( PDF ) Raiva e encefalite viral eqüina no semiárido nordestino, Brasil

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL

CAMPUS DE PATOS-PB

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

VETERINÁRIA

Raiva e encefalite viral eqüina no semiárido Nordestino,

Brasil

MARIA LUANA CRISTINY RODRIGUES SILVA

PATOS-PB

2010

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14

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

Raiva e encefalite viral eqüina no semiárido Nordestino,

Brasil

MARIA LUANA CRISTINY RODRIGUES SILVA

Dr. Albério Antônio de Barros Gomes

Orientador

PATOS-PB

2010

Dissertação apresentada ao Prog

rama de Pós

-

Graduação em

Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina

Grande, para obtenção do título de Mestre em Medicina

Veterinária.

15

FICHA CATALOGADA NA BIBLIOTECA SETORIAL DO

CAMPUS DE PATOS - UFCG

S586e

2010 Silva, Maria Luana Cristiny Rodrigues.

Raiva e encefite viral eqüina leste no semiárido nordestino, Brasil /

Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva - Patos: CSTR/UFCG, 2010.

115p.: il.

Inclui bibliografia.

Orientador: Albério Antônio de Barros Gomes.

Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária). Centro de

Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina

Grande.

1 – Zoonoses virais - Dissertação. 2 – Encefalite. I – Título.

CDU: 614

16

Nome: SILVA, Maria Luana Cristiny Rodrigues

Título: Raiva e encefalite viral eqüina no semiárido Nordestino, Brasil

Data:___/___/____

Banca Examinadora:

Dr. Albério Antônio de Barros Gomes

Instituição: UFCG/CSTR Patos-PB

Assinatura: ____________________________

Julgamento:_________________

Dra. Rita de Cássia Carvalho Maia

Instituição: UFRPE Recife-PE

Assinatura: ____________________________

Julgamento:_________________

Dr. Clebert José Alves

Instituição: UFCG/CSTR Patos-PB

Assinatura: ____________________________

Julgamento:_________________

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

-

Graduação

em Medicina Veterinária da Universidade Federal de

Campina Grande, para obtenção do título de Mestre em

Medicina Veterinária.

17

AGRADECIMENTO

gradeço primeiramente a Deus por sempre está comigo em todas as horas,

abençoando este momento de vitória e satisfação, e pela luz que clareia meu

caminho, pois nem a altura, nem a profundidade, nem alguma criatura poderá me

separar do amor de Deus.

A meus pais João Figueiredo (In memorial) e Salete Rodrigues por sempre

mostrarem o caminho da honestidade, dignidade, seriedade, companheirismo e

amor que nasce na simplicidade e se fortalesse ao nascer do sol diariamente.

A minha irmã Layssa Ryama, meu cunhado Romero Barros e meu sobrinho Lucas

Ryan pela compressão e amor a todo instante.

Aos meus familiares que sempre estiveram presente em minha vida, apoiando.

Ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da UFCG/CSTR pela

oportunidade.

Gostaria de demonstrar um sincero agradecimento aos professores Dr. Albério

Gomes, Dr. Sérgio Santos, Dr. Franklin Riet-Correa, pelos ensinamentos, orientação,

confiança, oportunidade e incentivo sempre demonstrado.

A Doutoranda Carolina Souza ao constante apoio, amizade e força pela realização

do meu trabalho.

Ao Laboratório de Histopatologia pelo apoio na realização deste trabalho.

A Clínica de Grandes animais pelo apoio no atendimento dos casos.

Ao Instituto Pasteur de São Paulo representado pelas Dra. Ivanete Kotait, Dra. Luiza

Carrieri e a todos que colaboraram para a realização deste trabalho.

Aos docentes e funcionários da UAMV/CSTR/UFCG.

Aos amigos do CSTR/UFCG, em especial Silvano, Glauco, Jefferson e Fabrine.

Aos Dr. Fumio Ito, Dr. Paulo Brandão pelo apoio.

Aos parceiros japoneses Dr. Tadeo Sakai e Dr. Takuya Itou, da Nihon University, e

seus orientados.

Aos amigos do VPS/FMVZ/USP.

Ao laboratório de Virologia da UFSM, pela realização do intercâmbio entre

mestrados, incluindo os professores, pós-graduandos e graduandos. Aos amigos da UFSM

em especial Juliana Targino pela acolhida no período de estágio.

A

18

Aos veterinários que atenderam os animais incluídos neste estudo e aos

proprietários por ter cedido estes animais.

As ULSAV, SEDESA, MAPA, ULTRA-PATOS em especial Dr. Tarcísio Maia

pelo apoio.

A Secretária de Saúde da Paraíba em nome de Dr. Francisco Assis.

A ADAGRI, em nome de Dr. Joaquim.

A Dr. Humberto e equipe no Rio Grande do Norte.

A Clínica de Bovinos de Garanhuns-UFPE representada pelo Dr. José Augusto,

médicos veterinários, residentes e a todos que colaboraram para a realização deste trabalho.

Ao CNPq pela bolsa concedida.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho, muito obrigado.

19

Dedicatória

Deus, meu pai (In memorial) minha mãe, minha irmã, meu sobrinho e a

todos que contribuíram para essa oportunidade.

A

20

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.......................................................................................... 08

1.Capítulo 1. Distribuição do vírus rábico em ruminantes

naturalmente infectados............................................................................

12

2. Capítulo 2. Paralytic rabies in swine ………………...………………

24

3. Capítulo 3. Eastern Equine Encephalitis in Northeastern Brazil….. 38

CONCLUSÃO……………………………………………………………

59

Anexos……………………………..……………………………………… 60

Anexo 1: Declaração da Bioética…………………………………………. 61

Anexo 2: Raiva paralítica em suínos. .......................................................... 63

Anexo 3: Encefalite eqüina leste no Nordeste do Brazil............................. 76

Anexo 4. Normas da Pesquisa Veterinária Brasileira...................................

98

Anexo 5. Normas do Brazilian Journal of Microbiology............................. 100

Anexo 6. Normas da Veterinary Research................................................... 108

21

historiador do lado vencedor

facilmente se inclina a interpretar o

sucesso de curto prazo em termos

de uma teologia ex post de longo prazo. Isso

não acontece com os derrotados. Sua

experiência básica é que tudo aconteceu

diferente do esperado ou planejado [...] Eles têm

uma necessidade maior de explicar por que

outra coisa ocorreu e não aquilo que achavam

que aconteceria. Isso pode estimular a busca de

causas de médio e longo prazo que expliquem a

[...] surpresa [...] gerando percepções mais

duradouras e, conseqüentemente, de maior

poder explicativo. No longo prazo, os ganhos

em compreensão histórica têm advindo dos

derrotados.”

(Koselleck, R. O presente como História. 243-255p.

In: Hobsbawm, E. Sobre História. São Paulo:

Companhia das Letras, 1998.)

“O

22

INTRODUÇÃO

O conhecimento da epidemiologia, sinais clínicos, patologia e o diagnóstico das

enfermidades das espécies domésticas no semiárido são importantes para a implantação

de programas de controle e erradicação. Na região a doença infecciosa mais importante,

que afeta o sistema nervoso central é a raiva. O desenvolvimento de técnicas corretas de

diagnóstico desta doença, assim como o conhecimento da sua epidemiologia permitirá

desenvolver campanhas de controle mais eficientes. Nesta dissertação, seguindo a

normativa do Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária da Universidade

Federal de Campina Grande (UFCG), são apresentados dois trabalhos sobre raiva: um

descrevendo os resultados de um estudo comparativo das técnicas (imunofluorescência

direta, inoculação em camundongos e exame histológico) utilizadas pelo Centro de

Saúde e Tecnologia Rural da UFCG no diagnóstico da doença em ruminantes e outro

descrevendo a epidemiologia, sinais clínicos e patologia de um surto de raiva em suínos

transmitida por morcegos hematófagos. O primeiro será enviado para publicação à

Pesquisa Veterinária Brasileira e o segundo à Brazilian Journal of Microbiology.

Por outro lado, o diagnóstico diferencial das encefalites nas diferentes espécies

animais é de extrema importância. Dentre essas doenças são importantes as encefalites

virais dos eqüinos, que incluem as encefalites eqüinas leste, oeste e venezuelana, que

apesar da sua extrema importância, por se tratar de zoonoses, têm sido pouco relatadas

atualmente no nosso país, principalmente no referente a epidemiologia, sinais clínicos

patologia e isolamento e identificação dos vírus. No Brasil, que apresenta características

ecológicas, demográficas, sanitárias, socioeconômicas e políticas que favorecem o

aparecimento de doenças emergentes e reemergentes, até o momento já foram

diagnosticadas as encefalites eqüinas leste e oeste (Kotait et al., 2008). Nesta

dissertação são descritos, pela primeira vez no Brasil, aspectos epidemiológicos, sinais

clínicos e patologia, assim como o isolamento e caracterização molecular do vírus, em

dois surtos de encefalomielite eqüina leste ocorridos nos Estados de Pernambuco,

Paraíba e Ceará entre os anos de 2008 e 2009. Esse trabalho a ser enviado à Veterinary

Research é importante para o conhecimento e a vigilância epidemiológica das

encefalites eqüinas no Brasil, principalmente levando em consideração o risco de

surgimento no país da febre do Nilo Ocidental, já disseminada nos Estados Unidos e

recentemente diagnosticada na Argentina (Morales et al., 2006).

23

REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO

Kotait I., Ito F. H., Carrieri M. L., Souza M. C. A. M., Peres N. F., Ferrari J. J. F.,

Araújo F. A. A. & Gonçalves V. L. N. 2008. Programa de Vigilância de Zoonoses e

Manejo de Eqüídeos do Estado de São Paulo. Módulo II: Principais zoonoses virais de

eqüídeos e vigilância epidemiológica em unidades municipais. Boletim Epidemiológico

Paulista. 5 (54): 18-26.

Morales M. A., Barrandeguy M., Fabbri C., Garcia J. B., Vissani A., Trono K., utierrez

G., Pigretti S., Menchaca H., Garrido N., Taylor N., Fernandez F., Levis S. & Enría D.

2006. West Nile Virus Isolation from Equines in Argentina. Emerging Infectious

Diseases. 12(10): 1559-1561.

24

s problemas significativos com os

quais nos deparamos não podem ser

resolvidos no mesmo nível de

pensamento em que estávamos quando os criamos”.

(ALBERT EINSTEIN, 2004).

