ads:
CAROLINE MÜLLER
RESPOSTA FOTOSSINTÉTICA À TOXIDEZ DE FERRO EM
DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Fisiologia Vegetal,
para obtenção do título de Doctor
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2011
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
CAROLINE MÜLLER
RESPOSTA FOTOSSINTÉTICA À TOXIDEZ DE FERRO EM
DIFERENTES CULTIVARES DE ARROZ
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Fisiologia Vegetal,
para obtenção do título de Doctor
Scientiae
APROVADA: 29 de abril de 2011
______________________________ ______________________________
PhD. Décio Karam Prof. Eduardo Gusmão Pereira
______________________________ ______________________________
Prof. Marcelo Ehlers Loureiro Profª. Andréa Miyasaki de Almeida
(Co-orientadora)
____________________________
Prof. Marco Antonio Oliva Cano
(Orientador)
ads:
ii
Aos meus pais, ofereço.
Às minhas irmãs, dedico.
“[....] talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
Mas lutei para que o melhor fosse feito[....]
Não sou o que deveria ser,
Mas Graças a Deus, não sou o que era antes”.
Marthin Luther King
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus e minha família, mãe Genecy, pai Bernardo, irmãs Vanessa, Aline e
Evelyn e ao sobrinho Luca Rafael, pela grandiosa força concedida ao longo de mais
uma jornada.
Ao orientador professor Marco Antonio Oliva, às co-orientadoras, Andréa
Miyasaka e Kacilda Naomi Kuki e ao “co-orientador adotivo” Marcelo Ehlers
Loureiro pela orientação e comprometimento. Sou imensamente grata pela
oportunidade de trabalhar com essa equipe, por cada voto de confiança, incentivo e,
mas do que isso, pela amizade proporcionada!
Aos membros da banca, professor Eduardo Gusmão Pereira e pesquisador
Décio Karam pela disponibilidade e valiosas considerações.
Aos professores Cosme Damião Cruz e Júlio César Lima Neves pelos
preciosos ensinamentos em estatística multivariada.
Aos demais professores do programa de Fisiologia Vegetal pela
disponibilidade de equipamentos e auxílio direto ou indireto para o desenvolvimento
desta pesquisa. E aos funcionários do Departamento, em especial aos técnicos
Rogério Gomide, João, Carlos Raimundo, Reginaldo, Osvaldo, Zé Antonio e as
secretárias Cássia, Luciene, Francine e Ângelo, pelo constante auxílio,
disponibilidade e atenção.
À equipe do projeto Daniel, Laíse, Solange, Eduardo Pereira, Eduardo
Almeida e Advânio, que participaram efetivamente deste trabalho, pela infinita ajuda
e amizade.
Ao Thales, meu namorado, pelo companheirismo e incentivo em todos os
momentos.
Aos amigos conquistados em Viçosa, que fizeram desses quatro anos, anos
mais alegres.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos, e à Universidade Federal de
Viçosa, Departamento de Biologia Vegetal pela oportunidade oferecida.
iv
"Sonhe com o que você quiser. Vá para onde você queira ir.
Seja o que você quer ser, porque você possui apenas uma vida
e nela só temos uma chance de fazer aquilo que queremos.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce.
Dificuldades para fazê-la forte.
Tristeza para fazê-la humana.
E esperança suficiente para fazê-la feliz."
Clarice Lispector
v
BIOGRAFIA
Caroline Müller, filha de Genecy Maria Cerezer e Bernardo Leopoldo Müller, nasceu
em Toledo, Estado do Paraná, no dia 01 de novembro de 1982. Em fevereiro de
2005, graduou-se em Licenciatura Plena em Ciências Biológicas pela Universidade
Federal do Mato Grosso do Sul, campus de Dourados. Em março de 2007 obteve o
título de mestre em Fisiologia Vegetal pela Universidade Federal de Viçosa. No
mesmo ano iniciou o curso de doutorado pelo programa em Fisiologia Vegetal pela
Universidade Federal de Viçosa, concluído em abril de 2011.
vi
CONTEÚDO
RESUMO .................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................. x
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 5
OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 10
CAPÍTULO 1. ALTERAÇÕES MOLECULARES, ENZIMÁTICAS,
FOTOSSINTÉTICAS E ANATÔMICAS EM ARROZ CULTIVADO SOB
EXCESSO DE FERRO .............................................................................................. 11
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 12
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 15
2.1. Condições de cultivo e aplicação dos tratamentos .......................................... 15
2.2. Variáveis avaliadas .......................................................................................... 15
2.2.1. Composição mineral do material vegetal ................................................. 15
2.2.2. Determinação das trocas gasosas .............................................................. 16
2.2.3. Fluorescência e Imagem da fluorescência da clorofila a .......................... 16
2.2.4. Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real (qPCR) ........ 17
2.2.5. Atividade de enzimas antioxidativas ........................................................ 19
2.2.6. Caracterização Anatômica Foliar .............................................................. 20
2.3. Análise Estatística ........................................................................................... 20
3. RESULTADOS ...................................................................................................... 21
3.1. Teor de ferro, índice de translocação .............................................................. 21
3.2. Composição Mineral ....................................................................................... 22
3.3. Trocas gasosas ................................................................................................. 24
3.4. Fluorescência da clorofila a............................................................................. 26
3.5. Expressão gênica ............................................................................................. 30
3.6. Atividade de enzimas antioxidantes ................................................................ 32
3.7. Sintomas visuais e caracterização foliar da fitotoxidez ................................... 33
4. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 36
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 41
6. ANEXOS ............................................................................................................... 42
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 45
vii
CAPÍTULO 2. FOTOSSÍNTESE E FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a
COMO FERRAMENTAS DE SELEÇÃO DE CULTIVARES DE ARROZ
RESISTENTES AO FERRO ..................................................................................... 53
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 54
2. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 56
2.1. Condições de cultivo e Aplicação do tratamento ...................................... 56
2.2. Variáveis Analisadas ................................................................................. 56
2.2.1. Absorção do ferro e composição mineral do material vegetal .............. 56
2.2.2. Determinação das trocas gasosas .......................................................... 57
2.2.3. Avaliação carboxilativa e regeneração da RuBP .................................. 57
2.2.4. Determinação da fotorrespiração in vivo .............................................. 58
2.2.5. Fluorescência da clorofila a .................................................................. 59
2.2.6. Determinação do malonaldeído ............................................................ 59
2.2.7. Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real (qPCR) .... 60
2.3. Análise Estatística...................................................................................... 61
3. RESULTADOS .................................................................................................. 62
3.1. Teor de ferro nos tecidos ........................................................................... 62
3.2. Composição Mineral.................................................................................. 63
3.3. Parâmetros de Trocas gasosas e Fotorrespiração ...................................... 65
3.4. Parâmetros de Fluorescência da clorofila a ................................................. 68
3.6. Expressão gênica ....................................................................................... 70
4. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 74
5. CONCLUSÕES .................................................................................................. 80
6. ANEXOS ............................................................................................................ 81
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 85
CAPÍTULO 3. BASES FISIOLÓGICAS PARA A SELEÇÃO DE
CULTIVARES DE ARROZ TOLERANTES A TOXIDEZ POR FERRO .............. 94
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 95
2. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 97
2.1. Condições de cultivo e Aplicação do tratamento ........................................ 97
2.2. Variáveis avaliadas ...................................................................................... 97
2.2.1. Composição mineral do material vegetal .............................................. 97
viii
2.2.2. Determinação das trocas gasosas .......................................................... 98
2.2.3. Fluorescência da clorofila a .................................................................. 98
2.2.4. Determinações de pigmentos cloroplastídicos ...................................... 99
2.2.5. Determinação dos teores de malonaldeído ........................................... 99
2.3. Análise Estatística.................................................................................... 100
3. RESULTADOS ............................................................................................. 101
4. DISCUSSÃO ................................................................................................ 112
5. CONCLUSÕES ............................................................................................ 115
6. ANEXOS ...................................................................................................... 116
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 118
CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................ 124
ix
RESUMO
MÜLLER, Caroline. D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, abril de 2011. Resposta
fotossintética à toxidez de ferro em diferentes cultivares de arroz. Orientador:
Marco Antonio Oliva Cano. Co-orientadoras: Andréa Miyasaka de Almeida e
Kacilda Naomi Kuki.
O ferro é um nutriente essencial para as plantas. No entanto, a disponibilidade
deste elemento para as plantas varia com as condições do solo e sistema de cultivo.
Oryza sativa pode ser cultivado em dois sistemas distintos: irrigado e sequeiro. Em
solos inundados, devido as condições anaeróbicas e de baixo pH, o ferro pode ser
reduzido tornando-se altamente disponível. A absorção excessiva de ferro pode gerar
toxidez nas plantas de arroz ocasionando perda de produtividade. Desta forma, o
presente trabalho objetivou estabelecer uma relação entre os mecanismos
fotoquímicos, bioquímicos, moleculares e de dissipação de energia em diferentes
cultivares de arroz que permitam realizar uma seleção de cultivares tolerantes ao
ferro. A utilização de citrato férrico (Fe
+3
) resultou em maior translocação deste
metal para as folhas das plantas de arroz. No entanto, o ferro na forma reduzida
(Fe
+2
) apresentou maior toxidez. O excesso de Fe
+2
ocasionou reduções drásticas nas
taxas fotossintéticas em diferentes cultivares de arroz. A queda fotossintética foi
acompanhada pela redução na taxa de transporte de elétrons e aumento na dissipação
regulada de energia. Esses parâmetros apresentaram-se sensíveis ao excesso de Fe
+2
na solução nutritiva de cultivo. A redução na fotossíntese deveu-se a limitações na
fixação do carbono pelas plantas de arroz expostas ao excesso de ferro. Danos
decorrentes do estresse por Fe
+2
ocasionaram um reparo ineficiente da proteína D1
do fotossistema II, observado pela diminuição na expressão do gene OspsbA. As
plantas de arroz aumentaram a expressão do gene OsFER1 em uma tentativa de
minimizar o excesso de ferro nos componentes celulares. Além dos danos
fisiológicos, o excesso de ferro afetou a absorção e translocação de outros minerais,
reduzindo o teor de P e Mg nas folhas. Os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e
fluorescência da clorofila a mostraram-se sensíveis aos efeitos tóxicos do ferro.
x
ABSTRACT
MÜLLER, Caroline. D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, April, 2011.
Photosynthetic response to iron toxicity in different rice cultivars. Adviser:
Marco Antonio Oliva Cano. Co-advisers: Andréa Miyasaka de Almeida and Kacilda
Naomi Kuki.
Iron is an essential nutrient for plants. However, the availability of this element
to plants varies with soil conditions and crop system. Oryza sativa can be cultivated
on two different systems: irrigated lowland and upland. In flooded soils, due to
anaerobic conditions and low pH, the iron can be reduced becoming highly available.
Excessive absorption of iron may cause toxicity in rice plants leading to productivity
decrease. Thus, this study aims to establish a relationship among the photochemical,
biochemical and molecular mechanisms and energy dissipation system on different
rice genotypes allowing a selection of iron tolerant genotypes. The use of ferric
citrate (Fe
+3
) resulted in greater translocation of this metal to the leaves of rice plants.
However, the reduced iron (Fe
+2
) showed a higher toxicity. The excess of Fe
+2
caused drastic reductions on photosynthetic rates in different rice genotypes. The
photosynthetic decrease was accompanied by a reduction of electron transport rate
and an increase of regulated energy dissipation. These parameters were also
susceptible to excessive Fe
+2
in the nutrient solution. The reduction on
photosynthesis was due to limitations on carbon fixation by rice plants exposed to
excessive iron. The damage resulted from the Fe
+2
stress caused an inefficient repair
of photosystem II D1 protein, being observed by a decrease of OspsbA gene
expression. The rice plants increased OsFERl gene expression in an attempt to
minimize the iron overload in cellular components. Besides the physiological
damage, excessive iron affected the absorption and translocation of other minerals,
reducing the P and Mg levels in leaves. The physiological parameters of gas
exchange and chlorophyll fluorescence revealed a sensibility to the toxic effects of
iron.
1
INTRODUÇÃO GERAL
O ferro (Fe), nutriente essencial para as plantas, é requerido para processos
vitais desde respiração a fotossíntese, onde participa na transferência de elétrons
através de reações redox reversíveis, alternando entre Fe
+2
e Fe
+3
(Kim e Guerinot,
2007). Várias etapas do metabolismo de pigmentos fotossintéticos são dependentes
de ferro (Briat et al., 2007). No entanto, o Fe absorvido em excesso induz alterações
nos mecanismos fotossintéticos (Spiller e Terry, 1980; Becana et al., 1998; Fang et
al., 2001; Souza-Santos et al., 2001; Briat et al., 2007) podendo afetar a produção de
cultivares de arroz (Sahrawat, 2005; Fageria et al., 2008; Olaleye et al., 2001, 2009;
Audebert e Fofana, 2009).
O Fe apresenta-se no solo aerado em sua forma oxidada (trivalente, Fe
+3
), a
qual é pouco disponível para as plantas (Ponnamperuma, 1972). Desta forma, com a
escassez de ferro em solos bem aerados, as plantas desenvolveram duas diferentes
estratégias para absorção, transporte e armazenamento deste elemento (Bughio et al.,
2002; Ishimaru et al., 2006).
A estratégia I baseia-se na redução do ferro em sua forma férrica (Fe
+3
) para
ferrosa (Fe
+2
). Inicialmente ocorre uma extrusão de prótons por ATPases presentes
nas células epidérmicas radiculares (Hell e Stephan, 2003; Schmidt, 2003). A
acidificação do meio aumenta a solubilidade do ferro na rizosfera e consequente
redução do Fe
+3
oxidado para a forma solúvel Fe
+2
(Kim e Guerinot, 2007), através
de enzimas ferro quelato redutase codificadas pelo gene FRO2 (Ferric Reductase
Oxidase) (Jeong e Connolly, 2009). Após a redução, o ferro é transportado para o
interior da célula por proteínas específicas IRT1 (Iron Regulated Transporter) (Eide
et al., 1996; Robinson et al., 1999; Guerinot, 2000; Varrotto et al., 2002).
Gramíneas em geral utilizam a estratégia II, baseada na quelação do ferro.
Essas plantas liberam compostos conhecidos como fitosideróforos (FS), da família
dos ácidos muginêicos. Os FS são sintetizados da L-metionina via nicotianamina
(NA), pela ação das enzimas sintase da nicotianamina (NAS) e transferase da
nicotianamina (NAAT) (Shojima et al., 1990; Ma et al., 1995; Higuchi et al., 1999;
Mori, 1999; Curie e Briat, 2003; Inoue et al., 2003; DiDonato Jr et al., 2004; Gendre
et al., 2006; Wu et al., 2011). Os FS possuem alta afinidade por Fe
+3
e se ligam
eficientemente ao ferro trivalente na rizosfera. Complexos Fe
+3
-FS são então
2
transportados para as raízes das plantas por proteínas transportadoras específicas
(Curie et al., 2001; Kim e Guerinot, 2007), codificadas por genes da família YSL
(Yellow Stripe Like) (Koike et al., 2004; Inoue et al., 2009). Os tecidos senescentes
também são capazes de remobilizar o ferro para toda a planta via floema (Takahashi,
2003; Takahashi et al., 2003), sugerindo uma provável participação no transporte
intra e intercelular de metais em espécies tanto da estratégia I como da II (Kim e
Guerinot, 2007). Foram identificados seis genes NAAT (Inoue et al., 2008) e três
genes NAS, dentre os quais apenas OsNAS1 e OsNAS2 são expressos nas raízes de
arroz (Inoue et al., 2003). Em arroz sob deficiência de Fe, a expressão dos genes
OsNAS foi observada, ainda, em células que atuam no transporte do mineral à longa
distância, evidenciando o papel de NAS e NA na remobilização do metal na planta
(Inoue et al., 2003).
Uma vez absorvido pelas raízes, o ferro é carregado no xilema e translocado
até a parte aérea através do fluxo transpiratório (Curie e Briat, 2003). O ferro
apresenta-se oxidado quando liberado nos vasos do xilema, sendo transportado na
forma de complexos com ácidos orgânicos, especialmente citrato, que é o principal
quelante de metais no xilema (Curie e Briat, 2003). A absorção de ferro pelas células
do mesofilo também requer uma etapa de redução, após a liberação do íon férrico
pela molécula de citrato, sugerindo a existência de um transportador especifico de
Fe
2+
localizado na plasmalema das células foliares. O doador de elétrons para a
redução do ferro é o NADPH, e esse processo parece ser fortemente induzido pelo
aumento na relação NADPH/NADP
+
resultante da etapa fotoquímica da fotossíntese
(Bruggemann et al., 1993). Uma vez no mesofilo, o ferro pode ser armazenado nos
vacúolos ou imobilizado pela proteína ferritina (Briat et al., 1995; 2010), a qual
ocorre principalmente nos plastídeos (Zancani et al., 2004).
O excesso de ferro na parte aérea pode ocasionar fitotoxicidade e provocar
manchas necróticas nas folhas, escurecimento das raízes e inibição do crescimento da
planta (Dobermann e Fairhurst, 2000), desbalanço catiônico, ocasionando desordem
nutricional (Snowden e Wheeler, 1995). Dentre os nutrientes essenciais, a
diminuição na absorção de P, K, Ca e Mg tem sido relatada para cultivares de arroz
sensíveis ao excesso de Fe (Silveira et al., 2007). Alguns nutrientes ainda, como o P,
são co-regulados pelo Fe (Zheng et al., 2009), podendo apresentar alteração na
expressão de genes específicos de P, como OsPI1 (Oryza sativa Phosphate-limitation
3
inducible gene 1) (Wasaki et al., 2003) e OsPTF1 (Oryza sativa Pi starvation
induced transcription factor 1) (Yi et al., 2005).
A toxidez por ferro, ainda, potencializa o estresse oxidativo, com aumento na
produção de espécies reativas de oxigênio, como peróxido de hidrogênio, superóxido
e radical hidroxila, este último considerado de maior toxidez para a célula (Becana et
al., 1998; Fang et al., 2001; Souza-Santos et al., 2001). Têm se observado que Beta
vulgaris sob toxidez por ferro apresentou alterações na estrutura do cloroplasto,
reduzindo o número de grana e lamela estromal por cloroplasto e de tilacóides por
grana e ainda o número de moléculas de P
700
e citocromo f por unidade de área
(Spiller e Terry, 1980). A desestruturação de pigmentos dos complexos
fotossintéticos promove, por sua vez, alteração no transporte de elétrons,
ocasionando redução na taxa de assimilação líquida de CO
2
e, com isso, perda da
capacidade de fixação de carbono nos cloroplastos (Terry, 1980; Taylor et al., 1982;
Scandalios, 1993; Desimone et al., 1996; Mishra e Dubey, 2005).
Para sustentar o crescimento e evitar a toxicidade do ferro celular, as plantas
dependem da capacidade de armazenar e remobilizar o ferro (Briat et al., 2007). Em
arroz é relatada a ocorrência de duas proteínas da classe das ferritinas, FER1 e FER2
(Gross et al., 2003). A ferritina atua como mecanismo fortemente envolvido na
tolerância a esse metal (Majerus et al., 2007) por incorporar o Fe em sua estrutura
minimizando, assim, a sua reatividade (Briat e Lobréaux, 1997; Majerus et al.,
2009).
O arroz (Oryza sativa L.) pode ser cultivado em diferentes sistemas de cultivo:
sequeiro, várzea úmida e irrigado. No cultivo de sequeiro a semeadura é feita em
solo seco e seu desenvolvimento e produtividade ficam condicionados às condições
climáticas. O cultivo em várzea é realizado em solos de várzea úmida drenadas
parcialmente, caracterizado pela umidade do solo na zona do sistema radicular das
plantas e, em períodos de chuva, o terreno pode ficar temporariamente alagado.
O cultivo de arroz irrigado, por sua vez, requer lâmina d’água permanente durante a
fase vegetativa até a fase de maturação fisiológica (Dobermann e Fairhurst, 2000).
Este terceiro sistema de cultivo corresponde à maior parte da área plantada no mundo
e contribui com 75% da produção mundial de grãos de arroz (Azambuja et al., 2004).
Durante o alagamento do solo, a difusão do oxigênio atmosférico para o solo é
limitada, predispondo o ambiente à hipóxia. Além disso, o oxigênio molecular
4
dissolvido na água é consumido pelos microorganismos aeróbicos que, com o tempo
são substituídos pelos anaeróbios, resultando num ambiente de acúmulo de CO
2
(Sousa et al., 2004; Grotz e Guerinot, 2006). Estes fatores contribuem para a
diminuição do pH favorecendo redução de metais originalmente oxidados – como o
ferro (Fe
3+
→ Fe
2+
), disponibilizando-os em altas concentrações para as plantas, o
que pode configurar uma situação potencialmente tóxica (Ponnamperuma, 1972;
Becana et al., 1998; Becker e Asch, 2005; Sahrawat, 2005; Audebert e Fofana,
2009).
A toxidez por ferro é uma dos mais importantes estresses abióticos que limitam
a produção de arroz em cultivo irrigado (Dobermann e Fairhurst, 2000). Assim, a
resistência ao excesso de Fe em plantas de arroz pode ser uma conseqüência de
evasão de Fe e/ou tolerância a altas concentrações de Fe interno. Diversos cultivares
variam amplamente em sua capacidade de responder ao excesso de Fe. Com isso,
tem sido sugerido que a manutenção dos níveis de nutrientes essenciais (Luo et al.,
1997), das taxas fotossintéticas, e, principalmente o controle da expressão gênica
(Sousa et al., 2004), em condições de excesso de Fe, contribui para caracterizar
fenótipos tolerantes.
5
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Audebert, A.; Fofana, M. (2009) Rice Yield Gap due to Iron Toxicity in West Africa.
Journal of Agronomy & Crop Science 195: 66-76
Azambuja, I.H.V.; Venetti Jr., F.J.; Magalhães Jr., A.M. (2004) Aspectos
socioeconômicos da produção de arroz. In: Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.)
Arroz Irrigado no Sul do Brasil: Empraba Informação Tecnológica. p. 23-44
Becana, M.; Moran, J.F.; Iturbe-Ormaetxe, I. (1998) Iron-dependent oxygen free
radical generation in plants subjected to environmental stress: toxicity and
antioxidant protection. Plant and Soil 201: 137-147
Becker, M.; Asch, F. (2005) Iron toxicity in rice - conditions and management
concepts. Journal of Plant Nutrition Soil Science 168: 558-573
Briat J.-F.; Fobis-Loisy, I.; Grignon, N.; Lobreaux, S.; Pascall, N.; Savino, G.;
Thoiron, S.; Von Wiren, N.; Wuytswinkel, O. (1995) Cellular and molecular aspects
of iron metabolism in plants. Biol. Cell 84:69-81.
Briat, J.-F.; Curie, C.; Gaumard, F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants.
Current Opinion in Plant Biology 10: 276–282
Briat, J.-F.; Duc, C.; Ravet, K., Gaymard, F. (2010) Ferritins and iron storage in
plants. Biochimica et Biophysica Acta 1800: 806-814
Briat, J.-F.; Lobréaux, S. (1997) Iron Transport and storage in plants. Trends in
Plant 2: 187-193
Bruggemann, W.; Maass-Kantel, K.; Moog, P. R. (1993) Iron uptake by leaf
mesophyll cells: the role of the plasma membrane bound ferric-chelate reductase.
Planta 190:151-155
Bughio, N.; Yamaguchi, H.; Nishizawa, N.K.; Nakanishi, H.; Mori, S. (2002)
Cloning an iron regulated metal transporter from rice. Journal of Experimental
Botany 53: 1677-1682
Curie, C.; Briat, J.F. (2003) Iron transport and signaling in plants. Annual Review of
Plant Biology 54: 183-206
Curie, C.; Panaviene, Z.; Loulergue, C.; Dellaporta, S.L.; Briat, J.-F.; Walker, E.L.
(2001) Maize yellow stripe1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III)
uptake. Nature 409: 346-349
Desimone, M.; Henke, A.; Wagner, E. (1996) Oxidative stress induces partial
degradation of the harge subunit of Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase
in isolated chloroplasts of barley. Plant Physiology 111: 789-796
DiDonato Jr, R.J.; Roberts, L.A.; Sanderson, T.; Eisley, R.B.; Walker. E.L. (2004)
Arabidopsis Yellow Stripe-Like2 (YSL2): a metal-regulated gene encoding a plasma
membrane transporter of nicotianamine–metal complexes. The Plant Journal 39:
403-414
6
Dobermann, A.; Fairhurst, T. (2000) Toxicidad de hierro en arroz. In: Dobermann,
A.; Fairhurst, T. (Eds.). Rice: nutrient disorders & nutrient management. Potash
and Phosphate Institute and International Rice Research Institute. p. 1-4
Eide, D.; Broderius, M.; Fett, J.P.; Guerinot, M.L. (1996) A novel iron-regulated
metal transporter from plants identified by functional expression in yeast.
Proceeding of the National Academy Science 93: 5624-5628
Fageria, N.K.; Santos, A.B.; Barbosa Filho, M.P.; Guimarães, C.M. (2008) Iron
toxicity in lowland rice. Journal of Plant Nutrition 31: 1676-1697
Fang, W.; Wang, J.; Lin, C.; Kao, C. (2001) Iron induction of lipid peroxidation and
effects on antioxidative enzyme activities in rice leaves. Plant Growth Regulation
35: 75-80
Gendre, D.; Czernic, P.; Conéjéro, G.; Pianelli, K.; Briat, J.-F.; Lebrun, M.; Mari, S.
(2006) TcYSL3, a member of the YSL gene family from the hyperaccumulator
Thlaspi caerulescens, encodes a nicotianamine- Ni/Fe transporter. The Plant
Journal 49: 1-15
Gross, J.; Stein, R.J.; Fett-Neto, A.G.; Fett, J.P. (2003) Iron homeostasis related
genes in rice. Genetics and Molecular Biology 26: 477-497
Grotz, N.; Guerinot, M.L. (2006) Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in
plants. Biochimica et Biophysica Acta 1763 :595-608
Guerinot, M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Biochimica et
Biophysica Acta 1465: 190-198
Hell, R.; Stephan, U.W. (2003) Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants.
Planta 216: 541-551
Higuchi, K.; Suzuki, K.; Nakanishi, H.; Yamagushi, H.; Nishisawa, N.K.; Mori, S.
(1999) Cloning of nicotianamine synthase genes, novel genes involved in the
biosynthesis of phytosiderophores. Plant Physiology 119: 471-479
Inoue, H.; Higuchi, K.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa, N.K.
(2003) Three rice nicotianamine synthase genes, OsNAS1, OsNAS2, and OsNAS3 are
expressed in cells involved in long-distance transport of iron and differentially
regulated by iron. The Plant Journal 36: 366-381
Inoue, H.; Kobayashi, T.; Nozoye, T.; Takahashi, M.; Kakei, Y.; Suzuki, K.;
Nakazono, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa, N.K. (2009) Rice OsYSL15 Is an
Iron-regulated Iron(III)-Deoxymugineic Acid Transporter Expressed in the Roots
and Is Essential for Iron Uptake in Early Growth of the Seedlings. The Journal of
Biological Chemistry 284: 3470-3479
Inoue, H.; Takahashi, M.; Kobayashi, T.; Suzuki, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.;
Nishizawa, N.K. (2008) Identification and localisation of the rice nicotianamine
aminotransferase gene OsNAAT1 expression suggests the site of phytosiderophore
synthesis in rice. Plant Molecular Biology 66: 193-203
Ishimaru, Y.; Suzuki, M.; Tsukamoto, T.; Suzuki, K.; Nakazono, M.; Kobayashi, T.;
Wada, Y.; Watanabe, S.; Matsuhashi, S.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.;
7
Nishizawa, N.K. (2006) Rice plants take up iron as an Fe
3+
-phytosiderophore and as
Fe
2+
. The Plant Journal 45: 335-346
Jeong, J.; Connolly, E.L. (2009) Iron uptake mechanisms in plants: Functions of the
FRO family of ferric reductases. Plant Science 176: 709-714
Kim, S.A.; Guerinot, M.L. (2007) Mining iron: Iron uptake and transport in plants.
FEBS Letters 581: 2273-2280
Koike, S.; Ionue, H.; Mizuno, D.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.;
Nishizawa, N.K. (2004) OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is
regulated by iron and expressed in the phloem. The Plant Journal 39: 415-424
Luo, A.; Jing, G.; Ni, J.; Jiang, S.; Zhang, Y. (1997) Rice genotype differences in
nutrient status under excessive ferric-iron conditions. Journal of Plant Nutrition 20:
1361-1373
Ma, J.F.; Shinada, T.; Matsuda, C.; Nomoto, K. (1995) Biosynthesis of
phytosiderophores, mugineic acids, assiciated with methionine cycling. The Journal
of Biological Chemistry 270:16549-165554
Majerus, V.; Bertin, P.; Lutts, S. (2009) Abscisic acid and oxidative stress
implications in overall ferritin synthesis by African rice (Oryza glaberrima Steud.)
seedlings exposed to short term iron toxicity. Plant Soil 324: 253-265
Majerus, V.; Bertin, P.; Swenden, V.; Fortemps, A.; Lobréaux, S.; Lutts, S. (2007)
Organ-dependent responses of the African rice to short-term iron toxicity: ferritin
regulation and antioxidative responses. Biologia Plantarum 51: 303-312
Mishra, S.; Dubey, R.S. (2005) Heavy metal toxicity induced alterations in
photosynthetic metabolism in plants. Cap 45. In: Pessarakli. M. (ed.) Handbook of
Photosynthesis. 2 ed. 862 p.
Mori, S. (1999) Iron acquisition by plants. Current Opinion in Plant Biology 2:
250-253
Olaleye, A.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Odeleye, F.O. Dada, O.A.; Senjobi,
B.A. (2009) Elemental Composition of Two Rice Cultivars under Potentially Toxic
on Aquept and Aquent. Notulae Scientia Biologicae 1: 46-49
Olaleye, A.O.; Tabi, F.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Sahrawat, K.L. (2001)
Effect of toxic iron concentrations on the growth of lowlands rice. Journal of Plant
Nutrition 24: 441-457
Ponnamperuma, F.N. (1972) The chemical of submerged soils. Advances in
Agronomy 24: 29-96
Robinson, N.J.; Proctor, C.M.; Connolly, E.L.; Guerinot, M.L. (1999) A ferric
chelate reductase for iron uptake from soils. Nature 397: 694-697
Sahrawat, K.L. (2005) Managing iron toxicity in lowland rice: the role of tolerant
genotypes and plant nutrients., In: Toriyama, K.; Heong, K.L.; Hardy, B. (Eds.).
Rice is life: scientific perspectives for the 21st century: Proceedings of the World
Rice Research Conference. Tsukuba, Japan. pp. 452-454
8
Scandalios, J.G. (1993) Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology
101: 7-12
Schmidt, W. (2003) Iron solutions: acquisition strategies and signaling pathways in
plants. Trends in Plant Science. 8: 188-193
Shojima, S.; Nishizawa, N.K.; Tushiya, S.; Nozoe, S.; Trifune, T.; Mori, S. (1990)
Biosynthesis of phytosiderophores In vitro byiosynthesis of 2”-deoxymugineic acid
from l-methionine and nicotianamine Plant Physiology 93:1497-1503
Silveira, V.C.; Oliveira, A.P.; Sperotto, R.A.; Amaral, L.; Dias, J.F.; Cunha, J.B.;
Fett, J.P. (2007) Influence of iron on mineral status of two rice (Oryza sativa L.)
cultivars. Brazilian Journal of Plant Physiology 19: 127-139
Snowden, R.; Wheeler, B.D. (1995) Chemical changes in selected wetland plant
species with increasing Fe supply, with specific reference to root precipitates and Fe
tolerance. New Phytologist 131: 503-520
Sousa, R.O.; Gomes, A.S.; Vahl, L.C. (2004) Toxidez por ferro em arroz irrigado.
In: Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.) Arroz Irrigado no Sul do Brasil: Empraba
Informação Tecnológica. p. 305-337
Souza-Santos, P.; Ramos, R.S.; Ferreira, S.T.; Carvalho-Alves, P.C. (2001) Iron
induced oxidative damage of corn root plasma membrane H
+
-ATPase. Biochimica et
Biophysica Acta 1512: 357-366
Spiller, S.; Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. II. Iron stress
diminishes photochemical capacity by reducing the number of photosynthetic units.
Plant Physiology 65: 121-125
Takahashi, M. (2003) Overcoming Fe deficiency by a transgenic approach in rice.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72: 211-220
Takahashi, M.; Terada, Y.; Nakai, I.; Nakanishi, H.; Yoshimura, E.; Mori, S.;
Nishizawa, N. (2003) Role of nicotianamine in the intracellular delivery of metals
and plant reproductive development. Plant Cell 15: 1263-1280
Taylor, S.E.; Terry, N.; Huston, R.P. (1982) Limiting Factors in Photosynthesis. III.
Effects of iron nutrition on the activities of three regulatory enzymes of
photosynthetic carbon metabolism. Plant Physiology 70: 1541-1543
Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. I. Use of iron stress to control
photochemical capacity in vivo. Plant Physiology 65: 114-120
Varotto, C.; Maiwald, D.; Pesaresi, P.; Jahns, P.; Salamini, F.; Leister, D. (2002) The
metal ion transporter IRT1 is necessary for iron homeostasis and efficient
photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 31: 589-599
Wasaki, J.; Yonetani, R.; Shinano, T.; Kai, M.; Osaki, M. (2003) Expression of the
OsPI1 gene, cloned from rice roots using cDNA microarray, rapidly responds to
phosphorus status. New Phytologist 158: 239-248
Wu, J.; Wang, C.; Zheng, L.; Wang, L.; Chen, Y.; Whelan, J.; Shou, H. (2011)
Ethylene is involved in the regulation of iron homeostasis by regulating the
expression of iron-acquisition-related genes in Oryza sativa. Journal of
Experimental Botany 62(2): 667-74
9
Yi, K.; Wu, Z.; Zhou, J.; Du, L.; Guo, L.; Wu, Y.; Wu, P. (2005) OsPTF1, a novel
transcription factor involved in tolerance to phosphate starvation in rice. Plant
Physiology 138: 2087-2096
Zancani, M.; Peresson, C.; Biroccio, A.; Federici, G.; Urbani, A.; Murgia, I.; Soave,
C.; Micali, F.; Vianello, A.; Macri, F. (2004) Evidence for the presence of ferritin in
plant mitochondria. European Journal of Biochemistry 271: 3657-3664
Zheng, L.; Huang, F.; Narsai, R.; Wu, J.; Giraud, E.; He, F.; Cheng, L.; Wang, F.;
Wu, P.; Whelan, J.; Shou, H. (2009) Physiological and transcriptome analysis of iron
and phosphorus interaction in rice seedlings. Plant Physiology 151: 262-274
10
OBJETIVO GERAL
Estabelecer uma relação entre os mecanismos fotoquímicos, bioquímicos,
moleculares e de dissipação de energia em diferentes cultivares de arroz que
permitam realizar uma seleção de cultivares tolerantes ao ferro.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar os efeitos de diferentes fontes de Fe sobre a fotossíntese
2. Caracterizar anatomicamente os efeitos de níveis tóxicos do ferro
3. Verificar a ação do ferro em níveis tóxicos sobre a absorção e acúmulo de
nutrientes
4. Analisar a expressão diferencial de genes envolvidos na absorção, transporte e
homeostase do ferro.
5. Verificar, através de parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares, uma
possível tolerância à níveis tóxicos de ferro, em cultivares de arroz de diferentes
procedências
6. Realizar uma seleção de cultivares possivelmente tolerantes ao ferro, a partir da
avaliação de parâmetros fisiológicos analisados de forma univariada e
multivariada.
11
CAPÍTULO 1
ALTERAÇÕES MOLECULARES, ENZIMÁTICAS, FOTOSSINTÉTICAS E
ANATÔMICAS EM ARROZ CULTIVADO SOB EXCESSO DE FERRO
12
1. INTRODUÇÃO
O ferro (Fe) é um micronutriente essencial para as plantas, compondo enzimas
envolvidas em reações redox importantes para a fotossíntese e respiração (Gross et
al., 2003). A disponibilidade desse metal no ambiente, no entanto, está associada ao
seu conteúdo no solo, pH, conteúdo de água e de substâncias orgânicas, bem como a
associação simbiótica com o sistema radicular (Sousa et al., 2004; Grotz e Guerinot,
2006). Sob condições excessivas Fe, em solos irrigados (Ponnamperuma, 1972),
ocorre aumento da disponibilidade deste elemento para as plantas podendo chegar a
níveis tóxicos (Fang et al., 2001; Sahrawat, 2005), os quais induzem alterações nos
mecanismos fisiológicos (Spiller e Terry, 1980; Fang et al., 2001; Souza-Santos et
al., 2001; Briat et al., 2007) podendo levar à perda de produtividade (Sahrawat,
2005; Fageria et al., 2008; Olaleye et al., 2001, 2009; Audebert e Fofana, 2009).
