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Campus de São José do Rio Preto
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS
PROPRIEDADES REOLÓGICAS DE
EXOPOLISSACARÍDEOS PRODUZIDOS
POR BACTÉRIAS DOS GÊNEROS
Rhizobium E Mesorhizobium
GABRIEL ARANDA SELVERIO
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-SP
2009
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2
GABRIEL ARANDA SELVERIO
PROPRIEDADES REOLÓGICAS DE
EXOPOLISSACARÍDEOS PRODUZIDOS
POR BACTÉRIAS DOS GÊNEROS
Rhizobium E Mesorhizobium
Orientadora:
Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva
(UNESP/FCT - Presidente Prudente/SP)
Co-orientadora:
Profa. Dra. Ana Lúcia Barretto Penna
(UNESP/IBILCE – São José do Rio Preto/SP)
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-SP
2009
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Aranda-Selverio, Gabriel.
Propriedades reológicas de exopolissacarídeos produzidos por bactérias
dos gêneros Rhizobium e Mesorhizobium / Gabriel Aranda Selverio. - São
José do Rio Preto : [s.n.], 2008.
110 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva
Co-orientador: Ana Lúcia Barretto Penna
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Exopolissacarídeos. 2. Polissacarídeos microbianos. 3. Rhizobium.
4. Mesorhizobium. 5. Análises reológicas. 6. Solução pseudoplástica. 7.
Comportamento viscoelástico. I. Silva, Maria de Lourdes Corradi
Custódio da. II. Penna, Ana Lúcia Barretto. III. Universidade Estadual
Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.
CDU - 577.124.5
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE
Campus de São José do Rio Preto - UNESP
4
GABRIEL ARANDA SELVERIO
PROPRIEDADES REOLÓGICAS DE
EXOPOLISSACARÍDEOS PRODUZIDOS
POR BACTÉRIAS DOS GÊNEROS
Rhizobium E Mesorhizobium
Dissertação apresentada para obtenção do
titulo de Mestre em Engenharia e Ciência de
Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de
Alimentos junto ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia e Ciência de
Alimentos do Instituto de Biociências,
Letras e Ciências Exatas da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de São José do Rio Preto.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva
Professor Assistente Doutor
UNESP/FCT - Presidente Prudente/SP
Orientadora
Profa. Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos
Professor Titular
UNESP/FCAV – Jaboticabal/SP
Prof. Dr. Javier Telis Romero
Professor Assistente Doutor
UNESP/FCT - Presidente Prudente/SP
São José do Rio Preto, 21 de agosto de 2009
5
AGRADECIMENTOS
À Deus, sempre presente na minha vida me guiando e iluminando, permitindo, assim, a
concretização de mais uma etapa da minha vida.
Aos meus pais, Festo e Odete, por apoiar sempre e proporcionar a realização de meus
projetos de vida e, sobretudo, pelos exemplos de conduta moral, força e paciência, que
certamente me transformaram na pessoa que sou.
Aos meus irmãos Cacá, Dadá, André e Vitor, minha cunhada Liliane e ao Tavinho, por
participarem de cada momento. Em especial a Dadá, por ter lido atentamente a versão final
bem como corrigido as referências. Seu companheirismo e descontração são fundamentais
sempre.
À todos mais da minha família, pelas alegrias, auxílio e incentivo em todos os momentos.
Sem o apoio da família não somos nada!
Agradecimentos especiais aos meus avós, Felix e Maria, ao Tio e amigo Cláudio, pelo
constante incentivo e apoio em todas as etapas desta caminhada.
À minha namorada e amiga Tamaya, a qual sempre participou de minha carreira
acadêmica. Muito obrigado pela paciência (principalmente na reta final) e por compartilhar
bons momentos juntos.
À minha orientadora Prof
a
Dr
a
Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva pela confiança,
dedicação e por ter me ensinado como se faz pesquisa. E, também, pelos exemplos de
profissionalismo e companheirismo.
À Prof
a
Dr
a
Ana Flora Dalberto Vasconcelos pelo auxílio durante todos os momentos desse
trabalho, e por estar sempre por perto dando aquela força. Principalmente quando a
química apertava. Um biólogo entende o outro!!!
À técnica Marilsa de Stefani Cardoso (UNESP-Presidente Prudente) pelas orientações
durante minha permanência no laboratório e auxílio nas aulas práticas.
6
Aos colegas do Laboratório de Química de Carboidratos da Unesp de Presidente Prudente
Luciana, Nilson, Junior e Simone pelas aulas de química e ajuda na realização dos
experimentos.
À Prof
a
Dr
a
Ana Lúcia Barretto Penna pela Co-orientação deste trabalho.
À todos os amigos, em especial ao Hector, que me acolheu em Rio Preto e me apresentou à
Rep. Pré-Tcheca, onde passei momentos importantes e sempre arrumando um tempinho
pra tomar “duas”. Ao Ghai, Darly, Elô, Tigrão, Linguiça e outros não menos importantes.
Muito obrigado pelo apoio!
Ao amigo Freedman por ter me recebido em sua casa em Curitiba.
Aos amigos do Curso de pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, em
especial a Gisele e Adriana pela amizade e companheirismo em todos os momentos.
À Prof
a
Dr
a
Joana Léa Meira Silveira, do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Paraná, pela colaboração na realização das análises
reológicas.
Aos colegas do Depto de Fisica, Química e Biologia da Unesp– Presidente Prudente, em
especial as funcionárias Juvanir R. de Mello e Ana Maria Dundi, pela convivência, auxilio
e cafezinho sempre presentes.
Ao programa de Pós-Graduação da Unesp - São José do Rio Preto.
À todos os professores e funcionários do Departamento de Engenharia e Tecnologia de
Alimentos Unesp - São José do Rio Preto.
À todos do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do
Paraná - UFPR, que se mostraram dispostos a me ajudar durante os experimentos,
principalmente ao Ricardo pelo auxílio nas análises reológicas.
À Cnpq pela bolsa de mestrado.
À todos que, de uma forma ou de outra, foram importantes para a realização deste trabalho
e para meu amadurecimento científico, o meu muito obrigado!
7
“O que sabemos é uma gota, o que ignoramos é um oceano”
Isaac Newton
8
RESUMO
Exopolissacarídeos (EPS) são polímeros produzidos por uma grande variedade de
microrganismos e possuem diferentes propriedades estruturais, físicas e químicas. A
investigação das propriedades reológicas de suas soluções é importante devido ao
crescente interesse na aplicação comercial de polissacarídeos, principalmente na indústria
de alimentos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar as características reológicas
dos exopolissacarídeos R
1
, R
2
, R
3
e R
4
produzidos por diferentes linhagens de Rhizobium e
Mesorhizobium. Análises quantitativas mostraram que o teor de ácido urônico encontrado
em R
3
(8,4 %) foi maior que em R
1
(2,4 %), R
2
(1,7 %) e R
4
(0,8 %). A cromatografia de
filtração em gel mostrou que R
2
e R
3
são mais homogêneos e menos polidispersos.
Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD mostrou glucose como constituinte básico
majoritário dos EPS, além de galactose e manose. Todos os polissacarídeos apresentaram
comportamento não-Newtoniano, com características de soluções pseudoplásticas nas
concentrações de 2, 5 e 10 g/L. O modelo reológico de Ostwald-de-Waele (Lei da
Potência) foi utilizado para representar os dados experimentais de tensão de cisalhamento
versus taxa de deformação. Os EPS R
1
, R
2
e R
4
demonstraram pequeno aumento na
viscosidade em presença de NaCl, e apresentaram comportamento viscoelástico de gel,
sendo R
1
o que apresenta características de gel mais forte. O EPS R
3
manteve-se como o
menos viscoso, tanto em meio aquoso quanto em solução salina, provavelmente devido ao
maior percentual de ácidos urônicos em sua estrutura. Além disso, R
3
exibiu
comportamento de solução diluída a baixas concentrações, e viscoelástico de gel fraco em
concentrações mais elevadas. A análise da influência da temperatura sobre o
comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas mostrou que os EPS R
1
, R
2
e R
4
apresentaram características de gel forte, na concentração de 5 g/L.
Palavras-chaves: Exopolissacarídeo; Rhizobium; Mesorhizobium; Análises Reológicas;
Solução Pseudoplástica; Comportamento viscoelástico.
9
ABSTRACT
Exopolysaccharides (EPS) are polymers produced by a great variety of
microorganisms and possess different structural, physical and chemical properties.
Investigation of rheological properties of these solutions is important due to an increasing
interest in polysaccharides commercial applications, mainly in food sectors. The objective
of this work was investigate rheological characteristics of exopolysaccharides R
1
, R
2
, R
3
and R
4
produced by different Rhizobium and Mesorhizobium strains. Quantitative analysis
showed that uronic acid component found in R
3
(8,4 %) was higher than R
1
(2,4 %), R
2
(1,7 %) and R
4
(0,8 %). Gel filtration chromatography indicated that EPS R
2
and R
3
are
more homogeneous
and less polidisperse. Acid hydrolysis and HPAEC/PAD analysis
revealed that glucose was the main monosaccharide, beyond galactose and mannose. All
exopolysaccharides had non-Newtonian behavior, with pseudoplastic characteristics at
concentrations of 2, 5 and 10 g/L. The Ostwald-de-Waele (Power Law) was the rheological
model used to represent the experimental data of the shear stress versus shear rate. EPS R
1
,
R
2
and R
4
demonstrated a slight increase in viscosity in presence of NaCl, and viscoelastic
behavior, R
1
had strong gelling characteristics. The EPS R
3
was less viscous, in water
solutions and presence of salt, probably due to a high percentual of uronic acids on its
structure. Moreover, R
3
exhibited diluted solution behavior at low concentration, and
viscoelastic weak gelling at high concentrations. Analysis of temperature influence over
polysaccharide solutions viscoelastic behavior showed that EPS R
1
, R
2
e R
4
had strong
gelling characteristics, at concentrations of 5 g/L.