“

O

O presente trabalho foi formatado segundo as normas da Pesquisa Veterinária Brasileira

de acordo com o que estabelece a Norma n° 01/2009 de 04 de fevereiro de 2009, do

Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de

Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia Rural – Campus de Patos – PB.

12

Distribuição do vírus rábico no sistema nervoso central em ruminantes

naturalmente infectados

1

Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva*

2

, Glauco José Nogueira de Galiza

2

, Franklin

Riet-Correa

2

, Sérgio Santos de Azevedo

2

, José Augusto Bastos Afonso

,3

e

Albério Antônio de Barros Gomes

2

ABSTRACT.- Silva M. L. C. R, Galiza G. J. N., Riet-Correa F., Azevedo S. S., Afonso

J. A. B. & Gomes A. A. B. 2010. [ Distribution of rabies vírus in the central nervous

system in naturally infected ruminants]. Distribuição do vírus rábico em herbívoros

naturalmente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Centro de Saúde

e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande, Campus de Patos, Patos,

PB 58700-000, Brazil. E-mail: luacristiny@yahoo.com.br

With the aim to study the distribution of lesions and the rabies virus in

spontaneous cases of rabies in ruminants and to determine the efficiency of the direct

immunofluorescent test (DIF), mouse inoculation (MI) and presence of Negri bodies in

the diagnosis of the disease, 48 cases of the disease were examined. Samples of frontal,

temporal, parietal and occipital cerebral cortex, hippocampus, thalamus, rostral and

caudal colliculi, cerebellum, pons, medulla oblongata, basal nuclei and sections of the

cervical, thoracic and lumbar spinal cord were examined. Of the 48 samples examined

all were positive on DIF and MI, and in 30 (62.5%) Negri bodies were observed.

However there were differences in the results of the three tests in the different regions

of the central nervous system. In the samples of the cerebral cortex in 38 cattle, the

frequency of inclusion bodies was low (11%-37%), and also the positivity to DIF and

MI (60%-80%). In contrast, all samples of thalamus, pons and spinal cord were positive

to DIF and MI. In other regions of the brain stem, positivity to these tests varied

between 60% and 96.7%. On histologic examination, the major frequency of Negri

bodies (88.2%) was observed in the cerebellum. In eight sheep the DIF and MI tests

were positive in all sections of the CNS examined and Negri bodies were found in three

1

Recebido em ............

Aceito para publicação em ...................

Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor.

2

Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande. Campus de Patos. Avenida

Santa Cecília, CX. P 64. CEP 58700-00, Patos, PB. *Autora para correspondência luacristiny@yahoo.com.br

3

Clinica de Bovinos- Campus Garanhuns da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av: Bom Pastor,

s/n. Caixa postal 152. Bairro Mundaú. Cep: 55.292-901.

13

animals. Only two goats were examined; both were positive in DIF and MI tests and in

one Negri bodies were found. These results suggest that the recommendations of the

Brazilian Technical Manual for Rabies of Herbivores is adequate for rabies diagnosis,

because their recommendations include the histologic study and the examination of

cerebellum, and sections of the brainstem with high positivity to DIF and MI tests.

However, a better recommendation is to send for DIF and MI half of the brain cut

longitudinally and samples of the spinal cord, which will permit to examine one or two

sections, and if those are negative to return to the material and examine the rest of the

sections. In contrast, to collect samples of the brain or half brain can be inappropriate

for the diagnosis of other diseases of the CNS, for which the study of the whole fixed

brain is necessary to recognize the symmetry or distribution of lesions. In these

situations by the results obtained here, it can be recommended to send different sections

of the spinal cord for DIF and MI tests and to fix the whole brain for gross and

histologic examinations.

INDEX TERMS: rabies, immunofluorescent test, mouse inoculation, Negri bodies,

laboratory diagnosis.

RESUMO.- Com o objetivo de identificar a distribuição das lesões e do vírus rábico no

sistema nervoso central de casos espontâneos de raiva em ruminantes e comparar as

técnicas de imunofluorescência direta (IFD), inoculação em camundongos (ICC) e

presença de corpúsculos de Negri para o diagnóstico da doença foram analisados

materiais proveniente de 48 casos de raiva, incluindo amostras de córtex frontal,

temporal, parietal e occipital, hipocampo, tálamo, colículo rostral e caudal, cerebelo,

ponte, medula oblonga, núcleo da base e porções da medula cervical, torácica e lombar.

De 48 amostras analisadas, todas foram positivas na IFD e na ICC e em 30 (62,5%)

foram encontrados corpúsculo de Negri (CN). No entanto, houve diferenças importantes

no resultados dos três testes nas diferentes regiões do SNC avaliadas. Nos cortes de

córtex cerebral, em 38 bovinos, a presença de corpúsculos de inclusão foi baixa (11% -

37%) assim como a positividade para IFD e ICC (60%-80%). Pelo contrário, todas as

amostras de ponte, tálamo e medula testados foram positivas para IFD e ICC. Em outras

regiões do tronco encefálico e também no cerebelo a positividade para ICC e IFD foi de

60% a 96,7%. No cerebelo foi encontrada a maior freqüência (88,2%) de corpúsculos de

inclusão. Em oito ovinos as provas de ICC e IFD foram positivas em todos os cortes

14

e foram observados corpúsculos de inclusão em três animais. Foram analisados somente

dois casos de caprinos encontrando-se corpúsculos de inclusão em um e ambos foram

positivos para IFD e ICC. Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que a conduta

recomendada pelo Manual Técnico de Controle da Raiva dos Herbívoros (MTCRH)

permite o diagnóstico de raiva associando o estudo histológico aos testes de IFD e ICC

que incluem cerebelo, tálamo e tronco encefálico que apresentam alta positividade para

as provas de IFD e ICC. No entanto, a melhor conduta é a de incluir metade do encéfalo

cortado longitudinalmente e amostras de medula. Isto permite examinar por IFD e ICC

uma ou mais regiões onde essas provas apresentam maior positividade e,

posteriormente, se essas provas fossem negativas, retornar ao material original e

examinar outras regiões. Por outro lado, a coleta de amostras dos locais recomendados

pela MTCRH, assim com a coleta de metade do encéfalo, podem prejudicar o

diagnóstico de outras doenças para o qual é necessário o estudo de todo o encéfalo após

a fixação em formaldeído, para constatar a simetria e a distribuição das lesões. Nestes

casos, com base nos resultados obtidos neste trabalho, pode ser recomendado para

diagnóstico laboratorial de raiva o envio exclusivo de porções da medula cervical,

dorsal e lombar, já que as três porções apresentaram 100% de positividade nas provas

de IFD e ICC. Além disso, o estudo histológico de todas as porções do cérebro incluídas

neste trabalho permitirá complementar o diagnóstico.

TERMOS DE INDEXAÇÃO: raiva, imunofluorescência, inoculação em

camundongos, corpúsculos de Negri, diagnóstico laboratorial.

INTRODUÇÃO

No Brasil a raiva é descrita desde 1911 (Carini 1911) e a partir de 1966 implantou-se o

Plano de Combate à Raiva dos Herbívoros, atualmente denominado Programa Nacional

de Controle da Raiva dos Herbívoros e outras Encefalopatias (PNCRH), que tem como

objetivo diminuir a prevalência da doença nos herbívoros domésticos (Brasil 2009).

Mesmo com a implantação do Programa a raiva ainda ocorre de maneira

endêmica na região do semiárido Brasileiro em diferentes espécies de animais

domésticos (Gomes 2004, Lima e al. 2005). Ocorrendo também em outros estados do

país (Lemos 2005, Rech 2007). São freqüentes os relatos de amostras de eqüinos e

bovinos negativas à imunofluorescência direta (IFD) e positivas na inoculação

intracerebral em camundongos (ICC) (Carrieri et al. 2006, Carvalho 2001). Vários são

15

os relatos de raiva animal no Brasil, no entanto são poucos os que descrevem a porção do

sistema nervoso central (SNC) que proporciona melhor o diagnóstico. Peixoto et al.

(2000) encontraram pouca concordância dos resultados entre as provas de IFD, ICC e

exame histopatológico. Rech et al. (2006a) e Lima et al. (2005) descreveram os locais

das lesões no SNC no exame histopatológico e Bingham & Van Der Merwe (2002)

indicaram a presença de corpúsculos fluorescentes em vários segmentos do SNC de

várias espécies. Diante do exposto, este trabalho objetivou identificar a distribuição das

lesões no SNC em casos de infecção natural da raiva em ruminantes e comparar as

técnicas IFD, ICC e exame histopatológico no diagnóstico laboratorial da doença. Com

essa informação será possível determinar as amostras a serem enviadas ao laboratório

para exame histológico, IFD e ICC, evitando os resultados falsos negativos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas 48 amostras de ruminantes com diagnóstico positivo para raiva em

pelo menos um dos testes padrão, procedentes da região do semiárido nordestino,

necropsiados pelo setor de Patologia Animal do Hospital Veterinário, do Centro de

Saúde e Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande (CSTR/UFCG),

no período de janeiro de 2004 a julho de 2009, e pela Clínica de Bovinos de Garanhuns

da Universidade Federal Rural de Pernambuco, no período de abril de 2008 a julho de

2009. Sendo 26 bovinos, dois caprinos e oito ovinos da Paraíba e 12 bovinos do

Pernambuco.

Essas amostras foram analisadas mediante as técnicas de IFD, ICC e exame

histopatológico, padronizando os cortes para serem analisados em córtex frontal,

temporal, parietal e occipital, hipocampo, tálamo, colículo rostral e caudal, cerebelo,

ponte, medula oblonga, núcleos da base e porções da medula cervical, torácica e lombar

dos animais.

Na prova da IFD, com os cortes já descritos anteriormente, as lâminas com

inclusões intracitoplasmáticas fluorescentes e/ou poeira antigênica foram registradas

como sendo positivas, de conformidade com o método descrito por Goldwasser &

Kissling (1958), com modificação descrita por Dean et al. (1996).

A ICC foi realizada com 0,03mL de inóculo da suspensão a 10% (p/v) em

camundongos albinos, com idade de 21 dias, criados no Biotério do CSTR/UFCG. Para

cada segmento da amostras foram utilizados grupos constituídos de seis indivíduos.