A ocorrência natural do ferro no solo é sob a forma de óxidos trivalentes
(Fe(OH)
3
) insolúveis e indisponíveis como micronutrientes para as plantas. No
entanto, de acordo com a disponibilidade de água no solo, o Fe
+3
pode ser reduzido a
Fe
+2
, tornando este metal solúvel e disponível para as plantas. O Fe
+2
pode ser
absorvido por transportadores específicos de Fe (Eide et al., 1996; Robinson et al.,
1999; Guerinot, 2000, Varrotto et al., 2002; Schmidt, 2003; Kim e Guerinot, 2007;
Jeong e Connolly, 2009). Os íons Fe
3+
, no entanto, precisam ser quelados à
fitosideróforos liberados pelas raízes (Shojima et al., 1990; Ma et al., 1995; Mori,
1999) para permitir absorção do metal (Curie et al., 2001; Koike et al., 2004, Kim e
Guerinot, 2007; Inoue et al., 2009). Para evitar a deficiência de Fe em solos aerados,
as plantas de arroz desenvolveram estratégias que permitem aborção de Fe em ambas
as formas divalente (Fe
+2
) e trivalente (F3
+3
) (Bughio et al., 2002; Ishimaru et al.,
2006). Isso ocorre uma vez que o cultivo de Oryza sativa pode ser conduzido em
sistemas distintos: sob alagamento constante, na ausência de alagamento, ou em
períodos parciais de retenção de água no solo (Azambuja et al., 2004). Em solos
inundados, devido as condições anaeróbicas e de baixo pH, o ferro, inicialmente em
sua forma trivalente (Fe
3+
), pode ser reduzido a sua forma divalente (Fe
2+
),
altamente disponível (Becana et al., 1998; Sahrawat, 2005).
O ferro, na planta, por sua vez é complexado, no xilema, com ácidos orgânicos
como o citrato (Cataldo et al., 1988) e translocado até a parte aérea através do fluxo
13
transpiratório (Curie e Briat, 2003). Os complexos Fe
+3
-citrato são, então, reduzidos
nas plasmalemas, pelas enzimas ferro redutase oxidase, disponibilizando Fe
+2
nas
células do mesófilo, e liberando o quelante (Bruggemann et al., 1993). O complexo
Fe-citrato atua ainda na distribuição do Fe na planta, pelo floema (Curie e Briat,
2003; Hell e Stephan, 2003).
O excesso de ferro no ambiente de cultivo promove desordens nutricionais
(Ottow et al., 1983, Genon et al., 1994; Snowden e Wheeler, 1995; Olaleye et al.,
2001, 2009; Silveira et al., 2007; Audebert e Fofana, 2009) que podem desfavorecer
o equilíbrio fisiológico das plantas. Dentre os nutrientes essenciais, a diminuição na
absorção de K, Ca e Mg tem sido relatada para cultivares de arroz sensíveis ao
excesso de Fe (Silveira et al., 2007), possivelmente como efeito da inibição da
absorção de cátions pelo Fe (Sousa et al., 2004). A toxidez pelo ferro é descrita em
plantas de arroz em dosagens superiores a 300 mg kg
-1
MS, podendo provocar
manchas necróticas nas folhas, escurecimento das raízes e inibição do crescimento da
planta (Dobermann e Fairhurst, 2000).
O excesso de ferro na planta pode propiciar a potencialização do estresse
oxidativo, com aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (Vansuyt et
al., 1997; Becana et al., 1998; Fang et al., 2001; Souza-Santos et al., 2001). O
estresse oxidativo pode desencadear danos nos componentes fotossintéticos (Spiller e
Terry, 1980; Gallego et al., 1996; Sinha et al., 1997; Vansuyt et al., 1997; Suh et al.,
2002; Lupinková e Komenda, 2004; Sinha e Saxena, 2006; Nenova, 2009), com
conseqüente redução na taxa fotossintética (Terry, 1980; Mishra e Dubey, 2005;
Pereira et al., 2008; Pereira, 2009). Alterações anatômicas, como ruptura das células
radicular e desestruturação nos componentes celulares ainda são descritas como
resultados da toxidez por ferro (Taylor et al., 1984; Sahrawat, 2005; Chen et al.,
2006).
Como mecanismo de exclusão de Fe pelas raízes, tem sido descrito a formação
da placa de ferro nas raízes de plantas de arroz, a qual é capaz de limitar a absorção
de minerais, como o próprio ferro (Howeler, 1973; Snowden e Wheeler, 1995; Batty
et al., 2000; Hose et al., 2001; Doran et al., 2006; Liu et al., 2009).
Mecanismos de proteção contra a toxidez por ferro no interior das plantas
podem envolver mecanismos enzimáticos (Fang et al., 2001) e não-enzimáticos
(Vansuyt et al., 1997). Como mecanismos enzimáticos têm se observado o aumento
14
na atividade das enzimas antioxidantes como a dismutase do superóxido, catalase e
peroxidase do ascorbato, as quais atuam na eliminação de espécies reativas de
oxigênio (EROs) (Becana et al., 1998). Compostos orgânicos como a glutationa
reduzida, α- tocoferóis, ácido ascórbico (Jaleel, 2009), carotenóides (Edge et al.,
1997; Krinsky e Yeum, 2003; Smirnoff, 2005; Polyakov et al., 2001), dentre outros,
compõem o sistema não enzimático para a neutralização de EROs. Além desses
fatores, a compartimentalização em organelas e/ou proteínas específicas é uma etapa
importante no metabolismo dos minerais. O armazenamento do Fe pode ocorrer no
apoplasto, vacúolos, plastídeos e em proteína especializada denominada ferritina
(Murgia et al., 2002; Curie e Briat, 2003; Briat et al., 1995; 2007; 2010), a qual atua
na manutenção da homeostase de ferro nas células, como observado em plantas de
arroz expostas ao excesso desse metal (Majerus et al., 2009).
Diante do excesso de ferro no meio, as plantas utilizam diferentes estratégias
para manutenção do metabolismo e crescimento. Deste modo, a resposta diferencial
de dois cultivares de arroz, irrigado e sequeiro, e a sensibilidade desses cultivares à
diferentes fontes de ferro foi analisada. Para tal, o objetivo do trabalho foi avaliar a o
efeito de diferentes fontes de Fe sobre a fotossíntese; caracterizar anatomicamente os
efeitos de níveis tóxicos do ferro; verificar a ação do ferro em níveis tóxicos sobre a
absorção e acúmulo de nutrientes e analisar a expressão diferencial de genes
envolvidos na absorção, transporte e homeostase do ferro.
15
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Condições de cultivo e aplicação dos tratamentos
Sementes de arroz (Oryza sativa L.), cultivares BR-IRGA 409 (híbrido das
linhagens IR 930-2/IR 665-31-2-4) (Cordeiro e Medeiros, 2008) e Canastra (CT
7415-6-5-1-2-B) (Soares et al., 1997), foram desinfestadas com hipoclorito de sódio
comercial (10%) por 10 min e germinadas em câmara de crescimento (27±2ºC) por 7
dias no escuro e 7 dias com fotoperíodo de 12 h. As plântulas foram transferidas para
solução nutritiva de Hoagland (pH 4,0, força total) em mantidas em casa-de-
vegetação. O pH foi ajustado a cada dois dias com KOH e HCl e a solução renovada
semanalmente.
Após aproximadamente trinta dias, as plantas, no estádio V5 de
desenvolvimento fenológico (Counce et al., 2000), foram tratadas com sulfato
ferroso (FeSO
4
, 7 mM) com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (p/p), cloreto
férrico (FeCl
3
-EDTA, 7 mM) e citrato de ferro III (7 mM), concentração previamente
definida (Pereira, 2009). Foi realizado em paralelo um tratamento controle em
solução nutritiva com concentrações fisiológicas de ferro (0,019 mM). Cada
tratamento foi constituído por quatro repetições, sendo o pH ajustado diariamente a
4,0 e a solução renovada a cada 4 dias. As avaliações foram realizadas após sete dias
de exposição ao excesso de ferro.
2.2. Variáveis avaliadas
2.2.1. Composição mineral do material vegetal
Para a quantificação do teor de nutrientes nas folhas e raízes, amostras do
material a fresco foram secas e moídas em moinho tipo Wiley. Para eliminar
qualquer interferência na quantificação de nutrientes na matéria seca das raízes, estas
foram previamente lavadas em solução contendo 3 % de ditionito de sódio (p/v), 0,3
M de citrato de sódio e 1,0 M bicarbonato de sódio (Taylor e Crowder, 1983).
O material vegetal moído foi digerido em 1,5 mL de HNO
3
(Fisher Trace
Metal grade) concentrado, à 118 ºC por 4 horas e em seguida diluídas em 16 mL de
água analisado por Thermo Elemental PQ Excell ICP-MS. A análise da composição
mineral foi realizada utilizando a técnica de espectrometria de massas com fonte de
plasma indutivamente acoplado (ICP-MS), de acordo com Lahner et al. (2003). O
16
teor dos minerais (mg kg
-1
) determinados foram: magnésio (Mg), fósforo (P), enxofre
(S), potássio (K), sódio (Na), cálcio (Ca); ferro (Fe), boro (B), cobalto (Co),
manganês (Mn), molibdênio (Mo), níquel (Ni), cobre (Cu), zinco (Zn) e alguns
elementos traços como arsênio (As), cádmio (Cd), estrôncio (Sr) e rubídio (Rb).
A partir dos teores de ferro obtidos, calculou-se o acúmulo de Fe nas raízes
(AR) (Liu et al., 2008) e na parte aérea (AP) (Abichequer e Bohen, 1998) pela razão
entre o conteúdo de ferro na parte aérea (CPA) ou nas raízes (CSR) pelo teor de ferro
na planta inteira, como sendo:
AR (%) = [CSR / (CPA + CSR)] * 100
AP (%) = [CPA / (CPA+CSR)] * 100
2.2.2. Determinação das trocas gasosas
As medições de trocas gasosas foram realizadas em folhas completamente
expandidas. As variáveis, taxa de assimilação fotossintética líquida (A), condutância
estomática (g
s
), taxa de transpiração (E) e a razão entre concentração interna e
externa de CO
2
(C
i
/C
a
) foram determinadas por um analisador de gás por
infravermelho (IRGA; modelo portátil LI-6400xt, LI-COR Biosciences Inc., Lincon,
Nebraska, USA). As medições foram realizadas entre 8:00 e 11:30 a.m., em casa-de-
vegetação, utilizando radiação fotossinteticamente ativa (PAR) constante (1000 μmol
fótons m
-2
s
-1
), concentração atmosférica de CO
2
(C
a
) (~ 392 μmol mol
-1
), e
temperatura (24 - 28 ºC) e umidade (53 - 66 %) ambiente.
A inibição da fotossíntese em relação à concentração de Fe nas folhas foi
avaliada ainda em um segundo experimento, montado nas mesmas condições
descritas no item 2.1. A coleta do material vegetal para quantificação do ferro (ver
item 2.2.1) foi realizada logo após as medições da assimilação líquida de CO
2
(A),
entre as 8:00 e 11:30 a.m. nas plantas de arroz expostas, ao longo dos sete dias, às
diferentes fontes de Fe. A partir dos dados obtidos, curvas de regressão exponencial
(y = a
-b.x
) foram construídas a partir da taxa fotossintética e o teor de ferro nas folhas
das plantas de arroz.
2.2.3. Fluorescência da clorofila a e Imagem da fluorescência da clorofila a
As variáveis de fluorescência da clorofila a foram obtidas com auxílio do
IRGA (LI-6400xt, LI-COR) na mesma área da folha em que foram realizadas as
17
medições das trocas gasosas. Para obtenção das imagens da fluorescência da clorofila
a foi utilizado o fluorômetro modulado Imaging-PAM (Heinz Walz, Effeltrich,
Germany). Os sinais de fluorescência em todos os pontos da área foliar analisada
foram capturados por uma câmera CCD (Charge Coupled Device) acoplada ao
aparelho a qual forneceu as imagens para o computador (Oxborough, 2004). Para as
avaliações as folhas foram adaptadas ao escuro para que os centros de reação
estivessem completamente abertos (todos os aceptores primários oxidados) com
perda de calor mínima. As variáveis de indução da fluorescência obtidas foram:
fluorescência inicial (F
0
) e fluorescência máxima (F
m
). A partir desses valores foi
obtido o rendimento quântico potencial do fotossistema II (FSII), F
v
/F
m
= (F
m
-F
0
)/F
m
(Genty et al., 1989). As variáveis da fase lenta de indução da fluorescência foram
obtidas seqüencialmente com a aplicação de uma iluminação actínica e um pulso de
luz actínica saturante para a determinação das variáveis: fluorescência em amostra
adaptada à luz antes do pulso de saturação (F) e fluorescência máxima em amostra
adaptada à luz (F
m
’). A partir desses parâmetros foi possível calcular a fluorescência
mínima do tecido vegetal iluminado, F
0
’ = F
0
/[((F
m
-F
0
/F
m
)+(F
0
/F
m
’)] (Oxborough e
Baker, 1997), para o cálculo do coeficiente de extinção fotoquímico pelo modelo
lake, o qual fornece uma estimativa de centros de reações abertos do FSII, q
L
= (F
m
’-
F)/(F
m
’-F
0
’).(F
0
’/F) (Kramer et al., 2004). O rendimento quântico efetivo de
conversão fotoquímica de energia no PSII, Y
II
= (Fm’-F)/Fm’; e os rendimentos
quântico da dissipação de energia regulada, Y
NPQ
= (F/Fm’) - (F/Fm) e da dissipação
de energia não regulada, Y
NO
= F/Fm, foram calculados de acordo com Genty et al.
(1989) e Hendrickson et al. (2004). O Y
II
foi utilizado ainda para estimar a taxa
aparente de transporte de elétrons, ETR = Y
II
.PAR.0,84.0,5 (Bilger et al., 1995), onde
PAR é o fluxo de fótons (µmol m
-2
s
-1
) incidente sobre a folha; 0,5 o valor
correspondente à fração de energia de excitação distribuída para o FSII (Laisk e
Loreto, 1996); e, 0,84 o valor correspondente à fração de luz incidente que é
absorvida pelas folhas (Ehleringer, 1981).
2.2.4. Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real (qPCR)
O RNA total foi extraído do material foliar fresco dos cultivares Canastra e
BR-IRGA 409 utilizando o reagente Trizol (38 % de fenol ácido pH 4,5, 0,8 M
tioceanato de guanidina; 0,4 M tioceanato de amônio; 0,1 M acetato de sódio pH 5,0;
18
5,0 % glicerol; água livre de RNAases tratada com dietil pirocarbonato, DEPC).
Realizou-se uma centrifugação com cloreto de sódio (5 N) e clorofórmio P.A para
separação das fases aquosa, contendo RNA, e orgânica, contendo proteínas e DNA.
A precipitação do RNA contido na fase aquosa foi realizada com igual volume de
isopropanol P.A. Em seguida realizou-se lavagem do RNA com etanol 75 %. Após a
extração o RNA foi quantificado em nanocell acoplado ao espectrômetro e analisado
em gel de agarose 0,8% (p/v), corado com red gel. Para o experimento de qRT-PCR
foram utilizadas quatro repetições biológicas com três replicatas técnicas.
A síntese de cDNA foi realizada com 2 μg de RNA total, pré-tratado com 1 μl
de DNAse (50 U/μL, Amplification GradeDnase I, Invitrogen
TM
), incubada por 37 ºC
a 15 min; para retirar os possíveis contaminantes de DNA genômico e para tal foi
utilizado o protocolo da Invitrogen seguindo as normas do fabricante. A síntese da
primeira fita de cDNA foi feita utilizando o kit SuperScript
TM
First-Strand Synthesis
System for RT-PCR (Invitrogen
TM
), realizada em thermomixer. O cDNA foi
armazenado a -20 °C.
Para a análise de expressão gênica foi utililzado a técnica de PCR em tempo
real (StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Applied Biosystem), com sistema de
detecção de fluorescência mix SYBR Green I (Applied Biosystems
®
, California,
USA). A reação foi realizada utilizando diluição da reação de síntese de cDNA de
fita simples, solução contendo os primers (primer direto e inverso, 10 µM), dNTP (5
mM), tampão de PCR 10x (Invitrogen), MgCl
2
(50 mM), SYBR Green I (1:10000;
Invitrogen), Platinum Taq DNA polimerase (5U/µl), ROX (Invitrogen) e H
2
O estéril.
As condições de amplificação foram: hot start a 95 ºC, 40 ciclos a 95 ºC, com
temperatura de anelamento entre 58 ºC e 60 ºC, conforme o T
m
do primer, e
temperatura de extensão 72 ºC. Os valores de Ct foram calculados pelo programa
Real Time PCR Miner v 2.2 (Zhao e Fernald, 2005; http://www.miner.ewindup.info/)
a partir dos valores de fluorescência das reações. Para a normalização dos dados
utilizou-se genes constitutivos selecionados pelo programa GeNorm v. 3.5, dentre os
genes de Oryza sativa actina (OsACT), β-1, 3-glucanase (OsGLU), tubulina (OsTUB)
e ubiquitina (OsUBQ5). Foram utilizados os métodos comparativos propostos por
Zhao e Fernald (2005).
19
2.2.5. Atividade de enzimas antioxidativas
Os extratos enzimáticos brutos para as determinações das atividades das
catalases (CATs) e das peroxidases do ascorbato (APXs) foram obtidos pela
maceração de 0,3 g de tecido vegetal em N
2
líquido, em 2 mL de meio de
homogeneização constituído de tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,8 ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfônico (PMSF) 1
mM; e polivinilpolipirrolidona (PVPP) 1 % (p/v) (Peixoto et al., 1999). Para a
determinação das redutases da glutationa (GRs) o meio de homogeneização foi
composto por tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol
(DTT) 2 mM, PMSF 1 mM e PVPP 1 %. O homogenato foi filtrado através de gaze e
centrifugado a 12.000 g por 15 minutos, a 4 ºC (Peixoto et al., 1999).
A atividade das catalases (CATs, EC 1.11.1.6) foi determinada pela adição de
100 µL do extrato enzimático foliar, a 2,9 mL de uma meio de reação constituído de
tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0 e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) 12,5
mM (Havir e Mchale, 1987). O decréscimo na absorbância a 240 nm, a 25 ºC, foi
medido durante o primeiro minuto de reação, sendo, a atividade das CATs
determinada com base na inclinação da reta no intervalo linear, após o inicio da
reação. A atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção
molar do H
2
O
2
de 36 M
-1
c
-2
(Anderson et al., 1985) e o resultado expresso em µmol
min
-1
mg
-1
proteína.
A atividade das peroxidades do ascorbato (APXs, EC 1.11.1.1) foi determinada
de acordo com o método de Nakano e Asada (1981), modificado por Koshiba (1993).
As alíquotas de 100 µL do extrato enzimático bruto foliar foram adicionados a 2,9
mL de um meio de reação constituído de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0,
acido ascórbico 0,8 mM e H
2
O
2
1 mM. O decréscimo na absorvância a 290 nm, a 25
ºC, foi medido durante o primeiro minuto de reação, sendo, a atividade das APXs
determinada com base na inclinação da reta no intervalo linear, após o inicio da
reação. A atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção
molar do ascorbato de 2,8 mM
-2
cm
-1
(Nakano e Asada, 1981) e o resultado expresso
em µmol min
-1
mg
-1
proteína.
A atividade das redutases da glutationa (GRs, EC 1.6.4.2) foi determinada pela
adição de 100 µL do extrato enzimático bruto foliar a 0,9 mL de um meio de reação
constituído de tampão fosfato de potássio (0,1 M) pH 7,5, EDTA (1 mM), glutationa
20
oxidada (GSSG, 1 mM) e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
(NADPH, 0,1 mM) (tampão Tris-HCl 0,5 mM, pH 7,5), segundo Carlberg e
Mannervik (1985). O decréscimo na absorvância a 340 nm, à temperatura de 30 ºC,
foi medido durante o primeiro minuto de reação, sendo, a atividade das GRs
determinada com base na inclinação da reta no intervalo linear, após o inicio da
reação. A atividade enzimática foi calculada utilizando-se o coeficiente de extinção
molar da coenzima NADP
+
de 6,22 mM
-1
cm
-1
(Foyer e Halliwell, 1976) e o
resultado expresso em µmol min
-1
mg
-1
proteína.
O teor de proteínas foi quantificado pelo método de Bradford.
2.2.6. Caracterização Anatômica Foliar
Para caracterização estrutural, em microscopia de luz, amostras foliares da
região mediana foram fixadas em solução de glutaraldeído (2,5%) e paraformaldeído
(4%), em tampão cacodilato de sódio (pH 7,2), acrescido de cloreto de cálcio 5 mM
(Karnovsky, 1965), por 48 horas, e estocadas em álcool 70%. Posteriormente, foram
desidratadas em série etílica e incluídas em historresina Leica (Leica Historesin,
Nussloch/Heidelberg, Germany). Cortes transversais (5 µm) foram obtidos em
micrótomo rotativo de avanço automático (modelo RM2155, Leica Microsystems
Inc., Deerfield, USA), sendo corados com azul de toluidina em pH 4,0 e montados
em Permount. As observações e documentações fotográficas foram realizadas em
fotomicroscópio (modelo AX70 TRF, Olympus Optical, Tokyo, Japão) equipado
com sistema U-photo, acoplado a uma câmera (modelo Spot Insightcolour 3.2.0,
Diagnostic Instruments inc., New York, USA).
2.3. Análise Estatística
O delineamento experimental constituiu-se de blocos ao acaso, com quatro
repetições. Os dados de trocas gasosas, fluorescência e expressão gênica foram
submetidos à análise de variância e teste de Scott-Knott, 5% de probabilidade, pelo
programa SAEG v 9.1. Foram feitas análises de correlações de Pearson, no qual
foram identificadas as correlações do mineral ferro e todos os outros minerais pelo
programa SAS v 9.0.
21
3. RESULTADOS
3.1. Teor de ferro, índice de translocação
O aumento na concentração de Fe na solução nutritiva resultou em maiores
níveis de Fe nas plantas de arroz. As plantas expostas ao sulfato ferroso (FeSO
4
-
EDTA, 7 mM), apresentaram maior acúmulo de ferro nas raízes, em 9,2 e 13,2 vezes
em relação às plantas controle, para os cultivares Canastra e BR-IRGA 409,
respectivamente (Fig. 1). Ambos os cultivares acumularam 4,2 vezes mais ferro nas
raízes, em relação aos respectivos controles, sob cultivo em cloreto férrico (FeCl
3
-
EDTA, 7 mM). Para o cultivo em citrato férrico (7 mM), Canastra apresentou
acúmulo 3,2 vezes e BR-IRGA 409 6,6 vezes superior aos respectivos controles.
Fe (mg kg
-1
MS raiz)
0
500
1000
1500
2000
Fe (mg kg
-1
MS folha)
0
200
400
600
800
1000
Canastra
BR-IRGA 409
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
A
B
B
C
B
C
B
B
C
A
B
E
D
E
C
C
A
B
Figura 1. Teor de ferro nas raízes (A) e na parte aérea (B) dos cultivares de arroz Canastra e
BR-IRGA 409 submetidas ao FeSO
4
-EDTA (7 mM), FeCl
3
-EDTA (7 mM) e Citrato Férrico
(7 mM). Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
O teor de ferro translocado para a parte aérea variou de acordo com as fontes
de ferro impostas (Fig. 2). As plantas de arroz submetidas ao sulfato ferroso
apresentaram menores índices de translocação de ferro, para ambos os cultivares (~
21 %), em relação ao teor de ferro total na planta, quando comparado às demais
fontes. O cultivo de Canastra, em solução com citrato férrico, proporcionou maior
acúmulo de ferro na parte aérea (62 %).
22
Figura 2. Acúmulo de ferro (%) nas raízes ( ) e na parte aérea ( )
em cultivares de arroz Canastra e BR-IRGA 409 após sete dias de
exposição à diferentes fontes de ferro (7 mM). Barras representam
médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
3.2. Composição Mineral
Os cultivares Canastra e BR-IRGA 409 apresentaram alterações no acúmulo de
outros elementos nas raízes (Tab. 1) e nas folhas (Tab. 2) quando cultivados em
solução com excesso de ferro. O teor de K, nas raízes, apresentou, de forma geral,
correlação negativa com a imposição do excesso de Fe na solução de cultivo. Os
elementos Ni e Cu apresentaram correlação positiva com o Fe nas raízes das plantas
de arroz. No entanto, o teor de Co apresentou correlação significativa e positiva nas
raízes de plantas de arroz expostas apenas ao cloreto férrico e citrato férrico (Tab. 1).
Efeitos mais pronunciados na dinâmica dos nutrientes nas plantas foram
observados na parte aérea de cultivares de arroz expostas ao excesso de ferro na
solução de cultivo (Tab. 2). Os teores de P, Mn e Rb apresentaram correlação
negativa com o Fe nas folhas de arroz em todos os tratamentos. O elemento Ca
apresentou menor acúmulo na parte aérea apenas nas plantas cultivadas em sulfato
ferroso. Os teores de Na apresentaram correlação positiva com o Fe, independente do
tratamento ao passo que, Co e Cu apresentaram correlação positiva e significativa
com o Fe apenas nas fontes trivalentes, cloreto férrico e citrato férrico, nas folhas e
raízes de arroz (Tab. 2).
Canastra
Acúmulo de ferro (%)
0
20
40
60
80
100
120
Folha
Raiz
BR-Irga 409
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
A
B
B
C
B
D
a
b
c
c
c
d
23
Tabela 1. Correlação de Pearson entre o teor de Fe e outros 17 elementos nas raízes de dois cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso
de sulfato ferroso (FeSO
4
-EDTA, 7 mM), cloreto férrico (FeCl
3
-EDTA, 7 mM) e citrato férrico (7 mM), por sete dias, em sistema
hidropônico.
* Significativo ao nível de 5 %; ** ao nível 1 % de probabilidade pelo teste t.
Tabela 2. Correlação de Pearson entre o teor de Fe e outros 17 elementos nas folhas de dois cultivares de Oryza sativa, cultivados sob
excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-EDTA, 7 mM), cloreto férrico (FeCl
3
-EDTA, 7 mM) e citrato férrico (7 mM), por sete dias, em sistema
hidropônico.
* Significativo ao nível de 5 %; ** ao nível 1 % de probabilidade pelo teste t.
RAIZ B Na Mg P S K Ca Mn Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra FeSO
4
0.272
ns
‐0.097
ns
‐0.562
ns
‐0.017
ns
‐0.624
*
‐0.856
**
0.063
ns
‐0.266
ns
0.609
ns
0.388
ns
0.700
*
0.391
ns
‐0.165
ns
‐0.539
ns
0.327
ns
0.116
ns
0.396
ns
Canastra FeCl
3
0.520
ns
0.452
ns
0.786
*
0.496
ns
‐0.226
ns
‐0.632
ns
0.091
ns
0.672
ns
0.945
**
0.986
**
0.990
**
‐0.453
ns
‐0.204
ns
‐0.307
ns
0.308
ns
‐0.841
**
0.192
ns
Canastra Citrato
‐0.122
ns
‐0.001
ns
‐0.261
ns
0.081
ns
‐0.170
ns
‐0.760
*
‐0.544
ns
‐0.512
ns
0.950
**
0.943
**
0.920
**
‐0.090
ns
‐0.072
ns
‐0.481
ns
0.173
ns
0.554
ns
0.272
ns
IRGA409 FeSO
4
0.572
ns
0.444
ns
‐0.329
ns
‐0.651
ns
0.158
ns
‐0.751
*
0.466
ns
0.024
ns
0.174
ns
0.669
*
‐0.209
ns
0.571
ns
‐0.312
ns
0.203
ns
0.380
ns
‐0.144
ns
‐0.503
ns
IRGA409 FeCl
3
0.742
ns
0.685
ns
0.060
ns
‐0.931
**
0.652
ns
‐0.754
*
‐0.101
ns
0.318
ns
0.938
**
0.927
**
0.962
**
0.063
ns
‐0.185
ns
‐0.038
ns
‐0.490
ns
‐0.773
*
‐0.791
*
IRGA409 Citrato
‐0.308
ns
‐0.285
ns
‐0.025
ns
‐0.194
ns
‐0.740
ns
‐0.760
ns
‐0.318
ns
‐0.241
ns
0.929
*
0.796
ns
0.679
ns
‐0.348
ns
0.074
ns
‐0.059
ns
‐0.552
ns
‐0.270
ns
‐0.780
*
FOLHA B Na Mg P S K Ca Mn Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra FeSO
4
0.695
*
0.962
**
‐0.907
**
‐0.921
**
0.764
**
‐0.060
ns
‐0.769
**
‐0.933
**
0.160
ns
‐0.400
ns
‐0.011
ns
0.865
**
0.309
ns
‐0.881
**
0.284
ns
‐0.887
**
0.387
ns
Canastra FeCl
3
0.323
ns
0.967
**
‐0.805
*
‐0.904
**
‐0.389
ns
‐0.621
ns
‐0.670
ns
‐0.900
**
0.817
**
0.612
ns
0.754
*
0.666
ns
‐0.239
ns
‐0.921
**
‐0.136
ns
‐0.892
**
‐0.514
ns
Canastra Citrato
0.683
ns
0.963
**
‐0.505
ns
‐0.889
**
0.686
*
‐0.622
ns
‐0.679
ns
‐0.865
**
0.977
**
0.876
**
0.735
*
0.270
ns
0.133
ns
‐0.840
**
0.081
ns
‐0.653
ns
‐0.842
**
IRGA409 FeSO
4
0.746
*
0.845
**
‐0.817
**
‐0.825
**
0.771
*
‐0.221
ns
‐0.742
*
‐0.905
**
0.337
ns
‐0.144
ns
‐0.586
ns
0.323
ns
‐0.309
ns
‐0.705
*
‐0.069
ns
‐0.617
ns
0.050
ns
IRGA409 FeCl
3
0.680
ns
0.938
**
‐0.496
ns
‐0.937
**
0.181
ns
‐0.616
ns
‐0.393
ns
‐0.926
**
0.887
**
0.454
ns
0.982
**
0.095
ns
‐0.483
ns
‐0.747
*
0.112
ns
‐0.875
**
0.018
ns
IRGA409 Citrato
0.429
ns
0.577
ns
‐0.128
ns
‐0.580
ns
‐0.148
ns
‐0.700
*
‐0.329
ns
‐0.505
ns
0.702
*
0.632
ns
‐0.590
ns
‐0.272
ns
‐0.264
ns
‐0.744
*
0.009
ns
‐0.273
ns
0.299
ns
24
3.3. Trocas gasosas
A taxa de assimilação líquida do CO
2
(A) foi reduzida significativamente para
ambos os cultivares em estudo. A redução na taxa fotossintética, foi mais expressiva nas
plantas tratadas com FeSO
4
(Fig. 3), sendo mais pronunciada no cultivar Canastra (71 %).
01234567
A (µmol m
-2
s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
BR-Irga 409
y=(23,32.8,2)/(8,2.x) R
2
= 0,8362
Tempo de exposição ao ferro (dias)
01234567
A (µmol m
-2
s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
Canastra
y=(24,74.8,3)/(8,3.x) R
2
= 0,9161
y=(25,67.13,1)/(13,1.x) R
2
= 0,7052
y=(24,66.4,2)/(4,2.x) R
2
= 0,8554
y=(25,34.6,2)/(6,2.x) R
2
= 0,9111
y=(26,85.8,6)/(8,6.x) R
2
= 0,7684
Figura 3. Taxa de assimilação líquida de CO
2
(A) em plantas de arroz cultivadas sob excesso de
FeSO
4
-EDTA (○,), FeCl
3
-EDTA (▼,......) e Citrato férrico (Δ; ), ao longo de sete dias. As
curvas foram ajustadas por meio de regressões hiperbólicas significativas.
A análise fatorial das trocas gasosas (Tab. 3) apresentou interação significativa para
a variável A, na qual, a partir do desdobramento, observou-se efeito significativo dos
cultivares para a variável “fontes de ferro” fixada e efeito significativo para a fonte de
ferro sulfato ferroso dentro dos cultivares. A redução nas taxas fotossintéticas (A) foi
acompanhada pela diminuição da condutância estomática (g
S
) e da transpiração (E) para
ambos os cultivares expostos ao sulfato ferroso e citrato férrico (Tab. 3). No entanto, a
exposição das plantas às dosagens tóxicas de ferro aumentou a relação C
i
/C
a
, em média,
17 % sob sulfato ferroso e 13 % em cultivo com cloreto férrico, para os cultivares
avaliados.
A partir da relação entre a taxa fotossinética e o acúmulo de ferro na parte aérea das
plantas de arroz foi possível observar que o cultivo em solução de citrato férrico
apresentou maior velocidade de absorção do metal, em relação às demais fontes (Fig. 4).
25
Tabela 3. Efeito de níveis tóxicos de ferro sobre as trocas gasosas: A, taxa de assimilação
líquida de CO
2
; g
S
, condutância estomática; C
i
, concentração interna de CO
2
; C
i
/C
a
,
relação entre a concentração interna e ambiente de CO
2
e E, transpiração em plantas de
arroz, após sete dias de exposição aos tratamentos.
Cultivar Fonte de Fe
A
g
S
C
i
/C
a
E
Canastra
Controle 24,39 ± 0,96 0.561 ± 0,07 0.780 ± 0,031 5.72 ± 0,39
FeSO
4
-EDTA 6,09 ± 0,86 0.395 ± 0,12 0.929 ± 0,022 4.02 ± 0,70
FeCl
3
-EDTA 12,49 ± 1,78 0.446 ± 0,04 0.855 ± 0,028 5.09 ± 0,34
Citrato Férrico 16,75 ± 1,92 0.351 ± 0,08 0.749 ± 0,048 4.24 ± 0,58
BR-IRGA 409
Controle 24.36 ± 0,35 0.544 ± 0,10 0.763 ± 0,041 5.74 ± 0,28
FeSO
4
-EDTA 13.68 ± 1,02 0.482 ± 0,05 0.857 ± 0,012 4.99 ± 0,08
FeCl
3
-EDTA 11.75 ± 0,59 0.570 ± 0,05 0.893 ± 0,008 5.41 ± 0,30
Citrato Férrico 19.37 ± 0,78 0.368 ± 0,05 0.791 ± 0,048 4.50 ± 0,49
Análise de variância
Fonte de Ferro (Fe) *** * ** *
Cultivar (C) ** * n.s. n.s.
Fe x C ** n.s. n.s. n.s.
Bloco n.s. n.s. n.s. n.s.
Canastra x Fe ***
BR-Irga x Fe ***
Controle x G n.s.
FeSO
4
-EDTA x C **
FeCl
3
-EDTA x C n.s.
Citrato Férrico x C n.s.
Média ± EP. Interação (Fe x C) significativa (A) foi seguida de desdobramento fixando as fontes de ferro e
posteriormente os cultivares. Nível de significância: p < 0,05 (*); p < 0,01 (**);p < 0,001 (***); n.s. (não
significante).
Figura 4. Taxa fotossintética em relação ao acúmulo de ferro (mg kg
-1
MS) nas folhas de plantas
de arroz cultivadas sob excesso de FeSO
4
-EDTA (●, —), FeCl
3
-EDTA (○,
......
) e Citrato férrico
(▼; ----), ao longo de sete dias. As curvas foram ajustadas por meio de regressões exponenciais
significativas.
Fe [mg kg
-1
]
0 200 400 600 800 1000 1200
A (µmol m
-2
s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
FeSO
4
y=25,15
(-0,0008.x)
R
2
= 0,8360
FeCl
3
y=28,18
(-0,0008.x)
R
2
= 0,9445
Citrato y=29,97
(-0,0017.x)
R
2
= 0,9305
CANASTRA
0 200 400 600 800 1000
A (µmol m
-2
s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
FeSO
4
y=25,04
(-0,0008.x)
R
2
= 0,7955
FeCl
3
y=27,08
(-0,0007.x)
R
2
= 0,8333
Citrato y=27,47
(-0,0013.x)
R
2
= 0,7002
BR-IRGA 409
26
3.4. Fluorescência da clorofila a
As plantas de arroz expostas ao excesso de ferro, sob diferentes fontes, não
apresentaram alterações significativas na fluorescência basal (F
0
) e no rendimento
quântico máximo do fotossistema II (FSII; F
v
/F
m
) (Figs. 5, 7 e 8). A taxa de transporte de
elétrons do FSII, ETR, apresentou uma redução significativa nos cultivares avaliados
cultivados em diferentes fontes de ferro. O cultivar Canastra teve a ETR reduzido em 57
%, 32 % e 19 % sob exposição de sulfato ferroso, cloreto férrico e citrato férrico,
respectivamente. O ETR foi significativamente diminuído no cultivar BR-IRGA 409
quando cultivado em sulfato ferroso (31 %) e cloreto férrico (41 %). O coeficiente de
extinção fotoquímica (q
L
), o qual estima o centro de reações abertos do FSII, foi reduzido
nos cultivares Canastra (43 %) e BR-IRGA 409 (18 %) cultivados em sulfato ferroso; e,
em média, 23 % no cultivar BR-IRGA 409 sob cultivo em cloreto férrico. O efeito no qL
foi observado também através da alteração na coloração da imagem da fluorescência da
clorofila a, do amarelo para alaranjado escuro (Figs. 7 e 8).
Fo
0
200
400
600
800
Canastra
BR-IRGA 409
Fv/Fm
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
ETR
0
20
40
60
80
100
120
qL
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AA
A
B
A
B
AA
A
B
C
C
C
D
AA
A
A
A
B
B
B
Figura 5. Fluorescência mínima (F
0
), rendimento quântico máximo do FSII (F
v
/F
m
), taxa de
transporte de elétrons (ETR) e coeficiente de extinção fotoquímico (q
L
) em dois cultivares de
arroz expostos a diferentes fontes de ferro (7 mM). Barras representam médias ± EP. Médias
seguidas de mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p >
0,05).