Keywords: Exopolysaccharides; Rhizobium; Mesorhizobium; Rheological analyses;
Pseudoplastic solution; Viscoelastic behavior.
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 -
Fluxo entre duas placas paralelas............................................................................. 28
Figura 02 -
Vários tipos de comportamento de fluxo................................................................. 30
Figura 03 -
Esquema de c
lassificação do comportamento reológico de
fluidos...................................................................................................................... 30
Figura 04 -
Reograma idealizado para um fluido pseudoplástico............................................... 32
Figura 05 -
Representação gráfica genérica de sistemas polissacarídicos submetidos a me
didas
reológicas dinâmicas. a) gel forte, b) solução concentrada ou gel fraco, e c) solução
diluída....................................................................................................................... 35
Figura 06 -
A) Reômetro HAAKE RS75 Rheostress; B) Sensor cone-placa (C60/2Ti°) ; C)
Amostra sobre a placa estacionária do reômetro; D) Exopolissacarídeo R
3
após
varredura, a 25 °C............................................................................................... 46
Figura 07 -
Soluções aquosas do EPS R
2
à temperatura de 25 ºC. (a) 5 g/L e (b) 10 g/L.......... 47
Figura 08 -
(A) Ilustração do EPS R
1
seco e moído; (B) EPS R
1
dialisado e liofilizado............ 51
Figura 09 -
Perfil de eluição por HPSEC para os EPS R
1,
R
2,
R
3
e R
4
........................................ 54
Figura 10 -
Análise dos monossacarídeos provenientes da hidrólise ácida dos EPS R
1
, R
2
, R
3
e
R
4
por HPAEC/PAD................................................................................................ 56
Figura 11 -
Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das soluções
polissacarídicas do EPS R
1
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 58
Figura 12 -
Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das soluções
polissacarídicas do EPS R
2
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 58
Figura 13 -
Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das soluções
polissacarídicas do EPS R
3
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 59
11
Figura 14 -
Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das soluções
polissacarídicas do EPS R
4
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 59
Figura 15 -
Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação (
) das soluções
polissacarídicas do EPS R
1
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 63
Figura 16 -
Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação (
) das soluções
polissacarídicas do EPS R
2
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 64
Figura 17 -
Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação (
) das soluções
polissacarídicas do EPS R
3
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC........................................................................................................................ 64
Figura 18 -
Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação (
) das soluções
polissacarídicas do EPS R
4
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 65
Figura 19 -
Curva de Histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das
soluções polissacarídicas do EPS R
1
na concentração de 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 68
Figura 20 -
Curva de Histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das
soluções polissacarídicas do EPS R
2
na concentração de 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 69
Figura 21 -
Curva de Histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das
soluções polissacarídicas do EPS R
3
na concentração de 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 69
Figura 22 -
Curva de Histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ))
das
soluções polissacarídicas do EPS R
4
na concentração de 10 g/L, à temperatura de
25 ºC......................................................................................................................... 70
12
Figura 23 -
Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
1
nas concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de
25 °C - (A), (B), (D) em solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.. 72
Figura 24 -
Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
2
nas concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de
25 °C - (A), (B), (D) em solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.. 73
Figura 25 -
Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
3
nas concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de
25 °C - (A), (B), (D) em solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.. 74
Figura 26 -
Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
4
nas concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de
25 °C - (A), (B), (D) em solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.. 75
Figura 27 -
Rampa de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
1
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min....79
Figura 28 -
Rampa de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
2
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min..... 80
Figura 29 -
Rampa de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
3
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min..... 80
Figura 30 -
Rampa de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
4
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min..... 81
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 -
Organism
os produtores de polissacarídeos bacterianos e suas
aplicações................................................................................................................. 22
Tabela 02 -
Modelos ajustados e suas equações.......................................................................... 48
Tabela 03 -
Quantificações de açúcares totais e redutores
, proteínas e ácido urônico dos
exopolissacarídeos produzidos por diferentes linhagens de bactérias
do gênero
Rhizobium e Mesorhizobium...........................................................................
........ 52
Tabela 04 -
Parâmetros reológicos obtidos pela análise das soluções exopolissacarídicas pela
aplicação do modelo da Lei da Potência.................................................................. 61
Tabela 05 -
Viscosidade absoluta (η) das soluções aquosa e salina dos EPS R
1
, R
2
, R
3
e R
4
,
5 g/L, nas taxas de deformação ( ) 10; 50 e 100 (s
-1
)............................................ 66
Tabela 06 -
Valores do módulo G’ nas varreduras de frequências dos EPS R
1
, R
2,
R
3
e R
4
, nas
frequências (f) 10
-1
e 10
0
(Hz), à temperatura de 25 °C e 5 ºC; valor do ponto de
cruzamento (Hz)..................................................................................................... 77
14
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
°C - Temperatura em graus celsius
BSA - Soroalbumina bovina
DMSO - Dimetilsulfóxido
EPS - Exopolissacarídeos
EPS R
1
- Exopolissacarídeo produzido por Rhizobium tropici (condições de
cultivo específicas)
EPS R
2
- Exopolissacarídeo produzido por Rhizobium tropici (condições de
cultivo específicas)
EPS R
3
- Exopolissacarídeo produzido por Mesorhizobium
EPS R
4
- Exopolissacarídeo produzido por Rhizobium sp.
f - Frequência
g/L - Gramas por litro
G* - Módulo de cisalhamento dinâmico complexo
G’ - Módulo de cisalhamento dinâmico elástico
G” - Módulo de cisalhamento dinâmico viscoso
HPSEC - Cromatografia líquida de filtração em gel
HPAEC - Cromatografia líquida de alta pressão e coluna de troca iônica
Hz - Hertz
K - Coeficiente ou Índice de consistência
M - Molar
mg - Miligrama
mL - Mililitros
m/v - Massa/volume
n - Índice de comportamento
nm - Nanômetros
nmol - Nanomol
Pa - Pascal
R
2
- Coeficiente de regressão
η - Viscosidade absoluta (Pa.s)
η* - Viscosidade complexa (Pa.s)
τ - Tensão de cisalhamento (Pa)
- Taxa de cisalhamento ou deformação (1/s)
15
kDa - Kilodaltons
pH - Potencial hidrogeniônico
rpm - Rotações por minuto
TFA - Ácido trifluoracético
v/v - Volume/volume
α - Alfa
β - Beta
µg - Micrograma
µL - Microlitro
µm - Micrometro
ϰ
2
- Chi-quadrado
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------------18
2. OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------------------- 19
2.1 Objetivos gerais----------------------------------------------------------------------------------- 19
2.2 Objetivos específicos ---------------------------------------------------------------------------- 19
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA----------------------------------------------------------------- 20
3.1 Polissacarídeos------------------------------------------------------------------------------------ 20
3.2 Exopolissacarídeos ------------------------------------------------------------------------------- 21
3.3 Exopolissacarídeos produzidos por bactérias do gênero Rhizobium ---------------------- 24
3.4 Reologia-------------------------------------------------------------------------------------------- 26
3.4.1 Propriedades dos fluidos ---------------------------------------------------------------------- 27
3.4.2 Líquidos Newtonianos------------------------------------------------------------------------- 29
3.4.3 Líquidos não-Newtonianos ------------------------------------------------------------------- 29
3.4.4 Modelando o comportamento reológico de fluidos --------------------------------------- 32
3.4.4.1 Modelo de Ostwald-de-Waele (Lei da Potência):--------------------------------------- 33
3.4.4.2 Modelo de Herschel-Bulkley:-------------------------------------------------------------- 33
3.4.4.3 Modelo de Casson:--------------------------------------------------------------------------- 34
3.4.5 Viscoelasticidade e soluções poliméricas--------------------------------------------------- 34
3.5 Algumas características reológicas de polissacarídeos ácidos----------------------------- 36
4. MATERIAIS E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------- 40
4.1 Materiais------------------------------------------------------------------------------------------- 40
4.1.1 Microrganismos -------------------------------------------------------------------------------- 40
4.1.2 Reagentes---------------------------------------------------------------------------------------- 40
4.1.3 Equipamentos----------------------------------------------------------------------------------- 40
4.2 Métodos gerais------------------------------------------------------------------------------------ 41
4.2.1 Preparo das amostras para análises ---------------------------------------------------------- 41
4.2.2 Análises quantitativas nos EPS R
1
, R
2
, R
3
e R
4
-------------------------------------------- 41
4.2.2.1 Determinação de açúcares totais - método do fenol - ácido sulfúrico---------------- 41
4.2.2.2 Determinação dos açúcares redutores - método de Somogyi – Nelson -------------- 42
4.2.2.3 Determinação de proteínas - método de Bradford--------------------------------------- 42
4.2.2.4 Determinação de ácidos urônicos - método de Blumenkrants modificado ---------- 43
4.2.3 Análise da homogeneidade por cromatografia de filtração em gel (HPSEC) --------- 43
4.2.4 Hidrólise Ácida Total-------------------------------------------------------------------------- 44
4.2.5 Análise da composição de monossacarídeos por cromatografia líquida de alta pressão
e coluna de troca iônica (HPAEC)------------------------------------------------------------------ 44
4.3 Análises reológicas------------------------------------------------------------------------------- 45
4.3.1 Métodos reológicos ---------------------------------------------------------------------------- 45
4.3.2 Preparo das soluções dos exopolissacarídeos ---------------------------------------------- 46
4.3.2.1 Determinação das Viscosidades Absolutas----------------------------------------------- 47
4.3.2.2 Curvas de Fluxo------------------------------------------------------------------------------ 48
4.3.3 Determinação da Tixotropia em sensor cone-placa --------------------------------------- 49
4.3.4 Análise Oscilatória em Sistema Dinâmico - Varredura de Tensão e Varredura de
Frequência---------------------------------------------------------------------------------------------- 49
4.3.5 Varredura de Temperatura -------------------------------------------------------------------- 50
17
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO--------------------------------------------------------------- 51
5.1 Quantificação dos exopolissacarídeos--------------------------------------------------------- 51
5.2 Análise da homogeneidade dos exopolissacarídeos por cromatografia de filtração em
gel (HPSEC) ------------------------------------------------------------------------------------------- 53
5.3 Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD dos exopolissacarídeos---------------- 55
5.4 Comportamento reológico das soluções formadas pelos exopolissacarídeos produzidos
pelo Rhizobium ---------------------------------------------------------------------------------------- 57
5.4.1 Curvas de fluxo--------------------------------------------------------------------------------- 57
5.4.2 Modelos reológicos ---------------------------------------------------------------------------- 60
5.4.3 Curvas de viscosidade ------------------------------------------------------------------------- 62
5.4.4 Tixotropia --------------------------------------------------------------------------------------- 67
5.4.5 Análise em sistema dinâmico----------------------------------------------------------------- 70
5.4.6 Varredura de temperatura --------------------------------------------------------------------- 79
6. CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------------------------------- 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS------------------------------------------------------- 84
ANEXO------------------------------------------------------------------------------------------------ 93
Carta de aceite de submissão de manuscrito ------------------------------------------------------ 95
Artigo encaminhado a Revista Química Nova---------------------------------------------------- 95
18
1. INTRODUÇÃO
Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos
extracelulares produzidos por alguns fungos e bactérias, podendo ser secretados no meio
de cultivo ou ligados à superfície das células. A crescente demanda por polímeros naturais
para diversas aplicações industriais impulsionou o interesse pela procura de
exopolissacarídeos de microrganismos. Os polissacarídeos de origem microbiana vêm
substituindo aqueles obtidos a partir de fontes convencionais, como plantas e animais, e
estão fornecendo a mesma rentabilidade econômica que as gomas naturais. A maioria das
aplicações práticas dessas macromoléculas envolve a propriedade de alterar as
propriedades físicas do meio onde se encontram, seja por conferir alta viscosidade às
soluções ou por criar redes intermoleculares coesivas.