Após a infecção foram mantidos no infectório do Laboratório de Virologia do

16

CSTR/UFCG. Os animais inoculados foram observados por um período de 30 dias com

observações diárias, e leitura a cada 24 horas. Mortes ocorridas antes do quinto dia pós-

inoculação não foram consideradas como sendo de raiva, conforme a metodologia

descrita por Koprowski (1996). Para a confirmação da presença do vírus rábico nos

camundongos que morreram no período de observação, os cérebros foram submetidos à

técnica de IFD. Os camundongos que não adoeceram no período de observação foram

eutanasiados com éter etílico e incinerados, conforme regras estabelecidas pela

Comissão de Bioética do CSTR/UFCG (Protocolo de Aprovação na Bioética

129/2009).

No exame histopatológico o encéfalo e a medula foram fixados em formol

tamponado a 10% e cortados transversalmente em fatias de 3 a 5 mm de espessura.

Amostras das regiões mencionadas anteriormente foram embebidas em parafina,

cortadas em secções de 4-5 µm e coradas com hematoxilina–eosina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De 48 amostras analisadas, todas foram positivas na IFD e ICC e em 30 foram

encontrados corpúsculos de Negri (CN) no exame histopatológico. No entanto, não

houve diferenças importantes nos resultados dos três testes nas diferentes regiões do

SNC avaliadas (Quadro 1). Em bovinos somente 11% a 37% dos cortes das diferentes

regiões do córtex resultaram positivas para corpúsculos de inclusão, sendo também

baixa a freqüência de encefalite ou meningite. Também nas técnicas de IFD e ICC a

positividade foi baixa no córtex, variando de 60% a 80%. Nos cortes de tronco

encefálico e medula houve também uma baixa freqüência de CN, sendo maior o número

de testes positivos tanto para IFD e ICC nas diferentes regiões do tronco encefálico.

Com isso observa-se que todas as amostras de ponte, tálamo e medula testados foram

positivas para IFD e ICC. Quando são analisados os resultados dos três testes nos cortes

de cerebelo observa-se que nesse órgão foi encontrada a maior freqüência de CN,

mesmo em casos sem outras lesões histológicas, e que as provas de IFD e ICC foram

positivas em todos os casos analisados. Isto sugere que o tálamo, a ponte, o cerebelo e a

medula são de eleição para realização de IFD e ICC e que o cerebelo é o local mais

indicado para a procura de CN.

Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que a conduta recomendada pelo

Manual Técnico de Controle da Raiva dos Herbívoros (MTCRH) (Brasil 2005) permite

o diagnóstico de raiva associando o estudo histológico aos testes de IFD e ICC, já que

incluem o cerebelo, tálamo e o tronco encefálico, que apresentam alta positividade para

17

as provas de IFD e ICC. Outra possibilidade de envio ao laboratório de virologia seria

metade do encéfalo cortado longitudinalmente e amostras de medula. Isto permitiria

examinar por IFD e ICC uma ou mais regiões onde essas provas apresentam maior

positividade e, posteriormente, se essas provas fossem negativas, retornar ao material

original e examinar outras regiões. Por outro lado, a coleta de amostras dos locais

recomendados pela MTCRH, assim com a coleta de metade do encéfalo pode prejudicar

o diagnóstico de outras doenças, para o qual é necessário o estudo de todo o encéfalo

após a fixação em formaldeído, para constatar a simetria e a distribuição das lesões.

Nestes casos, com base nos resultados obtidos neste trabalho, pode ser recomendado

para diagnóstico laboratorial de raiva o envio exclusivo de porções da medula cervical,

dorsal e lombar, já que as três porções apresentaram 100% de positividade nas provas

de IFD e ICC. Além disso, o estudo histológico de todas as porções do sistema nervoso

central permitirá complementar o diagnóstico através da observação de corpúsculos de

inclusão, que neste trabalho foram observados em 68% (26/38) dos casos em bovinos.

Essa freqüência de observação foi menor do que encontrada por Lima et al. (2005), em

87 % dos casos (20/23), e por Rech (2007) em 83,3 % (20/24), é a mesma freqüência

encontrada por Langohr et al. (2003), em 68% (17/25) dos casos, e maior do que a

encontrada por Lemos (2005), em 48 % (13/27) dos casos nas células de Purkinje.

Macruz et al. (1977) não encontraram corpúsculo de inclusão no hipocampo, cerebelo,

bulbo e medula de 20 bovinos infectados experimentalmente e os mesmos materiais

foram diagnosticados como raiva pela IFD e ICC.

Os relatos de raiva em pequenos ruminantes são menos freqüentes. Nos casos

examinados nesse trabalho, todos os fragmentos avaliados em materiais de ovinos

foram positivos na IFD e na ICC, sem exceção, ressaltando que a maioria apresentou

poeira antigênica na IFD. No entanto, corpúsculos de inclusão foram observados

somente em 37,5% (3/8) dos ovinos (Quadro 1). Guedes et al. (2007) observaram a

presença de CN em um caprino e um ovino examinados (100%), Lima et al (2007) em

dois caprinos (100 %) e em três de quatro ovinos (75%) e Rissi et al. (2008)

encontraram CN nos dois ovinos examinados (100%). Em relação aos caprinos, as

amostras dos dois animais examinados apresentaram corpúsculos de inclusão e as

únicas regiões examinadas pela IFD e ICC foram positivas. Enquanto não seja avaliado

um número maior de materiais provenientes de caprinos e ovinos com raiva, as

amostras a serem enviadas para o diagnóstico da doença nestas espécies podem ser

semelhantes às recomendadas para bovinos.

18

No presente estudo 10 amostras, seis de bovinos e quatro de ovinos,

encontravam-se em estado de decomposição, na IFD alguns cortes resultaram positivos,

enquanto que outros cortes apresentaram fluorescência não especifica, como relatado

por Trimarchi & Debbie (1991). Essas amostras apresentaram um período de incubação

maior nos camundongos, variando de 15 a 17 dias, enquanto que nas amostras não

autolizadas o período de incubação foi de 7-13 dias. No entanto, o período clínico, tanto

nas amostras autolizadas quando nas não autolizadas, foi semelhante, de 3 a 5 dias.

Carvalho (2001) encontraram sensibilidade da IFD de 73 % em materiais em

decomposição, valor menor da sensibilidade encontrada por Keane & Little (1987).em

materiais em bom estado, que foi de 99,8 % . Nesse trabalho a sensibilidade de 100%

para as duas provas deve-se provavelmente ao grande número de amostras examinadas

por cada animal.

Pela rapidez com que são obtidos os resultados, a realização correta da prova de

IFD em materiais enviados corretamente é muito importante para o diagnóstico de raiva.

Os diagnósticos falsos positivos na IFD podem ser decorrentes da qualidade na

confecção da lâmina, conjugado e experiência do leitor das lâminas, em alguns casos

que apresentam baixos títulos virais podendo apresentar apenas poeira antigênica

discreta que pode passar despercebida.

Os resultados deste trabalho mostram que as falhas de diagnóstico de raiva

utilizando corretamente os exames histopatológico, IFD, ICC em materiais corretamente

enviados, se ocorre, é um evento raro. Além disso, mesmo não tendo sido observados

CN e sendo negativas as provas de IFD e ICC podemos utilizar a prova de imuno-

histoquímica nos blocos utilizados para exame histológico. Ressalta também a

importância de realizar uma necropsia adequada, retirando todo o encéfalo, pelo menos

partes representativas da medula e o núcleo do trigêmeo para exame histológico, como

recomendado por Rech et al. (2006b), Rissi et al. (2008) e Pedroso et al. (2008).

REFERÊNCIAS

Bingham J. & Van Der Merwe M. 2002.Distribution of rabies antigen in infected brain

material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies

fluorescent antibody test. J. Virol. Meth. 101:85–94.

Brasil 2009. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Manual de

Legislação: programas na cionais de saúde animal do Brasil / Ministério da

19

Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretária de Defesa Agropecuária. Departamento

de Saúde Animal-Brasília: MAPA/DAS/DAS, 440p.

Brasil 2005. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Controle da Raiva

dos herbívoros/ Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretária de

Defesa Agropecuária. Departamento de Saúde Animal-Brasília: MAPA/DAS/DAS,

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21

Quadro 1: Resultados dos testes de imunofluorescência direta (IFD), inoculação intracerebral em

camundongos (ICC) e estudo histopatológico, em 38 amostras de bovinos e oito de ovinos, com

diagnóstico positivo para raiva, em diferentes regiões do sistema nervoso central, provenientes da

região semiárida do nordeste brasileiro, nos anos de 2004 a 2009.

Exame histopatológico IFD ICC

Corpúsculo de

inclusão

Manguito

perivascular

Gliose Meningite

Fragmento

N° de

positivos

N° de

positivos

N° de

positivos

N° de

positivos

Total

N° de

positivos

/Total

N° de

positivos

/Total

Bovinos

CF 9 (37,5%) 12 (50 %) 2 (8,33%) 6 (25,0%) 24 21 (30) 25 (32)

CP 3 (15,78%) 2 (10,52 %) 00 2 (10,52 %) 19 7 (11) 8 (12)

CT 4 (20,0 %) 4 (20,0 %) 1 (5,0 %) 1 (5,0 %) 20 7 (10) 8 (10)

CO 2 (11,76 %) 2 (11,76 %) 00 1 (5,88%) 17 6 (10) 7 (10)

NB 5 (27,77 %) 11 (61,11%) 2 (11,11%) 00 18 9 (10) 9 (10)

HP 1 (5,55%) 1 (5,55%) 00 00 18 6 (10) 7 (10)

TA 10 (41,66%) 21 (87,5%) 2 (8,33%) 1 (4,16%) 24 30 (31) 34 (34)

CR 5 (31,25%) 9 (56,25%) 2 (12,5%) 1 (6,25%) 16 9 (10) 9 (10)

CC 5 (35,71%) 5 (35,71%) 1 (7,14%) 1 (7,14%) 14 9 (10) 9 (10)

PT 8 (26,66%) 14 (46,66%) 2 (6,66%) 00 30 32 (32) 36 (36)

MO 4 (25,0%) 11 (68,75%) 3 (18,75%) 00 16 9 (10) 9 (10)

CE 30 (88,21%) 20 (58,82%) 2 (5,88%) 13 38,23%) 34 32 (32) 35 (35)

MC 10 (58,82%) 10 (58,82%) 3 (17,64%) 1 (5,88%) 17 4 (4) 6 (6)

MT 7 (41,17%) 7 (41,17%) 3 (17,64%) 00 17 4 (4) 6 (6)

ML 7 (41,17%) 10 (58,82%) 3 (17,64%) 1 (5,88%) 17 4 (4) 6 (6)