27
O rendimento quântico de conversão fotoquímica de energia no FSII (Y
II
) reduziu
significativamente nos cultivares Canastra e BR-IRGA 409 em resposta ao excesso de
diferentes fontes de ferro. A diminuição do Y
II
foi de até 57 % no cultivar Canastra
exposto ao sulfato ferroso (Figs. 6), podendo ser observada pela alteração na imagem da
fluorescência da clorofila a do tom verde para a coloração amarela/alaranjada (Figs. 7 e
8). As reduções no Y
II
ocorreram em resposta ao aumento significativo nos níveis do
rendimento quântico regulado da dissipação de energia no FSII (Y
NPQ
) em ambos os
cultivares. Foi possível observar incremento em 82 % e 52 % no Y
NPQ
para os cultivares
Canastra e BR-IRGA 409, respectivamente, cultivados em sulfato ferroso. Sob exposição
à toxidez por cloreto férrico, Y
NPQ
apresentou aumento de 65 % no cultivar Canastra e de
37 % no BR-IRGA 409. A fonte de ferro citrato férrico ocasionou um aumento de Y
NPQ
,
em média, 38 % para ambos os cultivares avaliados. O rendimento quântico não regulado
da dissipação de energia no FSII (Y
NO
) não foi afetado significativamente pelo excesso
de ferro imposto aos cultivares de arroz.
Controle
Y(NO)
CANASTRA
Y
(
N
P
Q
)
BR-IRGA 409
FeSO
4
-EDTA
Y
(
N
P
Q
)
FeCl
3
-EDTA
Y
(
I
I
)
Citrato
Y
(
N
P
Q
)
Y
(
N
P
Q
)
Y
(
I
I
)
Y(NO)
Y(NO)
Y(NO)
Y(NO)
Y(NO)
Y(NO)
Y(NO)
Y
(
NP
Q
)
Y
(
N
P
Q
)
Y
(
N
P
Q
)
Y
(
N
P
Q
)
Y
(
I
I)
Y
(
I
I
)
Y
(
I
I
)
Y
(
I
I
)
Y
(
I
I
)
Controle
FeSO
4
-EDTA
FeCl
3
-EDTA
Citrato
Y
(
I
I
)
26 %
21 %
53 %
11 %
39 %
50 %
18 %
35 %
47 %
27 %
24 %
49 %
19 %
37 %
45 %
16 %
33 %
51 %
21 %
31 %
48 %
25 %
32 %
43 %
Figura 6. Rendimento quântico de conversão fotoquímica de energia no FSII (Y
II
), rendimento
quântico regulado (Y
NPQ
) e não regulado (Y
NO
) da dissipação de energia no FSII de dois
cultivares de arroz expostos a diferentes fontes de ferro (7 mM).
28
Figura 7. Imagens da fluorescência da clorofila a da fluorescência mínima (F
0
), rendimento
quântico máximo do FSII (F
v
/F
m
), coeficiente de extinção fotoquímico (q
L
), rendimento quântico
de conversão fotoquímica de energia no FSII (Y
II
) e rendimentos quânticos regulado (Y
NPQ
) e não
regulado (Y
NO
) da dissipação de energia no FSII do cultivar Canastra, exposto a diferentes fontes
de ferro (7 mM). A escala de cor, abaixo das imagens, corresponde aos valores de 0 (preto) a 1
(rosa).
29
Figura 8. Imagens da fluorescência da clorofila a da fluorescência mínima (F
0
), rendimento
quântico máximo do FSII (F
v
/F
m
), coeficiente de extinção fotoquímico (q
L
), rendimento quântico
de conversão fotoquímica de energia no FSII (Y
II
) e rendimentos quânticos regulado (Y
NPQ
) e não
regulado (Y
NO
) da dissipação de energia no FSII do cultivar BR-IRGA 409, exposto a diferentes
fontes de ferro (7 mM). A escala de cor, abaixo das imagens, corresponde aos valores de 0 (preto)
a 1 (rosa).
30
3.5. Expressão gênica
O nível relativo de mRNA de genes de arroz relacionados a homeostase do ferro
(ferritina, OsFER1); codificação de proteínas D1 do fotossistema II (proteína Q-B
cloroplastídica, OspsbA); sintetase da glutamina citosólica (OsGS1); precursor de
fitosideróforos (sintetase da nicotianamina, OsNAS1); transportador de Fe-FS (Yellow
Stripe 1 Like, OsYSL1) e transportadores de fosfato (transportador de monosacarídeo do
tonoplasto induzível por limitação de fosfato 1, OsPI1; fator transcricional bHLH
induzível por limitação de fosfato 1, OsPTF1) foram avaliados em folhas dos cultivares
Canastra e BR-IRGA 409. Dentre os quatro genes constitutivos analisados, actina
(OsACT), sintetase da glutamina citosólica (OsGLU), ubiquitina 5 (OsUBQ5) e tubulina
(OsTUB), os genes OsUBQ5 e OsTUB foram utilizados para os cáclulos de expressão, de
acordo com a pré-análise realizada no programa GeNorm.
Os cultivares de arroz Canastra e BR-IRGA 409 apresentaram alto nível de
expressão do gene OsFER1, quando cultivadas em diferentes fontes excessivas de ferro
(Tab. 4). O cultivar Canastra apresentou incremento em 46, 30 e 18 vezes no nível de
expressão do gene OsFER1 cultivado em sulfato ferroso, cloreto férrico e citrato férrico,
em relação ao controle, respectivamente. O incremento na expressão do gene OsFER1, no
cultivar BR-IRGA 409, sob as diferentes fontes de ferro, foi em média, 69 vezes superior
ao controle. A expressão do gene psbA foi aumentada em duas vezes, em relação ao
controle, em ambos os cultivares, expostos ao citrato férrico e, ao cloreto férrico, apenas
para o cultivar BR-IRGA 409 (Tab. 4).
Os níveis de mRNA de OsGS1 apresentou níveis 3,8 vezes superior ao controle no
cultivar Canastra exposto ao sulfato ferroso e 5,6 vezes no cultivar BR-IRGA 409
cultivado em cloreto férrico. A expressão dos transportadores de fosfato, OsPI1
apresentaram expressão duas vezes maior que os controles nos cultivares Canastra e BR-
IRGA 409 cultivados em sulfato ferroso (Tab. 4). O gene do OsPTF1, transportador de
fosfato, não foi alterado nos cultivares de arroz em estudo. O gene OsYSL1 apresentou
incremento nos níveis de expressão relativa em 3,4 vezes para o cultivar Canastra e 2,2
vezes no cultivar BR-IRGA 409 quando expostos a dosagens tóxicas de sulfato ferroso. O
gene OsNAS1 não foi expresso nas folhas de arroz.
31
Tabela 4. Análises por qRT-PCR do nível relativo de mRNA, em folhas, dos genes da ferritina (OsFER1), proteína Q-B
cloroplastídica (OspsbA), sintetase da glutamina citosólica (OsGS1), transportador de monosacarídeo do tonoplasto induzível
por limitação de fosfato 1 (OsPI1), fator transcricional bHLH induzível por limitação de fosfato 1 (OsPTF1), Yellow Stripe
Like 1 (OsYSL1), dos cultivares Canastra e BR-IRGA 409 de Oryza sativa, cultivados em diferentes fontes de ferro (7 mM),
por sete dias.
Nível Relativo de mRNA
Genótipo Fonte de Fe
OsFER1 OspsbA OsGS1 OsPI1 OsPTF1 OsYSL1
Canastra
Controle 1,70 ± 0,42 24,30 ± 2,33 0,392 ± 0,035 4,95 ± 1,43 14,32 ± 3,31 0,73 ± 0,15
FeSO
4
78,38 ± 5,68 37,22 ± 1,52 1,473 ± 0,136 8,89 ± 1,65 4,77 ± 0,35 2,45 ± 0,49
FeCl
3
50,41 ± 2,45 29,84 ± 1,68 1,136 ± 0,193 4,81 ± 0,70 9,19 ± 2,41 0,86 ± 0,08
Citrato 29,94 ± 2,21 62,18 ± 12,6 0,512 ± 0,014 6,29 ± 0,12 10,58 ± 3,53 1,49 ± 0,18
BR-IRGA
409
Controle 1,11 ± 0,19 34,37 ± 2,63 0,827 ± 0,037 3,78 ± 0,43 8,55 ± 2,47 1,44 ± 0,18
FeSO
4
70,75 ± 16,4 54,16 ± 7,03 2,179 ± 0,103 7,84 ± 0,97 12,30 ± 4,23 3,14 ± 0,63
FeCl
3
85,72 ± 8,96 89,69 ± 11,4 4,594 ± 0,518 6,28 ± 0,26 11,50 ± 0,74 3,29 ± 0,46
Citrato 74.79 ± 15,8 73.66 ± 15,0 1.224 ± 0,150 6.81 ± 0,32 5.72 ± 1,11 1.22 ± 0,23
Nível relativo de expressão gênica normalizado em relação ao nível de expressão dos genes constitutivos ubiquitina5 e tubulina. Médias representam
n=4 com três replicatas técnicas ± EP.
32
3.6. Atividade de enzimas antioxidantes
A atividade das enzimas antioxidantes não apresentou diferenças significativas
entre os tratamentos para ambos os cultivares (Fig. 9), após sete dias de exposição às
fontes tóxicas de ferro. O cultivar Canastra, no entanto, apresentou um padrão de
atividade da APX superior ao cultivar BR-IRGA 409.
Atividade da Peroxidase do Ascorbato
(µmol.min
-1
.µg prot
-1
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Canastra
BR-IRGA 409
Atividade da Redutase da Glutationa
(µmol.min
-1
.µg prot
-1
)
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Controle
FeSO
4
FeCl
3
Citrato
A
A
A
A
A
A
A
A
Atividade da Catalase
(µmol.min
-1
.µg prot
-1
)
0
2
4
6
8
10
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
A
A
A
A
Figura 9. Atividade das peroxidases do ascorbato
(APXs), catalases (CATs) e redutases da glutationa
(GRs) nas folhas de dois cultivares de arroz expostos a
diferentes fontes de ferro (7 mM). Barras representam
médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não
diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-
Knott (p > 0,05).
33
3.7. Sintomas visuais e caracterização foliar da fitotoxidez
Os sintomas de toxidez por ferro foram observados a partir do terceiro dia de
exposição às diferentes fontes de ferro. Inicialmente ocorreu bronzeamento na região
apical das folhas, apresentando-se mais intenso na região subapical e se expandindo em
direção à região mediana das folhas, com o aumento do tempo de exposição aos
tratamentos. Após sete dias de exposição às diferentes fontes de ferro observou-se
bronzeamento seguido de necrose nas folhas de ambos os cultivares, com maior
intensidade para as plantas cultivadas em sulfato ferroso (Fig. 10).
Figura 10. Folhas de arroz após sete dias de exposição a 0,019 mM de FeSO
4
-EDTA
(Controle) e FeSO
4
-EDTA, FeCl
3
-EDTA e Citrato férrico (7 mM).
Ambos os cultivares apresentaram danos celulares mais evidentes quando tratados
com o sulfato ferroso. Com o desenvolvimento do bronzeamento na região subapical da
folha, houve colapso celular seguido de necrose, não havendo distinção nos conteúdos
celulares (Figs. 11C-D e 12C-D). As injúrias nas células da epiderme e do parênquima
clorofiliano causaram drástica redução na espessura do mesofilo (Figs. 11C-H e 12C-H),
em comparação com as plantas controle (Figs. 11A-B e 12A-B).
34
Figura 11. Estrutura foliar de Oryza sativa cultivar Canastra em microscopia de luz. Tratamento controle
(A e B), tratamento com sulfato ferroso 7 mM (C e D), tratamento com cloreto férrico 7 mM (E e F) e
tratamento com citrato férrico 7 mM (G e H). Nervura principal (A e G), nervura de terceira ordem (B, C, E
e H) e região do bordo (D e F). Legendas: (Cb) células buliformes, (Ae) aerênquima (Ep) epiderme, (X)
xilema, (Fl) floema, (Es) esclerênquima, (*) tecido desidratado e colapsado. Barras: 100 µm (A e G) e 50
µm (B-F e H).
35
Figura 12. Estrutura foliar de Oryza sativa cultivar BR-IRGA 409 em microscopia de luz. Tratamento
controle (A e B), tratamento com sulfato ferroso 7 mM (C e D), tratamento com cloreto férrico 7 mM (E e
F) e tratamento com citrato férrico 7 mM (G e H). Nervura de terceira ordem (A, C, E e G) e região do
bordo (B, D, F e H). Legendas: (Cb) células buliformes, (Ep) epiderme, (X) xilema, (Fl) floema, (Es)
esclerênquima, (*) tecido desidratado e colapsado. Barras: 50 µm (A- H).
36
4. DISCUSSÃO
A toxidez por ferro (Fe), nos cultivares Canastra e BR-IRGA 409, ocasionou
alterações morfológicas, anatômicas e fisiológicas às plantas de arroz, a qual foi
observada visualmente a partir do terceiro dia, com sintoma característico de
bronzeamento (Genon et al., 1994; Yamauchi e Peng 1995). O bronzeamento é causado
pelo aumento do teor de polifenol oxidado em folhas com elevados teores de Fe
(Thipyapong et al., 2004). A toxidez pelo ferro é descrita em dosagens superiores a 300
mg kg
-1
MS (Dobermann e Fairhurst, 2000), o que foi observado nas plantas de arroz
cultivadas em diferentes fontes de Fe.
O acúmulo tóxico de ferro nas raízes dos cultivares de arroz, cultivados
principalmente em sulfato ferroso (Fig. 1), pode ter ocorrido devido à manutenção da
solubilidade e disponibilidade do ferro em sua forma divalente (Becana et al., 1998; Fang
et al., 2001; Sahrawat, 2005; Kim e Guerinot, 2007). A adição de EDTA, por outro lado,
minimizou a reoxidação do ferro e formação da placa férrica (Taylor et al., 1984;
Snowden e Wheeler, 1995), a qual poderia limitar a absorção de nutrientes, inclusive do
Fe. As plantas de arroz cultivadas com cloreto férrico (FeCl
3
), ainda, apresentaram um
menor acúmulo de ferro nas raízes, uma vez que Fe
+3
requer redução ou complexação do
metal a fitosideróforos para possibilitar a sua absorção (Fox e Guerinot, 1998).
É possível que a maior velocidade de absorção de ferro (Fig. 4), com maior índice
de translocação (Fig. 2) esteja relacionada com a disponibilidade de citrato férrico no
meio de cultivo, mais evidenciado no cultivar Canastra. O citrato é um ácido orgânico
que atua complexando o Fe
+3
a fim de auxiliar o transporte de ferro para as células do
mésofilo, onde o complexo é reduzido e o ferro liberado (Cataldo et al., 1988). Sob
cultivo de sequeiro, o ferro encontra-se na forma de óxidos de ferro trivalente (Fe
+3
),
insolúveis e não disponíveis como micronutrientes às plantas (Dobermann e Fairhurst,
2000). Assim as plantas apresentam estratégias que envolvem reações de complexação e
redução do ferro na rizosfera para suprirem suas necessidades. O que, como carga
genética imposta, pode justificar a maior translocação de ferro no cultivar Canastra,
mesmo sob condição simulada de alagamento, como a estabelecida no presente trabalho.
Apesar da maior translocação de ferro pelas plantas cultivadas em citrato férrico, este se
mostrou menos tóxico em relação ao cultivo em sulfato ferroso. Uma vez que o citrato
auxilia o transporte de ferro, esse poderia não estar sendo liberado na parte aérea das
plantas de arroz, ou ainda poderia estar promovendo uma exclusão apoplástica. O Fe
37
potencialmente tóxico, Fe
+2
, após ser liberado do citrato, poderia ser oxidado no
apoplasto e assim prevenir a entrada no simplasto, por um possível mecanismo de
exclusão apoplástica de Fe (Engel, 2009). O acúmulo de Fe nas raízes das plantas de
arroz foi superior (em média, duas vezes) ao teor desse elemento nas folhas dos cultivares
de arroz avaliados (Fig. 1). Fato este demonstra a possível ativação de mecanismos para
evitar o transporte excessivo de ferro para a parte aérea, o que poderia vir a comprometer
ainda mais seu desempenho fisiológico.
A absorção excessiva de ferro promoveu alteração na composição mineral das
plantas de arroz. O acúmulo de K nas raízes das plantas de arroz foi significativamente
reduzido em ambos os cultivares, independente da fonte imposta (Tab. 2) se, no entanto,
promover menor acúmulo deste mineral na parte aérea (Tab. 1). A manutenção de K em
níveis ideais nas folhas é importante uma vez que o K é necessário para a síntese de
proteínas e ativação enzimática, podendo afetar a síntese da rubisco nos cloroplastos
(Marschner, 1995). O distúrbio nutricional, no entanto, pode prejudicar a oxidação das
raízes de arroz e conduzir a maior susceptibilidade à toxicidade de ferro (Tanaka et al.,
1966). Os elementos Cu e Ni apresentaram, em geral, correlação negativa com o Fe em
todos os tratamentos. O Cu
+2
, dentre outros elementos pode ser imobilizado por
compostos reduzidos, como o enxofre, em solos (Greenland e Datta, 1985). O Co
apresentou correlação significativa e positiva nas raízes de plantas de arroz expostas ao
cloreto férrico e citrato férrico (Tab. 2). O ferro, na forma trivalente é absorvido
complexado a fitosideróforos, como o ácido muginêico (Ishimaru et al., 2006). O
complexo ácido muginêico-Fe
+3
é estruralmente análogo ao complexo Co
+3
(Mino et al.,
1983), o que pode gerar um sinergismo na absorção de Fe e Co pelas plantas cultivadas
com excesso de ferro trivalente.
O acúmulo de vários nutrientes na parte aérea foi afetado pelo excesso de ferro na
solução. O Na apresentou correlação positiva com o Fe ao passo que P, Mn e Rb
apresentaram correlação negativa e significativa, independente das fontes de Fe e cultivar
avaliados (Tab. 1). Tem sido relatado decréscimo no teor de P nas folhas de arroz
cultivado sob excesso de Fe, sugerindo que ocorre uma limitação na translocação do P do
apoplasto para o simplasto (Silveira et al., 2007). O acúmulo de ferro observado em
plantas deficientes em P é, ainda, acompanhado pela indução de transcrição,
principalmente nas folhas, de genes relacionados com a homeostase (NAS3) ou
armazenamento (FER1) de ferro (Hirsch et al., 2006). Isso poderia sustentar evidência à
co-regulação dos transportadores de P e Fe (Hirsch et al., 2006; Zheng et al., 2009).
38
O decréscimo no teor de P na parte aérea possivelmente desencadeou uma resposta
de indução na expressão de transportadores de P, como observado pelo aumento da
expressão do OsPI1, nos cultivares de arroz expostos ao sulfato ferroso (Tab. 4). O
aumento na expressão desse transportador é importante na manutenção do crescimento e
desenvolvimento das plantas uma vez que esse nutriente é essencial nas taxas de reações
fisiológicas em células vegetais, atuando na regulação do processo de metabolismo do
açúcar (Giaquinta, 1980) e particionamento de carbono (Khamis et al., 1990) além de
servir como um dos substratos primários da fotossíntese (Plesnicar et al., 1994).
Sob cultivo com sulfato ferroso, o Zn e o B apresentaram correlação positiva com o
Fe. O íon ferroso é transportado para o interior das células radiculares por transportadores
IRT, capazes também de mediar o transporte de outros minerais, dentre os quais, o Zn
(Grotz e Guerinot, 2006). Desta forma, outras espécies de ambiente irrigado, cultivadas
sob excesso de Fe e Zn, separadamente, apresentaram boa correlação entre a tolerância a
Zn e Fe (Deng et al., 2009).
O excesso de ferro na solução de cultivos das plantas de arroz causou efeitos
severos na taxa de assimilação líquida de CO
2
, função crucial para as plantas e altamente
sensível a estresses. O cultivar Canastra apresentou queda fotossintética mais drástica em
comparação com o cultivar BR-IRGA 409, expostos ao sulfato ferroso (Fig. 3). Danos
estruturais celulares, como das moléculas da clororfila à ação das EROs (Spiller e Terry,
1980; Terry, 1980; Thompson et al., 1987; Gallego et al.,1996; Sinha et al., 1997;
Vansuyt et al., 1997; Becana et al., 1998), induzidos por Fe, podem afetar os complexos
protéicos da cadeia transportadora de elétrons fotossintética e conseqüentemente
ocasionar perda da capacidade de fixação de carbono nos cloroplastos (Scandalios, 1993).
Dentre os complexos fotossintéticos, a proteína psbA, presente no fotossistema II (FSII),
é o componente da membrana do tilacóide mais rapidamente regenerado e, seu contínuo
reparo, é crítico para a funcionalidade do FSII (Bhagwat e Bhattacharjee, 2005). O
aumento na expressão do gene OspsbA no cultivar BR-IRGA 409 (Tab. 4), sugere um
possível mecanismo protetor, atuando na remontagem do FSII a fim de reverter os
possíveis danos oxidativos causados neste complexo. A redução nas taxas fotossintéticas,
ainda, foi acompanhada pela diminuição da condutância estomática e da transpiração das
plantas. No entanto, a exposição das plantas às dosagens tóxicas de ferro aumentou a
relação C
i
/C
a
, em média, 17 % sob sulfato ferroso e 13 % em cultivo com cloreto férrico,
para os cultivares avaliados (Fig 3, Tab. 3), o que indica um efeito negativo na etapa
bioquímica da fotossíntese.
39
A diminuição da etapa fotoquímica foi verificada também através da redução
drástica na taxa de transporte de elétrons (ETR) da etapa fotoquímica da fotossíntese,
mais pronunciado nas plantas do cultivar Canastra, cultivados em excesso de sulfato
ferroso. A diminuição no ETR foi acompanhado pela redução nos valores de q
L
,
coeficiente de extinção fotoquímico (Fig. 5, 7-8), o qual o qual estima a fração de centros
de reação abertos do FSII (Klughammer e Schreiber, 2008).
A fim de evitar danos fisiológicos pelo estresse imposto, as plantas de arroz, em
resposta ao excesso de ferro, apresentaram aumento na dissipação do excesso de energia
absorvido. Essa dissipação foi realizada pelos rendimentos quânticos regulado (Y
NPQ
) e
não regulado (Y
NO
) de energia, em detrimento ao rendimento quântico de conversão
fotoquímica de energia no FSII (Y
II
), diretamente relacionado ao ETR. Isso ocorre uma
vez que Y
II
, Y
NPQ
e Y
NO
são competitivos entre si (Eskling et al., 1997). A redução do
Y
II
foi acompanhada pelo aumento do Y
NPQ
, uma vez que o Y
NO
não foi alterado nos
cultivares de arroz cultivados sob excesso de ferro (Fig. 6-8). A dissipação de energia via
Y
NPQ
está diretamente associada à dissipação de energia na forma de calor, pelo ciclo das
xantofilas (Gilmoré et al., 1995; Demmig-Adams e Adams, 1996; Niyogi et al., 1997;
Baroli e Niyogi, 2000). Esse mecanismo de dissipação não-fotoquímica tem sido efetivo
em plantas expostas a estresses, como o excesso de Fe (Wilson et al., 2007; Pereira,
2009). A zeaxantina, ainda, componente do ciclo das xantofilas tem sido indicada em
participar do processo de reparo do FSII e pode ser crítica na proteção deste fotossistema,
importante na degradação de proteínas não-funcionais e substituição da D1 (Jin et al.,
2003).
Como processos celulares alternativos na dissipação de elétrons, sob condições de
estresse, têm sido descrito a fotorrespiração (Wingler et al., 2000), o ciclo água-água
(Asada, 2000) ou o fluxo cíclico de elétrons (Heber, 2002). O aumento na expressão do
gene OsGS tem papel chave na fotorrespiração (Biesiadka e Legocki, 1997) e pode
indicar um mecanismo de dissipação do excesso de energia nos cultivares Canastra e BR-
IRGA 409, sob toxidez por Fe. Ambos os cultivares apresentaram incremento na
expressão gênica de GS, sendo, no entanto, mais evidenciado no cultivar Canastra (Tab.
4). Uma expressão menos pronunciada de OsGS1 no cultivar de cultivo irrigado pode ser
devido outros mecanismos eficientes na dissipação de energia nessas plantas.
A tolerância das plantas, aos elevados níveis de Fe nos tecidos, envolve ainda, o
armazenamento de Fe sob uma forma não tóxica, como a incorporação desse metal na
molécula da ferritina (Briat e Lobréaux, 1997; Majerus et al., 2009; Briat et al., 2010a).
40
Esse mecanismo foi, possivelmente, utilizado em ambos os cultivares, observado através
do aumento expressivo nos níveis de mRNA do gene da ferritina (OsFER1) (Tab. 4). A
atuação sequestrante da ferritina desempenha, ainda, um importante papel na defesa das
plantas contra o estresse oxidativo induzido por ferro, impedindo o metal de reagir com o
oxigênio (Ravet et al., 2009; Briat et al., 2010b).
O excesso de ferro nos tecidos foliares, ao longo de dias, promoveu, além das
alterações fisológicas, colapso celular decorrente as injúrias das células da epiderme e do
parênquima, e redução na espessura do mesofilo foram seguidas por necrose foliar (Figs.
11-12). Este sintoma, ocorrido de forma pronunciada nas plantas tratadas com sulfato
ferroso, é um indicativo de estresse oxidativo ocorrido nas folhas (Bode et al., 1995a;
1995b). As plantas do cultivar Canastra, cultivo de sequeiro apresentaram um padrão de
APX, responsável pela detoxificação de H
2
O
2
(Noctor e Foyer, 1998), independente do
tratamento, superior ao padrão encontrado para as plantas do cultivar BR-IRGA 409 (Fig.
9). O estresse observado pode ser decorrente combinação do excesso de ferro no meio e o
sistema hidropônico não aerado imposto. A atividade das enzimas antioxidantes
avaliadas, no entanto, não diferiu entre os tratamentos impostos (Fig. 9) após sete dias de
exposição ao estresse por ferro. O que pode indicar que, neste período, as plantas já não
utilizavam mais o mecanismo antioxidante enzimático como defesa ao estresse por ferro.
41
5. CONCLUSÕES
A disponibilidade de sulfato ferroso na solução de cultivo promoveu toxidez mais
acentuada nas plantas de arroz em relação ao cloreto férrico e citrato férrico.
O cultivar Canastra, recomendado para sistema de cultivo em terras altas,
apresentou maior sensibilidade às fontes tóxicas de ferro.
A exposição de fontes tóxicas de ferro divalente e trivalente afetaram
diferencialmente a absorção e translocação de nutrientes.
Dentre os parâmetros avaliados, as taxas fotossintética e de transporte de elétrons
mostraram-se mais sensíveis para a detecção da toxidez por Fe.
A dissipação regulada de energia (Y
NPQ
), assim como a expressão da ferritina,
demonstraram ser mecanismos fortemente atuantes na manutenção do estresse por ferro,
por sete dias de exposição.
Plantas de sequeiro, sob condição não aerada, apresentam maior sensibilidade ao
excesso de Fe em solução. No entanto, permitiu uma maior translocação de Fe para as
folhas possivelmente devido à carga genética imposta por sua condição natural, ausência
de Fe biodisponível.
42
6. ANEXOS
Tabela A1. Genes analisados de Oryza sativa com os respectivos primers utilizados.
GENES Acesso NCBI
*
Primers Fw/Rv 5’-3’
Tm (º C)
Fw/Rv
OsACT1
NC_008397.2
GGTTCATCAAGAAGGGACCCGG
57/58
TGGAGGTGTATCCTGATGCGACAA
OsFER1
NC_008404.2
GCACGCAGTAGCAATGGAGTGA
58/58
AGCGGCGCCATGTTCCTTTT
OsGLU
NC_008397.2
ATCACATCGGCTACGGTCTT
53/54
GGAGGCGACTGAGAAGGTC
OsGS1
NC_008395.2
TGACGCCACGACATCCTCGT
58/57
CAATGGAGCAACCGGAGCGA
OsNAAT1
NC_008395.2
ATCGGCAACTACGCGTTGGG
58/57
AGGTTTGAGTTCACCTGCCGG
OsNAS1
NC_008396.2
GCTGTGTCTCGCTGTCCGTG
59/59
GGCACGGATCAATGCCCAGG
OsPI1
NC_008394.4
TCCTCTCTACCCCCAACAATGG
55/56
TGGAGAAGGAAGACCTGCCAAA
OspsbA
NC_001320.1
CTGTGGGGTCGCTTCTGCAAC
58/57
TACTGGAGGGGCAGCGATGAA
OsPTF1
NC_008399.2
CGGCTGCAGAAATGTGCTGGA
58/58
TGTGCAACAGGCACACAATAGCT
OsTUB
NC_008397.2
TACCGTGCCCTTACTGTTCC
55/55
CGGTGGAATGTCACAGACAC
OsUBQ5
NC_008394.4
ACCACTTCGACCGCCACTACT
57/58
ACGCCTAAGCCTGCTGGTT
OsYSL1
NC_008397.2
GCTGAAAATAGCGCAAAATCCGTTG
57/57
AGTTACTGCACTTTTGCGCAGTC
*
Acesso obtido pelo BLASTN das sequências
foward e reverse.
43
Tabela A2. Teor (mg kg
-1
) de 18 elementos nas raízes de dois cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-
EDTA, 7 mM), cloreto férrico (FeCl
3
-EDTA, 7 mM) e citrato férrico (7 mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
B Na Mg P S K Ca Mn Fe
Canastra
Controle 46 ± 9,5 13751 ± 1076 850 ± 25 3533 ± 186 7064 ± 721 11808 ± 945 1018 ± 82 14,9 ± 0,8 108 ± 15
FeSO
4
-EDTA 58 ± 8,2 13511 ± 1361 714 ± 61 3533 ± 172 5162 ± 508 6512 ± 659 1074 ± 362 13,9 ± 1,1 992 ± 35
FeCl
3
-EDTA 54 ± 19 12012 ± 4120 745 ± 264 2977 ± 1082 4786 ± 1803 7245 ± 2559 1041 ± 800 14,2 ± 5,2 458 ± 163
Citrato 37 ± 7,2 11388 ± 2825 696 ± 173 2947 ± 720 5385 ± 1389 7106 ± 1792 680 ± 155 11,2 ± 2,4 346 ± 75
BR-IRGA
409
Controle 37 ± 4,4 11204 ± 1274 867 ± 91 3294 ± 99 6510 ± 326 10927 ± 1354 771 ± 300 14,9 ± 1,2 119 ± 14
FeSO
4
-EDTA 71 ± 15 15623 ± 1914 748 ± 52 2800 ± 218 7498 ± 713 6250 ± 544 1937 ± 851 14,6 ± 0,8 1643 ± 154
FeCl
3
-EDTA 61 ± 7,8 15995 ± 1514 888 ± 49 2457 ± 58 7411 ± 281 7432 ± 310 739 ± 318 15,9 ± 0,7 503 ± 13
Citrato 43 ± 9,6 14492 ± 4187 824 ± 64 3218 ± 274 7035 ± 1414 6943 ± 859 504 ± 100 14,1 ± 0,3 785 ± 154
Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra
Controle 0,40 ± 0,032 0,84 ± 0,021 23,3 ± 1,54 48,9 ± 4,80 77,06 ± 43,9 2,75 ± 0,29 3,841 ± 0,13 2,42 ± 0,10 0,66 ± 0,17
FeSO
4
-EDTA 0,52 ± 0,049 1,53 ± 0,635 36,8 ± 4,64 57,3 ± 5,92 46,61 ± 19,4 2,22 ± 0,06 5,123 ± 1,37 2,46 ± 0,19 1,01 ± 0,18
FeCl
3
-EDTA 0,77 ± 0,284 1,77 ± 0,440 112,2 ± 43 32,1 ± 10,6 33,88 ± 8,06 1,88 ± 0,71 4,380 ± 2,09 1,24 ± 0,42 0,75 ± 0,40
Citrato 0,94 ± 0,253 1,33 ± 0,350 39,6 ± 3,96 35,8 ± 11,9 44,82 ± 30,1 1,89 ± 0,46 3,436 ± 0,94 2,05 ± 0,64 0,76 ± 0,34
BR-IRGA
409
Controle 0,31 ± 0,034 0,73 ± 0,164 70,4 ± 11,74 54,8 ± 4,53 71,17 ± 24,5 2,51 ± 0,20 4,996 ± 0,84 3,41 ± 0,38 1,27 ± 0,28
FeSO
4
-EDTA 0,32 ± 0,005 1,32 ± 0,213 63,5 ± 4,58 65,7 ± 6,46 59,34 ± 12,3 2,57 ± 0,10 6,680 ± 1,45 3,60 ± 0,40 0,68 ± 0,11
FeCl
3
-EDTA 0,99 ± 0,082 3,02 ± 0,350 311,6 ± 30 55,3 ± 1,87 54,18 ± 22,9 2,49 ± 0,19 3,693 ± 0,70 2,19 ± 0,15 0,34 ± 0,07
Citrato 0,99 ± 0,097 1,64 ± 0,213 106,7 ± 14,3 45,0 ± 4,17 150,08 ± 77,6 2,38 ± 0,21 3,504 ± 0,10 3,36 ± 0,27 0,22 ± 0,06
44
Tabela A3. Teor (mg kg
-1
) de 18 elementos nas folhas de dois cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-
EDTA, 7 mM), cloreto férrico (FeCl
3
-EDTA, 7 mM) e citrato férrico (7 mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
B Na Mg P S K Ca Mn
Fe
Canastra
Controle 58 ± 3,5 248 ± 24 6765 ± 229 15865 ± 672 3917 ± 174 39917 ± 1218 1280 ± 61 501 ± 21
88 ± 7,,5
FeSO
4
-EDTA 86 ± 6,8 1383 ± 174 5065 ± 127 9608 ± 225 4947 ± 201 40124 ± 1354 924 ± 68 271 ± 10
325 ± 21
FeCl
3
-EDTA 49 ± 16 1673 ± 656 4243 ± 1595 6388 ± 2384 2844 ± 1024 27832 ± 10292 841 ± 303 215 ± 79
283 ± 109
Citrato 58 ± 16 966 ± 198 5073 ± 1341 7862 ± 2149 3626 ± 1002 28765 ± 7292 850 ± 215 249 ± 68
528 ± 168
BR-IRGA
409
Controle 62 ± 5,6 246 ± 65 7531 ± 424 16727 ± 1119 4207 ± 147 39887 ± 2674 1358 ± 83 352 ± 15
95 ± 6,3
FeSO
4
-EDTA 125 ± 6,2 1318 ± 280 5500 ± 234 8482 ± 428 5622 ± 242 38059 ± 905 990 ± 73 145 ± 11
325 ± 51
FeCl
3
-EDTA 79 ± 4,5 1222 ± 108 6675 ± 319 7633 ± 382 4277 ± 188 34292 ± 1404 1191 ± 142 192 ± 16
279 ± 8,8
Citrato 85 ± 10 1188 ± 154 5904 ± 382 8182 ± 325 3850 ± 123 36891 ± 2395 862 ± 74 152 ± 10
421 ± 171
Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo
Cd
Canastra
Controle 0,10 ± 0,004 0,84 ± 0,110 11,4 ± 0,72 28,4 ± 0,81 0,057 ± 0,019 4,00 ± 0,11 0,418 ± 0,03 2,58 ± 0,16
0,205 ± 0,02
FeSO
4
-EDTA 0,10 ± 0,011 0,69 ± 0,062 11,5 ± 0,38 39,0 ± 3,33 0,070 ± 0,015 3,21 ± 0,13 0,548 ± 0,14 1,52 ± 0,06
0,341 ± 0,08
FeCl
3
-EDTA 0,10 ± 0,039 0,93 ± 0,345 14,4 ± 5,55 24,8 ± 8,37 0,028 ± 0,012 2,45 ± 0,90 0,345 ± 0,09 1,07 ± 0,40
0,116 ± 0,04
Citrato 0,17 ± 0,052 1,33 ± 0,427 11,9 ± 2,47 24,5 ± 6,40 0,050 ± 0,018 2,71 ± 0,71 0,343 ± 0,10 1,65 ± 0,48
0,083 ± 0,02
BR-IRGA
409
Controle 0,06 ± 0,005 0,73 ± 0,132 19,4 ± 0,39 30,0 ± 1,96 0,186 ± 0,106 4,01 ± 0,30 0,527 ± 0,10 2,11 ± 0,08
0,108 ± 0,02
FeSO
4
-EDTA 0,08 ± 0,005 0,58 ± 0,086 18,4 ± 0,88 32,5 ± 1,35 0,086 ± 0,026 2,92 ± 0,10 0,542 ± 0,05 1,73 ± 0,27
0,130 ± 0,03
FeCl
3
-EDTA 0,10 ± 0,007 1,04 ± 0,245 32,4 ± 0,86 30,4 ± 0,78 0,050 ± 0,014 3,14 ± 0,09 0,537 ± 0,02 1,53 ± 0,12
0,103 ± 0,03
Citrato 0,14 ±0,006 1,15 ± 0,096 16,0 ± 0,36 27,1 ± 1,75 0,080 ± 0,019 3,14 ± 0,20 0,493 ± 0,03 1,46 ± 0,12
0,112 ± 0,01
45
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abichequer, A.D.; Bohnen, H (1998) Eficiência de absorção, translocação e utilização
de fósforo por variedades de trigo. Revista Brasileira de Ciência do Solo 22: 21-26
Anderson, M.E. (1985) Determination of glutathione disulfide in biological samples.
Methods in Enzymology 113: 584-555
Asada, K. (2000) The water–water cycle as alternative photon and electron sinks.
Philosophical Transactions of the Royal Society London B Biological Science 355:
1419-1431
Audebert, A.; Fofana, M. (2009) Rice Yield Gap due to Iron Toxicity in West Africa.