Os polissacarídeos podem atuar como estabilizantes, espessantes,
gelificantes, agentes modificadores de textura e crioprotetores, e têm sido aplicados nas
indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética, têxtil e biomédica. Além disso, os EPS
podem formar soluções aquosas altamente viscosas, mesmo em baixas concentrações, o
que é considerado um atrativo para aplicação industrial dessas macromoléculas.
Muitas bactérias gram-negativas são produtoras de polissacarídeos
extracelulares, entre elas as do gênero Rhizobium e Mesorhizobium, que são capazes de
produzir grandes quantidades de EPS que fazem parte do processo de fixação biológica de
nitrogênio em plantas leguminosas. Bactérias deste grupo infectam as raízes das plantas
desenvolvendo uma relação simbiótica, na qual o microrganismo utiliza os carboidratos,
como fonte de energia, obtidos a partir da fotossíntese efetuada pelo hospedeiro e, em
troca, realiza a fixação de nitrogênio atmosférico que será utilizado pelo vegetal.
Considerando que o foco principal deste grupo de pesquisa é o estudo
químico, reológico e biotecnológico de exopolissacarídeos, este trabalho propõe-se a
realizar análises reológicas dos exopolissacarídeos produzidos por bactérias do gênero
Rhizobium e Mesorhizobium. Acreditamos que esses dados fornecerão resultados
consistentes que permitirão futuras aplicações tecnológicas e industriais destas moléculas.
19
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
O presente estudo tem por objetivo geral avaliar algumas
propriedades reológicas de exopolissacarídeos produzidos por três diferentes estirpes de
bactérias do gênero Rhizobium e uma de Mesorhizobium.
2.2 Objetivos específicos
Para cada polissacarídeo a ser estudado:
a) Quantificar os açúcares totais e redutores, as proteínas e os ácidos
urônicos;
b) Analisar a composição monossacarídica, por cromatografia líquida de
alta pressão, em coluna de troca iônica (HPAEC);
c) Verificar a homogeneidade por cromatografia líquida de filtração em
gel (HPSEC);
d) Efetuar alguns estudos do comportamento reológico em sistemas
estático e dinâmico;
Para as análises em sistema estático, determinar:
Viscosidades absolutas;
Curvas de Fluxo;
Tixotropia.
Para as análises em sistema dinâmico, efetuar:
Varreduras de Tensão e de Frequência;
Varredura de Temperatura.
20
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Polissacarídeos
A maioria dos carboidratos encontrados na natureza ocorre como
polissacarídeos solúveis em água, iônicos ou não-iônicos. Podem ser extraídos de raízes,
tubérculos, caules e sementes de vegetais, nos quais atuam como reserva de energia, como
é o caso do amido e da inulina; outras vezes, podem ser encontrados na estrutura celular de
tecidos vegetais, onde contribuem para a integridade estrutural e para a força mecânica,
como é o caso das pectinas, em plantas terrestres, e das carragenanas, agar e alginatos, em
plantas marinhas (TONELI; MURR; PARK, 2005).
Os polissacarídeos possuem massa molecular relativamente alta, são
formados por monossacarídeos unidos por ligações covalentes, denominadas de ligações
glicosídicas, podem ou não ser ramificados e ter comprimento variável de suas cadeias.
São classificados como homo- ou heteropolímeros, se formados por iguais ou diferentes
unidades monossacarídicas e, quando ligados covalentemente a outras moléculas orgânicas
como proteínas ou lipídios, formam os glicoconjugados. Os homopolímeros são,
geralmente, produzidos por uma só enzima ou por um sistema simples de enzimas,
entretanto, os heteropolímeros por conterem duas ou mais unidades monoméricas
diferentes são sintetizados por sistemas enzimáticos mais complexos (PAZUR, 1994;
NELSON; COX, 2000).
Os polissacarídeos são matérias renováveis, de fonte biológica,
biodegradáveis e, geralmente, não tóxicos. Pela capacidade de retenção de água, de formar
filmes e propriedades reológicas específicas essas moléculas têm sido aplicadas na
indústria (KUMAR et al., 2004; FREITAS et al., 2009), especialmente nos ramos
alimentício e farmacêutico (KUMAR; MODY; JHA, 2007; VIJAYENDRA et al., 2008).
Na indústria de alimentos podem ser utilizados como espessantes, estabilizantes,
emulsificantes, coagulantes, formadores de filmes, gelificantes, agentes de suspensão e
dispersantes (LOPES; ANDRADE; MANO, 1991; MAIA; PORTE; SOUZA, 2000;
ARAÚJO; ALVES, 2003; CUNHA et al., 2004; GÓMEZ et al., 2007).
Há um interesse crescente na produção de alimentos com baixas calorias
e com pouco aditivos, se saudáveis e atrativos. Neste contexto, a indústria de alimentos
procura por novos componentes que possam melhorar a textura e o “mouthfeel”, além de
promover uma alimentação saudável (PIERMARIA; CANAL; ABRAHAM, 2008).
21
Dessa forma, a exploração industrial necessita que os polissacarídeos
sejam sintetizados como moléculas com composição química e propriedades físicas
constantes e em quantidade suficiente para atender a demanda comercial (CANILHA et al.,
2006).
3.2 Exopolissacarídeos
Há na natureza plantas e microrganismos que secretam polissacarídeos,
denominados exopolissacarídeos (EPS). Polissacarídeos sintetizados por bactérias podem,
de acordo com sua localização celular, apresentar-se como constituintes da parede celular
(lipopolissacarídeos ou LPS), associados covalentemente à superfície celular
(polissacarídeos capsulares ou CPS), ou secretados para o meio extracelular
(exopolissacarídeos ou EPS). São classificados como homopolissacarídeos (ex. dextrana) e
heteropolissacarídeos (ex. gelana, xantana) (KUMAR et al., 2004; SOUZA; GARCIA-
CRUZ, 2004; CANILHA et al., 2006;).
Os EPS mais estudados são os de origem microbiana devido algumas
vantagens de obtenção em relação às outras gomas, tais como: produção independente de
condições climáticas, possibilidade de utilização de matérias-primas regionais, maior
rapidez na obtenção do produto acabado e necessidade de espaço relativamente pequeno.
Além disso, apresentam maior uniformidade em suas propriedades físico-químicas devido
à especificidade do microrganismo utilizado e à possibilidade de um rígido controle dos
parâmetros de fermentação, como pH, temperatura, taxa de aeração, velocidade de
agitação, tempo de fermentação e composição do meio de cultivo (SOUZA; GARCIA-
CRUZ, 2004).
Várias bactérias são isoladas e cultivadas para a produção comercial
desses polímeros, principalmente devido ao elevado grau de viscosidade das soluções
poliméricas (SUTHERLAND, 2001; BARBOSA et al., 2003), que têm sido utilizadas
como aditivos alimentares tais como a goma xantana, produzida pela bactéria
Xanthomonas campestris, gelana de Sphingomonas paucimobilis (PIERMARIA; CANAL;
ABRAHAM, 2008), alginatos bacterianos secretados por espécies de Pseudomonas e de
Azotobacter chrococcum, celulose bacteriana de Acetobacter xylinium, ácido hialurônico
de Streptococcus equii e succinoglucanas de Rhizobium (KUMAR et al., 2004; SINGH;
SAINI; KENNEDY, 2008). Alguns desses exopolissacarídeos microbianos, com suas
respectivas aplicações, são mostrados na Tabela 1.