Ovinos

CF 2 (28,57%) 4 (57,14%) 0 4 (57,14%) 7 5 (5) 5 (5)

CP 0 0 0 3 (60,0%) 5 4 (4) 4 (4)

CT 0 0 0 2 (33,33%) 6 4 (4) 4 (4)

CO 0 0 0 3 (42,85%) 7 4 (4) 4 (4)

NB 1 (14,28%) 1 (14,28%) 1 (14,28%) 2 (28,57%) 7 4 (4) 4 (4)

HP 0 2 (33,33%) 0 0 6 4 (4) 4 (4)

TA 0 2 (28,57%) 0 1 (14,28%) 7 7 (7) 7 (7)

CR 1 (16,66%) 2 (33,33%) 0 1(16,66%) 6 4 (4) 4 (4)

CC 0 2 (33,33%) 1(16,66%) 1(16,66%) 6 4 (4) 4 (4)

PT 0 2 (40,0%) 1 (20,0%) 0 5 6 (6) 6 (6)

MO 0 3 (60,0%) 1 (20,0%) 0 5 4 (4) 4 (4)

CE 2 (25,0%) 2 (25,0%) 0 4(50,0%) 8 8 (8) 8 (8)

MC 1 (14,28%) 3 (42,85%) 0 1 (14,28%) 7 2 (2) 2 (2)

MT 0 3 (50,0%) 0 1 (16,66%) 6 2 (2) 2 (2)

ML 0 1 (16,66%) 0 0 6 2 (2) 2 (2)

a

CF

=

córtex frontal, CP

=

córtex parietal, CT

=

córtex temporal, CO

=

córtex occipital, NB

=

núcleos

da base, TL= tálamo, HP = hipocampo, TA = tálamo, CR = colículo rostral, CC = colículo caudal,

PT=ponte, MO

= medula oblongata, CE = cerebelo, MC = medula cervical, MT = medula torácica, ML= medula

lombar.

b

P/T = número de positivos / número total

c

IFD =

Imunofluorescência Direta.

d

ICC = Inoculação Intracerebral em camundongos.

e

EH = Exame histopatológico.

f

CN = Corpúsculos de Negri.

g

MG = Manguito.

h

GL = gliose.

22

ábio é quem tem coragem de

identificar suas loucuras e procurá-las.

Não esconde sua irracionalidade, trata-a.

Muitos impulsivos ferem durante a vida toda seus

íntimos porque nunca assumiram sua ansiedade.

Somos ótimos para nos esconder.” (ALBERT

EINSTEIN, 2004).

“S

23

O presente trabalho foi formatado segundo as normas da Brazilian Journal of

Microbiology de acordo com o que estabelece a Norma n° 01/2009 de 04 de fevereiro

de 2009, do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade

Federal de Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia Rural – Campus de Patos –

PB.

24

PARALYTIC RABIES IN SWINE

Clarice Ricardo de Macedo Pessoa

1

, Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva

1

, Albério

Antônio de Barros Gomes

1

, Andrea Isabel Estévez Garcia

2

, Fumio Honma Ito

2

, Paulo

Eduardo Brandão

2

, Franklin Riet-Correa

4

*

1 Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e Tecnologia Rural,

Universidade Federal de Campina Grande, Av. Universitária, Bairro Santa Cecília,

CEP 58700-970, Caixa Postal 64, Patos, Paraíba, Brazil

2 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil

ABSTRACT

Rabies virus was diagnosed in two pigs in the semiarid region of Paraíba State, Brazil. Main

clinical signs were paresis and paralysis of the pelvic limbs. The histological lesions were

diffuse non-suppurative encephalomyelitis with severe lesions in the spinal cord, mild to

severe lesions in the brain stem, and mild or absent lesions in the forebrain. The virus was

identified by RT-PCR as a Desmodus rotundus strain. Despite the various diagnosis of

rabies in pigs this is the first report of clinical signs and pathology of pig rabies transmitted

by vampire bats.

Keyword: vampire bats, epidemiology, virus isolation, zoonotic.

INTRODUCTION

Rabies virus (RV) presents special tropism to the central nervous system (CNS)

causing acute encephalomyelitis, and provoking a very lethal neurological disease in

mammals. RV belongs to the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, and it is a

important public health problem in Brazil, because the epidemiological situation is complex

and there is an overlap between the two major prevailing cycles: dogs and vampire bats(9).

4

Corresponding author: franklin.riet@pq.cnpq.br

25

This country has reduced human rabies through the control of the disease in dogs and,

actually, human cases of rabies transmitted by bats are more common than those

transmitted by dogs (15). The virus is also frequently isolated from wild animals, mainly

from wild canines (3), but the importance of these animals as a source for rabies in

domestic animals is unknown.

Rabies is rare in swine and there are few reports on the epidemiologic, clinical and

pathologic characteristics of the disease in this species. In an outbreak of swine rabies

transmitted by a dog in China the main clinical signs were aggressiveness and other

cerebral signs(10). In USA, in 10 cases of rabies transmitted by wild animals, mainly

raccoons, mongoose and skunks, clinical signs were fever, aggression, restlessness,

ptyalism, anorexia, head rubbing, progressive paralysis, depression, and vocalization (6)

In Brazil there are several reports of identification of rabies virus from swine from

the states of Pará(2), Tocantins(18), Goias (9), Mato Grosso (16) and Rio Grande do Sul

(21) but there are no reports on the epidemiology, clinical signs and pathology of the

disease in this species. Some of those viruses were originated from dogs (9) and others

from vampire bats (2). The objective of this paper is to report, for the first time, the

epidemiology, clinical and pathology of an outbreak of rabies transmitted by vampire bats

in swine.

MATERIAL AND METHODS

In June 2009, the Pathology Section of the Veterinary Animal Hospital belonging to

the Federal University of Campina Grande, state of Paraíba, received two pigs presenting

neurological signs. The two animals were raised in a piggery with other 28 pigs of different

ages, in the municipality of Mãe D’Água, in the semiarid of Paraíba. Both animals were

submitted to euthanasia and necropsied. Samples of tissues from the thoracic and

abdominal cavities, the whole brain and spinal cord of a pig, and half brain and spinal cord

of another pig were fixed in 10% buffered formalin. The tissues samples and samples of

transverse sections of the CNS including the spinal cord (cervical, thoracic and lumbar),

cerebellum, cortex, cerebellar peduncles, medulla oblongata, pons, rostral and caudal

colliculi, hippocampus, thalamus, basal nuclei and internal capsule were embedded in

26

paraffin, sectioned in 4-5 µm slices and stained with hematoxylin- eosin for histological

examination. The trigeminal ganglia from Pig 2 was also studied histologically.

From Pig 2, fragments of the brain and spinal cord from similar regions than those

examined histologically were examined for rabies through the direct fluorescent antibody

test (FAT) and mouse inoculation test (MIT). For the MIT, the suspensions were prepared

from the brain and spinal cord materials, each samples being individually macerated and

diluted to make a 20% suspension (weight/volume) with a solution of sterilized distilled

water containing 2% (v/v) rabbit sera, penicillin (500 UI/mL) and streptomycin (1,560

UI/mL). After centrifuging at 2,000 G for 10 minutes, a volume of 0.03 mL was inoculated

intracerebrally in groups of ten mice, according to Koprowski(11). Mice were daily

observed for 30 days for rabies signs, and the confirmation of rabies was by the FAT. Mice

used for diagnostic and virus isolation procedures were 21 day-old Swiss albino, lineage

CH3 Rockefeller, weighing 11-15 g, and maintained at the Federal University of Campina

Grande facilities. The FAT was performed according to the technique of Goldwasser &

Kissling(7) modified by Dean et al.(5). The historical and clinical data were obtained by

interviewing the owner, and the epidemiological information was completed after the

inspection of the piggery.

The rabies virus isolated from swine identified as PN169PB was submitted to RNA

extraction from a 10% viral suspension, using Trizol® (Invitrogen®), according to the

manufacturer’s instructions. RT-PCR was carried out as described by Macedo et. al.(13),

using sense primer 504 (5’-TATACTCGAATCATGATGAATGGAGGTCGACT-3’) and

antisense primer 304 (5’-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3’) targeted to the nucleoprotein

gene and M-MLV Reverse Transcriptase™ and Platinum™ Taq DNA Polymerase

(Invitrogen) according to manufacturer’s instructions.

The amplicon was sequenced with both primers using BigDye 3.1™ (Applied

Biosystems) according to manufacturer’s instructions and the sequences were obtained in

an ABI-377™ automatic sequencer (Applied Biosystems).

For the construction of a dendrogram, DNA sequences retrieved from Genbank

were employed and aligned by CLUSTAL/W method, using the Bioedit 7.0.9.0 program.

and a nucleotide distance tree was generated with the Neighbor-Joining algorithm and MCL

model using the MEGA software with 1000 bootstrap repetitions(20).

27

RESULTS

The first animal to show clinical signs (Pig 1) was a 45 days-old male pig, showing

flacid paralysis of the pelvic limbs during two days, which was presumptively diagnosed as

trauma. At necropsy, gross lesions were not observed. Upon histological examination, non-

suppurative encephalomyelitis with perivascular cuffs composed by lymphocytes, plasma

cells and rare macrophages, diffuse or multifocal gliosis, neuronophagia, hemorrhages and

vasculitis were observed notably in gray matter (Fig. 1). These lesions were mild in all

regions of brainstem, severe in spinal cord and absent in the telencephalon. Since the

lesions were similar to those of rabies, a visit to the farm was made to get additional

epidemiological data. During the visit, another animal (Pig 2) was found with nervous signs

and conducted to the Veterinary Hospital. It was a 30 month-old pregnant sow, and the

signs started 8 days before the visiting day. It showed anorexia and paresis followed by

paralysis of the pelvic limbs and tail (Fig. 2). During examination was in lateral

recumbence, adopting a sitting dog position when forced to stand. The cutaneous sensitivity

and cutaneous trunci reflex were severely decreased. At necropsy, no significant lesions

were observed. The histological lesions were non-suppurative encephalomyelitis,

meningitis, and trigeminal ganglioneuritis, with the same cell characteristics observed in

Pig 1 (Fig.1). Those lesions were mild in telencephalon and cerebellum and severe in

brainstem and spinal cord. The leptomeninges were diffusely infiltrated by mononuclear

cells with presence of perivascular cuffings.