Journal of Agronomy & Crop Science 195: 66-76
Azambuja, I.H.V.; Venetti Jr., F.J.; Magalhães Jr., A.M. (2004) Aspectos
socioeconômicos da produção de arroz. In: Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.) Arroz
Irrigado no Sul do Brasil: Empraba Informação Tecnológica. p. 23-44
Baroli, I.; Niyogi, K.K. (2000) Molecular genetics of xanthophyll-dependent
photoprotection in green algae and plants. Philosophical Transactions of the Royal
Society London B 355: 1385-1394
Batty, L.C.; Baker, A.J.M.; Wheeler, B.D.; Curtis, C.D. (2000) The effect of pH and
plaque of Cu and Mn in Phragmites australis (Cav.) Trin ex. Steudel. Annals of
Botany 86: 647-653
Becana, M.; Moran, J.-F.; Iturbe-Ormaetxe, I. (1998) Iron-dependant oxygen free
radical generation in plants subjected to environmental stresses: toxicity and
antioxydant protection. Plant Soil 201: 137-147
Bhagwat, A.S.; Bhattacharjee, S.K. (2005) Thermoluminescence as a Tool in the
Study of Photosynthesis. Cap 2. In: Pessarakli. M. (ed.) Handbook of Photosynthesis.
2 ed. 862 p
Biesiadka, J.; Legocki, A.B. (1997) Evolution of the glutamine synthetase gene in
plants. Plant Science 128: 51-58
Bilger, W.; Schreiber, U.; Bock, M. (1995) Determination of the quantum efficiency of
photosystem II and of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in the
field. Oecologia 102: 425-432
Bode, K.; Döring, O.; Lüthje, S.; Böttger. M. (1995a) Induction of iron toxicity
symptoms in rice (Oryza sativa L.). Mitteilungen aus dem Institut für allgemeine
Botanik in Hamburg 25:35-43
Bode, K.; Döring, O.; Lüthje, S.; Neue, H.-U.; Böttger, M. (1995b) The role of active
oxygen in iron tolerance of rice (Oryza sativa L.). Protoplasma 184: 249-255
Briat JF, Fobis-Loisy I, Grignon N, Lobreaux S, Pascall N, Savino G, Thoiron S, Von
Wiren N, Wuytswinkel O (1995) Cellular and molecular aspects of iron metabolism in
plants. Biology of the Cell 84:69-81
Briat, J.-F.; Curie, C.; Gaumard, F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants.
Current Opinion in Plant Biology 10: 276-282
46
Briat, J.-F.; Duc, C.; Ravet, K., Gaymard, F. (2010a) Ferritins and iron storage in plants.
Biochimica et Biophysica Acta 1800: 806-814
Briat, J.-F.; Lobréaux, S. (1997) Iron Transport and storage in plants. Trends in Plant
2: 187-193
Briat, J.-F.; Ravet, K.; Arnaud, N.; Duc, C.; Boucherez, J; Touraine, B.; Cellier, F.;
Gaymard, F. (2010b) New insights into ferritin synthesis and function highlight a link
between iron homeostasis and oxidative stress in plants. Annals of Botany 105: 811-
822
Bruggemann, W.; Maass-Kantel, K.; Moog, P. R. (1993) Iron uptake by leaf mesophyll
cells: the role of the plasma membrane bound ferric-chelate reductase. Planta 190:151-
155
Bughio, N.; Yamaguchi, H.; Nishizawa, N.K.; Nakanishi, H.; Mori, S. (2002) Cloning
an iron regulated metal transporter from rice. Journal of Experimental Botany 53:
1677-1682
Carlberg, I.; Mannervik, B. (1985) Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113:484-
490
Cataldo, D.A.; Mcfadden, K.M.; Garland, T.R.; Willdung, R.E. (1988) Organic
constituents and complexation of nickel (II), iron (III), cadmium (II), and plutonium
(IV) in soybean xylem exudates. Plant Physiology 86:734-739
Chen, R.F.; Shen, R.F.; Gu, P.; Dong, X.Y.; Du, C.W.; Ma, J.F. (2006) Response of
Rice (Oryza sativa) with Root Surface Iron Plaque Under Aluminium Stress. Annals of
Botany 98: 389-395
Cordeiro, A.C.C.; Medeiros, R.D. (2008) Cultivares de Arroz Irrigado
Recomendadas para Roraima. Circular Técnica 03: Embrapa Roraima p. 1-12
Counce, P.; Keisling, T.C.; Mitchell, A.J. (2000) A uniform, objective, and adaptive
system for expressing rice development. Crop Science 40: 436-443
Curie, C.; Briat, J.F. (2003) Iron transport and signaling in plants. Annual Review of
Plant Biology 54: 183-206
Curie, C.; Panaviene, Z.; Loulergue, C.; Dellaporta, S.L.; Briat, J.-F.; Walker, E.L.
(2001) Maize yellow stripe1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III)
uptake. Nature 409: 346-349
Demmig-Adams, B.; Adams, W.W (1996) The role of xanthophyll cycle carotenoids in
the protection of photosynthesis. Trends in Plant Science 1: 21-26
Deng, H.; Ye, Z.H.; Wong, M.H. (2009) Lead, zinc and iron (Fe
2+
) tolerances in
wetland plants and relation to root anatomy and spatial pattern of ROL. Environmental
and Experimental Botany 65: 353-362
Dobermann, A.; Fairhurst, T. (2000) Toxicidad de hierro en arroz. In: Dobermann, A.;
Fairhurst, T. (Eds.). Rice: nutrient disorders & nutrient management. Potash and
Phosphate Institute and International Rice Research Institute. p. 1-4
Doran, G.; Eberbach, P.; Helliwell, S. (2006) The impact of rice plant roots on the
reducing conditions in flooded rice soils. Chemosphere 63: 1892-1902
Edge, R.; McGarvey, D.J.; Truscott, T.G. (1997) The carotenoids as anti-oxidants – a
review. Journal of Photochemistry and Photobiology 41: 189-200
47
Ehleringer, J. (1981) Leaf absorptances of Mohave and Sonoran desert plants.
Oecologia 102: 366-370
Eide, D.; Broderius, M.; Fett, J.P.; Guerinot, M.L. (1996) A novel iron-regulated metal
transporter from plants identified by functional expression in yeast. Proceeding of the
National Academy Science 93: 5624-5628
Engel, K. (2009) Efficiency of adaptation mechanisms of rice to diverse conditions
of iron toxicity. In: The Proceedings of the International Plant Nutrition. Colloquim
XV!, University Of California, Davis. p 1372-1376
Eskling, M.; Arvidsson, P.-O.; Akerlund, H.-E. (1997) The xanthophyll cycle, its
regulation and components. Physiologia Plantarum 100: 806-816
Fageria, N.K.; Santos, A.B.; Barbosa Filho, M.P.; Guimarães, C.M. (2008) Iron toxicity
in lowland rice. Journal of Plant Nutrition 31: 1676-1697
Fang, W.; Wang, J.; Lin, C.; Kao, C. (2001) Iron induction of lipid peroxidation and
effects on antioxidative enzyme activities in rice leaves. Plant Growth Regulation 35:
75-80
Fox, T.C.; Guerinot, M.L (1998) Molecular biology of cation transport in plants.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49: 669-696
Foyer, C.H.;Halliwell, B. (1976) The presence of glutathione and glutathione reductase
in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta 133:21-25
Gallego, S.M.; Benavides, M.P.; Tomaro, M.L. (1996) Effect of heavy metal ion excess
on sunflower leaves: evidence for involvement of oxidative stress. Plant Science
121:151-159
Genon, J.; Hepcée, N.; Duffey, J.; Delvaux, B.; Hennebert, P. (1994) Iron toxicity and
other chemical soil constraints to rice in highland swamps of Burundi. Plant and Soil
166: 109-115
Genty, B.; Briantais, J.M.; Baker, N.R. (1989) The relatíonship between the quantum
yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence.
Biochimica et Biophysica Acta 990: 87-92
Giaquinta R T (1980) Translocation of sucrose and oligosaccharides. In: Preiss, J. (ed.),
The Biochemistry of Plants Vol. 3. Academic Press, New York.
Gilmoré, A.M.; Hazlett, T.L.; Govindjee (1995) Xanthophyll cycle-dependent
quenchiinq of photosystem II chlorophyll a fluorescence: Formation of a quenching
complex qith a short fluorescence lifetime. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2273-2277
Greenland, D.J.; De Datta, S.K. (1985) Constraint to rice production and wetland
soils characteristics. International Rice Research Institute. Wetland soils:
Characetrization, classification e utilization. 559 p
Gross, J.; Stein, R.J.; Fett-Neto, A.G.; Fett, J.P. (2003) Iron homeostasis related genes
in rice. Genetics and Molecular Biology 26: 477-497
Grotz, N.; Guerinot, M.L. (2006) Molecular aspects of Cu, Fe and Zn homeostasis in
plants. Biochimica et Biophysica Acta 1763 :595-608
Guerinot, M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Biochimica et Biophysica
Acta 1465: 190-198
48
Havir, E.A.; McHale, N.A. 1987. Biochemical and developmental characterization of
multiple forms of catalase in tobacco leaves. Plant Physiology 84: 450-455
Heber, U. (2002) Irrungen, Wirrungen? The Mehler reaction in relation to cyclic
electron transport in C3 plants. Photosynthesis Research 73: 223-231
Hell, R.; Stephan, U.W. (2003) Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants.
Planta 216: 541-551
Hendrikson, L.; Furbank, R.; Chow, W.S. (2004) A simple alternative approach to
assessing the fate of absorbed light energy using chlorophyll fluorescence.
Photosynthesis Research 82: 73-81
Hirsch, J.; Marin, E.; Floriani, M.; Chiarenza, S.; Richaud, P.; Nussaume, L.; Thibaud,
M.C. (2006) Phosphate deficiency promotes modification of iron distribution in
Arabidopsis plants. Biochimie 88: 1767-1771
Hose, E.; Clarkson, D.T.; Steudle, E.; Schreiber, L.; Hartung, W. (2001) The exordemis:
a variable apoplastic barrier. Journal of Experimental Botany 52:2245-2264
Howeler, R.H. (1973) Iron- induced oranging disease of rice in relation to
physicochemical changes in flooded oxisol. Soil Science Society of American
Procedment 37: 898-903
Inoue, H.; Kobayashi, T.; Nozoye, T.; Takahashi, M.; Kakei, Y.; Suzuki, K.; Nakazono,
M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa, N.K. (2009) Rice OsYSL15 Is an Iron-regulated
Iron(III)-Deoxymugineic Acid Transporter Expressed in the Roots and Is Essential for
Iron Uptake in Early Growth of the Seedlings. The Journal of Biological Chemistry
284: 3470-3479
Ishimaru, Y.; Suzuki, M.; Tsukamoto, T.; Suzuki, K.; Nakazono, M.; Kobayashi, T.;
Wada, Y.; Watanabe, S.; Matsuhashi, S.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.;
Nishizawa, N.K. (2006) Rice plants take up iron as an Fe
3+
-phytosiderophore and as
Fe
2+
. The Plant Journal 45: 335-346
Jaleel, C.A. (2009) Non-Enzymatic Antioxidant Changes in Withania somnifera with
Varying Drought Stress Levels. American-Eurasian Journal of Scientific Research 4
(2): 64-67
Jeong, J.; Connolly, E.L. (2009) Iron uptake mechanisms in plants: Functions of the
FRO family of ferric reductases. Plant Science 176: 709-714
Jin, E.; Yokthongwattana, K.; Polle, J.E.W.; Melis, A. (2003) Role of reversible
xanthophyll cycle in the PSII damage and repair cycle in Dunaliella salina. Plant
Physiology 132:352-364
Karnovsky, M. J. (1965) A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for
use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology 27: 136-137
Khamis S, Chaillou S, Lamaze T (1990) CO
2
assimilation and partitioning in maize
plants deprived of orthophosphate. Journal of Experimental Botany 41:1619-1625
Kim, S.A.; Guerinot, M.L. (2007) Mining iron: Iron uptake and transport in plants.
FEBS Letters 581: 2273-2280
Klughammer, C.; Schreiber, U. (2008) Complementary PS II quantum yields calculated
from simple fluorescence parameters measured by PAM fluorometry and the Saturation
Pulse method. PAM Application notes 1: 27-35
49
Koike, S.; Ionue, H.; Mizuno, D.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa,
N.K. (2004) OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is regulated by iron
and expressed in the phloem. The Plant Journal 39: 415-424
Koshiba, T. (1993) Cytosololic ascorbato peroxidase in seedling and leaves of maize
(Zea mays). Plant, Cell and Physiology 34: 713-721
Kramer, D.M.; Johnson, G.; Kiirats, O.; Edwards, G.E. (2004) New fluorescence
parameters for the determination of Q
A
redox state and excitation energy fluxes.
Photosynthesis Research 79: 209-218
Krinsky, N.I.; Yeum, K.-J. (2003) Carotenoid–radical interactions. Biochemical and
Biophysical Research Communications 305: 754-760
Lahner, B.; Gong. T.; Mahmoudian, M.; Smith, E.L.; Abid, K.B.; Rogers, E.E.;
Guerinot, M.L.; Harper, I.F.; Ward, J.M.; Meintyre, L.; Schroeder, J.I.; Salt, D.E.
(2003) Genomic scale profiling of nutrients and trace elements in Arabidopsis thaliana.
Nature Biotechnology 21:1215-1225
Laisk, A.; Loreto, F. (1996) Determining photosynthetic parameters from leaf CO
2
exchange and chlorophyll fluorescence. Plant Physiology 110: 903-912
Liu, Y.; Tam, N.F.Y.; Yang, J.X.; Pi, N.; Wong, M.H.; Ye, Z.H. (2009) Mixed heavy
metals tolerance and radial oxygen loss in mangrove seedlings. Marine Pollution
Bulletin 58:1843-1849
Liu, H.; Zhang, J.; Christiec, P.; Zhang, F. (2008) Influence of iron plaque on uptake
and accumulation of Cd by rice (Oryza sativa L.) seedlings grown in soil. Science of
the Total Environment 394: 361-368
Lupínková, L.; Komenda, J. (2004) Oxidative modifications of the photosystem II D1
protein by reactive oxygen species: from isolated protein to cyanobacterial cells.
Photochemistry and Photobiology 79: 152-162
Ma, J.F.; Shinada, T.; Matsuda, C.; Nomoto, K. (1995) Biosynthesis of
phytosiderophores, mugineic acids, assiciated with methionine cycling. The Journal of
Biological Chemistry 270:16549-165554
Majerus, V.; Bertin, P.; Lutts, S. (2009) Abscisic acid and oxidative stress implications
in overall ferritin synthesis by African rice (Oryza glaberrima Steud.) seedlings
exposed to short term iron toxicity. Plant Soil 324: 253-265
Marschner, H. (1995) Functions of mineral nutrients: macronutrients. In: Mineral
nutrition of higher plants. London: Academic Press. p 229-312
Mino, Y.; Ishida, T.; Ota, N.; Inoue, M.; Nomoto, K.; Takemoto, T.; Tanaka, H.;
Sugiura, Y. (1983) Mugineic acid-iron (III) complex and its structurally analogous
cobalt(III) complex: characterization and implication for absorption and transport of
iron in gramineous plants. Journal of the American Chemical Society 105: 4671-4676
Mishra, S.; Dubey, R.S. (2005) Heavy metal toxicity induced alterations in
photosynthetic metabolism in plants. Cap 45. In: Pessarakli. M. (ed.) Handbook of
Photosynthesis. 2 ed. 862 p
Mori, S. (1999) Iron acquisition by plants. Current Opinion in Plant Biology 2: 250-
253
50
Murgia, I.; Delledonne, M.; Soave, C. (2002). Nitric oxide mediates iron-induced
ferritin accumulation in Arabidopsis. The Plant Journal 30: 521-528
Nakano, Y.; Asada, K. (1981) Hydrogen peroxide is scavended by ascorbato-specific
peroxidades in spinach chloroplasts. Plant, Cell and Physiology 22: 867-880.
Nenova, V.R. (2009) Growth and photosynthesis of pea plants under different iron
supply. Acta Physiologiae Plantarum 31: 385-391
Niyogi, K.K.; Björkman, O.; Grossman, A.R. (1997) The roles of specific xanthophylls
in photoprotection. Proceedings of the National Academy of Sciences 94: 14162-
14167
Noctor, G.; Foyer, C.H. (1998) Ascorbate and Glutathione: keeping active oxygen
under control. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology
49:249-79
Olaleye, A.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Odeleye, F.O. Dada, O.A.; Senjobi, B.A.
(2009) Elemental Composition of Two Rice Cultivars under Potentially Toxic on
Aquept and Aquent. Notulae Scientia Biologicae 1: 46-49
Olaleye, A.O.; Tabi, F.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Sahrawat, K.L. (2001) Effect
of toxic iron concentrations on the growth of lowlands rice. Journal of Plant Nutrition
24: 441 - 457
Ottow, J.C.G.; Benckiser, G.; Watanabe, I.; Santiago, S. (1983) Multiple nutritional soil
stress as the prerequisite for iron toxicity of wetland rice (Oryza sativa L.). Tropical
Agriculture 60: 102-106
Oxborough, K. (2004) Imaging of chlorophyll a fluorescence: theoretical and practical
aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance.
Journal of Experimental Botany 55(400): 1195-1205
Oxborough, K.; Baker, N.R. (1997) An instrument capable of imaging chlorophyll a
fluorescence from intact leaves at very low irradiance and at the cellular and sub-
cellular levels of organization. Plant, Cell and Environment 20: 1473-1483
Peixoto, P.H.P.; Cambraia, J.; Santanna, R.; Mosquim, P.R.; Moreira, M.A. (1999)
Aluminum effects on lipid peroxidation and on the activities of enzymes of oxidative
metabolism in sorghum. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 11: 137-143
Pereira, E.G. (2009) Efeitos tóxicos do ferro: alterações fisiológicas e morfológicas
em plantas cultivadas e de restinga. Tese de Doutorado: Universidade Federal de
Viçosa.117 p
Pereira, E.G.; Oliva, M.A.; Kuki, K.N.; Cambraia, J. (2008) Photosynthetic changes and
oxidative stress caused by iron ore dust deposition in the tropical CAM tree Clusia
hilariana. Trees 23: 277-285
Plesnicar, M.; Kastori, R.; Petrovic, N.; Pankovic, D. (1994) Photosynthesis and
chlorophyll fluorescence in sunflower (Helianthus annus L.) leaves as affected by
phosphorus nutrition. Journal of Experimental Botany 45:919-924
Polyakov, N.E.; Kruppa, A.I.; Leshina, T.V.; Konovalova, T.A.; Kispert, L.D. (2001)
Carotenoids as Antioxidants: Spin Trapping EPR and Optical Study. Free Radical
Biology & Medicine 31: 43-52
51
Ponnamperuma, F.N. (1972) The chemical of submerged soils. Advances in
Agronomy 24: 29-96
Ravet, K.; Touraine, B.; Boucherez, J.; Briat, J.-F.; Gaymard, F.; Cellier, F. (2009)
Ferritins control interaction between iron homeostasis and oxidative stress in
Arabidopsis. The Plant Journal 57: 400-412
Robinson, N.J.; Proctor, C.M.; Connolly, E.L.; Guerinot, M.L. (1999) A ferric chelate
reductase for iron uptake from soils. Nature 397: 694-697
Sahrawat, K.L. (2005) Managing iron toxicity in lowland rice: the role of tolerant
genotypes and plant nutrients. In: Toriyama, K.; Heong, K.L.; Hardy, B. (Eds.). Rice
is life: scientific perspectives for the 21st century: Proceedings of the World Rice
Research Conference. Tsukuba, Japan. pp. 452-454
Scandalios, J.G. (1993) Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology
101: 7-12
Schmidt, W. (2003) Iron solutions: acquisition strategies and signaling pathways in
plants. Trends in Plant Science 8: 188-193
Shojima, S.; Nishizawa, N.K.; Tushiya, S.; Nozoe, S.; Trifune, T.; Mori, S. (1990)
Biosynthesis of phytosiderophores In vitro byiosynthesis of 2”-deoxymugineic acid
from l-methionine and nicotianamine Plant Physiology 93:1497-1503
Silveira, V.C.; Oliveira, A.P.; Sperotto, R.A.; Amaral, L.; Dias, J.F.; Cunha, J.B.; Fett,
J.P. (2007) Influence of iron on mineral status of two rice (Oryza sativa L.) cultivars.
Brazilian Journal of Plant Physiology 19: 127-139
Sinha, A.; Saxena, R. (2006) Effect of iron on lipid peroxidation, and enzymatic and
non-enzymatic antioxidants and bacoside-A content in medicinal plant Bacopa monnieri
L. Chemosphere 62:1340-1350
Sinha, S.; Gupta, M.; Chandra, P. (1997) Oxidative stress induced by iron in Hydrilla
verticillata (l.f.) Royle: responde of antioxidants. Ecotoxicology and Environmental
Safety 38: 286-291
Smirnoff, N. (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway
engineering and functions. In: Smirnoff, N. (Ed.) Antioxidants and reactive oxygen
species in plants. Blackwell Publishing Ltd. p. 53-86
Snowden, R.; Wheeler, B.D. (1995) Chemical changes in selected wetland plant species
with increasing Fe supply, with specific reference to root precipitates and Fe tolerance.
New Phytologist 131: 503-520
Soares, A.A.; Cornélio, V.M.O.; Soares, P.C.; Reis, M.S. (1997) Canastra e Confiança:
Cultivares melhorados de arroz para plantio em condições de sequeiro tradicional e
irrigado por aspersão. Revista Ceres 44: 230-240
Sousa, R.O.; Gomes, A.S.; Vahl, L.C. (2004) Toxidez por ferro em arroz irrigado. In:
Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.) Arroz Irrigado no Sul do Brasil: Empraba
Informação Tecnológica. p. 305-337
Souza-Santos, P.; Ramos, R.S.; Ferreira, S.T.; Carvalho-Alves, P.C. (2001) Iron
induced oxidative damage of corn root plasma membrane H
+
-ATPase. Biochimica et
Biophysica Acta 1512: 357-366
52
Spiller, S.; Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. II. Iron stress
diminishes photochemical capacity by reducing the number of photosynthetic units.
Plant Physiology 65: 121-125
Suh, H.-J.; Kim, C.S.; Lee, J.-Y.; Jung, J. (2002) Photodynamic effect of iron excess on
photosystem II function in pea plants. Photochemistry and Photobiology 75(5): 513-
518
Tanaka, A.; Loe, R.; Navasero, S.A. (1966) Some mecanisms involved in the
development of iron toxicity symptoms in the Rice plant. Soil Science and Plant
Nutrition 12: 32-38
Taylor, G. J.; Crowder, A. A.; Rodden, R. (1984) Formation and morphology of an iron
plaque on the roots of Typha latifolia L. grown in solution culture. American Journal
of Botany 71(5): 666-675
Taylor, G.J.; Crowder, A.A. (1983) Use of the DCB technique for extraction of hydrous
iron oxides from roots of wetland plants. American Journal of Botany 70: 1254-1257
Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. I. Use of iron stress to control
photochemical capacity in vivo. Plant Physiology 65: 114-120
Thipyapong, P.; Melkonian, J.; Wolfe, D.W.; Steffens, J.C. (2004): Suppression of
polyphenol oxidases increases stress tolerance in tomato. Plant Science 167: 693-704
Thompson, J.E.; Ledge, R.L.; Barber, R.F. (1987) The role of free radicals in
senescence and wounding. New Phytologist 105: 317-344
Vansuyt, G.; Lopez, F.; Inzé, D.; Briat, J.F.; Fourcroy, P. (1997) Iron triggers a rapid
induction of ascorbate peroxidase gene expression in Brassica napus. FEBS Letter
410: 1195-1200
Varotto, C.; Maiwald, D.; Pesaresi, P.; Jahns, P.; Salamini, F.; Leister, D. (2002) The
metal ion transporter IRT1 is necessary for iron homeostasis and efficient
photosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 31: 589-599
Wilson, A.; Boulay, C.; Wilde, A.; Kerfeld, C.A.; Kirilovsky, D. (2007) Light-Induced
Energy Dissipation in Iron-Starved Cyanobacteria: Roles of OCP and IsiA Proteins. The
Plant Cell 19: 656-672
Wingler, A.; Lea, P.J.; Quick, W.P.; Leegood, R.C. (2000) Photorespiration: Metabolic
pathways and their role in stress protection. Philosophical Transactions of the Royal
Society London B: Biological Science 355:1517-1529
Yamauchi, M.; Peng, X.X. (1995) Iron toxicity and stress induced ethylene production
in rice leaves. Plant and Soil 173: 21-28
Zhao, S.; Fernald, R.D. (2005) Comprehensive algorithm for quantitative real-time
polymerase chain reaction. Journal of Computational Biology 12(8): 1045-62
Zheng, L.; Huang, F.; Narsai, R.; Wu, J.; Giraud, E.; He, F.; Cheng, L.; Wang, F.; Wu,
P.; Whelan, J.; Shou, H. (2009) Physiological and transcriptome analysis of iron and
phosphorus interaction in rice seedlings.
Plant Physiology 151: 262-274
53
CAPÍTULO 2
FOTOSSÍNTESE E FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a COMO
FERRAMENTAS DE SELEÇÃO DE CULTIVARES DE ARROZ
RESISTENTES AO FERRO
54
1. INTRODUÇÃO
O excesso de ferro (Fe) nas plantas induz alterações nos mecanismos envolvidos
no processo fotossintético (Becana et al., 1998; Fang et al., 2001; Souza-Santos et al.,
2001; Briat et al., 2007), sendo um dos mais importantes estresses abióticos que limitam
a produção de arroz em cultivo irrigado (Dobermann e Fairhurst, 2000; Sahrawat, 2005;
Fageria et al., 2008; Olaleye et al., 2001, 2009; Audebert e Fofana, 2009).
Sob condições aeróbicas, o ferro é comumente encontrado nos solos em sua forma
trivalente (Fe
3+
). Porém, em solos irrigados caracterizados por condições anaeróbicas e
baixo pH (Ponnamperuma, 1972; Guerinot e Yi, 1994; Sousa et al., 2004), grande parte
deste elemento pode ser reduzido a Fe
2+
. Nessa forma, ocorre aumento da
disponibilidade de ferro para as plantas, onde, além da toxidez pela absorção excessiva
(Fang et al., 2001; Sahrawat, 2005), pode promover desordens nutricionais (Ottow et
al., 1983, Genon et al., 1994; Snowden e Wheeler, 1995; Olaleye et al., 2001, 2009;
Silveira et al., 2007; Audebert e Fofana, 2009) compromentendo o equilíbrio fisiológico
das plantas. A toxidez pelo ferro é caracterizada visualmente por manchas necróticas
nas folhas e escurecimento das raízes, promovendo inibição do crescimento da planta
(Dobermann e Fairhurst, 2000). Dentre os nutrientes essenciais, a diminuição na
absorção de P, K, Ca e Mg tem sido relatada para cultivares de arroz sensíveis ao
excesso de Fe (Silveira et al., 2007).
Uma vez na parte aérea, o ferro tem sido responsabilizado por induzir alterações
nos mecanismos fisiológicos (Briat et al., 2007). Dentre essas alterações, o Fe pode
potencializar o estresse oxidativo (Becana et al., 1998; Fang et al., 2001; Souza-Santos
et al., 2001) ocasionando desestruturação de complexos protéicos fotossintetizantes
(Spiller e Terry, 1980; Suh et al., 2002; Lupínková e Komenda, 2004) e redução na
assimilação líquida de carbono (Terry, 1980; Backhausen et al., 2000; Mishra e Dubey,
2005; Dhir et al, 2008; Pereira et al., 2009; Pereira, 2009). Nessas condições, ocorre
acúmulo de excesso de energia, o qual pode ser dissipado por processos celulares
alternativos, como a fotorrespiração (Wingler et al., 2000; Ort e Baker, 2002), o ciclo
água-água (Asada, 2000; Cruz et al., 2004) ou o fluxo cíclico de elétrons (Heber, 2002;
Joliot e Joliot, 2006). O transporte cíclico de elétrons promove o aumento do gradiente
de prótons no tilacóide, o qual favorece a dissipação não fotoquímica (NPQ) e a
oxidação parcial do P
700
(Golding e Johnson, 2003). O NPQ permite a dissipação
55
térmica de energia, importante para prevenir a superexcitação do fotossitema II
(Maxwell e Johnson, 2000; Heber et al., 2001).
Para sustentar o crescimento e evitar a toxicidade do ferro celular, as plantas
dependem da capacidade de armazenar e remobilizar o ferro (Briat et al., 2007). A
resistência ao excesso de Fe em plantas de arroz pode ser uma conseqüência de exclusão
de Fe e/ou tolerância a altas concentrações de Fe interno. Dentre os mecanismos
envolvidos na tolerância a esse metal, destaca-se o seqüestro do elemento na forma de
ferritina (Briat e Lobréaux, 1997; Gross et al., 2003; Majerus et al., 2007, 2009). No
entanto, diferentes cultivares variam amplamente em sua capacidade de enfrentar o
excesso de Fe. Com isso, tem sido sugerido que a manutenção dos níveis de nutrientes
essenciais, das taxas fotossintéticas e principalmente o controle da expressão gênica em
condições de excesso de Fe, contribuiriam para caracterizar fenótipos tolerantes.
O Fe
+2
, em concentrações tóxicas, é capaz de produzir alterações na absorção de
nutrientes, trocas gasosas e respostas enzimáticas controladas possivelmente por um
sistema de sinais que induzem expressões gênicas específicas. Atualmente os estudos
mais avançados de resistência de linhagens de arroz à toxidez por Fe estão sendo
realizados através da identificação de genes associados à toxidez, que podem ser
utilizados como marcadores moleculares. Todavia, o desconhecimento dos mecanismos
fisiológicos que desencadeiam a toxidez tem sido um obstáculo para a utilização dessa
técnica (Sousa et al., 2004). Desta forma, o presente trabalho propõe verificar, através
de parâmetros fisiológicos, bioquímicos e moleculares, uma possível resistência à níveis
tóxicos de ferro, em cultivares de arroz de diferentes procedências.
56
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Condições de cultivo e Aplicação do tratamento
Sementes de arroz (Oryza sativa L.), cultivares Canastra, BRSMG Curinga, BR-
IRGA 409 e IRGA 419, foram desinfestadas superficialmente com hipoclorito de sódio
comercial (10%) por 10 min e germinadas em câmara de crescimento (27 ± 2º C) por 7
dias no escuro e 7 dias com fotoperíodo de 12 h. As plântulas foram transferidas para
solução nutritiva de Hoagland (pH 4,0, força total) em casa-de-vegetação. O pH foi
ajustado a cada dois dias com KOH e/ou HCl e a solução renovada semanalmente.
Após aproximadamente 30 dias, as plantas no estádio V5 de desenvolvimento
fenológico (Counce et al., 2000), foram submetidas aos tratamentos com sulfato ferroso
(FeSO
4
) na concentração de cultivo (0,019 mM) e sob excesso de sulfato ferroso
(FeSO
4
, 7 mM, Pereira (2009)) com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (p/p).
Cada tratamento foi constituído por quatro repetições, sendo o pH ajustado diariamente
a 4,0 e a solução renovada a cada 4 dias. As avaliações foram realizadas após sete dias
de exposição ao excesso de ferro.
2.2. Variáveis Analisadas
2.2.1. Absorção do ferro e composição mineral do material vegetal
Para a quantificação do teor de nutrientes nas folhas e raízes, o material vegetal
foi seco e moído em moinho tipo Wiley. Para minimizar qualquer interferência na
quantificação de nutrientes na matéria seca das raízes, estas foram previamente lavadas
em solução contendo ditionito de sódio, citrato de sódio e bicarbonato de sódio (Taylor
e Crowder, 1983).
O material vegetal moído foi digerido em HNO
3
concentrado, à 118 ºC por 4
horas, e, em seguida diluído em água. A análise da composição mineral foi realizada
utilizando a técnica de espectrometria de massas com fonte de plasma indutivamente
acoplado (ICP-MS) de acordo com Lahner et al. (2003). O teor dos minerais (mg kg
-1
)
determinados foram: magnésio (Mg), fósforo (P), enxofre (S), potássio (K), sódio (Na),
cálcio (Ca), boro (B), cobalto (Co), manganês (Mn), molibdênio (Mo), ferro (Fe), níquel
(Ni), cobre (Cu), zinco (Zn), arsênio (As), cádmio (Cd), estrôncio (Sr) e rubídio (Rb).
A partir dos teores de ferro obtidos, calculou-se o acúmulo de Fe nas raízes (AR)
(Liu et al., 2008) e na parte aérea (AP) (Abichequer e Bohen, 1998) pela razão entre o
57
conteúdo de ferro na parte aérea (CPA) ou nas raízes (CSR) pelo teor de ferro na planta
inteira, como sendo:
AR (%) = [CSR / (CPA + CSR)] * 100
AP (%) = [CPA / (CPA+CSR)] * 100
2.2.2. Determinação das trocas gasosas
As medições de trocas gasosas foram realizadas em folhas completamente
expandidas. As variáveis, taxa de assimilação fotossintética líquida (A), condutância
estomática (g
s
), taxa de transpiração (E) e a razão entre concentração interna e externa
de CO
2
(C
i
/C
a
) foram determinadas por um analisador de gás por infravermelho (IRGA;
modelo portátil LI-6400xt, LI-COR Biosciences Inc., Lincon, Nebraska, USA). As
medições foram realizadas entre 8:00 e 11:30 a.m., utilizando radiação
fotossinteticamente ativa (PAR) constante (1000 μmol fótons m
-2
s
-1
), concentração
atmosférica de CO
2
(C
a
) (~400 μmol mol
-1
), temperatura (24 - 28 ºC) e umidade
ambiente (50 - 68 %).
Respostas de A em função de Ci (curva A/C
i
) foram obtidas pela injeção de
diferentes concentrações de CO
2
na câmara, controladas automaticamente por um
dispositivo injetor do LI-6400xt (6400-01 CO
2
injector; LI-COR, USA) utilizando-se
cartuchos de 12 g de CO
2
sob alta pressão. As medições da curva A/C
i
foram realizadas
em nove níveis de CO
2
(50, 100, 200, 400, 700, 1000, 1300, 1600 e 2000 µmol mol
-1
),
sob nível de irradiância de 1000 µmol fótons m
-2
s
-1
, em intervalo de 2 a 3 minutos entre
as leituras, nas mesmas condições ambientais descritas acima.
2.2.3. Avaliação carboxilativa e regeneração da RuBP
A taxa máxima de carboxilação (Vc,max) da enzima carboxilase/oxigenase da
ribulose-1,5 bisfostato (Rubisco), a taxa de transporte de elétrons dirigindo a
regeneração da ribulose-1,5 bisfostato (RuBP) (Jmax) e a utilização da triose fosfato
(V
TPU
) foram calculadas segundo Long e Bernacchi (2003) e Sharkey et. al. (2007). Para
os cálculos foram utilizados os parâmetros de trocas gasosas, temperatura foliar, pressão
atmosférica e curva A/C
i
corrigida:
A
corrigido
= A – [(0.00171 x CO
2
S) - 1.2519]
Ci
corrigido
= [(gCO
2
- (E/2000)) x CO
2
S - A
corrigido
]/[ gCO
2
+ (E/2000)]
gCO
2
= 1 / [(1.6/g
S
) + ((1.37 x 1) / BLCond)]
onde, BLcond representa a condutância da camada limítrofe, obtido pelo IRGA.
58
A partir desses dados, o V
c,max
, J
max
e V
TPU
foram estimados pelas seguintes
equações:
(1) A = Vc,Max C
c
– Γ* - R
d
C
c
+ K
c
(1+ O/K
o
)
Onde, C
c
é a pressão parcial de CO
2
da Rubisco, K
c
é a constante de Michaelis da
Rubisco para o dióxido de carbono, O é a pressão parcial de O
2
na Rubisco e K
o
é a
constante de inibição da Rubisco para o oxigênio. Desta forma, V
c,max
representa a
inclinação da curva A/C
i
e -R
d
o intercepto (Long e Bernacchi, 2003).
Quando A é limitada pela regeneração da RuBP,
(2) A = J C
c
– Г* - R
d
4C
c
+ 8Г*
onde J é a taxa de transporte de elétrons. Esta equação assume quatro elétrons por
carboxilação e oxigenação.
Quando A é limitada pela TPU,
(3) A = 3 TPU - R
d
onde TPU é a taxa de uso das triose fosfatos.
2.2.4. Determinação da fotorrespiração in vivo
A fotorrespiração foi obtida a partir dos dados de trocas gasosas e fluorescência
da clorofila a, de acordo com Epron et al. (1995) e Valentini et al. (1995). Para os
cálculos assumiu-se que o fluxo de elétrons linear é levado a carboxilação e oxigenação
da ribulose-1 ,5-bifosfato (ou seja, todos os outros processos consumindo os elétrons de
luz dirigido são desprezíveis), quatro elétrons são necessários para cada ciclo de
carboxilação ou oxigenação e uma molécula de CO
2
é lançada a cada dois ciclos de
oxigenação por descarboxilação da glicina na fotorrespiração. Assim:
J
t
= (F
m
’-F
s
)/F
m
’.PAR.0,454
J
c
= 1/3 [J
t
+ 8 (A + R
d
)]
J
o
= 2/3 [J
t
- 4 (A + R
d
)]
Rl = [J
t
- 4 (A + R
d
)] /12
onde J
t
é a taxa total de transporte de elétrons através do FSII da fotossíntese e
fotorrespiração; (F
m
’-F
s
)/F
m
’ é o rendimento quântico efetivo do fluxo linear de elétrons
pelo FSII; PAR é o fluxo de fótons (µmol m
-2
s
-1
) incidente sobre a folha; 0,454
representa a proporção de quanta utilizados pelos centros de reação do FSII (Melis et
al., 1987), respectivamente; J
c
e J
o
são os elétrons atribuídos às reações de carboxilação
59
e oxigenase da RuBP, respectivamente; A é a taxa de assimilação líquida de CO
2
; R
d
é a
taxa de respiração no escuro e Rl é a taxa de produção de CO
2
em fotorrespiração.