22
Tabela 1. Organismos produtores de polissacarídeos bacterianos e suas aplicações.
Organismo
Polissacarídeo
Aplicações
Xanthomonas Xantana Agente estabilizante e espessante em
alimentos, tintas, pesticidas, detergentes,
cosméticos e fármacos.
Sphingomonas
paucimobilis
Gelana
Agente gelificante em alimentos,
principalmente em produtos à base de frutas.
Alcaligenes
faecalis var.
Myxogenes
Curdlana Modificação de textura, agente gelificante,
aumento da viscosidade e na produção de
alimentos com reduzido valor calórico.
Leuconostoc
mesenteroides
Dextrana Indústria de alimentos como estabilizante e
agente de viscosidade. Medicina humana e
veterinária como hipocolesterolêmico.
Zymomonas
mobilis
Levana Indústrias de alimentos por suas propriedades
estabilizantes e espessantes e indústria
farmacêutica como imunomodulador,
anticarcinogênico e hipocolesterolêmico.
Rhizobium
meliloti e
Agrobacterium
radiobacter
Succinoglucana Nas indústrias de alimentos e farmacêutica
como agente gelificante e matriz
imobilizadora de drogas, respectivamente.
Acetobacter Celulose Fibras naturais não-digeríveis e na medicina
humana como pele artificial temporária.
Pseudomonas
aeruginosa e
Azobacter
vinelandii
Alginatos Matriz imobilizadora para células viáveis e
enzimas. Matriz encapsulante para
fertilizantes, pesticidas e nutrientes em
plantas.
Streptococcus
equii e
Streptococcus
zooepidermicus
Ácido hialurônico
Indústrias de cosméticos como loções e
cremes hidratantes.
Adaptado de KUMAR, A.S.; MODY, K.; JHA, B., 2007
.
Segundo García-Ochoa e colaboradores (2000), a xantana é um polímero
cuja cadeia principal é formada por unidades β-
D
-glucopiranosídicas 4-O ligadas. Quatro
unidades de glucose não substituídas são alternadas por uma unidade de glucose ramificada
em 3-O por manose: ácido glucurônico: manose, constituindo unidades pentassacarídicas
repetitivas. É produzida pelo cultivo de Xanthomonas campestris em meio contendo
carboidratos e recebeu permissão de uso em alimentos pelo “Food and Drug
Administration”- FDA em 1969. No Brasil, a adição de xantana aos alimentos é permitida
23
desde 1965, pelo Decreto Lei nº 55.871, da Legislação Brasileira de Alimentos (CRUZ
PRADELLA, 2006). Comercialmente é o polissacarídeo microbiano mais utilizado, com
produção mundial anual de cerca de 30.000 toneladas, movimentando um mercado de
aproximadamente 408 milhões de dólares. As principais indústrias produtoras de goma
xantana são Kelco (EUA), Rhône-Poulenc (França), Pfizer (EUA) e Mero-Rousselot-
Santia (França) (CANILHA et al., 2006). A xantana é solúvel em água fria, produz
soluções de elevada viscosidade em baixas concentrações e suas soluções apresentam
excelente estabilidade à variação de temperatura (0 a 100 ºC), mantendo as características
de gel em ampla faixa de pH (1 a 13) e presença de sais (DIAZ; VENDRUSCOLO;
VENDRUSCOLO, 2004; LÓPEZ et al., 2004).
Na indústria de alimentos a goma xantana é utilizada nos molhos,
coberturas para saladas, catchup, produtos de confeitarias, produtos dietéticos, sucos de
frutas, sopas e caldos, entre outros, atuando como agente espessante, estabilizante,
suspensor e auxiliar de emulsificação, possibilitando a criação de novos produtos de
diferentes texturas (DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004).
O termo dextrana descreve uma grande classe de polímeros bacterianos
extracelulares, constituído por unidades α-
D
-glucopiranosídicas 6-O ligadas (CANILHA et
al., 2006). A enzima dextrana-sacarase é responsável pela síntese de dextrana em meio
contendo sacarose como fonte de carbono (HONORATO et al., 2005) e muitos
microrganismos sintetizam dextrana a partir de sacarose, entre eles várias bactérias,
especialmente Leuconostoc mesenteroides. O polímero de dextrana é metabolizado
naturalmente, não é tóxico e não provoca reações adversas no organismo; é utilizado na
indústria de alimentos como estabilizante e agente de viscosidade (CANILHA et al., 2006;
CRUZ PRADELLA, 2006).
Levana, um homopolímero constituído por unidades β-
D
-
frutofuranosídicas 6-O ligadas (BAE et al., 2008), é sintetizado por diferentes tipos de
bactérias durante a assimilação da sacarose, entre elas a Zymomonas mobilis. É obtido pela
transfrutosilação em meio fermentativo à base de sacarose, extrato de levedura e sais
minerais. O levana é utilizado nas indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica
(ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2005).
Gelana é um polissacarídeo complexo com estrutura molecular
consistindo de unidades tetrassacarídicas repetitivas dispostas na sequência [β-(13)-
D
-
glucose-
β-(14)-
D
-glucuronato-β-(13)-
D
-glucose-α-(14)-
L
-ramnose]. É produzido
pela bactéria Sphingomonas paucimobilis, anteriormente denominada de Pseudomonas
24
elodea, gram-negativa, aeróbia e de pigmentação amarela (BANIK; KANARI;
UPADHYAY, 2000). Segundo Yamamoto e Cunha (2007) o gelana possui boa
estabilidade em ampla faixa de pH, produzindo um gel termorreversível que vem
substituindo o ágar (SUTHERLAND, 1998). Devido à estabilidade em pH ácido, a goma
gelana vem sendo utilizada pela indústria de alimentos, principalmente em produtos a base
de frutas (CANILHA et al., 2006; FREITAS et al., 2006). Tais características
proporcionam sua aplicação como estabilizante, emulsificante, texturizante e agente
gelificante. Além disso, oferece diversas vantagens sobre outras gomas, pois soluções com
concentrações entre 0,1 a 0,3 % são suficientes para formação de géis (AROCKIASAMY;
BANIK, 2008).
Outros tipos de bactérias podem sintetizar diferentes EPS sob condições
fisiológicas apropriadas, como a curdulana, de peso molecular relativamente baixo
(VILLAIN-SIMONNET, 2000).
O curdulana é um homopolímero neutro, produzido pelas bactérias
Alcaligenes faecalis variedade myxogenes, formado por unidades β-
D
-glucopiranosídicas
3-O ligadas (FUNAMI; NISHINARI, 2007). A goma curdulana possui a propriedade de
formar dois diferentes tipos de géis de acordo com a temperatura de aquecimento: um
termorreversível, denominado “low-set”, é formado quando suspensões aquosas do
polímero são aquecidas em temperaturas entre 50 ºC e 60 ºC e resfriadas a temperaturas
inferiores a 40 ºC, o outro, denominado “high-set”, se forma quando suspensão aquosa de
curdulana é aquecida em temperaturas superiores a 80 °C, se caracterizando como um gel
firme, resistente, não termorreversível e bastante estável em uma ampla faixa de
temperatura de congelamento (FUNAMI et al., 1999; CUNHA et al., 2004).
Segundo Cunha e colaboradores (2004), curdulana é um hidrocolóide
microbiano que apresenta propriedades físico-químicas interessantes do ponto de vista
industrial, tendo potencial para ser utilizado como aditivo alimentar, contribuindo para a
melhoria da estabilidade e da qualidade de inúmeros produtos alimentícios.
3.3 Exopolissacarídeos produzidos por bactérias do gênero Rhizobium
Na natureza, algumas espécies microbianas são capazes de secretar
polissacarídeos para o meio ambiente que podem, por exemplo, auxiliar na aderência do
microrganismo patogênico durante a infecção em uma planta ou animal (SUTHERLAND,
1998). Dentre essas, bactérias do gênero Rhizobium infectam as raízes de plantas
25
leguminosas desenvolvendo uma relação simbiótica com o hospedeiro, formando nódulos
onde realizam a fixação de nitrogênio, um processo pelo qual o nitrogênio molecular
inorgânico da atmosfera (N
2
) é incorporado inicialmente como amônia e depois, em
compostos orgânicos de uso dos organismos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Neste
processo grandes quantidades de polissacarídeos extracelulares são sintetizados pelos
rizóbios; essas moléculas têm diferentes funções biológicas (MARCZAK et al., 2008), tais
como sinais moleculares durante a invasão nodular da planta. A espessa camada hidratada
de EPS que reveste a bactéria oferece proteção contra dessecação e impede a remoção
mecânica do microrganismo. Os exopolissacarídeos também participam da formação de
estruturas celulares que facilitam o contato entre os organismos e auxiliam o processo de
infecção na planta (SERRATO et al., 2008).
Um exemplo típico dessa interação envolve a bactéria gram-negativa do
solo Sinorhizobium meliloti e seu hospedeiro, alfafa. O microrganismo secreta diferentes
substâncias e, entre elas, dois grupos de exopolissacarídeos denominados succinoglucana e
galactoglucana que são necessários para a invasão da bactéria e para formação do nódulo
fixador de nitrogênio (SHARYPOVA et al., 2006; SERRATO et al., 2008).