All the fragments examined were negative by the FAT and the samples of the

thalamus, pons, medulla oblongata and cervical, thoracic and lumbar medulla were positive

by MIT. The swine virus isolated showed maximum identity with bovine rabies virus

transmitted by D. rotundus bats of the São Paulo State (Fig. 3).

The place where the pigs were raised (Fig. 4A) was located in the neighboring of

the town (Fig. 4B) and the pigs were feed mainly with home residues. The town is

surrounded by mountains with caves, rocks and covered by the native forest (caatinga)

typical of the semiarid region (Fig. 4 B-D). No vaccination or deworming had been done

before the rabies outbreak. The owner remembered that approximately 6 months ago he

noted the presence of a bat inside the pen and the signal of blood feeding in one animal.

28

After the confirmation of rabies diagnosis, he was advised to vaccinate the remaining

animals. Eight days after vaccination with a commercial rabies vaccine (raivacel® -Vallée)

an adult sow showed clinical signs similar to those observed in the previous cases, but

recovered in 10-12 days. No more cases were observed later.

DISCUSSION

In Brazil, rabies is frequently diagnosed in cattle and horses (12). Sheep and goats

are less common affected (12) and the disease is rare in swine. In absence of cattle and

horses, which are favorite source for vampire bats, other species, including swine are

alternative source of food for D. rotundus (1, 21). Despite the reports on the isolation of

rabies virus in swine there are only rare reports on the clinical signs of the disease in this

species. In an outbreak of rabies transmitted initially by a dog, the main clinical signs were

aggressiveness, hyperexcitation, and roaring, with a furious rabies pig jumping the pen wall

to bite other pigs, which were later affected with a furious form of the disease (10). In

contrast, in the outbreak reported in this paper clinical signs were exclusively of the

paralytic form, similar to that observed in most cases of bovine rabies (12). Those clinical

signs are due to the distribution of the lesions in the affected animals which showed severe

lesions on the spinal cord in both animals, mild (Pig 1) or severe (Pig 2) lesions of the brain

stem, and absence (Pig 1) or mild lesions (Pig 2) in the telencephalon. To the best of our

knowledge this is the first report on clinical signs and pathology of rabies transmitted by

vampire bats in pigs.

The sensibility of FAT for the diagnosis of pig rabies is questioned. Yates et al. (22)

found four pigs negative for FAT but positive for MIT. Prins and Yates (17) analyzed 11

pigs, only one was FAT-negative, but all of them were MIT-positives. Also the absence of

Negri bodies in the cases reported in this paper and in other reports (14), indicates the

difficulties in the diagnosis of rabies in swine, and the importance of the differential

diagnosis with other swine viral encephalitis with lesions similar to those of rabies (19) .

The rapid diagnosis of rabies transmitted by bats in swine is also very important because, in

some occasions, human cases of rabies transmitted by vampire bats were preceded by swine

cases (15).

29

The genetic typing of the virus suggested that the transmitter was a D. rotundus bat.

The existence of caves in the region favors the presence of vampire bats and, consequently,

the transmission of the virus to other animal hosts, including wild animals, which

perpetuates the presence of virus in the Brazilian semiarid region (8). Due to the

seriousness of the disease, it is important to reinforce the vaccination of all farm animals,

including pigs, to prevent the disease in animals and man. The Pasteur Institute of São

Paulo registered from 1980 to 1995, one case of human rabies transmitted by a pig, which

is considered an animal offering a median risk (4). As a consequence in any pig with

neurological signs rabies is an alternative diagnostic, and there is the possibility of human

transmission.

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Canada. Can. Vet. J. 24, 162-163.

32

Fig. 1. Pig 1. Fig. 1. Rabies in pigs. A) Rostral colliculi, Pig 1. B) Medulla oblongata,

Pig 1. C) Thoracic spinal cord, Pig 1. D) Medulla oblongata, Pig 2. Focal gliosis (A

and B) (arrows), perivascular cuffing (A-arrow head- and D), and neuronophagia (C)

(arrow) are observed. HE, x10 (A and B), and x40 (C and D).

33

Fig. 2. The sow (Pig 2) affected by rabies shows paralysis of the hind limbs.

34

AB297652 Insectivorous bat

AB297653 Insectivorous bat

AB297654 Insectivorous bat

116

Lassiurus ega

AF394883

L.cinereus

USA

AF394885 L. borealis EUA

AF394886

L.bor

ealis

USA

AY739722

L.blossevilli

Br

AB297651 Insectivorous bat

CVS32

AB362483

Dusc

yon ve

tulus

AB083799 Bovine

AB083793 Feline

AB083792 Dog

AB083796 Dog

AB083797Dog

AB297650BRBAT3

AB297655BRBAT26

AB201806BRNL1

AB201808BRNL3

AB201815BRMM1

AB201816BRMM2

AB201811BREF1

AB201813BREF3

AB201807BRNL2

AB201812BREF2

AY170293LegaUSA

AF070450TbrCh

AF070450Tbra

AF394876TbrUSA

AB083803BRbv30

SWINEPN169PB

AB117970BRAL2

AB083809BRbv36

AB201803BRDR1

AB201804BRDR2

AB201805BRDR3

AB201802BRAL4

AB117969BRAL1

AB201811BRMR1

AB083805BRbv32

AY573965ABL

Mokola

EF547459LBV

EF614259Aravan

EF614261Khujand

AY863407EBL2

EF614260IRKUT

96

55

26

31

49

66

44

60

41

96

95

96

52

87

52

93

99

68

47

99

24

23

9

6

81

29

6

14

52

43

66

52

28

37

30

22

28

0.05

Fig. 3 Phylogenetic tree for partial RABV nucleoprotein gene showing strain

SWINEPNI69PB

(in bold) and homologous

sequences retrieved from the Genbank. The numbers at each branch are 1000 bootstrap replicates. The bar

represents the number of substitutions per site. The SWINEPNI69PB sample was situated in

the clade from bovine

origin, close to haematophagous bat group.

35

Fig. 4. The aspect of the piggery (A and C) and the town (B) surrounded by mountains

with caves, rocks and covered by the native forest (B, C and D).

36

em sonhos as perdas se tornam

insuportáveis, as pedras do caminho se

tornam montanhas, os fracassos se

transformam em golpes fatais. Mas se tiver grandes

sonhos... seus erros produzirão crescimento, seus desafios

produzirão oportunidades, seus medos produzirão

coragem”. (AUGUSTO CURY, 2004).

“

S

37

O presente trabalho foi formatado segundo as normas da Veterinary Research de acordo

com o que estabelece a Norma n° 01/2009 de 04 de fevereiro de 2009, do Programa de

Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Campina Grande,

Centro de Saúde e Tecnologia Rural – Campus de Patos – PB.

38

Eastern Equine Encephalitis in Northeastern Brazil

Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva

5

, Glauco José N. Galiza

1

, Antônio Flávio

M. Dantas

1

, Rafael de Novaes Oliveira

2

, Keila Iamamoto

2

, Samira Maria Achkar

2

,

Franklin Riet-Correa

1*

1

Center for Health and Technology Rural (CSTR) Federal University of Campina Grande

(UFCG),Campus de Patos, 58700-000 Patos, Paraíba, Brazil.

2

Instituto Pasteur, São Paulo, Brazil.

Abstract - Outbreaks of eastern equine encephalitis observed from May 2008 to

August 2009 in the Brazilian states of Pernambuco, Ceará, and Paraíba are

reported. The disease occurred in 93 farms affecting 229 equidae with a case

fatality rate of 80.27%. Main clinical signs were circling, depression or

hyperexcitability, ataxia, and progressive paralysis with a clinical manifestation

period of 3-15 days. Main histologic lesions were a diffuse lymphocytic

encephalomyelitis with neuronal death, satellitosis, neuronophagia, and

hemorrhages being more severe in the cerebral grey matter of the telencephalon,

diencephalon and mesencephalon. Some animals had also areas of malacia in the

telencephalon, thalamus and basal nuclei. From one case, the virus was isolated

by mice inoculation and in other 13 cases was identified as eastern equine

encephalitis virus by semi-nested RT-PCR. After DNA sequencing, all samples

were identified as eastern equine encephalitis through the blastn analysis, but

samples from the Ceará and Paraíba states corresponded to the same cluster, and

the sample from Pernambuco to a different cluster.

Equine encephalomyelitis/ semi-nested RT-PCR/ laboratory diagnosis/

Brazilian semiarid

5

*Corresponding author: franklin.riet@pq.cnpq.br

39

1. INTRODUCTION

Eastern equine encephalitis (EEE) is a zoonotic disease caused by a virus

of the family Togaviridae, genus Alphavirus [3]. Viruses of this genus are mainly

associated with disease of the central nervous system (CNS) of horses and

humans, who are the terminal hosts, while infected birds usually act as reservoirs

and do not develop disease [18]. However, domestic and wild birds including

pheasants, emus and broilers [18] have often been affected and there are record of

the disease in other species, including sheep [6], dogs [14] and deer [35, 37].

In South America there have only been two cases of fatal EEE reported in

humans, one in Bahia, Brazil [2] and another in Trinidad [10], while in North

America, over 100 fatal cases have been reported. This difference can be

attributed to the distinct pathogenic characteristics of the agents and habits of the

vectors involved. Weaver et al. [40] emphasized that the U.S. variants were more

virulent for humans and horses than the South America variants. Fatality rate for

humans with an U.S. variant ranged from 50% to 75% [41].

Mosquitoes of the species Culiseta melanura, Coquilletidia perturbans,

Ochlerotatus sollicitans, Aedes vexans, and Culex erraticus are the main

transmitters of the agent in the US [39]. In Brazil there are reports of virus

isolation in Aedes (Ochlerotatus) fulvus, Aedes (Och.) taeniorhynchus, Culex

(Culex) sp., Culex (Melanoconion) sp., Culex (Mel.) spissipes, Culex (Mel.)

pedroi, and Mansonia sp [38]. The transmission of the virus to horses occurs

exclusively by mosquitoes that have previously taken blood meal from viremic

birds [18].

In the state of São Paulo, Brazil, during the period of 1978 to 1990, several

species of birds have been diagnosed positive for EEE by means of the

haemagglutinin-inhibition test, including Porzana albicollis, Guira guira,

Synallaxis spixi, Anabacerthia amaurotis, Troglodytes aedon, Passer domesticus,

Geothlypis aequinoctialis, Thraupis sayaca, Tachyphocelus coronatus, and

Zonotrichia capensis among the resident birds. Antibodies were detected also in

40

the migratory birds such as Columbina talpacoti, Thraupis palmarum, Sporophila

caerulescen and Machetornis rixosus [17]. In the states of Amapá and Pará

antibodies were found in Ramphocelus carbo, Thamnophilus aethiops and

Phlegopsis nigromaculata [38].