2.2.5. Fluorescência da clorofila a
As variáveis de fluorescência da clorofila a foram obtidas com auxílio do IRGA
(LI-6400xt, LI-COR) na mesma área da folha em que foram realizadas as medições das
trocas gasosas. Para as avaliações as folhas foram adaptadas ao escuro para que os
centros de reação estivessem completamente abertos (todos os aceptores primários
oxidados) com perda de calor mínima. As variáveis de indução da fluorescência obtidas
foram: fluorescência inicial (F
0
) e fluorescência máxima (F
m
). A partir desses valores
foi obtido o rendimento quântico potencial do fotossistema II (FSII), F
v
/F
m
= (F
m
-F
0
)/F
m
(Genty et al., 1989). As variáveis da fase lenta de indução da fluorescência foram
obtidas seqüencialmente com a aplicação de uma iluminação actínica e um pulso de luz
actínica saturante para a determinação das variáveis: fluorescência em amostra adaptada
à luz antes do pulso de saturação (F) e fluorescência máxima em amostra adaptada à luz
(F
m
’). A partir desses parâmetros foi possível calcular a fluorescência mínima do tecido
vegetal iluminado, F
0
’ = F
0
/[((F
m
-F
0
/F
m
)+(F
0
/F
m
’)] (Oxborough e Baker, 1997), para o
cálculo do coeficiente de extinção fotoquímico pelo modelo lake, o qual fornece uma
estimativa de centros de reações abertos do FSII, q
L
= (F
m
’-F)/(F
m
’-F
0
’).(F
0
’/F) (Kramer
et al., 2004). O rendimento quântico efetivo de conversão fotoquímica de energia no
PSII, Y
II
= (Fm’-F)/Fm’; e os rendimentos quântico da dissipação de energia regulada,
Y
NPQ
= (F/Fm’) - (F/Fm) e da dissipação de energia não regulada, Y
NO
= F/Fm, foram
calculados de acordo com Genty et al. (1989) e Hendrickson et al. (2004). O Y
II
foi
utilizado ainda para estimar a taxa aparente de transporte de elétrons, ETR =
Y
II
.PAR.0,84.0,5 (Bilger et al., 1995), onde PAR é o fluxo de fótons (µmol m
-2
s
-1
)
incidente sobre a folha; 0,5 o valor correspondente à fração de energia de excitação
distribuída para o FSII (Laisk e Loreto, 1996); e, 0,84 o valor correspondente à fração
de luz incidente que é absorvida pelas folhas (Ehleringer, 1981).
2.2.6. Determinação do malonaldeído
A concentração de malonaldeído (MDA) acumulado foi determinada em folhas de
arroz, a partir da extração em ácido tricloroacético (TCA) (Hodges et al., 1999). O
macerado foi centrifugado e, a uma alíquota do sobrenadante, adicionou-se solução de
ácido tiobarbitúrico (TBA) em TCA. Um controle para cada amostra foi obtido sem a
60
adição de TBA. As soluções foram incubadas em banho-maria (90 ºC, 20 min) e, após
completa extração, as reações foram interrompidas em banho de gelo. Realizou-se a
leitura da absorbância nos comprimentos de onda de 400, 532 e 600 nm. Para o cálculo
da concentração de MDA, inicialmente, a diferença entre os valores de 532 e 600 nm
foram descontados dos mesmo valores obtidos pela reação sem adição de TBA, como
segue:
A = [(Abs
532
+TBA) - (Abs
600
+TBA)] – [(Abs
532
+TBA) - (Abs
600
+TBA)]
Posteriormente, foi descontado o interferente de leitura em 400 nm:
B = [[(Abs
400
+TBA) - (Abs
600
+TBA)] x 0,0571]
A partir das estimativas de A e B, o MDA foi quantificado pela equação:
MDA (nmol mL
-1
) = [A - B/157000] x 10
6
Os valores de MDA foram expressos por matéria fresca.
2.2.7. Extração de RNA, síntese de cDNA e PCR em tempo real (qPCR)
O RNA total foi extraído do material vegetal fresco, folhas e raízes, dos cultivares
Canastra, BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA 419 utilizando o reagente Trizol
(38 % de fenol ácido pH 4,5, 0,8 M tioceanato de guanidina; 0,4 M tioceanato de
amônio; 0,1 M acetato de sódio pH 5,0; 5,0 % glicerol; água livre de RNAases tratada
com dietil pirocarbonato, DEPC). Realizou-se uma centrifugação com cloreto de sódio
(5 N) e clorofórmio P.A para separação das fases aquosa, contendo RNA, e orgânica,
contendo proteínas e DNA. A precipitação do RNA contido na fase aquosa foi realizada
com igual volume de isopropanol P.A. Em seguida realizou-se lavagem do RNA com
etanol 75 %. Após a extração o RNA foi quantificado em nanocell acoplado ao
espectrômetro e analisado em gel de agarose 0,8% (p/v), corado com red gel. Para o
experimento de qRT-PCR foram utilizadas quatro repetições biológicas com três
replicatas técnicas.
A síntese de cDNA foi realizada com 2 μg de RNA total, pré-tratado com 1 μl de
DNAse (50 U/μL, Amplification GradeDnase I, Invitrogen
TM
), incubada por 37 ºC a 15
min; para retirar os possíveis contaminantes de DNA genômico e para tal foi utilizado o
protocolo da Invitrogen seguindo as normas do fabricante. A síntese da primeira fita de
cDNA foi feita utilizando o kit SuperScript
TM
First-Strand Synthesis System for RT-
PCR (Invitrogen
TM
), realizada em thermomixer. O cDNA foi armazenado a -20 °C.
Para a análise de expressão gênica foi utililzado a técnica de PCR em tempo real
(StepOnePlus™ Real-Time PCR System, Applied Biosystem), com sistema de detecção
61
de fluorescência mix SYBR Green I (Applied Biosystems
®
, California, USA). A reação
foi realizada utilizando diluição da reação de síntese de cDNA de fita simples, solução
contendo os primers (primer direto e inverso, 10 µM), dNTP (5 mM), tampão de PCR
10x (Invitrogen), MgCl
2
(50 mM), SYBR Green I (1:10000; Invitrogen), Platinum Taq
DNA polimerase (5U/µl), ROX (Invitrogen) e H
2
O estéril. As condições de
amplificação foram: hot start a 95 ºC, 40 ciclos a 95 ºC, com temperatura de anelamento
entre 58 ºC e 60 ºC, conforme o T
m
do primer, e temperatura de extensão 72 ºC. Os
valores de Ct foram calculados pelo programa Real Time PCR Miner v 2.2 (Zhao e
Fernald, 2005; http://www.miner.ewindup.info/) a partir dos valores de fluorescência
das reações. Para a normalização dos dados utilizou-se genes constitutivos selecionados
pelo programa GeNorm v. 3.5, dentre os genes de Oryza sativa actina (OsACT), β-1, 3-
glucanase (OsGLU), tubulina (OsTUB) e ubiquitina (OsUBQ5). Foram utilizados os
métodos comparativos propostos por Zhao e Fernald (2005).
2.3. Análise Estatística
O delineamento experimental constituiu-se de blocos ao acaso, com quatro
repetições. Os dados de trocas gasosas, fluorescência e expressão gênica foram
submetidas à análise de variância e teste de Scott-Knott 5% de probabilidade, com
auxílio do programa SAEG 9.0. As curvas A/Ci foram analisadas por regressão não-
linear obtidas no programa SigmaPlot 10.0. Foram realizadas análises de correlações de
Pearson, no qual foram identificadas as correlações do mineral ferro e todos os outros
minerais pelo programa SAS v 9.0.
62
3. RESULTADOS
3.1. Teor de ferro nos tecidos
Os cultivares Canastra, BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA 419
apresentaram incremento significativo no teor de ferro, nas folhas e raízes, quando
cultivados por sete dias sob 7 mM de sulfato ferroso com EDTA (Fig. 1). O cultivar
BRSMG Curinga apresentou um acúmulo de ferro nas raízes das plantas tratadas 11,8
vezes superior às plantas controle (350,3 mg.kg
-1
), seguido pelos cultivares Canastra,
BR-IRGA 409 e IRGA 419 com um acúmulo de ferro 7,7, 5,4 e 3,9 vezes superior aos
controles, repectivamente.
Os cultivares IRGA 419 e BRSMG Curinga apresentaram maior acúmulo de ferro
nas folhas, 8,2 e 7,7 vezes superior ao controle, respectivamente. A menor translocação
de ferro foi observada no cultivar BR-IRGA 409, com teor de ferro na parte aérea 4
vezes (547,00 mg.kg
-1
) superior ao controle (138,25 mg.kg
-1
).
Canastra Curinga IRGA409 IRGA419
Fe (mg kg
-1
MS folha)
0
200
400
600
800
1000
Controle
FeSO
4
-EDTA
Canastra Curinga IRGA409 IRGA419
Fe (mg kg
-1
MS raiz)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
Figura 1. Teor de ferro (mg kg
-1
MS) na raiz (A) e na parte aérea (B) de plantas de arroz,
cultivares Canastra, BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA 419, submetidas ao FeSO
4
-EDTA
(7 mM).
Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
Analisando o ferro absorvido pelas plantas de arroz cultivadas sob excesso de
ferro, verificou-se que a maior parte deste metal ficou acumulado nas raízes (Fig. 2). O
ferro foi mais acumulado nas raízes do cultivar BRSMG Curinga (87 %), embora não
seja verificado diferenças estatísticas em relação aos demais cultivares. A translocação
de ferro para as folhas foi superior no cultivar IRGA 419 (31,1 %) seguido pelos
cultivares: BR-IRGA 409 (20,6 %), Canastra (17,5 %) e BRSMG Curinga (12,9 %).
63
Canastra Curinga BR-IRGA 409 IRGA 419
Acúmulo de Ferro (%)
0
20
40
60
80
100
120
Folha
Raiz
A
AA
A
a
a
a
a
Figura 2. Acúmulo de ferro (%) nas raízes ( ) e nas folhas ( ) em
cultivares de arroz Canastra, BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA
419 após sete dias de exposição ao FeSO
4
-EDTA (7 mM). Barras
representam médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
3.2. Composição Mineral
A absorção e translocação de minerais, pelos cultivares de arroz, foram afetadas
em resposta ao cultivo das plantas sob excesso de sulfato ferroso (Tabs. 1 e 2). O
acúmulo dos minerais P, Zn e Sr, nas raízes, apresentou uma correlação positiva com o
incremento de Fe na solução de cultivo (Tab. 1, Fig. 3A). O excesso de Fe promoveu
uma correlação negativa e significativa com os minerais Mg, S, K e Rb, nas raízes de
todos cultivares avaliados (Tab. 1)
O aumento no acúmulo de Fe nas folhas das plantas de arroz promoveu correlação
positiva com Na e correlação negativa significtiva com P, em todos os cultivares (Tab.
2, Fig. 3B). O acúmulo de P foi reduzido nas folhas de arroz das plantas cultivadas em
sulfato ferroso (Fig. 3), em 30% nos cultivares BRSMG Curinga e BR-IRGA 409 e de
40 % nos cultivares Canastra e IRGA 419 (Tab. A3). O maior acúmulo de P nas raízes
das plantas cultivadas sob excesso de ferro foi observado, em todos os cultivares
analisados, pela razão de P nas folhas pelas raízes (Tab. 3).
64
Tabela 1. Correlação entre o teor de Fe e outros 17 elementos em raízes de quatro cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso
(FeSO
4
-EDTA, 7 mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
* 5%; ** 1%;
ns
não significativo
Tabela 2. Correlação entre o teor de Fe e outros 17 elementos em folhas de quatro cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso
(FeSO
4
-EDTA, 7 mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
* 5%; ** 1%;
ns
não significativo
Cultivar B Na Mg P S K Ca Mn Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra
-0.917
**
-0.743
*
-0.867
**
0.980
**
-0.875
**
-0.934
**
-0.043
ns
-0.692
ns
-0.390
ns
-0.911
**
-0.115
ns
0.847
**
-0.523
ns
-0.855
**
0.897
**
0.525
ns
0.222
n
s
BRSMG Curinga
-0.673
ns
-0.618
ns
-0.879
**
0.987
**
-0.796
*
-0.968
**
-0.251
ns
-0.695
ns
0.794
*
-0.620
ns
0.820
**
0.846
**
-0.696
*
-0.865
**
0.942
**
-0.056
ns
-0.755
*
BR-IRGA 409
-0.799
*
-0.822
**
-0.792
*
0.979
**
-0.882
**
-0.957
**
-0.329
ns
0.663
ns
-0.798
*
-0.739
*
-0.668
ns
0.867
**
-0.821
**
-0.913
**
0.856
**
-0.347
ns
-0.641
ns
IRGA419
-0.864
**
-0.869
**
-0.907
**
0.991
**
-0.908
**
-0.963
**
-0.332
ns
0.046
ns
-0.735
*
-0.698
*
-0.925
**
0.919
**
-0.815
**
-0.948
**
0.938
**
0.164
ns
-0.369
ns
Cultivar B Na Mg P S K Ca Mn Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra
0.866
**
0.847
**
-0.435
ns
-0.766
*
0.462
ns
-0.423
ns
-0.336
ns
-0.476
ns
0.806
**
-0.572
ns
-0.135
ns
0.900
**
-0.684
ns
-0.697
*
-0.457
ns
-0.433
ns
-0.672
ns
BRSMG Curinga
0.133
ns
0.907
**
-0.604
ns
-0.819
*
-0.058
ns
-0.775
*
-0.288
ns
-0.336
ns
0.671
ns
0.374
ns
-0.231
ns
0.920
**
-0.742
*
-0.870
**
-0.396
ns
-0.379
ns
-0.358
ns
BR-IRGA409
0.759
*
0.981
**
-0.939
**
-0.898
**
0.302
ns
-0.875
**
-0.661
ns
-0.775
*
0.451
ns
-0.328
ns
-0.232
ns
0.732
*
-0.503
ns
-0.878
**
-0.777
*
-0.676
ns
-0.493
ns
IRGA419
0.887
**
0.903
**
-0.814
**
-0.848
**
0.739
*
-0.818
**
-0.273
ns
-0.655
ns
0.032
ns
0.465
ns
0.432
ns
0.344
ns
-0.656
ns
-0.477
ns
-0.317
ns
-0.169
ns
-0.176
ns
65
Fe (mg kg
-1
MF raiz)
0 5000 10000 15000 20000 25000
P (mg kg
-1
MF raiz)
0
3000
6000
9000
12000
15000
18000
Fe (mg kg
-1
MF folha)
0 200 400 600 800 1000
P (mg kg
-1
MF folha)
0
3000
6000
9000
12000
15000
18000
Canastra
Curinga
BR-IRGA409
IRGA 419
A
B
Figura 3. Teor de Fe em relação ao teor de P nas raízes (A) e folhas (B) dos cultivares de arroz:
Canastra ( , Controle; , FeSO
4
-EDTA), BRSMG Curinga ( , Controle; , FeSO
4
-EDTA),
BR-IRGA 409 ( , Controle; , FeSO
4
-EDTA), IRGA 419 ( , Controle; , FeSO
4
-EDTA)
expostos ao excesso de ferro por sete dias, em solução hidropônica.
Tabela 3. Relação entre acúmulo de P nas folhas
e raízes de plantas de arroz cultivadas em FeSO
4
-
EDTA (7 mM), por sete dias.
Genótipo Tratamento
[P
folha
/P
raiz
]
Canastra
Controle 2,390 ± 0,47
FeSO
4
-EDTA 0,494 ± 0,04
BRSMG Curinga
Controle 2,163 ± 0,23
FeSO
4
-EDTA 0,510 ± 0,05
BR-IRGA 409
Controle 2,140 ± 0,29
FeSO
4
-EDTA 0,466 ± 0,03
IRGA 419
Controle 2,302 ± 0,25
FeSO
4
-EDTA 0,510 ± 0,05
3.3. Parâmetros de Trocas gasosas e Fotorrespiração
Todos os cultivares avaliados apresentaram redução na taxa de assimilação líquida
de CO
2
, quando submetidos à concentração excessiva de ferro. BRSMG Curinga
apresentou a maior sensibilidade com 66 % de redução na A, em relação ao controle,
seguidos pelo IRGA 419 (57 %), Canastra (54 %) e BR-IRGA 409 (49 %), (Figura 4).
A queda fotossintética foi acompanhada pela redução na condutância estomática, sendo,
em média, 62 % menor do que o apresentado pelas plantas controle; e, pela
transpiração, em geral, 46 % menor nas plantas tratadas com sulfato ferroso. A relação
Ci/Ca, no entanto, não apresentou alterações significativas ao nível de 5 % de
66
probabilidade, não diferindo entre as plantas controle e plantas tratadas em nenhum dos
cultivares avaliados (Figura 4).
A (µmol.m
-2
.s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
g
s
(µmol.m
-2
.s
-1
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
FeSO
4
-EDTA
Canastra Curinga IRGA409 IRGA419
C
i
/C
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Canastra Curinga IRGA409 IRGA419
E
(mmol.m
-2
.s
-1
)
0
2
4
6
A
A
B
B
A
B
B
A
A
AA
B
B
B
B
B
B
B
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Figura 4. Taxa de assimilação líquida de CO
2
(A); condutância estomática (g
S
); transpiração (E)
e relação Ci/Ca em quatro cultivares cultivados sob 7 mM de sulfato ferroso, por sete dias, em
sistema hidropônico. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não
diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
Após sete dias de exposição ao ferro, as respostas da taxa de assimilação
fotossintética em diferentes concentrações internas de CO
2
(curva A/C
i
) foram
significativas para todos cultivares avaliados (Figura 5). No entanto, a intensidade da
resposta e o padrão fotossintético ao aumento de C
i
foram distintos entre os cultivares.
A taxa de carboxilação máxima pela Rubisco foi afetada significativamente pelo
excesso de ferro em plantas de arroz (Tab. 4). Os cultivares mais sensíveis foram
BRSMG Curinga e IRGA 419 com 70 e 64 % de redução, em relação aos controles,
respectivamente. Canastra tratado com sulfato ferroso apresentou uma redução em 39 %
no V
c,Max
e BR-IRGA 409 19 %. A J
max
e V
TPU
apresentaram reduções semelhante nos
cultivares de arroz tratados com sulfato ferroso, com queda de, em média, 38 % no
67
cultivar BRSMG Curinga, seguido pelo Canastra (32 %), IRGA 419 (20 %) e BR-IRGA
409 (17 %).
A
(µmol m
-2
s
-1
)
0
10
20
30
40
Controle, r
2
= 0,95
FeSO
4
, r
2
= 0,84
Canastra
A
(µmol m
-2
s
-1
)
0
10
20
30
40
Controle, r
2
= 0,89
FeSO
4
, r
2
= 0,83
Curinga
C
i
(µmol m
-2
s
-1
)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
10
20
30
40
Controle, r
2
= 0,97
FeSO
4
, r
2
= 0,95
IRGA 409
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
10
20
30
40
Controle, r
2
= 0,94
FeSO
4
, r
2
= 0,99
IRGA 419
Figura 5. Regressão não-linear hiperbólica das curvas A/Ci em cultivares de arroz submetidos a
7 mM de sulfato ferroso por sete dias sob condição hidropônica. As equações das curvas estão
descritas na tab. A4.
Tabela 4. Taxa de carboxilação máxima pela Rubisco (Vc,Max), taxa de
transporte de elétrons para regeneração da RuBP (Jmax) e utilização da triose
fosfato (V
TPU
) em cultivares de arroz expostos ao FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete
dias.
V
c,max
J
max
V
TPU
Canastra
Controle 113.5 ± 10.3a 157.2 ± 13.5a 10.3 ± 0.38a
FeSO4-EDTA 68.9 ± 2.4b 100.9 ± 9.5a 7.5 ± 0.34b
BRSMG
Curinga
Controle 106.5 ± 13.5a 120.3 ± 16.8a 8.8 ± 0.87a
FeSO4-EDTA 32.3 ± 8.9c 69.2 ± 14.6a 5.9 ± 0.85b
IRGA 409
Controle 104.5 ± 12.0a 154.6 ± 11.1a 11.6 ± 0.78a
FeSO4-EDTA 84.4 ± 12.3a 124.6 ± 25.9a 9.9 ± 1.54a
IRGA 419
Controle 105.1 ± 15.9a 149.5 ± 18.1a 11.5 ± 0.83a
FeSO4-EDTA 37.7 ± 4.0c 114.7 ± 1.5a 9.5 ± 0.54a
Médias±EP seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si, para cada parâmetro,
pelo teste de Scott-knott, 5 % de probabilidade
.
68
A taxa total de transporte de elétrons (J
t
) apresentou alteração nos cultivares de
arroz expostos ao excesso de ferro (Tab. 5). O J
t
apresentou redução em 31 % para os
cultivares Canastra e BR-IRGA 409 e, em média, 38 % para os cultivares BRSMG
Curinga e IRGA 419, em relação ao controle. A redução em J
t
foi acompanhada pela
diminuição no transporte de elétrons atribuídos às reações da carboxilase (J
c
) da
ribulose 1-5 bifosfato (RuBP). O Jc apresentou redução em 40 % nos cultivares
Canastra e BR-IRGA 409, 46 % no IRGA 419 e em 51 % no cultivar BRSMG Curinga,
em relação ao controle. O transporte de elétrons atribuído às reações da oxigenase (J
o
)
da RuBP e a taxa do CO
2
produzido pela fotorrespiração não foram afetadas em
resposta ao ferro (Tab. 2). No entanto, a razão R1/A foi significativamente alterada e
aumentada em todos cultivares expostos ao ferro. O incremento na relação R1/A foi de
100 % nos cultivares Canastra e IRGA 419, 120 % no BRSMG Curinga e 137 % no
cultivar BR-IRGA 409, em relação aos respectivos controles.
Tabela 5. Taxa total de transporte de elétrons através do FSII da fotossíntese e
fotorrespiração (J
t
), elétrons atribuídos às reações de carboxilação (J
c
) e oxigenase (J
o
)
da RuBP, razão J
c
/J
t
, taxa do CO
2
produzido pela fotorrespiração (Rl) e razão R1/A em
cultivares de arroz expostas ao sulfato ferroso (7 mM).
J
t
J
c
J
o
J
c
/J
t
R1
R1/A
Canastra
Controle 172±11.4a 126.3±11.8a 45.8±0.8a 0.73±0.020a 5.73±0.10a 0.24±0.03c
FeSO
4
118±7.9b 74.0±7.4b 43.6±1.8a 0.63±0.022b 5.45±0.22a 0.48±0.07b
BRSMG
Curinga
Controle 161±9.4a 108.7±12.5a 52.3±3.2a 0.67±0.041a 6.54±0.40a 0.36±0.10c
FeSO
4
97±4.5b 53.8±4.6b 43.5±1.1a 0.55±0.023b 5.44±0.14a 0.79±0.12a
BR-
IRGA
409
Controle 165±7.4a 124.7±6.3a 40.1±1.1a 0.76±0.005a 5.01±0.13a 0.20±0.01c
FeSO
4
114±21.9b 76.8±19.3b 37.0±3.3a 0.66±0.051b 4.62±0.42a 0.48±0.19b
IRGA
419
Controle 176±5.5a 129.3±8.2a 46.3±3.3a 0.74±0.025a 5.79±0.42a 0.23±0.04c
FeSO
4
111±4.0b 70.3±1.6b 40.6±4.9a 0.64±0.032b 5.08±0.62a 0.47±0.09b
Médias±EP seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si, para cada parâmetro, pelo teste
de Scott-knott, 5 % de probabilidade.
3.4. Parâmetros de Fluorescência da clorofila a
A fluorescência da clorofila a foi afetada, em plantas de arroz, pela imposição ao
tratamento com sulfato ferroso (Figs. 6 e 7). Os parâmetros avaliados nas folhas
adaptadas ao escuro, como o F
0
e F
v
/F
m
, no entanto, não apresentaram alterações
significativas sob condição de toxidez por ferro. A taxa de transporte de elétrons,
apresentou uma redução em 42 % no cultivar BRSMG Curinga exposto ao ferro,
seguido pelo cultivar IRGA 409 (38 %), e BR-IRGA 409 e BRSMG Curinga, ambos
com redução de 32 % no ETR (Fig. 6). A redução no ETR foi acompanhada pela
69
diminuição no q
L
, o qual indica a estimativa de centros de reação oxidados. O q
L
apresentou redução em 35 % para o cultivar BRSMG Curinga, 26 % para o IRGA 419,
22% para BR-IRGA 409 e 16 % para Canastra (Fig. 6).
F
0
0
200
400
600
800
1000
Controle
FeSO
4
-EDTA
F
v
/F
m
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
ETR
0
40
80
120
160
200
B
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
AA
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
Canastra
Curinga IRGA409 IRGA419
Canastra
Curinga IRGA409 IRGA419
Controle
Fe-EDTA
qL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
B
A
A
B
A
B
B
A
Figura 6. Fluorescência inicial (F
0
), rendimento quântico potencial do PSII (F
v
/F
m
), taxa
aparente de transporte de elétrons (ETR) e estimativa de centros de reações abertos do FSII (q
L
)
em cultivares de arroz expostos as sulfato ferroso (7 mM). Barras representam médias ± EP.
Médias seguidas de mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-
Knott (p > 0,05).
Os rendimentos quânticos efetivo do fluxo linear de elétrons pelo PSII (Y
II
), da
dissipação de energia regulada (Y
NPQ
) e da dissipação de energia não regulada (Y
NO
)
são complementares e estão representados na Fig. 7. As plantas cultivadas em condições
adequadas de ferro apresentaram, de forma geral, proporção semelhante de
aproveitamento da energia absorvida para a etapa fotoquímica (Y
II
) e dissipada de forma
regulada (Y
NPQ
). As plantas de arroz, expostas ao excesso de ferro apresentaram
diminuição do Y
II
, em 32 % para os cultivares Canastra e BR-IRGA 409 e em 38 e 42
% para IRGA 419 e BRSMG Curinga, respectivamente. A redução em Y
II
foi
compesada pelo aumento do Y
NPQ
, em 36 % para o cultivar BRSMG Curinga, 42 %
para os cultivares Canastra e BR-IRGA 409 e em 50 % para o IRGA 419 (Fig. 6). O
70
rendimento quântico de energia não-regulado (Y
NO
) não apresentou diferença
significativa em plantas de arroz cultivadas sob excesso de ferro.
Canastra
CONTROLE
FeSO
4
-EDTA
Curinga
BR-Irga 409
Irga 419
Canastra
Curinga
BR-Irga 409
Irga 419
37 %
36 %
27 %
35 %
41 %
24 %
36 %
36 %
28 %
25 %
53 %
23 %
20 %
56 %
24 %
24 %
52 %
24 %
38 %
36 %
26 %
23 %
54 %
23 %
Figura 7. Rendimentos quânticos: efetivo do fluxo linear de elétrons pelo PSII (Y
II
, ), da
dissipação de energia regulada (Y
NPQ
, ), e da dissipação de energia não regulada (Y
NO
, ) em
cultivares de arroz expostos ao sulfato ferroso (7 mM).
3.5. Teor de aldeído malônico (MDA)
A quantificação de aldeído malônico (MDA), gerado pela peroxidação lipídica,
foi maior nos cultivares submetidos ao ferro. O cultivar IRGA 419 apresentou maior
teor de MDA (137 %), seguido por Canastra (81 %), BRSMG Curinga (62 %) e BR-
IRGA 409 com um aumento de 55 %, em relação ao respectivo controle (Figura 8).
3.6. Expressão gênica
Como controle para a normalização dos dados do qRT-PCR foram utilizados os
primers constitutivos dos genes ubiquitina (OsUBQ5) e tubulina (OsTUB) para análise
das folhas dos cultivares Canastra, BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA 419. Para
a análise da expressão gênica das raízes os dados foram normalizados utilizando os
primers constitutivos dos genes actina (OsACT) e glutamina (OsGLU).
As raízes apresentaram menor padrão de expressão dos genes (Tab. 6), em relação
às folhas de plantas de Oryza sativa (Tab. 7). O nível relativo de mRNA da ferritina
71
(OsFER1) foi aumentado, em resposta ao excesso de ferro, tanto nas raízes como nas
folhas, com maior intensidade no cultivar IRGA 419.
Os genes associados ao transporte de ferro e outros nutrientes, como Yellow Stripe
Like 1 (OsYSL1), transportador de monosacarídeo do tonoplasto induzível por limitação
de fosfato 1 (OsPI1), sintetase da nicotianamina (OsNAS1), transferase da
nicotianamina (OsNAAT1) apresetaram redução na expressão relativa das raízes de
plantas de arroz cultivadas sob excesso de ferro (Tab. 6). Os mesmos genes foram
expressamente induzidos nas folhas das plantas de arroz expostas so excesso de ferro
(Tab. 7), exceto o gene OsNAS1 que não foi expresso nas folhas das plantas de arroz.
As folhas expostas ao estresse por ferro apresentaram nível relativo de mRNA do
gene cloroplastídico psbA (OspsbA) reduzido, de forma mais expressiva nos cultivares
IRGA 419, seguido pelo BR-IRGA 409 e BRSMG Curinga (Tab. 7). A expressão do
gene OsGS1 foi aumentado em plantas de arroz cultivadas em FeSO
4
-EDTA (7 mM),
de forma mais expressiva no cultivar Canastra.
Genótipos
Canastra Curinga IRGA409 IRGA419
MDA (nmol.mg
-1
MF)
0
8
16
24
32
40
Controle
FeSO
4
-EDTA
A
A
A
B
B
B
B
B
Figura 8. Teor de aldeído malônico (MDA) em folhas de
cultivares de arroz submetidos a 7 mM de sulfato ferroso por
sete dias, sob condição hidropônica. Barras representam
médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p >
0,05).
72
Tabela 6. Análises por qRT-PCR do nível relativo de mRNA dos genes ferritina (OsFER1), transferase da
nicotianamina (OsNAAT1), sintetase da nicotianamina (OsNAS1), transportador de monosacarídeo do tonoplasto
induzível por limitação de fosfato 1 (OsPI1), fator transcricional bHLH induzível por limitação de fosfato 1 (OsPTF1),
Yellow Stripe Like 1 (OsYSL1), em raízes dos cultivares de Oryza sativa, cultivados em diferentes fontes de ferro (7
mM), por sete dias.
OsFER1 OsNAAT1 OsNAS1 OsPI1 OsPTF1 OsYSL1
Canastra
Controle 1.84±0.394 2.524±0.467 57.824±6.075 6.522±0.963 10.274±1.311 5.296±0.319
FeSO
4
5.30±1.802 0.165±0.034 2.335±0.478 0.311±0.048 6.609±1.493 0.916±0.275
BRSMG
Curinga
Controle 4.54±1.698 1.690±0.058 50.890±7.872 4.581±0.606 9.810±0.437 5.627±0.221
FeSO
4
10.70±1.922 0.454±0.114 1.467±0.441 0.438±0.046 9.688±1.168 1.901±0.079
BR-IRGA 409
Controle 3.95±0.124 1.244±0.185 3.480±0.539 1.404±0.270 10.909±1.943 4.991±0.670
FeSO
4
11.63±1.922 0.172±0.026 1.381±0.418 0.232±0.035 6.242±0.876 2.415±0.339
IRGA 419
Controle 4.94±1.085 1.284±0.425 3.766±0.422 4.147±0.948 11.867±2.516 20.552±2.709
FeSO
4
23.34±4.957 0.298±0.060 0.464±0.059 0.514±0.062 12.497±3.165 2.883±0.405
Nível relativo de expressão gênica normalizado em relação ao nível de expressão dos genes constitutivos actina e glutamina. Médias
representam n=3 com três replicatas técnicas ± EP.
73
Tabela 7. Análises por qRT-PCR do nível relativo de mRNA dos genes da proteína Q-B cloroplastídica
(OspsbA), ferritina (OsFER1), sintetase da glutamina citosólica (OsGS1), sintetase da nicotianamina (OsNAS1),
transportador de monosacarídeo do tonoplasto induzível por limitação de fosfato 1 (OsPI1), fator transcricional
bHLH induzível por limitação de fosfato 1 (OsPTF1), Yellow Stripe Like 1 (OsYSL1), em folhas dos cultivares
de Oryza sativa, cultivados em diferentes fontes de ferro (7 mM), por sete dias.
Nível Relativo de mRNA
OspsbA OsFER1 OsGS1 OsPI1 OsPTF1 OsYSL1
Canastra
Controle 19.8±4.1 7.3±2.6 1.41±0.11 0.180±0.018 0.145±0.024 2.59±0.43
FeSO
4
37.4±5.1 139.6±18.4 4.43±0.52 0.897±0.076 0.703±0.097 8.74±1.15
BRSMG
Curinga
Controle 33.8±5.9 2.3±0.2 1.72±0.29 0.097±0.010 0.054±0.006 3.33±0.60
FeSO
4
28.1±4.6 145.0±16.1 2.35±0.35 0.277±0.040 0.245±0.035 10.09±2.05
BR-IRGA 409
Controle 34.0±8.4 12.3±3.6 3.66±0.37 0.090±0.013 0.031±0.004 4.97±0.44
FeSO
4
25.4±3.9 39.6±6.5 3.12±0.47 0.161±0.016 0.119±0.017 6.74±1.10
IRGA 419
Controle 39.9±7.4 2.4±0.1 3.79±0.33 0.139±0.012 0.093±0.011 8.00±0.96
FeSO
4
11.7±3.0 130.5±7.5 4.76±0.42 0.333±0.020 0.248±0.028 5.06±0.25
Nível relativo de expressão gênica normalizado em relação ao nível de expressão dos genes constitutivos ubiquitina5 e tubulina.
Médias representam n=3 com três replicatas técnicas ± EP.
74
4. DISCUSSÃO
A toxidez pelo ferro, é descrita em plantas de arroz em dosagens superiores a 300
mg kg
-1
MS (Dobermann e Fairhurst, 2000), caracterizada visualmente pelo
bronzeamento, observado a partir do terceiro dia de exposição ao sulfato ferroso (dados
não mostrados). O acúmulo de ferro nas raízes das plantas de arroz foi mais expressivo
no cultivar Canastra, seguido pelo BRSMG Curinga, BR-IRGA 409 e IRGA 419 (Fig.
1). Em gramíneas, O Fe
+2
pode ser transportado para o interior das raízes, pela atuação
do YSL (Yellow stripe like), o qual pode absorver metais a partir de complexos de
nicotianamina e fitosideróforos (FS) (DiDonato Jr et al., 2004; Schaaf et al., 2004;
Curie et al., 2009). Dentre os 18 membros OsYSL identificados (Gross et al., 2003;
Koike et al., 2004; Aoyama et al., 2009), OsYSL1 apresentou aumento na expressão das
raízes com suprimento de Fe
+3
e Fe
+2
, ao passo que a expressão do mesmo gene nas
folhas foi aumentado sob deficiência de ferro, em mutantes de arroz naat1 (Cheng et al.,
2007). A expressão de OsYSL1, todavia, não foi observada em raízes e folhas de arroz
por outros autores (Inoue et al., 2009; Banerjee et al., 2010). Sob cultivo em excesso de
ferro, no entanto, nas condições experimentais vigentes, a expressão do gene OsYSL1
foi reduzida nas raízes das plantas de arroz, de forma mais expressiva no cultivar
Canastra e IRGA 419 (Tab. 3). A redução na expressão do gene relacionado à absorção
de ferro possivelmente apresentou-se como um mecanismo inicial de exclusão de ferro
na planta, o que, todavia, não foi capaz de impedir os altos teores de ferros nas raízes
dos cultivares em estudo.
A síntese de fitosideróforos, com a participação das enzimas sintase da
nicotianamina (NAS) e aminotransferase da nicotianamina (NAAT), é estimulada em
meio deficiente em Fe (Shojima et al., 1990; Ma et al., 1995; Higuchi et al., 1999;
Mori, 1999; Curie e Briat, 2003; Wu et al., 2011), conferindo importante papel na
homeostase de metais, como o ferro (DiDonato Jr et al., 2004; Gendre et al., 2006;
Kobayashi et al., 2010). No entanto, o alto nível de expressão do gene OsNAS1 em
raízes dos cultivares Canastra e BRSMG Curinga, sob condições ideais de ferro (Tab. 6)
sugere que os cultivares cultivados em ambiente de sequeiro apresentam uma
informação genética preexistente para a expressão desses genes. Neste ambiente de
cultivo, o ferro encontra-se na forma trivalente (Fe
+3
). Para absorver Fe
+3
, as plantas de
arroz possivelmente induzem a expressão de genes envolvidos com a estratégia II de
absorção de ferro, a qual consiste na liberação de FS e translocação complexo FS-Fe
+3
75
sem a necessidade de redução extracelular (Curie et al., 2001). No entanto, sob
exposição ao excesso de ferro, o nível de mRNA do gene OsNAS1, nos mesmos
cultivares, foi drasticamente reduzido nas raízes (Tab. 6), possivelmente devido uma
tentativa de limitar a absorção excessiva deste metal, altamente disponível em condições
alagadas. De forma semelhante, o gene OsNAAT1 foi reduzido nos quatro cultivares
quando cultivados sob exposição ao excesso de ferro (Tab. 6).