Isolados de Rhizobium huakuii retirados de nódulos de raízes de
Astragalus sinicus produziram um EPS composto de glucose, galactose, ribose e ácido
glucurônico na proporção de 5:1:1:1. Os resultados de experimentos de degradação com
enzimas capazes de hidrolisar succinoglucanas e análises de metilação sugeriram que a
cadeia principal desse EPS tem estrutura química comum aos exopolissacarídeos
produzidos por Agrobacterium sp e Rhizobium meliloti (HISAMATSU et al., 1997).
Succinoglucana é um polissacarídeo extracelular secretado por isolados de Rhizobium,
Agrobacterium e espécies relacionadas a microrganismos de solo (RIDOUT et al., 1997).
Pesquisas mostram que a invasão nodular por Rhizobium meliloti está
relacionada à presença do exopolissacarídeo (LEIGH et al., 1987; LYNNE et al., 1993).
Rhizobium meliloti e Agrobacterium sp produzem polissacarídeos (succinoglucana),
denominada tipo I, com cadeia principal comum contendo unidades de glucose e galactose
(HISAMATSU et al., 1980). Já linhagens de Rhizobium leguminosarium produziram
polissacarídeos denominados tipo II com cadeia principal formada de unidades de glucose
e ácido glucurônico (AMEMURA et al., 1983). Espécies de Rhizobium e Agrobacterium
também produzem glucanas cíclicas do tipo β (12), cuja função biológica parece estar
relacionada com a interação de plantas e bactérias (BREEDVELD et al., 1994).
26
Levery e colaboradores (1991) mostraram que linhagens normais de R.
meliloti produzem um EPS (succinoglucana) formado por unidades repetitivas
octassacarídicas, com algumas substituições por acetil e succinil. Mutantes de R. meliloti
secretaram um outro exopolissacarídeo, denominado EPSb, capaz de formar nódulos para
fixação de nitrogênio em alfafa, entretanto foram incapazes de produzir succinoglucana.
Evidenciaram também que o EPSb pode executar a mesma função biológica natural que a
succinoglucana de R. meliloti, consideravelmente mais complexo que o EPSb. Entretanto,
as duas estruturas têm uma característica comum que é a presença do dissacarídeo β-Glc-
(13)-Gal, o qual poderia representar o ponto de reconhecimento no processo de invasão
nodular.
Castellane e Lemos (2007) avaliaram o efeito de diferentes fontes de
carbono na composição dos exopolissacarídeos produzidos por Rhizobium tropici SEMIA
4077 e SEMIA 4080 e observaram predominância de unidades de glucose e galactose com
variações nas proporções dos monossacarídeos encontrados. Também foram observados
traços de manose, ramnose, ácido glucurônico e ácido galacturônico.
Guentas e colaboradores (2001) avaliaram a estrutura molecular do
exopolissacarídeo produzido por uma estirpe de Rhizobium sp. B. isolada de nódulos de
alfafa. Glucose e ramnose (1:2) foram os principais constituintes, com traços de ácido 2-
deoxi-
D
-arabino hexurônico, caracterizando-se como um EPS diferente daqueles
produzidos por outras estirpes de Rhizobium. A estrutura química da unidade repetitiva do
EPS produzido pelo Rhizobium sp. B é semelhante à cadeia principal dos polissacarídeos
pertencentes à família das gomas gelanas, conhecidas como bons agentes espessantes.
Considerando que grande parte dos exopolissacarídeos apresenta
características físico-químicas que permitem as suas aplicações nas indústrias de
alimentos, cosmética e farmacêutica, as etapas seguintes dessa revisão mostrarão como
determinar as características reológicas dessas moléculas, principalmente de
exopolissacarídeos bacterianos, enfoque deste trabalho.
3.4 Reologia
A reologia é a ciência que estuda a deformação e o fluxo dos materiais
sob influência de tensões. Dentro deste contexto, a matéria pode estar no estado líquido,
sólido ou gasoso (BRETAS; D’ÁVILA, 2005; DAK; VERMA; JAAFFREY, 2007).
Segundo Schramm (2006), sólidos ideais deformam-se elasticamente e a energia necessária
27
para a deformação é completamente recuperada quando a tensão é removida. Fluidos ideais
como líquidos e gases deformam-se irreversivelmente, eles escoam e, neste caso, a energia
requerida para a deformação é dissipada dentro do fluido na forma de calor e não pode ser
recuperada simplesmente pela remoção das tensões.
A reologia considera dois materiais como ideais: o sólido elástico e o
líquido viscoso. No sólido elástico a propriedade de maior interesse é a elasticidade, ou
seja, um material com forma definida quando deformado por uma força externa, dentro de
certos limites, retornará à sua forma e dimensões originais, após a remoção dessa força. Já
no líquido viscoso a propriedade de maior interesse é a viscosidade, que tem como
característica não possuir forma definida, escoando irreversivelmente com a aplicação de
uma força externa (BRETAS; D’ÁVILA, 2005).
3.4.1 Propriedades dos fluidos
Isaac Newton foi o primeiro cientista a expressar a lei básica da
viscosimetria, descrevendo o comportamento de fluxo de um liquido ideal (Equação 1) no
qual τ é a tensão de cisalhamento, η é a viscosidade dinâmica ou aparente e é a taxa de
cisalhamento ou deformação.
τ = η . (
Equação 1
)
A deformação dos fluidos pode ser estudada a partir da realização de uma
força contínua a uma taxa constante. Essa condição pode ser idealizada com a utilização de
duas placas paralelas com o fluido colocado no espaço entre elas, como mostra a figura 1.
A placa inferior é fixa e a superior se move a uma velocidade constante.
A tensão de cisalhamento refere-se à força aplicada tangencialmente sobre
uma área e sua unidade é o Pascal (Pa = N/m
2
). Considerando-se o modelo no qual um
fluido é mantido entre duas placas paralelas, onde a superior é móvel e a inferior
estacionária, ao se aplicar paralelamente uma força F na placa superior, a velocidade do
fluxo gerado é máxima na camada ligada diretamente à placa móvel e decresce
paralelamente através das camadas adjacentes do fluido, até chegar a zero na camada
ligada à placa estacionária. Isso ocorre devido à resistência interna do fluido, ou seja, sua
viscosidade (SCHRAMM, 2006).
28
O fluxo de líquidos em camadas paralelas infinitamente finas que
deslizam umas sobre as outras, arrastando consigo as camadas adjacentes, é chamado de
fluxo laminar. Com o tempo, as camadas líquidas sofrem deformação e a velocidade com a
qual a deformação aumenta em relação ao tempo é chamada de taxa de deformação ou
cisalhamento e sua unidade é s
-1
. Matematicamente, a taxa de deformação é definida pela
velocidade relativa das camadas líquidas dividida pela distância entre elas, indicando a
rapidez com que o líquido flui ao se aplicar uma tensão de cisalhamento sobre ele
(NAVARRO, 1997).
A propriedade física de um líquido de resistir ao fluxo induzido pela
tensão aplicada (cisalhamento) é descrita pela viscosidade. Ela é dependente da natureza
físico-química da substância, da temperatura, da pressão, da taxa de deformação e do
tempo (SCHRAMM, 2006). Fluidos altamente viscosos requerem maior força para se
mover do que materiais menos viscosos (BRETAS; D’ÁVILA, 2005). A viscosidade pode
ser medida pela fórmula matemática apresentada na equação 2, na qual η é a viscosidade
dinâmica ou aparente, τ é a tensão de cisalhamento e é a taxa de cisalhamento ou
deformação, tendo como unidade N/ m
2
.s, que equivale à Pa.s.
η = τ/
(Equação 2)
Figura 1 – Fluxo entre duas placas paralelas (SCHRAMM, 2006).
29
3.4.2 Líquidos Newtonianos
Para fluidos que seguem a lei de Newton da viscosimetria, a viscosidade
não varia com as mudanças na taxa de deformação, ou seja, a viscosidade é uma constante
da relação entre a tensão e a taxa de deformação. Esses líquidos são conhecidos como
líquidos Newtonianos e a água é um deles (TOSIN, 2008).
Newton assumiu que o gráfico equivalente à equação 1 para um líquido
ideal seria uma linha reta, com início na origem da curva de fluxo (τ x ), e que esta reta
subiria com uma inclinação de ângulo α (Figura 2). Qualquer ponto desta reta define pares
de valores para τ e . Dividindo um pelo outro se obtém o valor de η (Equação 2). Como a
curva de fluxo para um líquido ideal é uma reta, a razão de todos os pares de valores de τ e
pertencentes a essa reta é constante (Figura 2). Isso significa que a viscosidade (η) não é
afetada por mudanças na taxa de deformação. Todos os líquidos para os quais essa
afirmativa é verdadeira são chamados de líquidos Newtonianos, é o caso de líquidos puros,
soluções verdadeiras diluídas e poucos sistemas coloidais. Ex: água, óleo mineral, etc.
(SCHRAMM, 2006).
3.4.3 Líquidos não-Newtonianos
Todos os outros líquidos que não exibem comportamento de fluxo
‘‘ideal’’ são chamados de não-Newtonianos (Figura 2).
Fluidos não-Newtonianos viscoelásticos podem ser descritos como
aqueles que apresentam, simultaneamente, propriedades de fluidos (viscosas) e de sólidos
(elásticas). Já os fluidos não-Newtonianos inelásticos são todos aqueles que, de alguma
maneira não se comportam de acordo com a relação descrita pela Equação 1, quando são
submetidos a uma deformação (TONELI; MURR; PARK, 2005).
Os líquidos não-Newtonianos, sob certas condições de tensão e taxa de
deformação, independentemente do tempo (a viscosidade não depende da duração da taxa
de deformação), podem ter comportamento de fluxo pseudoplástico (shear thinning),
dilatante (shear thickening) ou plástico, conforme Figura 2.
30
Figura 2 – Vários tipos de comportamento de fluxo (SCHRAMM, 2006).