In Brazil there are few reports on the isolation of EEE virus from horses

[1, 7, 11, 27]. Most studies of the disease are based on antibodies detected in

horses, humans and wild vertebrates or on isolation of the virus from vectors, in

the states of Amazonas, Pará, Rondônia, Tocantins, Ceará, Pernambuco, Bahia,

Mato Grosso, Mato Grosso do Sul , Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo

[4, 8, 9, 13, 16, 20, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 36, 39]. There are no

detailed reports on the epidemiology, clinical signs and pathology of the disease.

The objective of this report is to describe the epidemiology, clinical signs and

pathology of outbreaks of EEE that occurred in 2008 and 2009 in the semiarid

region of the states of Pernambuco, Paraíba and Ceará, Northeastern Brazil.

2. MATERIAL AND METHODS

Epidemiological data were obtained from May 2008 to August 2009 on

visits to 11 farms in Pernambuco, 40 in Ceará, and 80 in Paraíba. During visits,

affected animals were examined clinically and 14 necropsies were performed.

During the necropsies, samples of the organs of the thoracic and abdominal

cavities, and the CNS were collected for histologic examination. These samples

were fixed in 10% buffered formalin solution. After fixation the brain and spinal

cord specimens were cut transversely into 3-5 mm thickness sections, and samples

of frontal, temporal, parietal and occipital lobes, hippocampus, basal nuclei,

thalamus, rostral and caudal colliculi, pons, cerebellum, medulla oblongata, and

cervical, thoracic and lumbar spinal cord were embedded in paraffin, cut into 4-5

µm sections of and then stained with hematoxylin-eosin.

Serum samples, one during the clinical disease and another 15 days later,

were collected from two horses, not vaccinated against equine encephalitis, and

sent to the Biological Institute of Sao Paulo to determine the antibody titers for

41

equine eastern and western encephalitis by means of the neutralization test in cell

culture.

Rabies-direct fluorescent antibody test (FAT) was conducted on brain

smears, according to the technique of Goldwasser & Kissling [19], with the slight

modification described by Dean et al. [12]. The mouse inoculation test (MIT) was

performed in newborn albino mice, of the CH3–Rockefeller strain. The mice were

inoculated with 0.03 mL of 10% suspension prepared from the CNS samples of

necropsied horses, according to Koprowski [26]. Mice were observed daily for 30

days for any neurologic signs or death.

RNA extraction was carried out using Trizol ® according to the guidelines

of the manufacturer, from the original specimens of horses. In 10 samples, the

extraction was performed in a pool of brain stem and cerebellum and in three, in a

pool of cervical cord, hippocampus and frontal cortex. As a positive control we

used a sample of fixed virus of Western Equine Encephalitis Virus (WEEV),

assigned by the Instituto Evandro Chagas (IEC), state of Pará, and maintained in

Swiss albino mice. As a negative control, ultra pure water free of DNase and

RNase was used. The positive and negative controls, together with the 13 CNS

samples, were submitted to the semi-nested RT-PCR technique directed toward

amplification of a fragment of 310 base pairs (nucleotides 283 to 592) of the non-

structural protein 1 (NSP1) of the genus Alphavirus, according to the protocol

described by Pfeffer [33].

In the semi-nested PCR, a negative control was used for every three

samples tested, to obtain greater control over possible contamination of the

reaction. The primers used in the semi-nested RT-PCR are described in Table I.

The fragment of 310 bp resulting from the semi-nested RT-PCR was purified

from 1% agarose gel with the kit QIAquick ® Gel Extraction Kit according to the

manufacturer's instructions and quantified with Low DNA Mass Ladder

(Invitrogen) agarose gel 2%, according to the manufacturer's instructions. For

each reaction of DNA sequencing, between 2.5 and 10 ng of DNA were used.

42

Table I: Description of the primers used for Semi-Nested RT-PCR

Primer Sense Use Sequence Position in the

Genome

A1 Sense RT-PCR 5’AGAGCDTTTTCGCAYSTRG

CHW 3’

nucleotide 159-

180

A2 Antisense RT-PCR/Semi-

Nested PCR

5’ACATRAANKGNGTNGTRTC

RAANCCDAYCC 3’

nucleotide 563-

592

A3 Sense Semi-Nested

PCR

5’

TGYCCNVTGMDNWSYVCNG

ARGAYCC 3’

nucleotide 283-

308

The DNA fragments were subjected to bidirectional DNA sequencing,

with primers A2 and A3 in separate reactions using the kit BigDye ® Terminator

v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). The purification of the

sequencing reaction was performed by Sephadex ™ G-50 fine (GE Healthcare

Bio-sciences), on plates with Multiscreen HV filter in 96 wells plates. After

purification, the sequences were generated in automatic genetic analyzer ABI-

3130 (Applied Biosystems ™). The confirmation of the sequencing and

determination of viral species was performed using the application blastn

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

The identification of the virus carried by semi-nested RT-PCR were

performed on 13 horse specimens collected: one from the municipality of Exu, in

the state of Pernambuco; one from Jaguaribe, and two from Várzea Alegre, in the

state of Ceará; and two from São João do Rio do Peixe, two from Coremas, two

from Poço de José de Moura, one from Uiraúna, one from Paulista, and one from

Patos in the state of Paraíba.

3. RESULTS

3.1. Epidemiology

The sequencing of the isolates that the sample isolated from Pernambuco

was of a different cluster than the samples isolated from Paraíba and Ceará that

belonged to another cluster, indicating the occurrence of two outbreaks: one in

43

Pernambuco in 2008, and another in Paraíba and Ceará in 2009. The first outbreak

occurred in the state of Pernambuco from April to August 2008. The initial case

occurred in the municipality of Parnamirim, with cases extending later to the

municipality of Exu. A total of 11 farms were involved, 60 horses died and only

one recovered.

Another outbreak occurred in the states of Ceará, and Paraíba, during the

period of March to July 2009. In Ceará, the disease occurred in the municipalities

of Jaguaribe, Iguatú, Missão Velha, Faria Brito, Baixio, Acopiara, Cedro, Umari,

Ico, Ipaumirim, Óros, Lavras da Manguabeira and Várzea Alegre. In Paraíba, the

disease was registered in the municipalities of Cajazeiras, São João do Rio do

Peixe, Coremas, Poço de José de Moura, Uiraúna, Brejo do Cruz, São José do

Brejo do Cruz, Belém do Brejo do Cruz, Condado, São Bentinho, Cajazeirinhas,

Catolé do Rocha, Paulista, Vista Serrana, São Francisco, Souza, Itaporanga,

Piancó, São Bento, Malta, São José de Espinharas, and Patos. The geographic

distribution of the disease is presented in Figure 1. Forty properties were affected in

Ceará and 42 in Paraíba; 165 horses, one pony, one donkey and one mule were

affected; 105 horses, the pony and the donkey died, and 60 horses and one mule

recovered. The fatality rate was 98.36% in the outbreak of Pernambuco, and

62.18% in the outbreak of Ceará and Paraiba. Horses of all ages were affected.

44

Figure 1. Map of the states of Paraíba, Ceará, and Pernambuco showing the

municipalities were EEE occurred.

45

3.2. Clinical signs

The main clinical signs were ataxia, circling, blindness, head pressing,

depression or hiperexcitability, lip movements or other involuntary movements,

tongue paralysis, ataxia, paresis progressing to paralysis, recumbence, paddling,

and coma (Figure 2). Fever, opisthotonos, lip or mandible paralysis, wide base

stance, hypermetric gait, stringhalt, falls, salivation, and nasal and eye discharge

were less frequently observed. The clinical manifestation period was of 3-15 days.

Figure 2. Horse affected by eastern equine encephalomyelitis from the

municipality of Jaguaribe, state of Ceará, showing severe depression, ataxia, and

tongue paralysis.

46

3.3. Pathology

At necropsy, traumatic lesions, including corneal opacity, subcutaneous

periocular edema, and alopecia and erosions of the skin in different parts of the

body were observed in nine horses. Five animals showed congestion of the

meningeal vessels. After fixation red or brown areas were observed in the

temporal and occipital cortex of one horse (Figure 3).

Figure 3. Cerebrum. Horse with equine encephalomyelitis from the municipality

of Jaguaribe, state of Ceará, showing red or brown areas of malacia in the

occipital cortex.

Main histologic lesions were a diffuse multifocal non suppurative

lymphoplasmocytic encephalomyelitis with perivascular infiltration by

lymphocytes, plasma cells, macrophages and some neurophils, vasculitis with

47

endothelial cells swelling, neuronal death, satellitosis, neuronophagia,

hemorrhages, edema, and mutifocal lymphocytic infiltration of the neuropil

(Figure 4-8). These lesions were more severe in the grey matter of the

telencephalon, diencephalon, and mesencephalon. Similar but mild lesions were

observed in the cerebellum and spinal cord, mainly in the grey matter. The

distribution and severity of the inflammatory lesions in 14 horses are presented in

Table II. In five cases, rare eosinophils were observed within the

lymphoplasmocytic exudates. Nine cases showed lymphoplasmocytic meningitis

with perivascular cuffing in the cerebral meninges and in four of these horses the

meningitis affected also the cerebellum. Focal areas of malacia, with vacuolation

of the neuropil and presence of macrophages, neutrophils, cellular debris, and

occasionally guitter cells were observed mainly in the telencephalon, thalamus,

and basal nuclei. Axonal spheroids were occasionally observed. No significant

lesions were observed in other organs examined.

Figure 4. Basal nuclei. Horse with equine encephalomyelitis from the

Municipality of Exú, Pernambuco showing encephalitis with lymphoplasmocitic

parivascular cuffing and gliosis. H-E.

48

Figure 5. Basal nuclei. Horse with equine encephalomyelitis from the

Municipality of Exú, Pernambuco showing perivascular cuffing of lymphocytes,

plasma cells and macrophages. H-E.

Figure 6. Hippocampus. Horse with equine encephalomyelitis from the

Municipality of Exú, Pernambuco showing neuronophagia. H-E.

49

Figure 7. Basal nuclei. Horse with equine encephalomyelitis from the

Municipality of Exú, Pernambuco showing neuronal necrosis with infiltration of

the neuropil by lymphocytes, plasma cells and neutrophils. H-E.