O cultivar Canastra apresentou menor acúmulo de ferro (2,6 vezes) nas folhas das
plantas de arroz, em relação aos demais cultivares, com acúmulo de, em média, 6,8
vezes superior às plantas controle. O cultivar BRSMG Curinga tem sido descrito como
um cultivar adaptado tanto para condições alagadas como sistema de sequeiro (Morais
et al., 2005). O excesso de ferro no meio de cultivo interferiu, ainda, na absorção de
outros minerais. Os minerais P, Zn e Sr tiveram sua absorção aumentanda nas raízes de
plantas de arroz expostas ao excesso de ferro (Tab. 1). A acidificação do meio
disponibiliza o Zn de frações insolúveis, permitindo maior absorção na forma de Zn
+2
(Kirk e Bajita, 1995; Kobayashi e Nishi, 2008). O Zn pode ainda ser absorvido pelas
raízes de arroz por transportadores de ferro, como membros da família IRT (Iron
Regulated Transporter; Hell e Stephan, 2003) e da família ZIP (ZRT/IRT-related
Proteins; ZRT, Zinc Regulated Transporter; Guerinot, 2000; Ramesh et al., 2003).
O aumento nos níveis de P, em raízes de arroz, sob condições de excesso de Fe,
promoveu redução na expressão do transportador de P, OsPI1, de forma mais expressiva
no cultivar Canastra (Tab. 6). As expressões de OsPI1 e OsPTF1 são induzidas pela
deficiência de fosfato nas raízes e constitutivamente expressas em folhas de arroz
(Wasaki et al., 2003; Yi et al., 2005). O aumento da expressão do gene transportador de
induzido por deficiência de P foram observados nas folhas de arroz, onde o teor de P foi
reduzido, sob exposição ao excesso de ferro (Tab. 2 e 3). A alta translocação de Fe tem
sido descrita por promover deficiência de P nas folhas de arroz (Mission et al., 2005),
decorrente limitação na translocação do P do apoplasto para o simplasto (Silveira et al.,
2007), o que evidencia a co-regulação dos transportadores de P e Fe (Hirsch et al.,
2006; Zheng et al., 2009). A alta concentração de ferro causou, ainda, um desbalanço
nutricional através de efeitos antagonísticos na absorção dos minerais B, Na, Mg, S, K,
Ni, As, e Co (Tab. 1), como observado por outros autores (Sahrawat, 2005; Silveira et
al., 2007).
A alta translocação de ferro nas folhas dos cultivares de arroz (Fig. 2), cultivados
sob excesso de ferro, foi acompanhada pelo incremento nos níveis de mRNA de
76
OsYSL1, principalmente nos cultivares Canastra e BRSMG Curinga (Tab. 7). Uma vez
na parte aérea, o transporte intercelular de ferro é afetado decorrente a expressão de
genes da família YSL (Kim e Guerinot, 2007), conferindo um possível mecanismo de
remobilização do excesso desse metal.
Uma vez no mesofilo, além da remobilização (DiDonato Jr et al., 2004;
Nishizawa, 2005), o ferro pode ser armazenado nos vacúolos ou incorporando à
ferritina, (Briat et al., 1995; Briat e Lobréaux, 1997; Majerus et al., 2009; Briat et al.,
2010a). Esse mecanismo de proteção à toxidez por Fe foi confirmado nas plantas de
arroz, através do aumento expressivo no nível de mRNA do gene OsFER1, tantos nas
raízes (Tab. 6) quanto nas folhas (Tab. 7). Na parte aérea sempre esta indução foi maior
e, a expressão de OsFER1 foi mais expressiva nos cultivares BRSMG Curinga e IRGA
419, com aumento, em média, 59 vezes superior aos respectivos controle. OsFER1 e
OsFER2 apresentaram níveis aumentados em folhas e raízes de arroz sob exposição do
excesso de ferro (Stein et al., 2009). O ferro, quando armanezado nas ferritinas não
pode reagir com oxigênio, desempenhando, assim, um importante papel na defesa das
plantas contra o estresse oxidativo induzido por ferro (Ravet et al., 2009; Briat et al.,
2010b).
A não-compartimentação ou não-complexação do ferro nas folhas, no entanto,
pode incorrer em aumento do risco oxidativo, em decorrência ao alto caráter reativo do
elemento. Uma vez que a toxicidade por ferro é considerada como estresse oxidativo, os
sistemas de defesa antioxidante intrínsecos também podem ser um fator importante à
resistência à toxicidade (Suh et al., 2002). O aumento de enzimas antioxidantes como a
dismutase do superóxido e redutase da glutationa, além de antioxidantes não
enzimáticos como manitol e glutationa reduzida foi observado em folhas de arroz
cultivadas sob excesso de ferro (Fang et al., 2001). Assim, o estresse severo pode
ocasionar um desequilíbrio celular a favor de prooxidantes em detrimento aos
antioxidantes, desencadeando o estresse oxidativo (Suh et al., 2002; Sinha et al., 1997;
Becana et al., 1998; Souza-Santos et al., 2001). O estresse oxidativo pode ser observado
nas plantas de arroz cultivadas sob excesso de ferro, a partir da quantificação de aldeído
malônico (MDA), gerado pela peroxidação lipídica (Fang et al., 2001). Dentre os
cultivares avaliados, Canastra e IRGA 419 apresentaram níveis mais expressivos de
MDA (Fig. 8). O estresse oxidativo mediado por ferro pode se difundir nos
compartimentos celulares e causar danos severos em macromoléculas, como lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos (Halliwell e Gutteridge, 1984) e diminuição dos pigmentos
77
fotossintéticos (Terry, 1980; Spiller e Terry, 1980; Taylor et al., 1982). A
desestruturação de pigmentos dos complexos fotossintéticos ocasiona, por sua vez, a
redução na taxa de assimilação líquida de CO
2
e, com isso, perda da capacidade de
fixação de carbono nos cloroplastos (Scandalios, 1993; Suh et al., 2002).
Os cultivares de arroz, cultivados sob excesso de ferro, apresentaram redução na
taxa de assimilação líquida de CO
2
(A), de forma mais acentuada no cultivar BRSMG
Curinga. A queda fotossintética, nas plantas de arroz, foi acompanhada pela redução na
condutância estomática (g
S
), e pela transpiração, sem, no entanto, alteração na relação
Ci/Ca (Fig. 4). Desta forma, a redução na g
S
não foi o fator limitante da fotossíntese nas
plantas de arroz. A redução na fotossíntese máxima observada com o aumento das
concentrações internas de CO
2
(curva A/Ci), nas plantas cultivadas em sulfato ferroso,
indica alterações na etapa bioquímica da fotossíntese (Fig. 5). Este fato pode ser
confirmado pela redução na taxa máxima de carboxilação (V
c,max
) pela enzima ribulose
1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) das plantas de arroz, de forma mais
expressiva nos cultivares BRSMG Curinga e IRGA 419 (Tab. 4). A redução na
atividade da carboxilase da rubisco tem sido descrita sob estresse severo de Fe (Taylor
et al., 1982), possivelmente pela degradação da subunidade maior da Rubisco por
espécies reativas de oxigênio (Desimone et al., 1996).
Os cultivares Canastra e BRSMG Curinga apresentaram reduções mais intensas
na taxa de transporte de elétrons dirigidas à regeneração da ribulose 1,5-bifosfato
(RuBP) (J
max
) e utilização da triose fosfato (V
TPU
). As trioses fosfato são formadas na
etapa de redução do ciclo de Calvin, convertido a um intermediário utilizado na
regeneração da RuBP. O funcionamento do ciclo de Calvin e absorção contínua de CO
2
necessitam que o seu aceptor, RuBP, seja constantemente regenerado (Rao et al., 1989;
Arulanantham et al., 1990; Mitchell et al., 2000). A síntese triose fosfato a partir do
CO
2
, conhecida como etapa de redução do 3-fosfoglicerato, requer energia do ATP e
equivalentes redutores na forma de NADH (Heldt e Heldt, 2005). Uma vez que o ATP
utilizado é produzido na cadeia transportadora de elétrons, a taxa de transporte de
elétrons torna-se o principal fator limitante na regeneração da RuBP (Farazdaghi, 2011).
Dentre outros fatores, a limitação de P nas folhas dos cultivares de arroz cultivados em
excesso de ferro (Tab. 2 e 3), elemento essencial para a síntese de ATP, pode, ainda, ter
contribuído na diminuição mais expressiva na etapa da regeneração da RuBP. Além
disso, a deficiência de P nas folhas de plantas de arroz tem sido associadas à redução na
78
fixação de CO
2
, ocasionando um acúmulo de carboidratos solúveis e sacarose nas folhas
(Yong-fu et al., 2006).
A inibição do Ciclo de Calvin e a redução taxa de transporte de elétrons
cloroplastídica, pela imposição do excesso de ferro, nas plantas de arroz, pode estar
associada à diminuição no transporte de elétrons atribuídos às reações da carboxilase
(J
c
) da RuBP (Tab. 5), como observado, sob mesmo estresse, em Beta vulgaris (Terry,
1980). No entanto, não foi observado incremento no transporte de elétrons atribuído às
reações da oxigenase (J
o
) da RuBP nos cultivares de arroz. O que demonstra que a taxa
de produção de CO
2
pela fotorrespiração não foi afetada em resposta ao ferro (Tab. 5).
A fotorrespiração é a atividade oxigenativa da Rubisco, observada principalmente em
plantas C3, que acarreta em perdas de CO
2
dependente de luz (Ogren, 1984). Dentre
outros fatores, as taxas fotorrespiratórias (R1) aumentam quando a relação CO
2
/O
2
diminui (Muraoka et al., 2000), o que não foi observado em em plantas de arroz
cultivadas sob excesso de ferro (Fig. 4).
O gene OsGS1, o qual codifica a enzima sintetase da glutamina, apresenta três
isoformas, dentre as quais, duas são altamente expressas em folhas de arroz (Tabuchi et
al., 2005). A enzima GS têm sido proposta por desempenhar papéis importantes no
metabolismo do nitrogênio, dentre os quais, a reassimilação do amônio liberada na
fotorrespiração (Lam et al., 1996), a qual representa cerca de 90 % do fluxo por meio da
rota GS/GOGAT nas folhas de plantas C
3
(Stitt et al., 2002). Dentre os cultivares
avaliados, sob excesso de ferro, o nível de mRNA de OsGS1 foi expressivamente
aumentado no cultivar Canastra (Tab. 7). A formação do 2-oxoglutarato, no entanto,
limitante da atividade in vivo da GOGAT pode ser restrito em situações de estresse com
baixas taxas de turnover do ciclo de Calvin (Stitt et al., 2002). Desta forma, a
fotorrespiração não pareceu ser um processo celular alternativo na dissipação de
elétrons em cultivares de arroz cultivados sob excesso de ferro em meio hidropônico.
A diminuição induzida pelo estresse abiótico no funcionamento de enzimas do
ciclo de Calvin também resulta em acúmulo de ATP e NADPH, levando a inibição do
feedback de transporte de elétrons e aumento do gradiente de prótons transtilacoidal
(Siedlecka et al., 1997; Siedlecka e Krupa, 2004). Com isso, a redução no consumo de
ATP gera uma saturação, bloqueando o dreno de elétrons na etapa fotoquímica,
ocasionando redução na taxa de transporte de elétrons (ETR), a qual foi observada de
forma mais expressiva nos cultivares BRSMG Curinga e IRGA 419 (Fig. 6). A redução
no ETR foi acompanhada pela diminuição no q
L
, o qual indica a estimativa de centros
79
de reação oxidados. A limitação no transporte de elétrons, pode proporcionar
reatividade de radicais livres com o ferro disponível nas folhas, e afetar, via produção de
EROs, a desestruturação de complexos protéicos fotossintéticos, como discutido
anteriormente.
A perda da capacidade do FSII não está necessariamente vinculada ao decréscimo
na aquisição de carbono (Behrenfel et al., 1998). No entanto, o reparo de danos nos
centros de reação do FSII através do turnover da proteína D1 é inibido quando o
transporte de elétrons fotossintético é saturado e estimulado quando subsaturado (Gong
e Ohad, 1991), levando a restauração do transporte de elétrons (Behrenfel et al., 1998).
Danos nos centros de reação do fotossistema II, com reparo ineficiente, podem ser
sugeridos pela redução na expressão do gene OspsbA, em plantas de arroz expostas ao
excesso de ferro, de forma mais expressiva nos cultivares BR-IRGA 409 e IRGA 419
(Tab. 7). Danos na proteína D1 do FSII tem sido descritos em plantas sob estresse
abiótico (Sundby et al., 1993), como o excesso de ferro (Suh et al., 2002). A síntese de
novo da proteína D1 pode ser inibida pela interrupção do ciclo de Calvin (Takahashi e
Murata, 2005; Nishiyama et al., 2006),e pelo estresse oxidativo, onde a inibição da
síntese de novo da proteína D1 é um fator primário e não o dano direto ao FSII
(Nishiyama et al., 2001).
A redução no fluxo linear de elétrons do FS II, em plantas de arroz, foi
compensada pelo incremento na dissipação de energia pelo rendimento quântico da
dissipação de energia regulada (Y
NPQ
) quando expostas ao excesso de ferro (Fig. 7).
Esse aumento na dissipação térmica tem sido observada em respostas iniciais à
condições de estresse abiótico, onde a fixação de carbono é inibida, ocorrendo a partir
da formação de um gradiente de pH pelo fluxo de elétrons cíclico (Golding e Johnson,
2003; Joliot e Joliot, 2006). A acidificação do lúmen do tilacóide (Baroli e Niyogi,
2000; Logan, 2005) é requerida para a ativação da enzima que converte violaxantina em
zeaxantina, a qual é responsável pela re-emissão de energia na forma de calor (Havaux e
Niyogi, 1999; Baroli e Niyogi, 2000; Smirnoff, 2005). A dissipação térmica ocorre pela
alteração em sua conformação devida as ligações de prótons e da zeaxantina às
proteínas da antena coletora de luz (Demmig-Adams e Adams, 1996; Horton et al.,
1996), e está envolvida na proteção do maquinário fotossintético contra a super-
excitação (Krause e Weis, 1991; Ort e Baker , 2002) e proteção contra danos e/ou
síntese de novo da proteína D1 do FSII (Jin et al., 2003).
80
5. CONCLUSÕES
Os cultivares IRGA 419, indicado para ambiente irrigado, e BRSMG Curinga,
adequado aos ambientes irrigado e de sequeiro, apresentaram alta sensibilidade ao
excesso de ferro. Ambos os cultivares apresentaram aumento na dissipação térmica do
excesso de energia e da expressão do gene OsFER1. Esses mecanimos, no entanto, não
foram eficientes em impedir danos oxidativos e redução na fotossíntese desses
cultivares.
Os cultivares Canastra e BR-IRGA 409 apresentaram efeitos tóxicos moderados
em relação aos demais cultivares, em resposta à parâmetros fisiológicos e bioquímicos.
O cultivar Canastra possivelmente apresentou mecanismo para limitar a translocação de
ferro para as folhas. O menor acúmulo de ferro nas folhas do cultivar Canastra pode
minimizar o estresse oxidativo e permitir aumento na expressão do gene OspsbA, como
reparo do centro de reação do FSII.
O cultivar BR-IRGA 409 apresentou maior tolerância fisiológica ao excesso de
ferro, dentre os cultivares avaliados, em condições de casa-de-vegetação.
Os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e fluorescência da clororfila a são
sensíveis e responsivos à toxidez por ferro em plantas de arroz. Dentre os parâmetros
avaliados, a taxa fotossintética, a taxa de transporte de elétrons e o coeficiente de
extinção fotoquímico mostraram-se mais sensíveis para a detecção da toxidez.
Desta forma, metodologias não invasivas podem ser aplicadas em campo, e
permitir a realização de screening de cultivares de arroz de diferentes procedências,
quanto a susceptibilidade ou não a níveis tóxicos de ferro. Isso proporciona selecionar,
de forma rápida e simples, cultivares possivelmente mais resistentes ao ferro, o qual tem
sido responsável pelo decréscimo na produção e qualidade dos grãos em cultivo
irrigado.
81
6. ANEXOS
Tabela A1. Genes analisados de Oryza sativa com os respectivos primers utilizados.
GENES Acesso NCBI
*
Primers Fw/Rv 5’-3’
Tm (º C)
Fw/Rv
OsACT1
NC_008397.2
GGTTCATCAAGAAGGGACCCGG
57/58
TGGAGGTGTATCCTGATGCGACAA
OsFER1
NC_008404.2
GCACGCAGTAGCAATGGAGTGA
58/58
AGCGGCGCCATGTTCCTTTT
OsGLU
NC_008397.2
ATCACATCGGCTACGGTCTT
53/54
GGAGGCGACTGAGAAGGTC
OsGS1
NC_008395.2
TGACGCCACGACATCCTCGT
58/57
CAATGGAGCAACCGGAGCGA
OsNAAT1
NC_008395.2
ATCGGCAACTACGCGTTGGG
58/57
AGGTTTGAGTTCACCTGCCGG
OsNAS1
NC_008396.2
GCTGTGTCTCGCTGTCCGTG
59/59
GGCACGGATCAATGCCCAGG
OsPI1
NC_008394.4
TCCTCTCTACCCCCAACAATGG
55/56
TGGAGAAGGAAGACCTGCCAAA
OspsbA
NC_001320.1
CTGTGGGGTCGCTTCTGCAAC
58/57
TACTGGAGGGGCAGCGATGAA
OsPTF1
NC_008399.2
CGGCTGCAGAAATGTGCTGGA
58/58
TGTGCAACAGGCACACAATAGCT
OsTUB
NC_008397.2
TACCGTGCCCTTACTGTTCC
55/55
CGGTGGAATGTCACAGACAC
OsUBQ5
NC_008394.4
ACCACTTCGACCGCCACTACT
57/58
ACGCCTAAGCCTGCTGGTT
OsYSL1
NC_008397.2
GCTGAAAATAGCGCAAAATCCGTTG
57/57
AGTTACTGCACTTTTGCGCAGTC
*
Acesso obtido pelo BLASTN das sequências
foward e reverse.
82
Tabela A2. Teor (mg kg
-1
) de 18 elementos nas folhas de cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-EDTA,
7 mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
B Na Mg P S K Ca Mn Fe
Canastra
Controle
26.6 ± 0.94 26937 ± 3994 1669 ± 220 4431 ± 434 15470 ± 2047 24959 ± 2561 1709 ± 512 47.9 ± 7.250 585 ± 81
FeSO
4
15.8 ± 1.54 16107 ± 790 715 ± 49 11910 ± 447 6517 ± 549 8873 ± 310 1666 ± 65 31.3 ± 0.747 16071 ± 298
BRSMG
Curinga
Controle
22.3 ± 3.09 24049 ± 4192 1593 ± 207 4107 ± 326 15230 ± 2467 22426 ± 923 1680 ± 455 47.3 ± 4.349 616 ± 65
FeSO
4
14.7 ± 1.30 15841 ± 1397 580 ± 43 12097 ± 728 7244 ± 762 10125 ± 920 1351 ± 51 33.6 ± 2.346 12646 ± 797
BR-IRGA
409
Controle
48.5 ± 7.51 46576 ± 5074 2545 ± 480 4602 ± 673 28628 ± 2851 30469 ± 1957 3144 ± 1205 25.1 ± 3.791 796 ± 31
FeSO
4
20.9 ± 2.44 24292 ± 2334 932 ± 25 13883 ± 861 10973 ± 1580 11772 ± 725 2032 ± 106 33.3 ± 1.801 18958 ± 1525
IRGA 419
Controle
49.2 ± 7.61 48914 ± 5124 3047 ± 402 4270 ± 295 28610 ± 2639 40450 ± 3036 2104 ± 346 30.7 ± 3.893 769 ± 18
FeSO
4
15.9 ± 2.32 23968 ± 1590 795 ± 37 11543 ± 712 11036 ± 1162 10018 ± 444 1739 ± 144 30.9 ± 0.846 18475 ± 1148
Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra
Controle
0.391 ± 0.027 0.86 ± 0.074 7.49 ± 0.99 32.80 ± 6.56 0.32 ± 0.024 1.60 ± 0.187 2.12 ± 0.347 2.89 ± 0.302 0.329 ± 0.070
FeSO
4
0.362 ± 0.009 0.37 ± 0.051 7.05 ± 0.96 60.03 ± 2.03 0.24 ± 0.042 0.84 ± 0.041 4.68 ± 0.410 3.47 ± 0.246 0.373 ± 0.051
BRSMG
Curinga
Controle
0.454 ± 0.021 1.25 ± 0.335 8.69 ± 0.36 27.90 ± 6.85 0.38 ± 0.022 1.48 ± 0.087 1.93 ± 0.309 3.74 ± 0.429 0.387 ± 0.062
FeSO
4
0.524 ± 0.013 0.49 ± 0.107 19.75 ± 3.16 54.22 ± 1.35 0.22 ± 0.051 0.96 ± 0.091 4.27 ± 0.352 3.69 ± 0.217 0.203 ± 0.013
BR-IRGA
409
Controle
0.453 ± 0.031 1.27 ± 0.284 15.69 ± 1.57 38.58 ± 4.75 0.43 ± 0.048 2.09 ± 0.203 3.15 ± 0.617 5.57 ± 0.469 0.646 ± 0.145
FeSO
4
0.322 ± 0.046 0.39 ± 0.069 11.34 ± 1.77 62.65 ± 1.42 0.24 ± 0.032 0.94 ± 0.048 5.80 ± 0.377 4.88 ± 0.311 0.342 ± 0.055
IRGA 419
Controle
0.437 ± 0.037 0.87 ± 0.099 18.42 ± 1.52 39.70 ± 1.41 0.43 ± 0.073 2.46 ± 0.199 3.14 ± 0.239 5.57 ± 0.208 0.726 ± 0.162
FeSO
4
0.285 ± 0.029 0.47 ± 0.113 8.23 ± 0.25 61.40 ± 5.26 0.18 ± 0.028 0.86 ± 0.027 5.13 ± 0.340 5.66 ± 0.187 0.572 ± 0.054
83
Tabela A3. Teor (mg kg
-1
) de 18 elementos nas folhas de cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-EDTA, 7
mM), por sete dias, em sistema hidropônico.
B Na Mg P S K Ca Mn Fe
Canastra
Controle 40.0 ± 2.3 671 ± 129 9015 ± 566 9982 ± 673 6973 ± 428 81062 ± 5248 5694 ± 239 271 ± 10 191.4 ± 27.6
FeSO
4
51.7 ± 4.7 5425 ± 633 5646 ± 583 5871 ± 314 6947 ± 513 59242 ± 4028 3796 ± 504 185 ± 17 506.0 ± 89.8
BRSMG
Curinga
Controle 34.1 ± 6.4 496 ± 42 5635 ± 561 8713 ± 522 6285 ± 67 73482 ± 6227 3791 ± 705 276 ± 44 75.8 ± 8.8
FeSO
4
34.8 ± 4.2 2951 ± 432 3980 ± 304 6205 ± 118 5899 ± 39 49079 ± 3266 2837 ± 401 215 ± 21 468.9 ± 42.2
BR-IRGA
409
Controle 35.8 ± 2.7 476 ± 42 6977 ± 14 9277 ± 489 6784 ± 67 81718 ± 3919 5596 ± 658 336 ± 29 71.7 ± 3.3
FeSO
4
48.5 ± 3.5 2698 ± 386 4712 ± 92 6389 ± 169 7365 ± 24 56702 ± 1440 3915 ± 180 225 ± 8 491.6 ± 58
IRGA 419
Controle 36.0 ± 3.3 629 ± 110 7472 ± 27 9640 ± 620 6386 ± 17 83942 ± 3065 4977 ± 338 303 ± 21 68.7 ± 2.7
FeSO
4
56.3 ± 5.0 2112 ± 324 5527 ± 29 5808 ± 329 7502 ± 55 60432 ± 3112 4512 ± 331 237 ± 22 499.0 ± 40
Co Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
Canastra
Controle 0.072 ± 0.004 0.724 ± 0.069 12.83 ± 0.49 49.99 ± 4.42 0.675 ± 0.12 2.704 ± 0.174 2.377 ± 0.042 4.051 ± 0.10 0.484 ± 0.05
FeSO
4
0.099 ± 0.005 0.480 ± 0.044 10.59 ± 1.09 86.68 ± 17.9 0.186 ± 0.02 1.819 ± 0.059 1.525 ± 0.182 2.294 ± 0.40 0.233 ± 0.06
BRSMG
Curinga
Controle 0.081 ± 0.003 0.540 ± 0.063 13.17 ± 1.37 39.95 ± 2.38 0.414 ± 0.07 2.582 ± 0.201 1.526 ± 0.225 3.308 ± 0.76 0.360 ± 0.08
FeSO
4
0.095 ± 0.006 0.581 ± 0.086 11.89 ± 0.85 58.77 ± 4.52 0.198 ± 0.02 1.507 ± 0.051 1.129 ± 0.123 2.187 ± 0.30 0.275 ± 0.03
BR-IRGA
409
Controle 0.072 ± 0.004 0.678 ± 0.083 14.11 ± 1.11 46.96 ± 4.44 0.307 ± 0.04 2.570 ± 0.146 2.252 ± 0.156 3.303 ± 0.30 0.454 ± 0.09
FeSO
4
0.079 ± 0.006 0.637 ± 0.068 13.69 ± 0.63 68.35 ± 2.65 0.202 ± 0.03 1.703 ± 0.023 1.550 ± 0.055 2.337 ± 0.15 0.257 ± 0.04
IRGA 419
Controle 0.069 ± 0.005 0.625 ± 0.062 12.88 ± 0.31 50.56 ± 4.26 0.484 ± 0.10 2.494 ± 0.099 2.147 ± 0.073 2.599 ± 0.24 0.228 ± 0.08
FeSO
4
0.071 ± 0.003 0.705 ± 0.067 13.45 ± 0.47 54.68 ± 2.13 0.259 ± 0.03 2.133 ± 0.237 1.981 ± 0.236 2.407 ± 0.16 0.182 ± 0.02
84
Tabela A4. Equações hiperbólicas e coeficiente de determinação (R
2
) das regressões
não-lineares das curvas A/Ci em cultivares de arroz submetidos ao sulfato ferroso (7
mM), por sete dias.
Cultivar Tratamento Equação R
2
Canastra
Controle y = 33,04-44,59/(1-0,0006.x)
1/-0,1124
0,9549
FeSO
4
-EDTA y = 25,65-33,61/(1+0,0038.x)
1/0,7542
0,8354
BRSMG
Curinga
Controle y = 29,98-47,36/(1+0,0063.x)
1/0,7023
0,8851
FeSO
4
-EDTA y = 18,19-23,89/(1-0,0007.x)
1/-0,3009
0,8292
BR-IRGA
409
Controle y = 35,62-46,92/(1+0,0011.x)
1/0,2161
0,9733
FeSO
4
-EDTA y = 45,88-62,14/(1+0,0294.x)
1/3,7686
0,9471
IRGA 419
Controle y = 44,17-64,03/(1+0,0117.x)
1/1,3243
0,9354
FeSO
4
-EDTA y = 33,59-43,83/(1+0,0006.x)
1/0,2307
0,9877
85
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abichequer, A.D.; Bohnen, H (1998) Eficiência de absorção, translocação e utilização
de fósforo por variedades de trigo. Revista Brasileira de Ciência do Solo 22: 21-26
Aoyama, T.; Kobayashi, T.; Takahashi, M.; Nagasaka, S.; Usuda, K.; Kakei, Y.;
Ishimaru, Y.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa, N.K. (2009) OsYSL18 is a rice
iron(III)–deoxymugineic acid transporter specifically expressed in reproductive organs
and phloem of lamina joints. Plant Molecular Biology 70:681-692
Arulanantham, A.R.; Rao, I.M.; Terry, N. (1990) Limiting Factors in Photosynthesis
VI. Regeneration of Ribulose 1,5-Bisphosphate Limits Photosynthesis at Low
Photochemical Capacity. Plant Physiology 93: 1466-1475
Asada, K. (2000) The water–water cycle as alternative photon and electron sinks.
Philosophical Transactions of the Royal Society London B Biological Science 355:
1419-1431
Audebert, A.; Fofana, M. (2009) Rice Yield Gap due to Iron Toxicity in West Africa.
Journal of Agronomy & Crop Science 195: 66-76
Backhausen, J.E.; Kitzmann, C.; Horton, P.; Scheibe, R. (2000) Electron acceptors in
isolated intact chloroplasts act hierarchically to prevent over reduction and competition
for electrons. Photosynthesis Research 64:1-13
Banerjee, S.; Sharma, D.J.; Verulkar, S.B.; Chandel, G. (2010) Use of in silico and
semiquantitative RT-PCR approaches to develop nutrient rich rice (Oryza sativa L.).
Indian Journal of Biotechnology 9: 203-212
Baroli, I.; Niyogi, K.K. (2000) Molecular genetics of xanthophyll-dependent
photoprotection in green algae and plants. Philosophical Transactions of the Royal
Society London B 355: 1385-1394
Becana, M.; Moran, J.-F.; Iturbe-Ormaetxe, I. (1998) Iron-dependant oxygen free
radical generation in plants subjected to environmental stresses: toxicity and
antioxydant protection. Plant Soil 201: 137-147
Behrenfeld, M.J.; Prasil, O.; Kolber, Z.S.; Babin, M.; Falkowski, P.G. (1998)
Compensatory changes in Photosystem II electron turnover rates protect photosynthesis
from photoinhibition. Photosynthesis Research 58: 259-268
Bilger, W.; Schreiber, U.; Bock, M. (1995) Determination of the quantum efficiency of
photosystem II and of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in the
field. Oecologia 102: 425-432
Briat, J.-F.; Curie, C.; Gaumard, F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants.
Current Opinion in Plant Biology 10: 276–282
Briat, J.-F.; Duc, C.; Ravet, K., Gaymard, F. (2010a) Ferritins and iron storage in plants.
Biochimica et Biophysica Acta 1800: 806-814
Briat, J.-F.; Fobis-Loisy, I.; Grignon, N.; Lobreaux, S.; Pascall, N.; Savino, G.; Thoiron,
S.; von Wiren, N.; Wuytswinkel, O. (1995) Cellular and molecular aspects of iron
metabolism in plants. Biology of the Cell 84:69-81
86
Briat, J.-F.; Lobréaux, S. (1997) Iron Transport and storage in plants. Trends in Plant
2: 187-193
Briat, J.-F.; Ravet, K.; Arnaud, N.; Duc, C.; Boucherez, J; Touraine, B.; Cellier, F.;
Gaymard, F. (2010b) New insights into ferritin synthesis and function highlight a link
between iron homeostasis and oxidative stress in plants. Annals of Botany 105: 811-
822
Cheng, L.; Wan, F.; Shou, H.; Huang, F.; Zheng, L.; He, F.; Li, J.; Zhao, F.-J.; Ueno,
D.; Ma, J.F.; Wu, P. (2007) Mutation in nicotianamine aminotransferase stimulated the
Fe(II) acquisition system and led to iron accumulation in rice. Plant Physiology 145:
1647-1657
Counce, P.; Keisling, T.C.; Mitchell, A.J. (2000) A uniform, objective, and adaptive
system for expressing rice development. Crop Science 40: 436-443
Cruz, J.A.; Avenson, T.J.; Kanazawa, A.; Takizawa, K.; Edwards, G.E.; Kramer, D.M.
(2004) Plasticity in light reactions of photosynthesis for energy production and
photoprotection. Journal of Experimental Botany 56 (411): 395-406
Curie, C.; Briat, J.F. (2003) Iron transport and signaling in plants. Annual Review of
Plant Biology 54: 183-206
Curie, C.; Cassin, G.; Couch, D.; Divol, F.; Higuchi, K.; Jean, M.L.; Misson, J.;
Schikora, A.; Czernic, P.; Mari, S. (2009) Metal movement within the plant:
contribution of nicotianamine and yellow stripe 1-like transporters. Annals of Botany
103: 1-11
Curie, C.; Panaviene, Z.; Loulergue, C.; Dellaporta, S.L.; Briat, J.-F.; Walker, E.L.
(2001) Maize yellow stripe1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III)
uptake. Nature 409: 346-349
Demmig-Adams, B.; Adams, W.W (1996) The role ox xanthophylls cycle carotenoids
in the protection of photosynthesis. Trends in Plant Science 1(1): 21-26
Desimone, M.; Henke, A.; Wagner, E. (1996) Oxidative stress induces partial
degradation of the harge subunit of Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase in
isolated chloroplasts of barley. Plant Physiology 111: 789-796
Dhir, B.; Sharmila, P.; Saradhi, P.P. (2008) Photosynthetic performance of Salvinia
natans exposed to chromium and zinc rich wastewater. Brazilian Journal of Plant
Physiology 20(1): 61-70
DiDonato Jr, R.J.; Roberts, L.A.; Sanderson, T.; Eisley, R.B.; Walker. E.L. (2004)
Arabidopsis Yellow Stripe-Like2 (YSL2): a metal-regulated gene encoding a plasma
membrane transporter of nicotianamine–metal complexes. The Plant Journal 39: 403-
414
Dobermann, A.; Fairhurst, T. (2000) Toxicidad de hierro en arroz. In: Dobermann, A.;
Fairhurst, T. (Eds.). Rice: nutrient disorders & nutrient management. Potash and
Phosphate Institute and International Rice Research Institute. p. 1-4
Ehleringer, J. (1981) Leaf absorptances of Mohave and Sonoran desert plants.
Oecologia 102: 366-370
87
Epron, D.; Godard, D.; Cornic, G.; Genty, B. (1995) Limitation of net CO2 assimilation
rate by internal resistances to CO2 transfer in the leaves of two tree species (Fagus
sylvatica L. & Castanea sativa Mill.). Plant, Cell and Environment 18: 43-51
Fageria, N.K.; Santos, A.B.; Barbosa Filho, M.P.; Guimarães, C.M. (2008) Iron toxicity
in lowland rice. Journal of Plant Nutrition 31: 1676-1697
Fang, W.; Wang, J.; Lin, C.; Kao, C. (2001) Iron induction of lipid peroxidation and
effects on antioxidative enzyme activities in rice leaves. Plant Growth Regulation 35:
75-80
Farazdaghi, H. (2011) The single-process biochemical reaction of Rubisco: A unified
theory and model with the effects of irradiance, CO
2
and rate-limiting step on the
kinetics of C
3
and C
4
photosynthesis from gas exchange. Biosystems 103(2): 265-284
Gendre, D.; Czernic, P.; Conéjéro, G.; Pianelli, K.; Briat, J.-F.; Lebrun, M.; Mari, S.
(2006) TcYSL3, a member of the YSL gene family from the hyperaccumulator Thlaspi
caerulescens, encodes a nicotianamine- Ni/Fe transporter. The Plant Journal 49: 1-15
Genon, J.; Hepcée, N.; Duffey, J.; Delvaux, B.; Hennebert, P. (1994) Iron toxicity and
other chemical soil constraints to rice in highland swamps of Burundi. Plant and Soil
166: 109-115
Genty, B.; Briantais, J.M.; Baker, N.R. (1989) The relatíonship between the quantum
yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence.
Biochimica et Biophysica Acta 990: 87-92
Golding, A.J.; Johnson, G.N. (2003) Down-regulation of linear and activation of cyclic
electron transport during drought. Planta 218: 107–114
Gong, H.; Ohad, I. (1991) The PQ/PQH2 ratio and occupancy of Photosystem II-QB
site by plastoquinone control the degradation of Å1 protein during photoinhibition in
vivo. The Journal of Biology Chemistry 266: 21293-21299
Gross, J.; Stein, R.J.; Fett-Neto, A.G.; Fett, J.P. (2003) Iron homeostasis related genes
in rice. Genetics and Molecular Biology 26: 477-497
Guerinot, M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Biochimica et Biophysica
Acta 1465: 190-198
Guerinot, M.L.; Yi, Y. (1994) Iron: nutritious, noxious, and not readily available. Plant
Physiology 104: 815-820
Halliwell, B.; Gutteridge, J.M.C. (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition
metals and disease. Biochemical Journal 219: 1-14
Havaux, M.; Niyogi, K.K. (1999) The violaxanthin cycle protects plants from
photooxidative damage by more than one mechanism. Proceedings of the National
Academy of Sciences 96: 8762-8767
Heber, U. (2002) Irrungen, Wirrungen? The Mehler reaction in relation to cyclic
electron transport in C3 plants. Photosynthesis Research 73: 223-231
Heber, U.; Bukhov, N.G.; Shuvalov, V.A.; Kobayashi, Y.; Lange, O.L. (2001)
Protection of the photosynthetic apparatus against damage by excessive illumination in
homoiohydric leaves and poikilohydric mosses and lichens. Journal of Experimental
Botany 52(363): 1999-2006
88
Heldt, H.-W.; Heldt, F. (2005) The Calvin cycle catalyzes photosynthetic CO
2
assimilation. In: Heldt, H.-W. (ed.) Plant Biochemistry (3 Ed.) p. 165-193
Hell, R.; Stephan, U.W. (2003) Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants.
Planta 216: 541-551
Hendrickson, L.; Furbank, R.T.; Chow, W.S. (2004) A simple alternative approach to
assessing the fate of absorbed light energy using chlorophyll fluorescence.
Photosynthesis Research 82: 73-81
Higuchi, K.; Suzuki, K.; Nakanishi, H.; Yamagushi, H.; Nishisawa, N.K.; Mori, S.
(1999) Cloning of nicotianamine synthase genes, novel genes involved in the
biosynthesis of phytosiderophores. Plant Physiology 119: 471-479
Hirsch, J.; Marin, E.; Floriani, M.; Chiarenza, S.; Richaud, P.; Nussaume, L.; Thibaud,
M.C. (2006) Phosphate deficiency promotes modification of iron distribution in
Arabidopsis plants. Biochimie 88: 1767-1771
Hodges, D.M.; DeLong, J.M.; Forney, C.F.; Prange, R.K. (1999) Improving the
thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant
tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta 207: 604-611
Horton, P.; Ruban, A.V.; Walters, R.G. (1996) Regulation of light harvesting in green
plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47:655-84
Jin, E.; Yokthongwattana, K.; Polle, J.E.W.; Melis, A. (2003) Role of the Reversible
Xanthophyll Cycle in the Photosystem II Damage and Repair Cycle in Dunaliella
salina. Plant Physiology 132: 352-364
Joliot, P.; Joliot, A. (2006) Cyclic electron flow in C3 plants. Biochimica et Biophysica
Acta 1757: 362-368
Kim, S.A.; Guerinot, M.L. (2007) Mining iron: Iron uptake and transport in plants.