As propriedades físico-químicas de exopolissacarídeos microbianos são
explicadas em termos de diferentes comportamentos reológicos (Figura 3) os quais
incluem comportamento de fluxo pseudoplástico, elasticidade, tixotropia e
viscoelasticidade (KUMAR; MODY; JHA, 2007) .
Figura 3 – Esqiuema de classificação do comportamento reológico de fluidos (TONELI; MURR;
PARK, 2005).
31
Os líquidos pseudoplásticos apresentam uma diminuição da viscosidade
com o aumento da taxa de deformação, que depende principalmente da
orientação/alinhamento de moléculas ou partículas na direção do fluxo, superando o
movimento Browniano de moléculas. Em taxas de deformação muito baixas, o movimento
Browniano das moléculas as mantêm em uma ordem interna irregular, sem alteração
significativa da estrutura tridimensional, apesar dos efeitos iniciais da orientação de
cisalhamento. Deste modo, o líquido apresenta um comportamento semelhante ao dos
líquidos Newtonianos, com a viscosidade independente da taxa de deformação. Quando o
cisalhamento excede o efeito aleatório do movimento Browniano, a viscosidade cai
drasticamente pela indução do alinhamento das moléculas na direção do fluxo. Em taxas de
deformação extremamente altas, a viscosidade se aproxima de um nível finito constante.
Taxas de deformação ainda maiores não são mais capazes de reduzir a viscosidade, pois o
ótimo da orientação/alinhamento das moléculas foi alcançado. Este alinhamento se perde
quando o cisalhamento diminui ou é interrompido. Dentre os líquidos pseudoplásticos
estão diversas substâncias de alta importância técnica e comercial, tais como soluções
poliméricas, emulsões, suspensões ou dispersões (VRIESMANN, 2008).
Os fluidos pseudoplásticos, durante o escoamento, podem apresentar três
regiões distintas de taxas de deformação: baixa, média e alta, como mostra a figura 4. Na
região newtoniana ou de baixas taxas de deformação, a viscosidade aparente (ηo), chamada
de viscosidade limitante à taxa de deformação zero, não varia com a taxa de deformação
aplicada. Na região de taxas de deformação médias, a viscosidade aparente (η) diminui
com o aumento da taxa de deformação (comportamento pseudoplástico) e, na região de
altas taxas de deformação, a viscosidade aparente (η∞) volta a ficar constante e é chamada
de viscosidade limitante a taxas de deformação infinitas (TONELI; MURR; PARK, 2005).
32
Figura 4: Reograma idealizado para um fluido pseudoplástico (adaptado de
TONELI; MURR;
PARK, 2005
).
Os líquidos dilatantes mostram um aumento da viscosidade quando a taxa
de deformação aumenta, pois as partículas exigem um espaço maior para o movimento e,
havendo líquido disponível para ocupar os novos espaços, o fluido se dilata (TONELI,
MURR, PARK, 2005).
Os fluidos plásticos não fluem até que uma tensão de cisalhamento crítica
(yield point) seja excedida. O sistema em repouso apresenta um caráter sólido, com uma
viscosidade extremamente alta em razão das forças das ligações intermoleculares, as quais
restringem mudanças de posição de elementos de volume, e impedem o fluxo. Quando a
força externa excede as forças das ligações, verifica-se um ponto de ruptura, no qual a
estrutura entra em colapso, os elementos de volume podem mudar de posição
irreversivelmente, o sólido se torna líquido e começa a fluir. Em outras palavras, a
plasticidade descreve líquidos pseudoplásticos com limite de escoamento, tais como graxa,
massas para batom, pasta de dentes e borrachas naturais (SCHRAMM, 2006; TOSIN,
2008).
3.4.4 Modelando o comportamento reológico de fluidos
A modelagem provê meios para representar uma larga quantidade de
dados reológicos em termos de uma simples expressão matemática. Muitas formas de
equações são possíveis, no entanto, um modelo geral que se aplique a todas as situações
não existe. Normalmente utilizam-se modelos de dois e três parâmetros para o ajuste de
33
dados reológicos, sendo os mais utilizados Lei da Potência (Ostwald-de-Waele) e Casson
de dois parâmetros e Herschel-Bulkley de três parâmetros (PELEGRINE et al. 2002).
3.4.4.1 Modelo de Ostwald-de-Waele (Lei da Potência):
A equação 3 representa a chamada Lei da Potência, na qual K é o
coeficiente de consistência e n é o índice de comportamento de fluxo. O valor de n é uma
medida da “pseudoplasticidade” do polímero (BRETAS; D’ÁVILA, 2005). O desvio de
“n” da unidade indica o grau de desvio do comportamento newtoniano, sendo que, se n < 1
o comportamento é pseudoplástico e, se n > 1, dilatante (TONELI; MURR; PARK, 2005)
τ = K .
n
( Equação 3)
K = Coeficiente de consistência (Pa.s)
n = Índice de comportamento (adimensional)
= Taxa de deformação (s
-1
)
τ = Tensão de cisalhamento (Pa)
Este modelo tem sido adotado como ideal para interpretar o
comportamento do purê de pêssego (TORALLES; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO,
2006) e polpa de manga (VIDAL et al., 2006).
3.4.4.2 Modelo de Herschel-Bulkley:
É uma forma modificada do modelo proposto por Ostwald-de-Waele,
conforme ilustra a equação 4. Como é possível observar, esse modelo difere da Lei da
Potência apenas pela existência da tensão de cisalhamento inicial (τ
0
) (FERREIRA;
GUIMARÃES; MAIA, 2008), ou seja, uma vez que a tensão aplicada ao fluido ultrapasse
o valor da tensão inicial, o material passa a se comportar de acordo com o modelo da Lei
da Potência.
34
τ = τ
0 +
K .
n
(Equação 4)
K = Coeficiente de consistência (Pa.s)
n = Índice de comportamento (adimensional)
= Taxa de deformação (s
-1
)
τ = Tensão de cisalhamento (Pa)
τ
0
= Tensão de cisalhamento inicial (Pa)
Segundo Cabral e colaboradores (2002) este modelo descreve os melhores
parâmetros estatísticos para polpa de cupuaçu.
3.4.4.3 Modelo de Casson:
Casson (1959) elaborou esse modelo para uma suspensão de partículas
interagindo num meio newtoniano, obtendo expressão matemática correspondente à
equação 5. É usado para fluidos que só iniciam o processo de escoamento quando a tensão
de cisalhamento aplicada supera uma tensão inicial, que é própria de cada material
(HAMINIUK, 2007). Tem sido adotado como método ideal para interpretar o
comportamento do chocolate pelo “International Office of Cocoa and Chocolate”
(BRANCO; GASPARETTO, 2005).
τ
1/2
= K
oc
+ K
c
1/2
(Equação 5)
τ = Tensão de cisalhamento (Pa)
= Taxa de deformação (s
-1
)
K
oc
= Tensão inicial do modelo de Casson (Pa)
K
c
= Viscosidade plástica de Casson (mPa.s)
3.4.5 Viscoelasticidade e soluções poliméricas
A grande maioria dos fluidos apresenta um comportamento reológico que
os classifica entre os líquidos e sólidos: eles são chamados de viscoelásticos. Deste modo,
a viscosidade e a elasticidade são duas possibilidades de resposta à tensão a que são
submetidos. O comportamento sólido (distensão) ou líquido (fluxo) vai depender das
características relacionadas ao tempo natural de relaxação e ao tempo de duração do
experimento (SCHRAMM, 2006).
35
No estudo do comportamento viscoelástico dos sistemas reais de
polissacarídeos, os caracteres sólido e líquido podem ser quantificados, respectivamente,
através dos módulos de armazenamento (G’) e de perda (G”), em função da frequência,
ambos expressos em Pascal (Pa), e que são componentes do módulo complexo (G*), que
representa a resistência total à deformação.
O módulo de armazenamento, G’, também denominado módulo elástico, é
a razão entre a tensão aplicada e a deformação provocada em fase e indica que a energia de
tensão é armazenada temporariamente durante o teste e pode ser recuperada mais tarde. O
módulo de perda, G”, também denominado módulo viscoso, é a razão entre a tensão
aplicada e a deformação provocada fora de fase; faz alusão ao fato de que a energia usada
para iniciar o fluxo é irreversivelmente dissipada ou perdida, sendo transformada em calor
de cisalhamento. O módulo complexo (G*), por sua vez, pode definir uma viscosidade
dinâmica complexa η*, considerada análoga da viscosidade absoluta η, sendo a razão entre
o G* e a frequência (f). A frequência, expressa em Hertz (Hz), pode ser considerada como
análoga da taxa de deformação ( ) (SCHRAMM, 2006; TORRES et al., 2006).
Em uma varredura de frequência, a deformação é aumentada passo a
passo. A figura 5 ilustra a representação gráfica para sistemas polissacarídicos submetidos
a medidas reológicas dinâmicas.
Figura 5 - Representação gráfica genérica de sistemas polissacarídicos submetidos a medidas
reológicas dinâmicas. a) gel forte b) solução concentrada ou gel fraco e c) solução diluída
(TABILO-MUNIZAGA; BARBOSA-CÁNOVAS, 2005; SCHRAMM, 2006).
36
Quando o módulo G’ é maior que G”, em toda faixa de frequência
utilizada no experimento (Figura 5a), apresenta uma resposta predominantemente sólida, e
ambos os módulos G’ e G” são essencialmente independentes da frequência na região de
viscoelasticidade, como esperado para uma rede elástica. Quanto maior o valor de G’,
maior é o caráter sólido do gel e as deformações serão elásticas ou recuperáveis. A
viscosidade dinâmica complexa η* diminui linearmente com o aumento da frequência
(TORRES et al., 2006; ZHANG et al, 2008), tratando-se, portanto, de um gel forte.