Figure 8. Brain stem. Horse with equine encephalomyelitis from the Municipality

of Exú, Pernambuco showing severe hemorrhages. H-E.

50

Table II: Distribution and intensity of inflammatory histologic lesions observed in 14

cases of eastern equine encephalitis in northeastern Brazil.

Case

FC

a

PC TC OC BN HY TA RC CC PO MO CE MC MT ML

1

++

++ + + +++ + ++ ++ ++ + + - + - -

2

+ + + + ++ - ++ ++ + + + - + - -

3

+++ ++ +++ ++ +++ - + + + + + + + + -

4

++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ + + + - -

5

++ + + + + - ++ ++ NE NE + + + - -

6

++ NE

+ + ++ NE +++ ++ ++ NE ++ + NE NE -

7

+ + + + ++ - ++ ++ NE ++ + + + - NE

8

+++ + + + +++ - ++ ++ NE ++ + + NE + +

9

+ + ++ + ++ NE +++ + NE + + NE ++ NE +

10

+ ++ ++ + + ++ ++ + NE ++ + NE + - -

11

+ + + + + - ++ + + + + NE + - +

12

+ + + + + - ++ ++ ++ + + - + + +

13

++ + + + ++ NE ++ ++ + NE NE + - + -

14

+ + + + ++ - ++ ++ ++ + + + + + -

a

CF= frontal cortex, CP= parietal cortex, CT= temporal cortex, CO= occipital cortex,

BN= basal nuclei, HY= hippocampus, TA= thalamus, RC= rostral colliculi, CC= caudal

colliculi, PO= pons, MO= medulla oblongata, CE= cerebellum, MC= cervical spinal

cord, MT= thoracic spinal cord, ML= lumbar spinal cord;

NE= non examined; -

absent, + mild, ++ moderate,+++ severe

3.4. Laboratory diagnosis

In the paired serum samples taken from two horses, the antibodies titers

against EEE virus were 1:10 and 1:10 in the first sample, increasing to 1:320 and

1:160 in the second.

The 5 day-old mice inoculated with the CNS suspension from one horse

began to show signs 24 hours after inoculation. The animals stayed isolated from

the other mates of the litter, failed to nurse and had difficulty breathing, and

paresis progressing to flaccid paralysis. The death occurred within six hours after

the onset of first signs. Forty-eight hours after inoculation of the newborn mice,

the mother presented nervous signs including circling movement, head pressing

on the box, and paresis of the hind limbs progressing to flaccid paralysis. It died

51

72 hours after inoculation. The virus isolated from mice was confirmed as EEE by

the semi-nested RT-PCR.

Of the 13 SNC samples submitted to semi-nested RT-PCR, all were

positive for the genus Alphavirus. After DNA sequencing, all positive samples

were identified as EEEV through the blastn analysis. The sequencing showed that

the samples from Ceará and Paraíba states corresponded to the same cluster, and

the sample from Pernambuco to a different cluster. Detailed results of the

sequencing of these samples will be published elsewhere.

4. DISCUSSION

In these outbreaks the presumptive diagnosis of EEE was made by the

epidemiological, clinical and pathological features of the disease, and confirmed

by isolation of virus, by semi-nested RT-PCR, and by the increased antibodies

title in two horses recovered from the disease. The results of the sequencing of the

isolates proved that the outbreak in 2008 in Pernambuco was caused by a distinct

EEE virus variant from the virus variant causing the outbreak in Ceará and

Paraíba states in 2009. The diagnosis of two outbreaks of EEE in the semiarid

regions of three Northeastern states represents the first full description of the

disease in Brazil, including epidemiology, clinical signs, pathology, and virus

identification.

During the visits to the farms, some experienced owners and veterinarians

mentioned that this disease is known as roda (circling) and occurs periodically in

the region. The occurrence of both outbreaks of EEE at the end of the rainy season

suggests that the disease is seasonal and epidemic in the Brazilian semiarid

region.

The semiarid region is characterized by a warm climate with an average

temperature of 26

o.

C and rainfall of about 800 mm per year, and in some regions

of only 500-600 mm. The rains are irregular with insignificant to low rainfall

occurring for years. The rainy season is short, from January-February to April-

May. The humidity is low, ranging from 60% to 75%, and the vegetation is

52

typical of caatinga (means white forest in Tupi-Guarani), being an exclusive

Brazilian biome, occupying almost 11% of the country. This vegetation is

characteristic of the arid conditions (xerophytic) with a strong presence of bushes

with twisted branches and deep roots, and the presence of cacti and bromeliads.

Bushes lose almost all of their leaves in times of drought

[5].

The seasonal variation of EEE, as well as other arboviral diseases, is

associated with a particular temperature range, rainfalls and other environmental

factors that determine the density of vectors [22]. The rainfall of Paraíba, in 2009,

is among the highest in the last 15 years (Figure 9), suggesting that the increased

rainfalls is an important factor for the occurrence of outbreaks, which occur

preferentially at the end of the rainy season (Figure 10) when there is an increase

in vector population.

Figure 9. Mean annual rainfalls in 16 municipalities (Belém do Brejo do Cruz,

Cajazeiras, Catolé do Rocha, Condado, Coremas, Itaporanga, Malta, Patos, Sousa,

São Francisco, Vista Serrana, Poço de José de Moura, São Bentinho, São José do

Brejo do Cruz, Uiraúna, São João do Rio do Peixe) of Paraíba where EEE

occurred. Data from the Executive Agency Water Management of the State of

Paraíba. http://www.aesa.pb.gov.br/2009.

53

Figure 10. Mean monthly rainfalls, from January to December 2009, in the

municipalities (Belém do Brejo do Cruz, Cajazeiras, Catolé do Rocha, Condado,

Coremas, Itaporanga, Malta, Patos, Sousa, São Francisco, Vista Serrana, Poço de

José de Moura, São Bentinho, São José do Brejo do Cruz, Uiraúna, São João do

Rio do Peixe) of Paraíba where eastern equine encephalitis occurred. Data from

the Executive Agency Water Management of the State of Paraíba.

http://www.aesa.pb.gov.br/2009.

The fatality rates suggest that the isolate from the first outbreaks was more

pathogenic than the isolate from the second. The EEE virus is considered more

pathogenic than the Venezuelan and western equine encephalomyelitis viruses,

although considerable variation in pathogenicity may occur [15, 21].

Epidemiologic characteristics (epidemic and seasonal) as well as clinical

signs suggesting mainly cerebral and brain stem involvement, and the presence of

a diffuse necrotizing and hemorrhagic lymphoplasmocytic encephalitis allowed

differentiation of EEE from rabies, Crotalaria retusa poisoning, and

leukoencephalomalacia, which are common diseases of horses in the Brazilian

semiarid [34]. Rabies and C. retusa poisoning are endemic diseases in the

Brazilian semiarid region, also in rabies the encephalomyelitis is less severe,

without necrosis or hemorrhages, and in C. retusa poisoning hepatic lesions are

54

characteristic of pyrrolizidinic alkaloids poisoning. In leukoencephalomalacia the

history of corn feeding and the characteristic gross malacia of the white matter

allow the differential diagnosis.

Although the epidemiology, clinical signs and pathology allow the

presumptive diagnosis of the disease, it is necessary to submit specimens to

laboratory diagnosis to determine the etiologic agent of the encephalitis. Such

identification is very important for the surveillance of equine arboviruses because

of their public health importance, in addition to any economic loss.

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59

CONCLUSÕES

Os resultados deste trabalho mostram que as falhas de diagnóstico de raiva

utilizando corretamente os exames histopatológico, imunofluorescência direta e

inoculação intracerebral em camundongos, em materiais corretamente enviados, se

ocorre, é um evento raro.

A raiva suína, apesar de ser rara, ocorre no semiárido, portanto em suínos com

sinais neurológicos, a raiva é um diagnóstico alternativo, e há possibilidades de

transmissão ao homem.

Devido à importância da raiva no semiárido é importante reforçar a vacinação de

todos os animais, incluindo os porcos, e realizar um programa de controle dos

reservatórios.

Em suínos a raiva transmitida por morcego hematófago causa raiva paralítica

com lesões localizadas preferentemente na medula.

A encefalite eqüina leste (EEE) é uma doença epidêmica sazonal que ocorre no

semiárido nordestino. O isolamento e identificação do vírus de EEE é extremamente

importante para a vigilância epidemiológica e profilaxia da doença, assim como para a

saúde pública, pois, assim como a raiva, trata-se de uma zoonose.

60

ANEXOS

6

1

ANEXO 1

62

63

ANEXO 2

64

RAIVA PARALÍTICA EM SUÍNOS

Clarice Ricardo de Macedo Pessoa

1

, Maria Luana Cristiny Rodrigues Silva

1

, Albério

Antônio de Barros Gomes

1

, Andrea Isabel Estévez Garcia

2

, Fumio Honma Ito

2

, Paulo

Eduardo Brandão

2

, Franklin Riet-Correa

1*

1

Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e Tecnologia Rural,

Universidade Federal de Campina Grande, Av. Universitária, Bairro Santa Cecília,

CEP 58700-970, Caixa Postal 64, Patos, Paraíba, Brazil

2

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil

RESUMO

O vírus rábico foi diagnosticado em dois suínos no semiárido do Estado da Paraíba, Brasil.

Os sinais clínicos foram paresia e paralisia dos membros pélvicos. Lesões histológicas de

encefalomielite não supurativa difusa com lesões severa na medula espinhal, lesões de

discreta a acentuada no tronco cerebral, e discretas ou ausentes na parte frontal do cérebro.

O vírus foi identificado por RT-PCR como uma cepa de Desmodus rotundus. Apesar das

várias formas de diagnóstico da raiva em animais este é o primeiro relatório de sinais

clínicos e patologia da raiva suína transmitida por morcegos hematófagos.

Palavras-chaves: morcego vampiro, epidemiologia, isolamento viral, zoonoses

INTRODUÇÃO

Vírus rábico (VR) apresenta tropismo especial pelo sistema nervosa central (SNC)

causando encefalomielite aguda, e provocando doença neurológica letal em mamíferos. O

VR pertence ao gênero Lyssavirus da familia Rhabdoviridae, sendo um problema

importante de saúde pública no Brasil, a situação epidemiológica é complexa e há dois

principais ciclos predominante: cães e morcegos vampiro (9). O país reduziu a raiva

65

humana através do controle da doença em cães e, casos humanos de raiva transmitida por

morcegos são mais comuns do que transmitidos por cães (15). O vírus também é

freqüentemente isolado de animais silvestres, principalmente de canídeos silvestres (3), mas

a importância desses animais como fonte de raiva em animais domésticos é desconhecida.

