
injeção em camundongos Balb/c de proteínas de camada S e também sua administração
por via oral/nasal provocou uma resposta de hipersensibilidade retardada (DTH)
comparáveis às respostas do hidróxido de alumínio, mostrando que o conjunto natural de
proteínas de camada S possui propriedades adjuvantes intrínsecas.
Além disso, estudos indicam que as proteínas de camada S são importantes na adesão
dos lactobacilos às superfícies dos hospedeiros. A proteína de camada S de várias cepas de
L. acidophilus foram propostas como mediadoras da adesão a células epiteliais do intestino
de suínos (Kos et al., 2003), de camundongos (Frece et al., 2005) e de aves (Schneitz et al.,
1993). Tal propriedade, juntamente com as propriedades imunológicas adjuvantes das
proteínas de camada S, levam a crer que os lactobacilos possam ser excelentes como
carreadores de antígenos vacinais e também seu próprio adjuvante.
Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que os anticorpos contra proteínas de
camada S de linhagens bacterianas específicas são capazes de reconhecer as mesmas
proteínas de diversas outras linhagens, tornando mais fácil a escolha de uma delas como
adjuvantes eficazes para vacinas.
Notou-se através da visualização em SDS-PAGE dos extratos proteicos totais e
semipurificados uma diferença na quantidade de proteínas entre as amostras, apesar da
padronização por densidade óptica das bactérias na extração das proteínas e na quantidade
aplicada em cada gel. Essa diferença pode ser explicada pela diferença entre os diversos
lactobacilos com relação a tamanho das células e consequentemente a quantidade de
proteínas em cada uma delas. Para lactobacilos com células menores, um maior número de
células „necessário para resultar em uma OD igual a de um lactobacilo com célula maior, o
que pode resultar em uma maior quantidade de proteína no extrato proteico.
Dos 38 extratos protéicos testados, 16 reagiram com o anticorpo contra proteína S da
bactéria L. acidophilus 2G14E; 28 reagiram com o anticorpo da bactéria L. crispatus 3D14L;
e 31 reagiram com o anticorpo da bactéria L. acidophilus 5C14E. Sendo que todos os
extratos que reagiram com o primeiro anticorpo também reagiram com pelo menos um dos
outros dois. Quatro extratos reagiram exclusivamente com o segundo anticorpo e três
reagiram apenas com o último anticorpo.
Dos 16 extratos que reagiram com o anticorpo de L. acidophilus 2G14E, nove eram de L.
acidophilus, um de L. salivarius, um de L. reuteri, um de L. crispatus, dois de L. vaginalis, um
de L. johnsonii e um de uma espécie de Lactobacillus não identificada.
40
Dos 28 extratos que reagiram com o anticorpo de L. crispatus 3D14L, dois eram de L.
salivarius, onze eram de L. reuteri, cinco de L. acidophilus, dois de L. crispatus, quatro de L.
vaginalis, três de L. johnsonii e um de uma espécie de Lactobacillus não identificada.
Dos 31 extratos que reagiram com o anticorpo de L. acidophilus 5C14E, um era de L.
salivarius, onze eram de L. acidophilus, quatro de L. johnsonii, onze de L. reuteri, um de L.
crispatus, dois de L. vaginalis e um de uma espécie de Lactobacillus não identificada.
Dois dos extratos testados não reagiram com nenhum anticorpo, a saber, os extratos
protéicos de L. salivarius 4C14C e L. salivarius 5C14C.
Nos géis dos extratos proteicos, visualizou-se uma diferença no tamanho das bandas de
proteína S entre lactobacilos de mesma espécie, como por exemplo das linhagens de
Lactobacillus acidophilus 5C14E e 2G14E, indicando uma diferença entre as proteínas S de
linhagens diferentes.
Para confirmar essa diferença, o resultado das reações imunes cruzadas dessas duas
linhagens foi diferente, inclusive na reação com os L. acidophilus, nas quais a linhagem
5C14E reagiu com todos os onze L. acidophilus testados, enquanto a linhagem 2G14E não
reagiu com duas das linhagens de L. acidophilus testadas.
Frações de componentes celulares de Lactobacillus acidophilus foram testadas para
estimular a expressão dos genes do sistema imune na TONSILA CECAL e em células
mononucleares do baço de frangos, mostrando que os esplenócitos foram mais estimulados
pela fração dos componentes da parede celular e as células da TONSILA CECAL pelo DNA
(Brisbin, Zhou et al., 2008).
A proteína de camada S de lactobacilos também já foi utilizada com sucesso por Khang
e colaboradoes (2009). Eles fizeram uma proteína de camada S recombinante, cujo gene
codificava proteína verde fluorescente (GFP) e proteína S de L. brevis e/ou duas cópias do
domínio Z ligante de Fc, um análogo sintético do domínio B da proteína A, e expressaram
em E. coli. Sua propriedade adesiva possibilitou uma fácil e rápida imobilização de enzimas
ou anticorpos em materiais sólidos, como plásticos, vidro, filmes sol-gel e células do epitélio
intestinal. Devido à sua afinidade com as células intestinais e de imunoglobulina G, a fusão
de proteínas com a proteína de camada S permitiu a adesão de anticorpos para células
epiteliais humanas. Além disso, uma mistura dessa fusão de proteínas com anticorpos
contra diarréia neonatal de bezerros (coronavirus, rotavirus, E. coli e Salmonella
typhimurium) dada a bezerros Hanwoo resultou em 100% de prevenção contra a síndrome
de diarréia neonatal do bezerro.
41
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Mostrou-se a partir dos resultados obtidos que os três anticorpos testados funcionaram
bem com os extratos protéicos utilizados, não reagindo com o controle negativo (BSA).
Os resultados dos Western Blots mostraram que o anticorpo de L. acidophilus 5C14E
possui uma especificidade menor quando comparado aos outros dois e que o de maior
especificidade foi o de L. acidophilus 2G14E.
Esses resultados permitem futuros estudos para utilização dessas proteínas como
adjuvantes vacinais. Para isso, será preciso caracterizá-las quanto à modulação imunológica
por elas induzida.
42
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