Soluções concentradas de polímeros ou géis fracos apresentam
comportamento de fluxo semelhante ao de um líquido, em baixas frequências, onde há
predomínio de G” devido a reorganização da rede (Figura 5b). Quando a frequência vai
aumentando em relação à reorganização molecular, ocorre distorção da rede, com G’
aumentando mais rapidamente que G”. Desta forma, os módulos tornam-se praticamente
iguais e se cruzam em determinado ponto, chamado de ponto de gelificação, a partir do
qual G’ torna-se maior que G” e há predomínio do caráter sólido (XU; LIU; ZHANG,
2006).
O comportamento típico de uma solução polimérica diluída é
demonstrado na figura 5c, na qual o módulo G’ é significativamente mais baixo que o
módulo G”, e ambos tendem a zero quando a frequência tende a zero. A viscosidade
dinâmica complexa η* apresenta um comportamento essencialmente linear com o aumento
de frequência (CHAMBERLAIM; RAO, 1999).
O estudo do acompanhamento das variações de G’ e G” e η* com a
variação da frequência permite caracterizar o comportamento viscoelástico dos sistemas
polissacarídicos e essas informações são importantes para se conhecer a força de um gel.
3.5 Algumas características reológicas de polissacarídeos ácidos
As características físico-químicas de polissacarídeos são dependentes da
seqüência em que os açúcares estão dispostos na molécula, da forma como suas cadeias
interagem e da presença de resíduos iônicos carregados encontrados nas ramificações. As
cargas existentes nos grupos funcionais ácidos, presentes na estrutura, atuam na
conformação molecular e aumentam a solubilidade do biopolímero (KUMAR; MODY;
JHA, 2007).
Kaci e colaboradores (2005) isolaram e identificaram um EPS produzido
por uma estirpe de Rhizobium, de solos áridos, como um polímero formado por glucose,
37
galactose e ácido manurônico na proporção molar de 2:1:1. Análises reológicas mostraram
que as soluções do polissacarídeo têm comportamento de fluido pseudoplástico, sendo
utilizado como agente espessante, com propriedades polieletrolíticas.
Segundo Beyer e colaboradores (1987), soluções a 1 % do EPS produzido
por Rhizobium CB744 quando submetidas à temperatura de 65 ºC e elevadas taxas de
deformação, apresentam um decréscimo da viscosidade. A diminuição da viscosidade com
o aumento da taxa de deformação e temperatura é uma característica comum aos
biopolímeros bacterianos (SHIMADA; NAKATA; NAKAMURA, 1997).
Shimada e colaboradores (1997) avaliaram o efeito da concentração de
NaCl na viscosidade intrínseca do exopolissacarídeo ácido produzido por Enterobacter sp.
Observaram uma diminuição nos valores da viscosidade intrínseca com o aumento da
concentração de NaCl, o que é característico de polieletrólitos. Polissacarídeos ácidos
como as gomas xantana, gelana e karaya são típicos polieletrólitos.
PINTO e colaboradores (2002) também estudaram a viscosidade do
biopolímero acídico produzido pela bactéria Beijerinckia sp em solução de CaCO
3
e KCl,
em diferentes valores de pH. Na maior parte dos resultados houve uma diminuição da
viscosidade das suspensões aquosas analisadas.
Árvores do gênero Sterculia secretam polissacarídeos ácidos que formam
soluções de alta viscosidade e com características gelificantes. O polímero de Sterculia
striata é acetilado e tem como principais constituintes galactose e ramnose, além de ácidos
glucurônico e galacturônico. A adição de NaCl às soluções polissacarídicas de S. striata
em diferentes concentrações, resulta na diminuição da viscosidade intrínseca com o
aumento da força iônica. Assim como observado para a gelana, a diminuição nos valores
da viscosidade intrínseca com o aumento da concentração de NaCl confirma o
comportamento de polieletrólito do polissacarídeo de S. striata e a cadeia torna-se mais
flexível com o aumento da concentração de sal (BRITO et al., 2004).
BRITO e colaboradores (2005) estudaram o comportamento reológico, em
sistema dinâmico, do polissacarídeo chichá, produzido por Sterculia striata, e da goma
karaya. Observaram que a goma karaya forma géis mais fortes e com pequenas variações
conformacionais com o aumento da temperatura, entretanto, a adição de NaCl diminui a
força dos géis de ambos os polissacarídeos.
Yamazaki, Kurita e Matsumura (2009) avaliaram o hidrocolóide acídico
extraído de folhas de Corchorus olitorius L., o qual demonstrou um caráter de gel em
concentrações acima de 5 g/L. A viscosidade deste polímero foi maior do que a das gomas
38
guar e locuste, nas mesmas condições. Sob aquecimento, acima de 60 ºC houve aumento
irreversível da viscosidade, sugerindo mudança conformacional nas moléculas deste
polissacarídeo.
A adição de sais inorgânicos às soluções polissacarídicas pode
promover modificações, aumentando ou diminuindo a viscosidade das soluções (DIAZ;
VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004).
As propriedades reológicas das soluções de xantana são dependentes da
concentração do polímero e de qualquer eletrólito adicionado (MARTÍNEZ-
RUVALCABA; CHORNET; RODRIGUE, 2007). A adição de eletrólito reduz o valor do
módulo elástico quando comparado com medidas de solução aquosa de xantana. Este
comportamento é típico de polieletrólitos e pode ser atribuído ao resultado da mudança na
conformação, causando uma diminuição no volume hidrodinâmico e decrescendo os
valores dos parâmetros reológicos. Acima da concentração crítica, a adição de eletrólito
pode induzir a um aumento nos valores dos parâmetros reológicos por associações
intermoleculares, facilitadas pela redução das repulsões eletrostáticas e ordenação das
cadeias, conduzindo a uma rede tridimensional (PELLETIER et al., 2001). A exploração
da goma xantana pela indústria de alimentos se deve, principalmente, ao seu
comportamento não-Newtoniano e formação de soluções pseudoplásticas em baixas
concentrações (SHOBHA; THARANATHAN, 2009).
As propriedades das soluções de polissacarídeos podem ser modificadas
por interação com outros polissacarídeos, alterando assim as propriedades reológicas das
soluções. A goma xantana, por si só, não é capaz de formar um gel forte, mas forma um gel
termorreversivel quando em presença de outro polissacarídeo, como galactomananas
(BRESSOLIN et al., 1998) e a quitosana a qual o gel resultante apresenta uma boa textura,
é elástico e resistente ( MARTÍNEZ-RUVALCABA; CHORNET; RODRIGUE, 2007).
A maioria das aplicações práticas dos polissacarídeos envolve a
habilidade dessas moléculas em alterar as propriedades físicas do meio onde se encontram,
seja por conferir alta viscosidade às soluções ou por criar redes intermoleculares coesivas.
A formação de géis é um processo muito importante, pois a estrutura do gel influencia o
processamento dos mais diversos produtos (VRIESMANN, 2008).
Nas áreas da ciência dos alimentos, a reologia possui grande importância.
Segundo Haminiuk (2007), muitas das propriedades texturais que os humanos percebem
quando consomem alimentos são basicamente de natureza reológica, isto é, cremosidade,
39
suculência, maciez, suavidade e dureza e, segundo Toneli e colaboradores (2005) os dados
reológicos em alimentos são essenciais para:
a) Cálculos em engenharia de processos, envolvendo grande variedade de
equipamentos, tais como bombas, tubulações, extrusores, misturadores, trocadores de
calor, dentre outros;
b) Determinação da funcionalidade de ingredientes no desenvolvimento
de produtos;
c) Controle intermediário ou final da qualidade de produtos;
d) Testes de tempo de prateleira;
e) Avaliação da textura de alimentos e correlação com testes sensoriais;
De acordo com Saude e colaboradores (2002), para que os
polissacarídeos possam ser aplicados na indústria há necessidade que algumas informações
sobre estrutura química e características físico–químicas, tais como o comportamento
reológico, sejam previamente conhecidos. Neste contexto, este trabalho teve como
principal objetivo realizar alguns estudos para determinar o comportamento reológico das
soluções formadas pelos exopolissacarídeos produzidos pelas diferentes estirpes de
bactérias do gênero Rhizobium e Mesorhizobium acreditando na possibilidade de aplicação
futura desta família de polímeros na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica.
40
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Microrganismos
Os exopolissacarídeos utilizados para as análises foram fornecidos pela
Professora Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos do Departamento de Tecnologia da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de Jaboticabal. Detalhes
das condições de cultivo dos microorganismos produtores dos EPS estão sob sigilo de
patente com registro PI0304053-4.
Três diferentes linhagens de bactérias do gênero Rhizobium foram
utilizadas para a produção dos exopolissacarídeos utilizados neste trabalho. Os EPS,
denominados R
1
e R
2
, foram produzidos a partir da mesma estirpe, Rhizobium tropici, com
diferenças nas condições de cultivo (dados não disponíveis), o que pode acarretar
diferenças na constituição química e, consequentemente, em suas propriedades físico-
químicas. O EPS R
3
foi produzido a partir de uma linhagem denominada Mesorhizobium e
o EPS R
4
a partir de uma estirpe selecionada conhecida como Rhizobium sp.
4.1.2 Reagentes
Os principais reagentes químicos utilizados para o preparo das soluções
e os experimentos foram de grau analítico, obtidos da Merck, Fluka ou Sigma.