FEBS Letters 581: 2273-2280
Kirk, G.J.D.; Bajita, J.B. (1995) Root-induced iron oxidation, pH changes and zinc
solubilization in the rhizosphere of lowland rice. New Phytologist 131: 129-137
Koike, S.; Inoue, H.; Mizuno, D.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa,
N.K. (2004) OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is regulated by iron
and expressed in the phloem. The Plant Journal 39: 415-424
Kobayashi, T.; Nakanishi, H.; Nishizawa, K. (2010) Recent insights into iron
homeostasis and their application in graminaceous crops. Proceedings of the Japan
Academy B 86: 900-913
Kobayashi, T.; Nishi, N.K. (2008) Regulation of iron and zinc uptake and
translocation in rice. Section IV.3. In: Hirano, H.-Y.; Hirai, A.; Sano, Y.; Sasaki, T.
(Eds.) Rice Biology in the Genomics Era. Biotechnology in Agriculture and Foresty 62.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg. p. 321-335
Kramer, D.M.; Johnson, G.; Kiirats, O.; Edwards, G.E. (2004) New fluorescence
parameters for the determination of QA redox state and excitation energy fluxes.
Photosynthesis Research 79: 209-218
Krause, G.H.; Weis, E. (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42:313-349
89
Lahner, B.; Gong. T.; Mahmoudian, M.; Smith, E.L.; Abid, K.B.; Rogers, E.E.;
Guerinot, M.L.; Harper, I.F.; Ward, J.M.; Meintyre, L.; Schroeder, J.I.; Salt, D.E.
(2003) Genomic scale profiling of nutrients and trace elements in Arabidopsis thaliana.
Nature Biotechnology 21:1215-1225
Laisk, A.; Loreto, F. (1996) Determining photosynthetic parameters from leaf CO
2
exchange and chlorophyll fluorescence. Plant Physiology 110: 903-912
Lam, H.-M.; Coschigano, K.T.; Oliveira, I.C.; Melo-Oliveira, R.; Coruzii, G.M. (1996)
The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 569-593
Liu, H.; Zhang, J.; Christiec, P.; Zhang, F. (2008) Influence of iron plaque on uptake
and accumulation of Cd by rice (Oryza sativa L.) seedlings grown in soil. Science of
the Total Environment 394: 361-368
Logan, B.A. (2005) Reactive oxygen species and photosynthesis. In: Smirnoff, N.
(Ed.) Antioxidants and reactive oxygen species in plants. Blackwell Publishing Ltd. p.
250-267
Long, S.P.; Bernacchi, C.J. (2003) Gas exchange measurements, what can they tell us
about the underlying limitations to photosynthesis? Procedures and sources of error.
Journal of Experimental Botany 54 (392): 2393-2401
Lupínková, L.; Komenda, J. (2004) Oxidative modifications of the photosystem II D1
protein by reactive oxygen species: from isolated protein to cyanobacterial cells.
Photochemistry and Photobiology 79(2): 152–162
Ma, J.F.; Shinada, T.; Matsuda, C.; Nomoto, K. (1995) Biosynthesis of
phytosiderophores, mugineic acids, assiciated with methionine cycling. The Journal of
Biological Chemistry 270:16549-165554
Majerus, V.; Bertin, P.; Lutts, S. (2009) Abscisic acid and oxidative stress implications
in overall ferritin synthesis by African rice (Oryza glaberrima Steud.) seedlings
exposed to short term iron toxicity. Plant Soil 324: 253-265
Majerus, V.; Bertin, P.; Swenden, V.; Fortemps, A.; Lobréaux, S.; Lutts, S. (2007)
Organ-dependent responses of the African rice to short-term iron toxicity: ferritin
regulation and antioxidative responses. Biologia Plantarum 51: 303-312
Maxwell, K.; Johnson, G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence – a practical guide.
Journal of Experimental Botany 51 (345): 659-668
Melis, A.; Spangfort, M.; Andersson, B. (1987) Light-absorption and electron-transport
balance between photosystem II and photosystem I in spinach chloroplasts.
Photochemistry and Photobiology 45: 129-136
Mishra, S.; Dubey, R.S. (2005) Heavy metal toxicity induced alterations in
photosynthetic metabolism in plants. Cap 45 p. 832-850. In: Pessarakli. M. (Ed.)
Handbook of Photosynthesis. 2 Ed. 862 p
Misson, J.; Raghothama, K.G.; Jain, A.; Jouhet, J.; Block, M.A.; Bligny, R.; Ortet, P.;
Creff, A.; Somerville, S.; Rolland, N.; Doumas, P.; Nacry, P.; Herrerra-Estrella, L.;
Nussaume, L.; Thibaud, M.-C. (2005) A genome-wide transcriptional analysis using
Arabidopsis thaliana Affymetrix gene chips determined plant responses to phosphate
90
deprivation. Proceedings of the National Academy of Sciences 102 (33): 11934-
11939
Mitchell, R.A.C.; Theobald, J.C.; Parry, M.A.J.; Lawlor, D.W. (2000) Is there scope for
improving balance between rubp-regeneration and carboxylation capacities in wheat at
elevated CO
2
? Journal of Experimental Botany 51: 391-398
Morais, O.P.; Castro, E.M.; Soares, A.A.; Guimarães, E.P.; Chatel, M.; Ospina, Y.;
Lopes, A.M.; Pereira, J.A.; Utumi, M.M.; Centeno, A.C.; Fonseca, J.M.; Breseghello,
F.; Guimarães, C.M.; Bassinello, P.Z.; Prabhu, A.S.; Ferreira, E.; Souza, N.R.G.; Souza,
M.A.; Reis, M.S.; Santos, P.G. (2005) BRSMG Curinga: Cultivar de arroz de terras
altas de ampla adaptação para o Brasil. Comunicado Técnico 114: Embrapa Arroz e
Feijão p. 1-8
Mori, S. (1999) Iron acquisition by plants. Current Opinion in Plant Biology 2: 250-
253
Muraoka, H.; Tang, Y.; Terashima, I.; Koizumi, H.; Washitani, I. (2000) Contributions
of diffusional limitation, photoinhibition and photorespiration to midday depression of
photosynthesis in Arisaema heterophyllum in natural high light. Plant, Cell and
Environment 23: 235-250
Nishiyama, Y.; Allakhverdiev, S.I.; Murata, N. (2006) A new paradigm for the action of
reactive oxygen species in the photoinhibition of photosystem II. Biochimica et
Biophysica Acta 1757: 742-749
Nishiyama, Y.; Yamamoto, H.; Allakhverdiev, S.I.; Inaba, M.; Yokota, A.; Murata, N.
(2001) Oxidative stress inhibits the repair of photodamage to the photosynthetic
machinery. The Embo Journal 20: 5587-5594
Nishizawa, N.K. (2005) The uptake and translocation of minerals in rice plants. Session
3: Opportunities and challenges of transgenic rice. p 90-93. In: Toriyama, K.; Heong,
K.L.; Hardy, B. (Eds.) Rice is life: scientific perspectives for the 21st century.
Proceedings of the World Rice Research Conference held in Tokyo and Tsukuba: Japan
590 p
Ogren, W. L. (1984) Photorespiration pathways, regulation and modification. Annual
Review of Plant Physiology 35: 415-442
Olaleye, A.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Odeleye, F.O. Dada, O.A.; Senjobi, B.A.
(2009) Elemental Composition of Two Rice Cultivars under Potentially Toxic on
Aquept and Aquent. Notulae Scientia Biologicae 1: 46-49
Olaleye, A.O.; Tabi, F.O.; Ogunkunle, A.O.; Singh, B.N.; Sahrawat, K.L. (2001) Effect
of toxic iron concentrations on the growth of lowlands rice. Journal of Plant Nutrition
24: 441 - 457
Ort, D.R.; Baker, N.R. (2002) A photoprotective role for O
2
as an alternative electron
sink in photosynthesis? Current Opinion in Plant Biology 5:193-198
Ottow, J.C.G.; Benckiser, G.; Watanabe, I.; Santiago, S. (1983) Multiple nutritional soil
stress as the prerequisite for iron toxicity of wetland rice (Oryza sativa L.). Tropical
Agriculture 60: 102-106
91
Oxborough, K.; Baker, N.R. (1997) An instrument capable of imaging chlorophyll a
fluorescence from intact leaves at very low irradiance and at the cellular and sub-
cellular levels of organization. Plant, Cell and Environment 20: 1473-1483
Pereira, E.G. (2009) Efeitos tóxicos do ferro: alterações fisiológicas e morfológicas
em plantas cultivadas e de restinga. Tese de Doutorado: Universidade Federal de
Viçosa.117 p
Pereira, E.G.; Oliva, M.A.; Kuki, K.N.; Cambraia, J. (2009) Photosynthetic changes and
oxidative stress caused by iron ore dust deposition in the tropical CAM tree Clusia
hilariana. Trees 23: 277-285
Ponnamperuma, F.N. (1972) The chemical of submerged soils. Advances in
Agronomy 24: 29-96
Ramesh, S.A.; Shin, R.; Eide, D.J.; Schachtman, D.P. (2003) Differential metal
selectivity and gene expression of two zinc transporters from rice. Plant Physiology
133: 126-134
Rao, I.M.; Arulanantham, A.R.; Terry, N. (1989) Leaf Phosphate Status, Photosynthesis
and Carbon Partitioning in Sugar Beet. II. Diurnal Changes in Sugar Phosphates,
Adenylates, and Nicotinamide Nucleotides. Plant Physiology 90(3): 820-826
Ravet, K.; Touraine, B.; Boucherez, J.; Briat, J.-F.; Gaymard, F.; Cellier, F. (2009)
Ferritins control interaction between iron homeostasis and oxidative stress in
Arabidopsis. The Plant Journal 57: 400-412
Sahrawat, K.L. (2005) Managing iron toxicity in lowland rice: the role of tolerant
genotypes and plant nutrients. Session 15: Challenges to expanding rice production in
unfavorable environments, p 452-254. In: Toriyama, K.; Heong, K.L.; Hardy, B. (Eds.)
Rice is life: scientific perspectives for the 21st century. Proceedings of the World
Rice Research Conference held in Tokyo and Tsukuba, Japan 590 p
Scandalios, J.G. (1993) Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology
101: 7-12
Schaaf, G.; Ludewig, U.; Erenoglu, B.E.; Mori, S.; Kitahara, T.; von Wirén, N. (2004)
ZmYS1 Functions as a Proton-coupled Symporter for Phytosiderophore- and
Nicotianamine-chelated Metals. The Journal of Biological Chemistry 279 (10): 9091-
9096
Sharkey, T.D.; Bernacchi, C.J.; Farquhar, G.D.; Singsaas, E.L. (2007) In Practice:
Fitting photosynthetic carbon dioxide response curves for C3 leaves. Plant, Cell and
Environment 30 (9): 1035-1040
Shojima, S.; Nishizawa, N.K.; Tushiya, S.; Nozoe, S.; Trifune, T.; Mori, S. (1990)
Biosynthesis of phytosiderophores In vitro byiosynthesis of 2”-deoxymugineic acid
from l-methionine and nicotianamine Plant Physiology 93:1497-1503
Siedlecka, A.; Gardestrom, P.; Samuelson, G.; Oquist, G.; Gardestrom, P. (1997)
Primary carbon metabolism in Phaseolus vulgaris plants under Cd/Fe interaction. Plant
Physiology and Biochemistry 35: 951-957
Siedlecka, A.; Krupa, Z. (2004) Rubisco activity maintenance in environmental stress
conditions: How many strategies? Cellular and Molecular Biology Letters 9: 56-57
92
Silveira, V.C.; Oliveira, A.P.; Sperotto, R.A.; Amaral, L.; Dias, J.F.; Cunha, J.B.; Fett,
J.P. (2007) Influence of iron on mineral status of two rice (Oryza sativa L.) cultivars.
Brazilian Journal of Plant Physiology 19: 127-139
Sinha, S.; Gupta, M.; Chandra, P. (1997) Oxidative stress induced by iron in Hydrilla
verticillata (l.f.) Royle: responde of antioxidants. Ecotoxicology and Environmental
Safety 38: 286-291
Smirnoff, N. (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway
engineering and functions. In: Smirnoff, N. (Ed.) Antioxidants and reactive oxygen
species in plants. Blackwell Publishing Ltd. p. 53-86
Snowden, R.; Wheeler, B.D. (1995) Chemical changes in selected wetland plant species with
increasing Fe supply, with specific reference to root precipitates and Fe tolerance. New
Phytologist 131: 503-520
Sousa, R.O.; Gomes, A.S.; Vahl, L.C. (2004) Toxidez por ferro em arroz irrigado. In:
Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.) Arroz Irrigado no Sul do Brasil: Empraba
Informação Tecnológica. p. 305-337
Souza-Santos, P.; Ramos, R.S.; Ferreira, S.T.; Carvalho-Alves, P.C. (2001) Iron
induced oxidative damage of corn root plasma membrane H
+
-ATPase. Biochimica et
Biophysica Acta 1512: 357-366
Spiller, S.; Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. II. Iron stress
diminishes photochemical capacity by reducing the number of photosynthetic units.
Plant Physiology 65: 121-125
Stein, R.J.; Ricachenevsky, F.K.; Fett, J.P. (2009) Differential regulation of the two rice
ferritin genes (OsFER1 and OsFER2). Plant Science 177: 563–569
Stitt, M.; Müller, C.; Matt, P.; Gibon, Y.; Carillo, P.; Morcuende, R.; Scheible, W.-R.;
Krapp, A. (2002) Steps towards an integrated view of nitrogen metabolism. Journal of
Experimental Botany, Inorganic Nitrogen Assimilation Special Issue 53(370): 959-970
Suh, H.-J.; Kim, C.S.; Lee, J.-Y.; Jung, J. (2002) Photodynamic effect of iron excess on
photosystem II function in pea plants. Photochemistry and Photobiology 75(5): 513-
518
Sundby, C.; McCaffery, S.; Anderson, J.M. (1993) Turnover of the photosystem II D1
protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. The
Journal of Biological Chemistry 268 (34): 25476-25482
Tabuchi, M.; Sugiyama, K.; Ishiyama, K.; Inoue, E.; Sato, T.; Takahashi, H.; Yamaya,
T. (2005) Severe reduction in growth rate and grain filling of rice mutants lacking
OsGS1;1, a cytosolic glutamine synthetase1;1. The Plant Journal 42: 641-651
Takahashi, S.; Murata, N. (2005) Interruption of the Calvin cycle inhibits the repair of
Photosystem II from photodamage. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics
1708 (3): 352-361
Taylor, G.J.; Crowder, A.A. (1983) Use of the DCB technique for extraction of hydrous
iron oxides from roots of wetland plants. American Journal of Botany 70: 1254-1257
Taylor, S.E.; Terry, N.; Huston, R.P. (1982) Limiting Factors in Photosynthesis. III.
Effects of iron nutrition on the activities of three regulatory enzymes of photosynthetic
carbon metabolism. Plant Physiology 70: 1541-1543
93
Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. I. Use of iron stress to control
photochemical capacity in vivo. Plant Physiology 65: 114-120
Valentini, R.; Epron, D.; De Angelis, P.; Matteucci, G.; Dreyer, E. (1995) In situ
estimation of net CO2 assimilation, photosynthetic electron flow and photorespiration in
Turkey oak (Q. cerris L.) leaves: diurnal cycles under different levels of water supply.
Plant, Cell and Environment, 18:631-640
Wasaki, J.; Yonetani, R.; Shinano, T.; Kai, M.; Osaki, M. (2003) Expression of the
OsPI1 gene, cloned from rice roots using cDNA microarray, rapidly responds to
phosphorus status. New Phytologist 158: 239-248
Wingler, A.; Lea, P.J.; Quick, W.P.; Leegood, R.C. (2000) Photorespiration: Metabolic
pathways and their role in stress protection. Philosophical Transactions of the Royal
Society London B: Biological Science 355:1517-1529
Wu, J.; Wang, C.; Zheng, L.; Wang, L.; Chen, Y.; Whelan, J.; Shou, H. (2011) Ethylene
is involved in the regulation of iron homeostasis by regulating the expression of iron-
acquisition-related genes in Oryza sativa. Journal of Experimental Botany 62(2): 667-
74
Yi, K.; Wu, Z.; Zhou, J.; Du, L.; Guo, L.; Wu, Y.; Wu, P. (2005) OsPTF1, a novel
transcription factor involved in tolerance to phosphate starvation in rice. Plant
Physiology 138: 2087-2096
Yong-fu, L.; An-cheng, L.; Hassan, M.J.; Xing-hua, W. (2006) Effect of phosphorus
deficiency on leaf photosynthesis and carbohydrates partitioning in two rice genotypes
with contrasting low phosphorus susceptibility. Rice Science 13(4): 283-290
Zhao, S.; Fernald, R.D. (2005) Comprehensive algorithm for quantitative real-time
polymerase chain reaction. Journal of Computational Biology 12(8): 1045-62
Zheng, L.; Huang, F.; Narsai, R.; Wu, J.; Giraud, E.; He, F.; Cheng, L.; Wang, F.; Wu,
P.; Whelan, J.; Shou, H. (2009) Physiological and Transcriptome Analysis of Iron and
Phosphorus Interaction in Rice Seedlings. Plant Physiology 151: 262-274
94
CAPÍTULO 3
BASES FISIOLÓGICAS PARA A SELEÇÃO DE CULTIVARES DE ARROZ
TOLERANTES A TOXIDEZ POR FERRO
95
1. INTRODUÇÃO
Os efeitos visuais associados à toxidez por ferro incluem redução no tamanho
das folhas, bronzeamento foliar, murcha das folhas, redução na ramificação radicular,
flacidez e nanismo nas raízes que, em conjunto, depreciam o crescimento das plantas
(Genon et al., 1994; Yamauchi e Peng 1995; Thipyapong et al., 2004). O excesso de
ferro nas plantas de arroz promove necrose foliar, desbalanço catiônico, ocasionando
desordem nutricional (Snowden e Wheeler, 1995; Silveira et al., 2007). Esses sintomas
são decorrentes da toxidez direta e indireta, que podem refletir na produtividade das
cultivares (Bode et al., 1995; Dobermann e Fairhurst, 2000). A toxidez direta,
promovida pela absorção excessiva de ferro, ocasiona desestruturação celular e danos
fisiológicos e bioquímicos. Por outro lado, a toxidez indireta resulta da deposição de
Fe
3+
nas raízes promovendo a formação de uma placa composta por óxidos ou
hidróxidos de ferro a qual pode limitar a absorção do Fe e outros elementos (Taylor et
al., 1984; Chen et al., 2006; Guo et al., 2007; Silveira et al., 2007; Zhou e Shi, 2007;
Liu et al., 2007; 2008).
O excesso de ferro nos tecidos foliares, caracterizado por teores superiores a 300
mg kg
-1
MS (Dobermann e Fairhurst, 2000), induz uma extensiva gama de desordens
metabólicas, desencadeando estresse oxidativo (Sinha et al., 1997; Eaton e Qian, 2002),
que pode ser responsável por danos nos componentes fotossintéticos (Spiller e Terry,
1980; Suh et al., 2002; Lupínková e Komenda, 2004). A desestruturação de pigmentos
dos complexos fotossintéticos promove, por sua vez, alteração no transporte de elétrons,
ocasionando redução na taxa de assimilação líquida de CO
2
e, com isso, perda da
capacidade de fixação de carbono nos cloroplastos (Terry, 1980; Taylor et al., 1982;
Scandalios, 1993; Desimone et al., 1996; Mishra e Dubey, 2005). Além disso, a
deficiência de nutrientes como o P, Mg, nas folhas, dentre outras consequências, afetam
a regeneração da RuBP (Farazdaghi, 2011) e ativação da Rubisco, respectivamente,
ocasionando redução na taxa fotossintética por retroinibição (Heldt e Heldt, 2005).
As plantas dependem da capacidade de armazenar e remobilizar o ferro para
adequado crescimento e minimizar sua toxicidade (Briat et al., 2007). Mecanismos de
dissipação do excesso de energia, a fim de evitar danos nos componentes celulares
(Golding e Johnson, 2003; Cruz et al., 2004; Mishra e Dubey, 2005; Joliot e Joliot,
2006), além de mecanismos enzimáticos e não enzimáticos contra o estresse oxidativo
gerado pelo excesso de ferro (Vansuyt et al., 1997; Becana et al., 1998; Fang et al.,
96
2001; Majerus et al., 2007) são utilizados pelas plantas. Dentre os mecanismos não
enzimáticos, o ferro pode ser armazenado nos vacúolos (Briat e Lobréaux, 1997) ou
imobilizado pela incorporação ferritina, a qual minimiza danos diretos e protege contra
a possível formação de espécies reativas de oxigênio (Briat et al., 1995; Murgia et al.,
2002; Zancani et al., 2004).
O estudo fisiológico dos efeitos tóxicos do ferro em plantas de arroz tem sido
importante na seleção de cultivares tolerantes e, ainda, auxiliará em estudos moleculares
mais específicos para o melhoramento de plantas de arroz (Sousa et al., 2004). A
fotossíntese, principal processo fisiológico, diretamente relacionado à produtividade,
tem sido estudada recentemente através da fluorescência da clorofila a. Esta análise
permite, além de danos fotossintéticos, avaliar mecanismos de dissipação não
fotoquímica (Baker, 2008), auxiliando na seleção de plantas fisiologicamente mais
tolerantes. O cultivo de cultivares tolerantes tem sido o principal recurso para garantir a
produtividade em ambientes com excesso de ferro (Audebert e Fofana, 2009). Desta
forma, o presente trabalho objetivou avaliar os efeitos tóxicos do ferro em cultivares de
Oryza sativa e, realizar uma seleção de cultivares possivelmente tolerantes ao ferro, a
partir da avaliação de parâmetros fisiológicos analisados de forma univariada e
multivariada.
97
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Condições de cultivo e Aplicação do tratamento
Sementes de arroz (Oryza sativa L.), cultivares ou linhagens BRS Atalanta,
Canastra, CMG 1167, CMG 1174, BRSMG Conaí, BRSMG Curinga, IRGA 419, BRS
Ourominas, BRS Pepita, BRSMG Relâmpago e BRSMG Seleta foram desinfestadas
superficialmente com hipoclorito de sódio comercial (10%) por 10 min e germinadas
em câmara de crescimento (27±2ºC) por 7 dias no escuro e 7 dias com fotoperíodo de
12 h. As plântulas foram transferidas para solução nutritiva de Hoagland (pH 4,0, força
total) em casa-de-vegetação. O pH foi ajustado a cada dois dias e a solução renovada
semanalmente.
Após aproximadamente trinta dias, as plantas, no estádio V5 de desenvolvimento
fenológico (Counce et al., 2000), foram tratadas com sulfato ferroso (FeSO
4
, 7 mM)
com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (p/p), concentração previamente
definida (Pereira, 2009). Foi realizado em paralelo um tratamento controle em solução
nutritiva com concentrações fisiológicas de ferro (0,019 mM). Cada tratamento foi
constituído por quatro repetições, sendo o pH ajustado diariamente a 4,0 e a solução
renovada a cada 4 dias. As avaliações foram realizadas após sete dias de exposição ao
excesso de ferro.
2.2. Variáveis avaliadas
2.2.1. Composição mineral do material vegetal
Para a quantificação do teor de nutrientes nas folhas e raízes, amostras do material
a fresco foram secas e moídas em moinho tipo Wiley. Para eliminar qualquer
interferência na quantificação de nutrientes na matéria seca das raízes, estas foram
previamente lavadas em solução contendo 3 % de ditionito de sódio (p/v), 0,3 M de
citrato de sódio e 1,0 M bicarbonato de sódio (Taylor e Crowder, 1983).
O material vegetal moído foi digerido em 1,5 mL de HNO
3
(Fisher Trace Metal
grade) concentrado, à 118 ºC por 4 horas e em seguida diluídas em 16 mL de água
analisado por Thermo Elemental PQ Excell ICP-MS. A análise da composição mineral
foi realizada utilizando a técnica de espectrometria de massas com fonte de plasma
indutivamente acoplado (ICP-MS), de acordo com Lahner et al. (2003). O teor dos
minerais (mg kg
-1
) determinados foram: magnésio (Mg), fósforo (P), enxofre (S),
potássio (K), sódio (Na), cálcio (Ca); ferro (Fe), boro (B), cobalto (Co), manganês
98
(Mn), molibdênio (Mo), níquel (Ni), cobre (Cu), zinco (Zn) e alguns elementos traços
como arsênio (As), cádmio (Cd), estrôncio (Sr) e rubídio (Rb).
A partir dos teores de ferro obtidos, calculou-se o acúmulo de Fe nas raízes (AR)
(Liu et al., 2008) e na parte aérea (AP) (Abichequer e Bohen, 1998) pela razão entre o
conteúdo de ferro na parte aérea (CPA) ou nas raízes (CSR) pelo teor de ferro na planta
inteira, como sendo:
AR (%) = [CSR / (CPA + CSR)] * 100
AP (%) = [CPA / (CPA+CSR)] * 100
2.2.2. Determinação das trocas gasosas
As medições de trocas gasosas foram realizadas em folhas completamente
expandidas. As variáveis, taxa de assimilação fotossintética líquida (A), condutância
estomática (g
s
), taxa de transpiração (E) e a razão entre concentração interna e externa
de CO
2
(C
i
/C
a
) foram determinadas por um analisador de gás por infravermelho (IRGA;
modelo portátil LI-6400xt, LI-COR Biosciences Inc., Lincon, Nebraska, USA). As
medições foram realizadas entre 8:00 e 12:30 a.m., em casa-de-vegetação, utilizando
radiação fotossinteticamente ativa (PAR) constante (1000 μmol fótons m
-2
s
-1
),
concentração atmosférica de CO
2
(C
a
) (~410 μmol mol
-1
), temperatura (20 - 30 ºC) e
umidade ambiente (50 - 69 %).
2.2.3. Fluorescência da clorofila a
As variáveis de fluorescência da clorofila a foram obtidas com auxílio do
fluorômetro modulado Imaging-PAM (Heinz Walz, Effeltrich, Germany) na mesma
área da folha em que foram realizadas as medições das trocas gasosas. Os sinais de
fluorescência em todos os pontos da área foliar analisada foram capturados por uma
câmera CCD (Charge Coupled Device) acoplada ao aparelho (Oxborough, 2004). Para
as avaliações as folhas foram adaptadas ao escuro para que os centros de reação
estivessem completamente abertos (todos os aceptores primários oxidados) com perda
de calor mínima. As variáveis de indução da fluorescência obtidas foram: fluorescência
inicial (F
0
) e fluorescência máxima (F
m
). A partir desses valores foi obtido o rendimento
quântico potencial do fotossistema II (FSII), F
v
/F
m
= (F
m
-F
0
)/F
m
(Genty et al., 1989). As
variáveis da fase lenta de indução da fluorescência foram obtidas seqüencialmente com
a aplicação de uma iluminação actínica e um pulso de luz actínica saturante para a
determinação das variáveis: fluorescência em amostra adaptada à luz antes do pulso de
99
saturação (F) e fluorescência máxima em amostra adaptada à luz (F
m
’). A partir desses
parâmetros foi possível calcular a fluorescência mínima do tecido vegetal iluminado, F
0
’
= F
0
/[((F
m
-F
0
/F
m
)+(F
0
/F
m
’)] (Oxborough e Baker, 1997), para o cálculo do coeficiente
de extinção fotoquímico pelo modelo lake, o qual fornece uma estimativa de centros de
reações abertos do FSII, q
L
= (F
m
’-F)/(F
m
’-F
0
’).(F
0
’/F) (Kramer et al., 2004). O
rendimento quântico efetivo de conversão fotoquímica de energia no PSII, Y
II
= (Fm’-
F)/Fm’; e os rendimentos quântico da dissipação de energia regulada, Y
NPQ
= (F/Fm’) -
(F/Fm) e da dissipação de energia não regulada, Y
NO
= F/Fm, foram calculados de
acordo com Genty et al. (1989) e Hendrickson et al. (2004). O Y
II
foi utilizado ainda
para estimar a taxa aparente de transporte de elétrons, ETR = Y
II
.PAR.0,84.0,5 (Bilger et
al., 1995), onde PAR é o fluxo de fótons (µmol m
-2
s
-1
) incidente sobre a folha; 0,5 o
valor correspondente à fração de energia de excitação distribuída para o FSII (Laisk e
Loreto, 1996); e, 0,84 o valor correspondente à fração de luz incidente que é absorvida
pelas folhas (Ehleringer, 1981).
2.2.4. Determinações de pigmentos cloroplastídicos
Os teores de pigmentos (clorofila a, b e carotenóides) foram determinados
utilizando como extrator o dimetilsulfóxido (DMSO), conforme descrito por Wellburn
(1994). Dois discos foliares de 0,59 cm de diâmetro cada foram colocados em
recipientes contendo 5 mL de DMSO, saturado com carbonato de cálcio e mantidos no
escuro. Após 4 horas em banho-maria a 65ºC, as absorbâncias dos extratos foram lidas
em espectrofotômetro a 480; 649,1 e 665,1 nm, utilizando como branco o DMSO puro.
Os teores dos pigmentos foram expressos por matéria fresca.
2.2.5. Determinação dos teores de malonaldeído
A concentração de malonaldeído (MDA) acumulado, a qual indica a peroxidação
de lipídios, foi determinada em folhas de arroz, a partir da extração em ácido
tricloroacético (TCA). O macerado foi centrifugado e, a uma alíquota do sobrenadante,
adicionou-se solução de ácido tiobarbitúrico (TBA) em TCA. Um controle para cada
amostra foi obtido sem a adição de TBA. As soluções foram incubadas em banho-maria
e, após completa extração, as reações foram interrompidas em banho de gelo. Realizou-
se a leitura da absorbância nos comprimentos de onda de 400, 532 e 600 nm. Para o
cálculo da concentração de MDA, inicialmente, a diferença entre os valores de 532 e
100
600 nm foram descontados dos mesmos valores obtidos pela reação sem adição de
TBA, segundo Hodges et al. (1999).
2.3. Análise Estatística
O delineamento experimental constituiu-se de blocos ao acaso, com quatro
repetições. Os dados de trocas gasosas, fluorescência, pigmentos e malonaldeído foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Scott-Knott 5% de
probabilidade, pelo programa SAEG v 9.0.
Os nutrientes foram analisados através da correlação de Pearson, no qual foram
identificadas as correlações do mineral ferro e todos os outros minerais, pelo programa
SAS v 9.0.
Para as análises multivariadas foi obtida a variação relativa para cada variável
analisada, pela seguinte equação: Variação Relativa (%) = (trat - contr) / contr x 100. Os
cultivares utilizados nesse trabalho foram agrupados, pelo método de variáveis
canônicas, com base em 19 variáveis fisiológicas obtidas. Foi analisada a contribuição
relativa dos caracteres para divergência pelo Método de Singh, a partir de médias não
padronizadas. Para as técnicas de agrupamento de otimização, pelos métodos de Tocher
e da ligação média entre grupo, UPGMA (unweighted pair-group method using
arithmetic averages), os dados foram analisados pela distância generalizada de
Mahalanobis, a qual apresenta vantagem de levar em consideração a correlação entre os
caracteres considerados, utilizando as variâncias e covariâncias residuais, a partir da
estimativa da distância de D
2
(Cruz et al., 2011). As análises multivariadas foram
realizadas com auxílio do programa GENES v 2007.0.0.
101
3. RESULTADOS
O cultivo de plantas em solução nutritiva com excesso de ferro ocasionou
acúmulo excessivo deste metal nas raízes e folhas dos diferentes cultivares estudados. O
acúmulo de ferro nas folhas foi até 5 vezes, superior às plantas controle, nos cultivares
CMG 1174 e IRGA 419 (Fig. 1A). No entanto, o maior acúmulo de ferro nas raízes das
plantas de arroz foi observado no cultivar BRSMG Seleta (22 vezes), seguido pelos
cultivares CMG 1167 e Canastra, com 19 vezes e, BRSMG Relâmpago, IRGA 419 e
BRS Pepita, em média, 16 vezes superior às raízes das plantas controle (Fig. 1A).
Controle
FeSO
4
-EDTA
Controle
FeSO
4
-EDTA
Atal
a
nta
Ca
n
ast
ra
CMG 116
7
CMG 117
4
Conaí
Curinga
I
rg
a 419
Ourominas
Pepita
Relâmpago
Seleta
Fe (mg.kg
-1
MSfoliar)
0
200
400
600
800
1000
Controle
FeSO
4
-EDTA
B
Fe (mg.kg
-1
MSradicular)
0
500
1000
1500
2000
2500
A
a
b
c
b
b
b
b
b
b
b
b
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
bb
b
b
b
b
b
b
b
b
Figura 1. Teor de ferro nas raízes (A) e folhas (B) de cultivares de
arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete dias, em
solução. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de
102
mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Scott-Knott (p > 0,05).
Os cultivares de arroz, cultivados sob excesso de ferro, apresentaram um maior
acúmulo de ferro nas raízes em detrimento ao índice de translocação para as folhas (Fig.
2). Os cultivares BRSMG Seleta, BRSMG Relâmpago, BRS Pepita, BRSMG Conaí e
CMG 1167 retiveram acima de 70 % do total de ferro incorporado às plantas, em suas
raízes, permitindo translocação de menos de 30 % para as folhas. A maior translocação
de ferro para as folhas foi observada no cultivar CMG 1174 (46 %), seguido pelos
cultivares BRSMG Curinga e BRSMG Ourominas (37 %) (Figs. 1B, 2)
A
talanta
C
anas
t
r
a
C
MG
1167
CMG 1174
Conaí
C
ur
ing
a
I
rga 41
9
Ourominas
Pepita
Relâmpago
Se
l
e
t
a
Acúmulo de ferro (%)
0
20
40
60
80
100
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
Figura 2. Acúmulo de ferro (%) nas raízes ( ) e nas folhas ( ) em
cultivares de arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete dias,
em solução. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de
mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-
Knott (p > 0,05).
O excesso de ferro na solução de cultivo afetou a absorção e translocação de
outros elementos nas plantas de arroz. O ferro apresentou correlação positiva e
significativa com B, Na, Ca, Zn, Sr e Mo nas raízes das plantas de arroz expostas ao
FeSO
4
-EDTA (7 mM) (Tab. 1). Os elementos Mg e K apresentaram correlação negativa
com o Fe nas raízes das plantas de arroz. A translocação de Fe correlacionou-se
positivamente com os elementos B, Na, S e Co. Os elementos Mg, P, K, Ca, Mn, Cu,
103
Rb, Sr e Mo apresentaram correlação negativa com o Fe nas folhas das plantas de arroz
expostas ao excesso de Fe (Tab. 1).
Tabela 1. Correlação entre o teor de Fe e outros 17 elementos em raízes e folhas de onze
cultivares de Oryza sativa, cultivados sob excesso de sulfato ferroso (FeSO
4
-EDTA, 7 mM), por
sete dias, em sistema hidropônico.
Raízes
B Na Mg P S K Ca Mn Co
0.353* 0.408* -0.517* 0.132
ns
-0.002
ns
-0.410* 0.466* -0.180
ns
-0.064
ns
Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
-0.084
ns
-0.032
ns
0.327* 0.072
ns
0.006
ns
0.797* 0.300* 0.053
ns
Folhas
B Na Mg P S K Ca Mn Co
0.552* 0.917* -0.571* -0.424* 0.380* -0.649* -0.405* -0.503* 0.530*
Ni Cu Zn As Rb Sr Mo Cd
0.150
ns
-0.343* -0.059
ns
0.004
ns
-0.561* -0.406* -0.334* 0.039
ns
* 1 %;
ns
não significativo
As respostas na taxa de assimilação líquida do CO
2
variaram entre os cultivares
avaliados, com reduções expressivas nos cultivares BRS Atalanta (77 %), CMG 1174
(73 %), BRS Pepita (48 %), CMG 1167 (43 %) e IRGA 419 (42 %), em relação aos
respectivos controles (Fig. 3A). A queda fotossintética foi acompanhada pela redução
na condutância estomática (g
S
), em até 89 % no cultivar BRS Atalanta, e na taxa
transpiratórias (E) nas plantas de arroz (Figs. 3B e 3C). A relação C
i
/C
a
, no entanto, foi
afetada em menor proporção nos cultivares de arroz cultivados sob excesso de ferro,
com reduções significativas nos cultivar BRS Atalanta (22 %), CMG 1174 (15 %) e
Conaí, BRSMG Seleta e BRSMG Relâmpago, com 13 % de redução em relação aos
respectivos controles (Fig. 3D).
A fluorescência inicial da clorofila a (F
0
) foi afetada de forma mais expressiva
nos cultivares CMG 1174, com aumento de 21 %, seguido pelos cultivares BRS
Atalanta, CMG 1167 e BRS Ourominas, com 13 %, em relação ao controle (Fig. 4A). O
rendimento quântico potencial do fotossistema II (FSII; F
v
/F
m
), no entanto, apresentou
redução significativa nos cultivar BRS Pepita (12 %), BRS Atalanta (10 %) e CMG
1174 (8%), em relação ao respectivo controle (Fig. 4B).