A raiva é uma doença rara em suínos e são poucos os relatos sobre a epidemiologia,

características clínicas e patológicas da doença nesta espécie. Em um surto da raiva

transmitida por um cão na China, os principais sinais clínicos foram agressividade e outros

sinais cerebrais (10). Nos E.U.A., em 10 casos de raiva transmitida por animais silvestres,

principalmente, guaxinins, mangoose e shunks, os sinais clínicos foram febre,

agressividade, agitação, anorexia, prurido, paralisia progressiva, depressão e

vocalização(6).

No Brasil existem vários relatórios de identificação do vírus rábico de suínos

provenientes dos Estados do Pará (2), Tocantins (19), Goiás (9), Mato Grosso (16) e Rio

Grande do Sul (21), mas não há relatos sobre a epidemiologia, sinais clínicos e as

características patológicas da doença nesta espécie. Alguns desses vírus são originados de

cães (9) e outros de morcego vampiro (2). O objetivo deste trabalho é apresentar, a

epidemiologia, as características clínicas e patológicas de um surto de raiva transmitida por

morcegos hematófagos em suínos.

MATERIAL E MÉTODOS

Em Junho de 2009, a secção de Patologia Animal do Hospital Veterinário

pertencente à Universidade Federal de Campina Grande, Estado da Paraíba, recebeu dois

animais apresentando sinais neurológicos. Os dois animais foram criados em uma pocilga

com outros 28 suínos de diferentes idades, no município de Mãe D'Água, no semiárido da

Paraíba. Os animais foram submetidos à eutanásia e necropsiado. Amostras de órgãos das

cavidades torácicas e abdominais, todo o encéfalo e a espinal medula de um suíno, e

metade do cérebro e da medula espinhal de outro suíno foram fixados em formalina 10%

tamponada. As amostras de órgãos e as amostras de cortes transversais do SNC, incluindo a

medula espinhal (cervical, torácica e lombar), cerebelo, córtex, pedúnculos cerebelares,

bulbo, ponte, colículo rostral e caudal, hipocampo, tálamo, núcleos da base e cápsula

66

interna foram embebidos em parafina, seccionados em 4-5 fatias µm e corados com

hematoxilina-eosina para exame histológico.

Fragmentos do cérebro e da medula espinhal do suíno 2, regiões semelhantes do

exame histológico foram examinados para a raiva através do teste de imunofluorescência

direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC). Para o ICC, as suspensões

foram preparadas a partir materiais do cérebro e da medula espinhal, amostras individuais

foram macerados e diluídas para fazer uma suspensão de 20% (peso/volume) com uma

solução de água destilada esterilizada contendo 2% (v / v) soro de coelho, penicilina (500

UI / ml) e estreptomicina (1.560 UI / ml). Após a centrifugação a 2.000 G por 10 minutos,

um volume de 0,03 mL foram inoculadas em grupos de dez camundongos, de acordo com

Koprowski (11). Camundongos foram observados diariamente durante 30 dias para os

sinais de raiva, e a confirmação da raiva pela IFD. Os camundongos utilizados para fins de

diagnóstico e procedimentos de isolamento do vírus foram camundongos de 21 dias de

idade, albino suíço, CH3 linhagem Rockefeller, pesando 11-15 g, e mantida no infectório

da UAMV/CSTR/UFCG. A IFD foi feita de acordo com a técnica de Goldwasser &;

Kissling (7) modificado por Dean et al. (5). Os dados históricos e clínicos foram obtidos

através de entrevistas com os proprietários, e as informações epidemiológicas foi concluída

após a inspeção da suinocultura.

O vírus rábico isolado do suíno identificado como PN169PB,foi submetido a

extração de RNA de suspensão a 10 %, usando Trizol® (Invitrogen®), de acordo com a

instrução dos fabricantes. RT-PCR foi realizado conforme descrito por Macedo et. al.(13).

Para a construção do dendrograma, seqüências de DNA foram recuperadas do Genbank

empregadas e alinhadas pelo método CLUSTAL/W, usando o programa BIOEDIT. Para a

reconstrução filogenética foi utilizado o algoritmo de Neighbor-Joining utilizando o

software MEGA software com 1000 repetições bootstrap (20).

RESULTADOS

O primeiro animal apresentava sinais clínicos (Suíno 1) com 45 dias de idade,

macho, demonstrando paralisia flácida dos membros pélvicos durante dois dias, que

presumivelmente foi diagnosticado como trauma. Na necrópsia, as lesões graves não foram

67

observadas. Ao exame histológico, encefalomielite não-supurativa com manguitos

perivasculares composto por linfócitos, células plasmáticas e raros macrófagos, gliose

multifocal ou difusa, neuronofagia, hemorragias e vasculite foram observados, na

substância cinzenta (Fig. 1). Estas lesões foram leves em todas as regiões do tronco

cerebral, grave na medula espinhal e ausente no telencéfalo. As lesões foram semelhantes

aos da raiva, uma visita à fazenda foi realizada para obter dados epidemiológicos. Durante

a visita, um outro animal (Suíno 2) foi encontrado com sinais nervosos e conduzida ao

Hospital Veterinário. Com 30 meses de idade uma porca prenhe, e os sinais iniciados oito

dias antes do dia de visita. Mostrando anorexia e paresia seguida de paralisia dos membros

pélvicos e cauda (Fig. 2). Durante o exame estava em decúbito lateral, adotando uma

posição de cão sentado quando obrigada a ficar em pé. A sensibilidade cutânea e reflexo

cutâneo encontravam-se severamente diminuídos. Na necropsia, não foram observadas

lesões significativas. As lesões histológicas foram encefalomielite não-supurativa e

meningite, com as mesmas características observadas no suíno 1 (Fig. 1). Essas lesões

foram leves no telencéfalo e cerebelo e grave no tronco cerebral e medula espinhal. As

leptomeninges eram difusamente infiltrada por células mononucleares com a presença de

manguitos perivasculares.

Todos os fragmentos examinados foram negativos pela IFD e o tálamo, ponte, bulbo

e medula cervical, medula torácica e lombar foram positivas pela ICC. O isolado suíno

mostrou identidade máxima com o vírus da raiva bovina transmitida por morcegos D.

rotundus do Estado de São Paulo (Fig. 3).

Os suínos ficavam localizados (Fig. 4A) próximo da periferia da cidade (Fig. 4B)e

os suínos eram alimentados principalmente com resíduos domiciliares. A cidade é cercada

por montanhas com grutas, rochas e cobertos por mata nativa (caatinga) típico da região

semi-árida (Fig. 4 B-D). Nenhuma vacina ou vermifugação antes do surto de raiva foi

realizada. Um dos proprietários lembrou que cerca de 6 meses atrás, ele notou a presença

de um morcego dentro da pocilga e de sinal de mordedura em um animal. Após a

confirmação do diagnóstico da raiva, ele foi aconselhado a vacinar os animais restantes.

Oito dias após a vacinação com uma vacina anti-rábica comercial (raivacel ®-Vallée) uma

porca de adultos apresentou sinais clínicos semelhantes aos observados nos casos

68

anteriores, mas se recuperou em 10-12 dias. Não foram observados casos posteriores à

vacinação.

DISCUSSÃO

No Brasil, a raiva é frequentemente diagnosticada em bovinos e eqüinos (12).

Ovinos e caprinos são menos afetados (12), a doença é rara em suínos. Na ausência de

bovinos e equinos, que são os preferidos dos morcegos hematófagos, outras espécies,

incluindo suínos são fonte alternativa de alimento para D. rotundus (1, 21). Apesar dos

relatos sobre o isolamento do vírus da raiva em suínos há apenas raros relatos sobre os

sinais clínicos da doença nesta espécie. Em um surto de raiva transmitida inicialmente por

um cão, os principais sinais clínicos foram agressividade, hiperexcitação, e vocalização,

dos suínos com raiva furiosa mordendo outros suínos, que posteriormente foram afetados

com a forma furiosa da doença (10) . Contradizento, o surto descrito neste artigo os sinais

clínicos foram exclusivamente da forma paralítica, semelhante ao observado na maioria dos

casos de raiva bovina (12). Esses sinais clínicos são devidos à distribuição das lesões nos

animais afetados, que apresentaram lesões graves na medula espinhal, em ambos os

animais, leve (suíno 1) ou grave as lesões do tronco cerebral (suíno 2), e na ausência (suíno

1) ou lesões leves no telencéfalo (suíno 2). Ao nosso conhecimento este é o primeiro

relatório sobre os sinais clínicos e patologia da raiva transmitida por morcegos hematófagos

em suínos.

A sensibilidade da IFD para o diagnóstico da raiva de suínos é questionada. Yates et

al. (22) encontraram quatro suínos negativos para IFD, mas positivo para ICC. Prins e

Yates (17) analisaram 11 suínos, sendo um negativo na IFD, mas todos positivo na ICC.

Também a ausência de corpúsculos de Negri nos casos relatados neste trabalho e em outros

relatos (14) indica às dificuldades no diagnóstico da raiva em suínos, a importância do

diagnóstico diferencial com outras encefalites virais desta espécie com lesões muito

semelhante as da raiva (19). O rápido diagnóstico da raiva transmitida por morcegos em

suínos também é muito importante porque, em algumas ocasiões, os casos de raiva humana

transmitida por morcegos hematófagos foram precedidos por casos em suínos (15).

69

A tipagem genética do vírus indicou que o transmissor seria um morcego D.

rotundus. A existência de cavernas na região favorece a presença de morcegos hematófagos

e, conseqüentemente, a transmissão do vírus para outros animais, incluindo animais

silvestres, que perpetuam o vírus no semi-árido brasileiro (8). Devido à gravidade da

doença, é importante reforçar a vacinação de todos os animais, incluindo os suínos, para

prevenir a doença nos animais e no homem. O Instituto Pasteur de São Paulo registrou de

1980 a 1995, um caso de raiva humana transmitida por um suínno, que é considerado um

animal que oferece um risco médio (4). Como conseqüência, qualquer suíno com sinais

neurológicos, deve ter a raiva como um diagnóstico alternativo, devido a possibilidade de

transmissão humana.