104
A (µmol.m
-2
.s
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
35
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
c
b
c
b
b
b
a
g
S
(µmol.m
-2
.s
-1
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
FeSO
4
-EDTA
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
A
t
alan
t
a
Ca
n
astra
CMG
116
7
CMG 1174
Conaí
C
uringa
I
rg
a
41
9
Ourominas
Pepita
R
elâmpago
S
e
l
e
ta
C
i
/C
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
a
a
a
a
a
a
a
a
ba
a
a
b
b
a
b
b
b
b
b
b
b
At
alan
ta
Canas
t
ra
CMG 1167
C
M
G
1
174
Cona
í
Curinga
Irga 419
Ouromi
n
as
Pepita
R
elâm
p
ago
Selet
a
E (mmol.m
-2
.s
-1
)
0
2
4
6
8
10
12
14
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
A
B
C
D
Figura 3. Taxa de assimilação líquida de CO
2
(A; A); condutância estomática (g
S
; B); relação C
i
/C
a
(C) e taxa transpiratória (E) em
cultivares de arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete dias, em solução. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de
mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
105
F
0
0
50
100
150
200
b
a
c
b
b
b
c
c
c
c
c
c
c
b
b
b
b
c
a
b
b
c
A
t
a
l
an
t
a
Cana
s
tr
a
CMG 1167
CMG 1
1
74
Con
a
í
Curin
g
a
I
rga 419
Our
o
minas
Pepita
R
elâmpago
S
e
le
t
a
F
v
/F
m
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
FeSO
4
-EDTA
aa
a
a
a
b
a
a
a
a
a
b
b
b
a
a
a
a
a
a
a
a
A
B
Figura 4. Fluorescência inicial da clorofila a (F
0
; A) e rendimento
quântico potencial do fotossitema II (FSII; F
v
/F
m
; B) em cultivares de
arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete dias, em solução.
Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de mesma letra não
diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
A taxa de transporte de elétrons (ETR) foi afetada de forma mais expressiva nos
cultivares CMG 1167, IRGA 419 e BRS Pepita, com redução de 29 %, 25 % e 15 %,
respectivamente, em relação ao controle (Fig. 5A). A redução no ETR foi acompanhada
por diminuição no quenching fotoquímico (q
P
; dados não mostrados) e rendimento
quântico efetivo do fluxo linear de elétrons pelo FSII (Y
II
) (Fig. 6A). A estimativa de
centros de reações abertos no FSII (q
L
) apresentou incremento significativo nas
cultivares BRS Atalanta (188 %), BRS Pepita (129 %), BRS Ourominas (99 %) e CMG
11 74 (73 %), em relação às plantas cultivadas em ambiente ideal de ferro (Fig. 5B).
106
ETR
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
Atalan
t
a
Canastra
CM
G
1
167
CM
G
1174
Con
a
í
Cu
ringa
Irga 419
Our
o
minas
P
e
p
it
a
Relâm
p
ago
Se
le
ta
q
L
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Controle
FeSO
4
-EDTA
a
a
a
a
c
b
b
b
b
b
b
b
b
bb
b
b
b
bb
b
b
A
B
Figura 5. Taxa aparente de transporte de elétrons (ETR; A) e
estimativa de centros de reações abertos no FSII (q
L
; B) em
cultivares de arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete
dias, em solução. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas
de mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Scott-Knott (p > 0,05).
O rendimento quântico da dissipação de energia regulada (Y
NPQ
) aumentou em
até 55 % no cultivar BRSMG Seleta, em relação ao controle, seguido pelos cultivares
CMG 1174 (48 %), BRS Atalanta e BRSMG Relâmpago (34,5 %) e BRSMG Curinga,
BRS Ourominas e BRS Pepita com 23 % (Fig. 6C). O aumento em Y
NPQ
foi
acompanhado pelo incremento mais expressivo no coeficiente de extinção não-
fotoquímico (NPQ, dados não mostrados). O rendimento quântico da dissipação de
energia não regulada (Y
NO
), de forma geral, não foi afetado significativa e
expressivamente nos cultivares avaliados, sob cultivo em excesso de ferro (Fig. 6B).
Os pigmentos fotossintéticos, clorofila a, clorofila b e carotenóides totais não
foram afetados significativamente nos cultivares de arroz cultivados por sete dias sob
exposição ao excesso de FeSO
4
-EDTA (Fig. 7A-C).
107
Y(II)
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
a
a
a
a
a
Y(NPQ)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
b
b
b
b
b
b
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
A
tala
nta
Canastra
CMG 1167
CMG 1174
Con
aí
Cur
inga
Ir
g
a 419
O
uro
mi
nas
P
epi
t
a
R
e
lâmpago
S
el
eta
Y(NO)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Controle
FeSO
4
-EDTA
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
a
a
aa
a
a
a
aaa
a
a
A
B
C
Figura 6. Rendimentos quânticos: efetivo do fluxo linear de
elétrons pelo FSII (Y
II
; A), da dissipação de energia regulada
(Y
NPQ
; B) e da dissipação de energia não regulada (Y
NO
; C) em
cultivares de arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete
dias, em solução. Barras representam médias ± EP. Médias
seguidas de mesma letra não diferem significativamente entre si
pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
108
Clorofila b (µg.mg MF
-1
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Atalanta
C
a
na
st
r
a
C
M
G
11
67
C
M
G
11
7
4
C
on
a
í
C
u
r
in
g
a
Irg
a
4
1
9
Ou
r
omin
a
s
Pe
pit
a
R
e
lâ
m
pa
go
Seleta
Carotenóides (µg.mg MF
-1
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Controle
FeSO
4
-EDTA
Clorofila a (µg.mg MF
-1
)
0
1
2
3
4
5
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
A
B
C
aa
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
Figura 7. Teor de clorofila a (A), clorofila b (B) e carotenóides
totais (C) em cultivares de arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA
(7 mM), por sete dias, em solução. Barras representam médias ±
EP. Médias seguidas de mesma letra não diferem
significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (p > 0,05).
109
O teor de malonaldeído (MDA) nas folhas apresentou de forma geral,
incremento superior a 30 % nas plantas de arroz expostas ao excesso de ferro. Os
aumentos mais expressivos de MDA foram observados nos cultivares BRS Atalanta
(106 %), BRSMG Seleta e BRS Ourominas (86 %), CMG 1175 (59 %) e BRSMG
Conaí (53 %) (Fig. 8).
A
t
a
la
nta
Can
a
stra
CMG
1
1
67
CMG
1
1
7
4
Conaí
Cu
r
ing
a
Irga 41
9
O
uromin
a
s
Pepita
Relâm
p
ago
S
e
leta
MDA (nmol.g MF
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
Controle
FeSO
4
-EDTA
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
a
aa
b
a
Figura 8. Teor de malonaldeído (MDA) em cultivares de
arroz cultivados sob FeSO
4
-EDTA (7 mM), por sete dias, em
solução. Barras representam médias ± EP. Médias seguidas de
mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste
de Scott-Knott (p > 0,05).
A partir da análise multivariada das 19 variáveis fisiológicas obtidas, foi
possível observar que as três primeiras variáveis canônicas respondem em 72,20 %
(Tab. A1) da variância total de caracteres analisados, permitindo a representação da
variabilidade manifestada entre os cultivares, em um gráfico tridimensional (Fig. A1).
As variáveis q
P
, q
N
, A e NPQ apresentaram maior contribuição relativa para a
dissimilaridade, baseado pelo método de Singh (Tab. 2). O que demonstra que
caracteres fotossintéticos e de dissipação de energia contribuem para a validação das
inferências realizadas, permitindo a utilização dessas avaliações não invasivas na pré-
seleção de cultivares tolerantes ao ferro.
O agrupamento pelo método UPGMA permitiu a obtenção de um dendrograma
de dissimilaridade entre os cultivares (Fig. 9). O dendrograma permitiu verificar a
formação de cinco grupos, dentre os quais, 3 cultivares, Atalanta, CMG 1167 e CMG
110
1174, pretencentes cada um a um grupo (III, IV e V), apresentaram alta sensibilidade ao
Fe. Os cultivares Canastra e IRGA 419, dentre os cultivares avaliados, apresentaram
maior tolerância fisiológica ao excesso de ferro em solução de cultivo.
Tabela 2. Contribuição relativa das variáveis
avaliadas para a dissimilaridade pelo Método
de Singh, a partir de médias não padronizadas.
Variável S.j %
q
P
867.62 25.906
q
N
374.52 11.183
A
286.87 8.566
NPQ 282.61 8.439
q
L
229.23 6.845
E
218.09 6.512
Y
NO
194.22 5.799
F
v
/F
m
186.20 5.560
ETR
132.16 3.946
Carot 113.08 3.376
g
S
104.06 3.107
C
i
/C
a
65.24 1.948
C
i
64.72 1.933
Chla 59.45 1.775
F
0
58.73 1.754
Y
II
52.58 1.570
Y
NP
Q
40.47 1.208
MDA 12.08 0.361
Chlb 7.13 0.213
111
Figura 9. Dendrograma representativo da dissimilaridade genética entre onze cultivares de arroz, pelo método de agrupamento através da ligação média entre
grupos, UPGMA, baseado na distância de Mahalanobis (D
2
), avaliado pelo índice relativo do efeito do excesso de ferro no cultivo das plantas de arroz.
112
4. DISCUSSÃO
A toxicidade por ferro é uma síndrome de desordem associada a altos teores de
ferro reduzido (Fe
+2
) na solução do solo (Becker e Asch, 2005). Os níveis tóxicos são
descritos para o arroz em dosagens superiores a 300 mg kg
-1
MS (Dobermann e
Fairhurst, 2000), como observado nos cultivares em estudo (Fig. 1). O acúmulo de ferro
nas raízes das plantas de arroz variou de acordo com o cultivar, independente do sistema
de cultivo pré recomendado, sendo, em média, 15 vezes superior ao respectivo controle.
O alto acúmulo de ferro pode ser devido a expressão de transportadores específicos de
ferro. As plantas de arroz apresentam estratégias para aumentar a absorção deste metal,
através da acidificação do meio e redução de Fe
+3
a Fe
+2
(Fox e Guerinot, 1998; Gross
et al., 2003), ou ainda quelação do metal com fitosideróforos (Schmidt et al., 2003;
Ishimaru et al., 2006).
A toxidez por ferro, no entanto, requer além da absorção excessiva de Fe
+2
pelas
raízes, translocação, via fluxo transpiratório, para as folhas (Becker e Asch, 2005). A
translocação de ferro, através do xilema, envolve transportadores de cátions (Curie et
al., 2000; Thomine et al., 2003) ou associados com o transporte de metais quelados
(Takahashi, 2003; Koike et al,. 2004; Guerinot, 2000). Dentre os cultivares avaliados,
BRSMG Conaí e BRSMG Seleta proporcionaram uma menor translocação de ferro para
a parte aérea das plantas de arroz cultivadas em excesso de ferro. Nesses cultivares, o
ferro foi acumulado nas raízes em teores acima de 70 % do total. Linhagens tolerantes
de arroz tem sido descritas pelo incremento mais lento de ferro nas raízes durante os
estágios finais do desenvolvimento, sugerindo um mecanismo de exclusão de ferro
pelas raízes dessas plantas (Nozoe et al., 2004). Os cultivares Canastra, CMG 1174,
IRGA 419 e BRS Pepita apresentaram um acúmulo de ferro nas folhas, em média, 5
vezes superior aos controles (Figs. 1-2).
O incremento nos teores de elementos como B, Na, Ca, Zn, Sr e Mo nas raízes
das plantas de arroz expostas ao excesso de ferro (Tab. 1), sugerem que outros
elementos podem ser transportados por carreadores utilizados para a absorção de Fe
+2
(Curie e Briat, 2003). No entanto, alta concentração de ferro causou um desbalanço
nutricional através de efeitos antagonísticos na absorção de outros nutrientes (Sahrawat,
2005; Silveira et al., 2007), como Mg e K nas raízes e Mg, K, Ca, Mn, Cu, Rb, Sr e Mo
nas folhas das plantas de arroz (Tab. 1). Elementos como o Mg e P são essenciais para a
manutenção do metabolismo fotossintético das plantas que, sob deficiência podem
113
comprometer a ativação de enzimas essenciais para o metabolismo do carbono (Cakmak
e Kirkby, 2008), teor de pigmentos fotossintéticos (Ding et al., 2006; 2008; Esfandiari
et al., 2010), promovendo alterações na fotossintese, pela redução no transporte de
elétrons fotossintético (Wissuma et al., 2005; Hermans e Verbruggen, 2005; Xu et al.,
2007).
A toxidez por ferro nas folhas, devido ineficiência na compartimentalização do
excesso de ferro no apoplasto e vacúolos (Briat e Lobréaux, 1997) ou em moléculas de
ferritina (Majerus et al., 2009; Briat et al., 2010) ocasionou redução na taxa
fotossintéticas das plantas (Fig. 3A). A queda fotossintética foi mais expressiva nos
cultivares BRS Atalanta, CMG 1174, BRS Pepita, CMG 1167 e IRGA 419, sendo
acompanhada pela redução na condutância estomática. A concentração interna de CO
2
,
no entanto, não foi proporcionalmente diminuída em decorrência ao fechamento
estomático (Fig. 3B-D). Este fato, associado à redução no teor de Mg e P nas folhas de
plantas de arroz, sugerem que a diminuição na fotossíntese por ter ocorrido por
alterações nas enzimas envolvidas no metabolismo do carbono, como a ribulose 1,5 –
bifosfato (RuBP) carboxilase/oxigenase (Rubisco), e regeneração da RuBP (Taylor et
al., 1982; Desimone et al., 1996; Mitchell et al., 2000; Heldt e Heldt, 2005; Farazdaghi,
2011).
A redução fotossintética foi acompanhada pela redução na taxa de transporte de
elétrons (ETR), de forma mais expressiva nos cultivares CMG 1167, IRGA 419 e BRS
Pepita (Fig. 5A). Danos na etapa fotoquímica da fotossíntese impedem a utilização da
energia absorvida, gerando excesso de energia. A fluorescência inicial da clorofila a
(F
0
) representa a emissão de excitação pelo complexo antena (Krause e Weis, 1991). O
aumento em F
0
, induzido pelo excesso de ferro, como observado nos cultivares CMG
1174, BRS Atalanta, CMG 1167 e BRS Ourominas (Fig. 4A), indica disparidade na
transferência de energia dos pigmentos do complexo coletor de luz para o centro de
reação (Pereira, 2009). Uma vez transferida ao FSII, o excesso de energia pode ainda
ser dissipado na forma de calor (Demmig-Adams e Adams, 1996; Baroli e Niyogi,
2000; Smirnoff, 2005), como observado pelo aumento do Y
NPQ
. O aumento mais
expressivo de YNPQ foi observado no cultivar BRSMG Seleta, seguido pelos cultivares
CMG 1174, BRS Atalanta, BRSMG Relâmpago, BRSMG Curinga, BRS Ourominas e
BRS Pepita (Fig. 6).
Danos nos complexos fotossintéticos têm sido descritos como decorrentes de
estresse oxidativo gerado pelo excesso de ferro (Terry, 1980; Spiller e Terry, 1980;
114
Taylor et al., 1982; Suh et al., 2002; Mehraban et al., 2008). O estresse oxidativo foi
observado nos cultivares de arroz pelos altos teores de malonaldeído (MDA; Fig. 8), um
composto indicativo de oxidação lipídica (Fang et al., 2001). Os aumentos mais
expressivos de MDA foram observados nos cultivares BRS Atalanta, BRSMG Seleta,
BRS Ourominas, CMG 1175 e BRSMG Conaí.
115
5. CONCLUSÕES
Os cultivares de arroz BRS Atalanta, CMG 1167 e CMG 1174 apresentaram alta
sensibilidade à toxidez por ferro, com reduções mais expressivas na taxa fotossintética
e, com isso, alta dissimilaridade entre os tratamentos, para cada cultivar.
Os cultivares BRSMG Relâmpago e MRS Ourominas apresentaram moderada
sensibilidade ao ferro, com mecanismos de dissipação do excesso de energia a fim de
evitar o comprometimento e redução expressiva da fotossíntese.
Os cultivares Canastra, BRSMG Conaí e BRSMG Curinga, apesar da pré
indicação para cultivo em sistema de sequeiro, demonstraram maior capacidade
fisiológica de tolerar o excesso de ferro, entre os cultivares avaliados em condições de
casa-de-vegetação.
O cultivar BRSMG Seleta apresentou possível mecanismo de exclusão de ferro,
ao limitar a translocação de ferro absorvido para as folhas, além de dissipar excesso de
energia na forma de calor, como mecanismo de proteção contra danos no FSII. Este
cultivar, indicado para cultivo irrigado, apresenta, nas condições impostas, tolerância
fisiológica ao excesso de ferro.
As análises uni e multivariadas mostraram-se apropriadas para a seleção de
cultivares tolerantes ao ferro.
Os parâmetros fisiológicos são descritos pela alta sensibilidade em resposta aos
níveis tóxicos de ferro. Trabalhos em casa-de-vegetação são importantes para uma pré-
seleção de possíveis cultivares tolerantes, os quais precisam ser posteriormente
confirmados em campo.
116
6. ANEXOS
Tabela A1. Variância (autovalores), variância percentuais
e variâncias acumuladas das variáveis canônicas visando
estimar a dissimilaridade entre os 11 cultivares de arroz.
Variáveis
Canônicas
Variâncias
(autovalores)
Variâncias
percentuais
Variâncias
Acumuladas
VC1
5.3307 35.4828 35.48
VC2
3.2238 21.4586 56.94
VC3
2.2924 15.2589 72.20
VC4
1.8140 12.0742 84.27
VC5
0.7999 5.3246 89.60
VC6
0.6977 4.6444 94.24
VC7
0.3670 2.4430 96.69
VC8
0.2569 1.7099 98.40
VC9
0.1688 1.1235 99.52
VC10
0.0721 0.4800 100.00
VC11
0.0000 0.0000 100.00
VC12
0.0000 0.0000 100.00
VC13
0.0000 0.0000 100.00
VC14
0.0000 0.0000 100.00
VC15
0.0000 0.0000 100.00
VC16
0.0000 0.0000 100.00
VC17
0.0000 0.0000 100.00
VC18
0.0000 0.0000 100.00
VC19
0.0000 0.0000 100.00
Tabela A2. Agrupamento de cultivares de Oryza sativa, pelo método de Tocher, com
base no índice relativo 19 caracteres quantitativos.
Grupo Cultivares/Trat
I Canastra, IRGA 419, Relâmpago, Seleta, Conaí, Ourominas, Pepita, Curinga
II CMG 1174
III CMG 1167
IV Atalanta
117
Figura A3. Dispersão gráfica dos escores da primeira (VC1, 35,48%) e da segunda (VC2,
21,46%) e da terceira (vc3, 15,26%) variável canônica as quais explicam o somatório de
71,20 % da dissimilaridade.
118
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abichequer, A.D.; Bohnen, H (1998) Eficiência de absorção, translocação e utilização
de fósforo por variedades de trigo. Revista Brasileira de Ciência do Solo 22: 21-26
Audebert, A.; Fofana, M. (2009) Rice Yield Gap due to Iron Toxicity in West Africa.
Journal of Agronomy & Crop Science 195: 66-76
Baker, N.R. (2008) Chlorophyll Fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo.
Annual Review of Plant Biology 59: 89-113
Baroli, I.; Niyogi, K.K. (2000) Molecular genetics of xanthophyll-dependent
photoprotection in green algae and plants. Philosophical Transactions of the Royal
Society London B 355: 1385-1394
Becana, M.; Moran, J.F.; Iturbe-Ormaetxe, I. (1998) Iron-dependent oxygen free radical
generation in plants subjected to environmental stress: toxicity and antioxidant
protection. Plant and Soil 201: 137-147
Becker, M.; Asch, F. (2005) Iron toxicity in rice - conditions and management concepts.
Journal of Plant Nutrition Soil Science 168: 558-573
Bilger, W.; Björkman, O. (1990) Role of the xanthophyll cycle in photoprotection
elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and
photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research 25: 173-185
Bilger, W.; Schreiber, U.; Bock, M. (1995) Determination of the quantum efficiency of
photosystem II and of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in the
field. Oecologia 102: 425-432
Bode, K.; Doring, O.; Luthje, S.; M, Bottger. (1995) Induction of iron toxicity
symptoms in rice (Oryza sativa L.). Mitteilungen aus dem Institut für allgemeine
Botanik in Hamburg 25: 35-43
Briat, J.-F.; Curie, C.; Gaumard, F. (2007) Iron utilization and metabolism in plants.
Current Opinion in Plant Biology 10: 276-282
Briat, J.-F.; Duc, C.; Ravet, K., Gaymard, F. (2010) Ferritins and iron storage in plants.
Biochimica et Biophysica Acta 1800: 806-814
Briat, J.-F.; Fobis-Loisy, I.; Grignon, N.; Lobreaux, S.; Pascall, N.; Savino, G.; Thoiron,
S.; von Wiren, N.; Wuytswinkel, O. (1995) Cellular and molecular aspects of iron
metabolism in plants. Biology of the Cell 84:69-81
Briat, J.-F.; Lobréaux, S. (1997) Iron Transport and storage in plants. Trends in Plant
2: 187-193
Cakmak, I.; Kirkby, E. (2008). Role of magnesium in carbon partitioning and
alleviating photooxidative damage. Physiologia Plantarum 133: 692-704
Chen, R.F.; Shen, R.F.; Gu, Pei.; Dong, X.Y.; Du, C.W.; Ma, J.F. (2006) Response of
rice (Oryza sativa) with root surface iron plaque under aluminium stress. Annals of
Botany 98: 389–395
Counce, P.; Keisling, T.C.; Mitchell, A.J. (2000) A uniform, objective, and adaptive
system for expressing rice development. Crop Science 40: 436-443
119
Cruz, C.D.; Ferreira, F.M.; Pessoni, L.A. (2011) Biometria aplicada ao estudo da
diversidade genética. 620 p
Cruz, J.A.; Avenson, T.J.; Kanazawa, A.; Takizawa, K.; Edwards, G.E.; Kramer, D.M.
(2004) Plasticity in light reactions of photosynthesis for energy production and
photoprotection. Journal of Experimental Botany 56 (411): 395-406
Curie, C.; Alonso, J.M.; Le Jean, M.; Ecker, J.R.; Briat, J.-F. (2000) Involvement of
NRAMP1 from Arabidopsis thaliana in iron transport. Biochemical Journal 347: 749-
755
Curie, C.; Briat, J.F. (2003) Iron transport and signaling in plants. Annual Review of
Plant Biology 54: 183-206
Demmig-Adams, B.; Adams, W.W (1996) The role ox xanthophylls cycle carotenoids
in the protection of photosynthesis. Trends in Plant Science 1(1): 21-26
Desimone, M.; Henke, A.; Wagner, E. (1996) Oxidative stress induces partial
degradation of the harge subunit of Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase in
isolated chloroplasts of barley. Plant Physiology 111: 789-796
Ding, Y.; Luo, W.; Xu, G. (2006) Characterisation of magnesium nutrition and
interaction of magnesium and potassium in rice. Annals of Applied Biology 149:111-
123
Ding, Y.-C.; Chang, C.-R.; Luo, W.; Wu, Y.-S.; Ren, X.-L.; Wang, P.; Xu, G.-H. (2008)
High Potassium Aggravates the Oxidative Stress Inducedy by Magnesium Deficiency in
Rice Leaves. Pedosphere 18(3): 316–327
Dobermann, A.; Fairhurst, T. (2000) Toxicidad de hierro en arroz. In: Dobermann, A.;
Fairhurst, T. (Eds.). Rice: nutrient disorders & nutrient management. Potash and
Phosphate Institute and International Rice Research Institute. p. 1-4
Eaton, J.W.; Qian, M. (2002) Molecular bases of cellular iron toxicity. Free Radical
Biology and Medicine 32: 833-840
Ehleringer, J. (1981) Leaf absorptances of Mohave and Sonoran desert plants.
Oecologia 102: 366-370
Esfandiari, E.; Shokrpour, M.; Alavi-Kia, S. (2010) Effect of Mg deficiency on
antioxidant enzymes activities and lipid peroxidation. Journal of Agricultural Science
2(3): 131-136
Fang, W.; Wang, J.; Lin, C.; Kao, C. (2001) Iron induction of lipid peroxidation and
effects on antioxidative enzyme activities in rice leaves. Plant Growth Regulation 35:
75-80
Farazdaghi, H. (2011) The single-process biochemical reaction of Rubisco: A unified
theory and model with the effects of irradiance, CO
2
and rate-limiting step on the
kinetics of C
3
and C
4
photosynthesis from gas exchange. Biosystems 103(2): 265-284
Fox, T.C.; Guerinot, M.L (1998) Molecular biology of cation transport in plants.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49: 669-696
Genon, J.; Hepcée, N.; Duffey, J.; Delvaux, B.; Hennebert, P. (1994) Iron toxicity and
other chemical soil constraints to rice in highland swamps of Burundi. Plant and Soil
166: 109-115
120
Genty, B.; Briantais, J.M.; Baker, N.R. (1989) The relatíonship between the quantum
yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence.
Biochimica et Biophysica Acta 990: 87-92
Golding, A.J.; Johnson, G.N. (2003) Down-regulation of linear and activation of cyclic
electron transport during drought. Planta 218: 107-114
Gross, J.; Stein, R.J.; Fett-Neto, A.G.; Fett, J.P. (2003) Iron homeostasis related genes
in rice. Genetics and Molecular Biology 26: 477-497
Guerinot, M.L. (2000) The ZIP family of metal transporters. Biochimica et Biophysica
Acta 1465: 190-198
Guo, W.; Zhu, Y.-G.; Liu, W.-J; Liang, Y.-C.; Geng, C.-N.; Wang, S.-G. (2007) Is the
effect of silicon on rice uptake of arsenate (As
V
) related to internal silicon
concentrations, iron plaque and phosphate nutrition? Environmental Pollution 148:
251-257
Heldt, H.-W.; Heldt, F. (2005) The Calvin cycle catalyzes photosynthetic CO
2
assimilation. In: Heldt, H.-W. (ed.) Plant Biochemistry (3 Ed) p. 165-193
Hendrickson, L.; Furbank, R.T.; Chow, W.S. (2004) A simple alternative approach to
assessing the fate of absorbed light energy using chlorophyll fluorescence.
Photosynthesis Research 82: 73-81
Hermans, C.; Verbruggen, N. (2005). Physiological characterization of Mg deficiency
in Arabidopsis thaliana. Journal of experimental botany 56: 2153-2161
Hodges, D.M.; DeLong, J.M.; Forney, C.F.; Prange, R.K. (1999) Improving the
thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating lipid peroxidation in plant
tissues containing anthocyanin and other interfering compounds. Planta 207: 604-611
Ishimaru, Y.; Suzuki, M.; Tsukamoto, T.; Suzuki, K.; Nakazono, M.; Kobayashi, T.;
Wada, Y.; Watanabe, S.; Matsuhashi, S.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.;
Nishisawa, N.K. (2006) Rice plants take up iron as an Fe
3+
-phytosiderophore and as
Fe
2+
. Plant Journal 45: 335-346
Joliot, P.; Joliot, A. (2006) Cyclic electron flow in C3 plants. Biochimica et Biophysica
Acta 1757: 362-368
Koike, S.; Inoue, H.; Mizuno, D.; Takahashi, M.; Nakanishi, H.; Mori, S.; Nishizawa,
N.K. (2004) OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is regulated by iron
and expressed in the phloem. The Plant Journal 39: 415-424
Kramer, D.M.; Johnson, G.; Kiirats, O.; Edwards, G.E. (2004) New fluorescence
parameters for the determination of QA redox state and excitation energy fluxes.
Photosynthesis Research 79: 209-218
Krause, G.H.; Weis, E. (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42:313-349
Lahner, B.; Gong. T.; Mahmoudian, M.; Smith, E.L.; Abid, K.B.; Rogers, E.E.;
Guerinot, M.L.; Harper, I.F.; Ward, J.M.; Meintyre, L.; Schroeder, J.I.; Salt, D.E.
(2003) Genomic scale profiling of nutrients and trace elements in Arabidopsis thaliana.
Nature Biotechnology 21:1215-1225
121
Laisk, A.; Loreto, F. (1996) Determining photosynthetic parameters from leaf CO
2
exchange and chlorophyll fluorescence. Plant Physiology 110: 903-912
Lichtenthaler, H.K.; Buschmann, C.; Knapp, M. (2005) How to correctly determine the
different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease
ratio RFd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica 43 (3): 379-393
Liu, H.; Zhang, J.; Christie, P.; Zhang, F. (2008) Influence of iron plaque on uptake and
accumulation of Cd by rice (Oryza sativa L.) seedlings grown in soil. Science of the
Total Environment 394: 361-368
Liu, H.-J.; Zhang, J.-L.; Zhang, F.-S. (2007) Role of iron plaque in Cd uptake by and
translocation within rice (Oryza sativa L.) seedlings grown in solution culture.
Environmental and Experimental Botany 59: 314-320
Lupínková, L.; Komenda, J. (2004) Oxidative modifications of the photosystem II D1
protein by reactive oxygen species: from isolated protein to cyanobacterial cells.
Photochemistry and Photobiology 79(2): 152–162
Majerus, V.; Bertin, P.; Lutts, S. (2009) Abscisic acid and oxidative stress implications
in overall ferritin synthesis by African rice (Oryza glaberrima Steud.) seedlings
exposed to short term iron toxicity. Plant Soil 324: 253-265
Majerus, V.; Bertin, P.; Swenden, V.; Fortemps, A.; Lobréaux, S.; Lutts, S. (2007)
Organ-dependent responses of the African rice to short-term iron toxicity: ferritin
regulation and antioxidative responses. Biologia Plantarum 51: 303-312
Mehraban, P.; Zadeh, A.A.; Sadeghipour, H.R. (2008) Iron toxicity in rice (Oryza sativa
L.), under different potassium nutrition. Asian Journal of Plant Sciences 1-9
Mishra, S.; Dubey, R.S. (2005) Heavy metal toxicity induced alterations in
photosynthetic metabolism in plants. Cap 45. In: Pessarakli. M. (ed.) Handbook of
Photosynthesis. 2 ed. 862 p
Mitchell, R.A.C.; Theobald, J.C.; Parry, M.A.J.; Lawlor, D.W. (2000) Is there scope for
improving balance between rubp-regeneration and carboxylation capacities in wheat at
elevated CO
2
? Journal of Experimental Botany 51: 391-398
Murgia, I.; Delledonne, M.; Soave, C. (2002) Nitric oxide mediates iron-induced ferritin
accumulation in Arabidopsis. The Plant Journal 30: 521-528
Nozoe, T.; Agbisit, R.; Fukuta, Y.; Rodriguez, R.; Yanagihara, S. (2004) The Iron (Fe)-
excluding power of rice roots as a mechanism of tolerance of elite breeding lines to iron
toxicity. Proceedings of the 4o. International Crop Science Congress: Brisbane,
Austrália p. 1-6
Oxborough, K. (2004) Imaging of chlorophyll a fluorescence: theoretical and practical
aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance.
Journal of Experimental Botany 55(400): 1195-1205
Oxborough, K.; Baker, N.R. (1997) An instrument capable of imaging chlorophyll a
fluorescence from intact leaves at very low irradiance and at the cellular and sub-
cellular levels of organization. Plant, Cell and Environment 20: 1473-1483
Pereira, E.G. (2009) Efeitos tóxicos do ferro: alterações fisiológicas e morfológicas
em plantas cultivadas e de restinga. Tese de Doutorado: Universidade Federal de
Viçosa.117 p
122
Sahrawat, K.L. (2005) Managing iron toxicity in lowland rice: the role of tolerant
genotypes and plant nutrients. Session 15: Challenges to expanding rice production in
unfavorable environments, p 452-254. In: Toriyama K, Heong KL, Hardy B (eds.) Rice
is life: scientific perspectives for the 21st century. Proceedings of the World Rice
Research Conference held in Tokyo and Tsukuba, Japan 590 p
Scandalios, J.G. (1993) Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology
101: 7-12
Schmidt, W.; Michalke, W.; Schikora, A. (2003) Proton pumping by tomato roots.
Effect of Fe deficiency and hormones on the activity and distribution of plasma
membrane H+-ATPase in rhizodermal cells. Plant, Cell and Environment 26: 361-370
Silveira, V.C.; Oliveira, A.P.; Sperotto, R.A.; Amaral, L.; Dias, J.F.; Cunha, J.B.; Fett,
J.P. (2007) Influence of iron on mineral status of two rice (Oryza sativa L.) cultivars.
Brazilian Journal of Plant Physiology 19: 127-139
Sinha, S.; Gupta, M.; Chandra, P. (1997) Oxidative stress induced by iron in Hydrilla
verticillata (l.f.) Royle: responde of antioxidants. Ecotoxicology and Environmental
Safety 38: 286-291
Smirnoff, N. (2005) Ascorbate, tocopherol and carotenoids: metabolism, pathway
engineering and functions. In: Smirnoff, N. (Ed.) Antioxidants and reactive oxygen
species in plants. Blackwell Publishing Ltd. p. 53-86
Snowden, R.; Wheeler, B.D. (1995) Chemical changes in selected wetland plant species
with increasing Fe supply, with specific reference to root precipitates and Fe tolerance.
New Phytologist 131: 503-520
Sousa, R.O.; Gomes, A.S.; Vahl, L.C. (2004) Toxidez por ferro em arroz irrigado. In:
Gomes, A.S.; Magalhães Jr. (eds.) Arroz Irrigado no Sul do Brasil: Empraba
Informação Tecnológica. p. 305-337
Spiller, S.; Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. II. Iron stress
diminishes photochemical capacity by reducing the number of photosynthetic units.
Plant Physiology 65: 121-125
Suh, H.-J.; Kim, C.S.; Lee, J.-Y.; Jung, J. (2002) Photodynamic Effect of Iron Excess
on Photosystem II Function in Pea Plants. Photochemistry and Photobiology 75(5):
513–518
Takahashi, M. (2003) Overcoming Fe deficiency by a transgenic approach in rice. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 72: 211-220
Taylor, G. J.; Crowder, A. A.; Rodden, R. (1984) Formation and morphology of an iron
plaque on the roots of Typha latifolia L. grown in solution culture. American Journal
of Botany 71(5): 666-675
Taylor, G.J.; Crowder, A.A. (1983) Use of the DCB technique for extraction of hydrous
iron oxides from roots of wetland plants. American Journal of Botany 70: 1254-1257
Taylor, S.E.; Terry, N.; Huston, R.P. (1982) Limiting Factors in Photosynthesis. III.
Effects of iron nutrition on the activities of three regulatory enzymes of photosynthetic
carbon metabolism. Plant Physiology 70: 1541-1543
Terry, N. (1980) Limiting Factors in Photosynthesis. I. Use of iron stress to control
photochemical capacity in vivo. Plant Physiology 65: 114-120
123
Thipyapong, P.; Melkonian, J.; Wolfe, D.W.; Steffens, J.C. (2004): Suppression of
polyphenol oxidases increases stress tolerance in tomato. Plant Science 167: 693-704
Thomine, S.; Lelièvre, F.; Debarbieux, E.; Schroeder, J.I.; Barbier-Brygoo, H. (2003)
AtNRAMP3, a multispecific vacuolar metal transporter involved in plant responses to
iron deficiency. The Plant Journal 34: 685-695
Vansuyt, G.; Lopez, F.; Inzé, D.; Briat, J.F.; Fourcroy, P. (1997). Iron triggers a rapid
induction of ascorbate peroxidase gene expression in Brassica napus. FEBS Letter
410: 1195-1200
Wellburn, A.R. (1994) The spectral determination of chlorophylls a and b, as well as
total carotenoids, using various solvents with spectrometers of different resolution.
Journal of Plant Physiology 144: 307-313
Wissuwa, M.; Garnat, G.; Ismail, A.M. (2005) Is root growth under phosphorus
deficiency affected by source or sink limitations? Journal of Experimental Botany 56
(417): 1943-1950
Xu, H.X.; Weng, X.Y.; Yang, Y. (2007) Effect of Phosphorus Deficiency on the
Photosynthetic Characteristics of Rice Plants. Russian Journal of Plant Physiology
54(6): 741-748
Yamauchi, M.; Peng, X.X. (1995) Iron toxicity and stress induced ethylene production
in rice leaves. Plant and Soil 173: 21-28
Zancani, M.; Peresson, C.; Biroccio, A.; Federici, G.; Urbani, A.; Murgia, I.; Soave, C.;
Micali, F.; Vianello, A.; Macri, F. (2004) Evidence for the presence of ferritin in plant
mitochondria. European Journal of Biochemistry 271: 3657-3664
Zhou, X.-B.; Shi, W.-M. (2007) Effect of root surface iron plaque on se translocation
and uptake by fe-deficient rice. Pedosphere 17(5): 580-587
124
CONCLUSÕES GERAIS
O sulfato ferroso apresentou alta toxidez às plantas de arroz. Esta forma de ferro é
prontamente disponível às plantas, em solos irrigados, como na situação imposta no
presente trabalho. O excesso de ferro nos tecidos promoveu alterações fisiológicas,
anatomorfológicas, bioquímicas e moleculares nas plantas de arroz.
Os cultivares de arroz apresentaram, de forma diferencial, como mecanismo de
defesa, o aumento da dissipação regulada de energia e da expressão do gene da ferritina,
relacionado à homeostase do ferro.
Dentre os parâmetros avaliados, a taxa fotossintética e a taxa de transporte de
elétrons mostraram-se altamente sensíveis ao excesso por ferro. Estes parâmetros, por
serem não invasivos, se tornam ferramentas importantes, de campo, na seleção de
cultivares tolerantes ao metal.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