4.1.3 Equipamentos
Balanças Analíticas Mettler Toledo AB204, Micronal e balanças
semianalíticas Gehaka BG-440 e Gehaka BG-2000
Cromatógrafo Líquido de Troca Iônica (HPAEC) com detector
Eletroquímico modelo ED 40, Bomba Gradiente modelo GP 40 e Integrador modelo 4600
da Dionex
Liofilizador modelo E.C, Edwards
Estufa incubadora Nova Ética 411D
Evaporador Rotativo Buchi, modelo R-114, e banho-maria Buchi,
modelo B-480
41
Microcentrífuga Beckman
Espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-VIS 1601
Destilador marca Quimis
Deionizador Water Pro PS, Labconco
Cromatógrafo de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC)
SHIMADZU, equipado com um detector de índice de refração diferencial SHIMADZU
modelo RID 10A
Reômetro HAAKE RS75 Rheostress acoplado a um banho
termostatizado HAAKE K15, a um termocirculador de água DC5B3 e sistema Peltier
(TC81).
4.2 Métodos gerais
4.2.1 Preparo das amostras para análises
Os polissacarídeos foram disponibilizados secos e moídos (Figura 8). Em
seguida solubilizados em água deionizada e dialisados contra água corrente por 48 horas e
contra água destilada por 24 horas, para a retirada de sais provenientes do meio de cultivo.
Após diálise exaustiva (72 horas) os EPS foram liofilizados. Alíquotas de 5 mg foram
retiradas, solubilizadas em água destilada e submetidas às análises descritas a seguir.
4.2.2 Análises quantitativas nos EPS R
1
, R
2
, R
3
e R
4
4.2.2.1 Determinação de açúcares totais - método do fenol - ácido sulfúrico
O método de fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS; GILLES; HAMILTON,
1956) foi utilizado para determinar a concentração de carboidrato total nos respectivos EPS
(R
1
, R
2
, R
3
e R
4
). O método consiste na formação do derivado furfural, na presença de
H
2
SO
4
concentrado, que reage com o fenol formando um complexo de cor alaranjada. Foi
seguido o protocolo original do método, conforme descrito:
Reagentes: Solução de fenol 5 % (m/v), H
2
SO
4
concentrado.
Procedimento: foi adicionado 0,5 mL da solução de fenol a 0,5 mL da
amostra e, em um único jato, foram adicionados 2,5 mL de H
2
SO
4
concentrado. Após 10
minutos em repouso, foi feita a leitura espectrofotométrica a 480 nm.
42
Para calcular a concentração de carboidratos, foi realizada uma curva
padrão de glucose (0,1 %), com faixa de sensibilidade de 10 a 100 µg.
4.2.2.2 Determinação dos açúcares redutores - método de Somogyi – Nelson
A presença de açúcar redutor nas amostras foi determinada pelo método
de Somogyi (1945) e Nelson (1944). Neste método, os açúcares redutores reduzem o
reativo cupro-alcalino de Somogyi formando óxido cuproso, que na presença do reativo
arseno-molíbdico de Nelson forma um complexo de óxido de molibdênio de cor azul
estável.
Reagentes: reativo arseno-molíbdico de Nelson (NELSON, 1944) e
reativo de Somogyi (SOMOGYI, 1945).
Procedimento: a 0,5 mL da amostra contendo de 10 a 80 µg de açúcares
redutores foram acrescentados 0,5 mL do reativo de Somogyi. Os tubos foram cobertos
com pérolas de vidro, para evitar a evaporação do solvente, e levados ao aquecimento em
banho fervente por 10 minutos. Em seguida, foram resfriados e adicionados 0,5 mL do
reagente de Nelson e acrescentados 3,5 mL de água destilada. Os tubos foram agitados e
lidos em espectrofotômetro em 540 nm.
Para calcular a concentração de açúcares redutores nas amostras foi
usada uma curva padrão de glucose a 0,1%. A curva de calibração foi desenvolvida na
faixa de concentração de 10 a 100 µg, de acordo com a estimativa do teor de carboidratos
da amostra.
4.2.2.3 Determinação de proteínas - método de Bradford
A determinação da concentração de proteínas nas amostras foi realizada
pelo método de Bradford (1976) que se baseia na ligação do corante (Coomassie Blue G-
250) com a proteína, formando um complexo de cor azul. O corante reage
preferencialmente com resíduos de arginina e, em menor extensão, com resíduos de
histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenilalanina.
Solução estoque: 40 mg de Coomassie Blue G-250 foram dissolvidos em
20 mL de etanol absoluto. Foram adicionados 40 mL de acido fosfórico 85 % e água
destilada para completar 100 mL de solução.
43
Solução de uso: foi feita uma diluição (1:4, v/v) da solução estoque em
água e, em seguida, filtrada em papel de filtro.
Procedimento: foi adicionado 1 mL da solução com o corante a 100 µL
da amostra e em seguida foi feita a leitura em espectrofotômetro a 595 nm.
A concentração de proteína foi calculada através de uma curva de
calibração com albumina bovina (BSA), na faixa de concentração de 10 a 50 µg.
4.2.2.4 Determinação de ácidos urônicos - método de Blumenkrants modificado
A dosagem de ácido urônico foi realizada pelo método colorimétrico
descrito por Filisetti-Cozzi e Carpita (1991). Em 400 µL de amostra (100 µg/mL) foram
adicionados 40 µL de uma solução de ácido sulfâmico-sulfamato de potássio 4 M (pH 1,6)
e 2,4 mL de solução de tetraborato de sódio 75 mM, em H
2
SO
4
concentrado. Após
aquecimento em banho com H
2
O fervente por 20 min, esta mistura foi resfriada e
adicionados 80 µL da solução de m-hidroxi-bifenil (Sigma) a 0,15 % em NaOH 0,5 %,
para a produção do complexo colorido.
A coloração, estável até 1 hora após sua formação, foi lida em 525 nm. A
quantificação foi realizada com o auxílio de uma curva padrão de ácido glucurônico
(Sigma) dentro da sensibilidade do método (0,97 a 38,8 µg de ácido urônico).
4.2.3 Análise da homogeneidade por cromatografia de filtração em gel (HPSEC)
Para análise de homogeneidade foi preparada uma solução de 1mg de
amostra em 1mL de solução de cloreto de sódio (NaCl 0,9 %). As soluções obtidas foram
filtradas em membranas MILLIPORE (acetato de celulose) 0,22 µm.
As análises de homogeneidade foram realizadas em cromatógrafo de
exclusão estérica de alta pressão (HPSEC) SHIMADZU, equipado com um detector de
índice de refração diferencial SHIMADZU modelo RID 10A. Foram utilizadas 4 colunas de
gel permeação WATERS, com limites de exclusão de 1.10
6
, 4.10
5
, 8.10
4
e 5.10
3
, dispostas
em série. O eluente utilizado foi uma solução de nitrato de sódio (NaNO
3
0,1 M) contendo
azida sódica (0,03 %), pressão de 1422 Psi a 37 ºC e fluxo de 0,6 mL/min. Foi utilizado o
programa LC Solution (SHIMADZU CORPORATION) para analisar os dados obtidos.
44
4.2.4 Hidrólise ácida total
Preparo da amostra: alíquotas das amostras, contendo 50 µg de açúcares
totais, foram distribuídas em tubos próprios para hidrólise, congeladas e liofilizadas.
Hidrólise: a hidrólise ácida foi efetuada pela adição de 300 µL de ácido
trifluoracético (TFA) 5 M à amostra seca, a seguir cada amostra foi solubilizada, o tubo
selado e aquecido a 100 °C por 12 horas (VASCONCELOS et al., 2008). O ácido foi
removido por evaporação em evaporador rotativo (BUCHI – R 114), com consecutivas
trocas de H
2
0 deionizada até a evaporação total do ácido. As amostras foram solubilizadas
em 500 µL de H
2
0 deionizada, sendo posteriormente analisadas no cromatógrafo líquido de
alta pressão (HPAEC). As condições da análise cromatográfica foram efetuadas como
descrito por Mendes e colaboradores (2009).
4.2.5 Análise da composição de monossacarídeos por cromatografia líquida de alta
pressão e coluna de troca iônica (HPAEC)
Para análise dos monossacarídeos foi utilizado um sistema Dionex
DX500 (cromatografia líquida de íons) com detector de amperometria integrada (IAD). Os
cromatogramas foram registrados em um integrador modelo 4600. Os açúcares neutros
foram separados isocraticamente, usando uma coluna analítica CarboPac PA1 (4x250 mm)
equipada com guarda coluna PA1, e fluxo de 1 mL/min. As condições de eluição foram
produzidas utilizando H
2
O deionizada (eluente 1) e NaOH 200 mM (eluente 2) preparada a
partir de uma solução de NaOH 50 %.
A coluna foi regenerada após 25 min de corrida com 100% do eluente 2,
por 10 minutos. Em seguida retornou às condições iniciais da corrida por cerca de 15
minutos (para equilibrar a coluna), antes da injeção da amostra.
Procedimento: 25 µL da solução em estudo, contendo 1 µg de açúcares
totais, foram injetados no Dionex.
Padrões: foi utilizada como padrão uma mistura de açúcares neutros
contendo 200 ng/25 µL de cada um dos seguintes monossacarídeos: L-fucose, L-ramnose,
D-galactose, D-glucose e D-manose totalizando 1 µg/25 µL de açúcares totais.
45
4.3 Análises reológicas
As análises reológicas foram efetuadas em colaboração com a Professora
Dra. Joana Léa Meira Silveira do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Paraná.
4.3.1 Métodos reológicos
Foi utilizado um reômetro HAAKE RS75 Rheostress acoplado a um
banho termostatizado HAAKE K15 e termocirculador de água DC5B3 e a um sistema
controlador de temperatura, denominado sistema Peltier (TC81) (Figura 6). Os testes
foram conduzidos à temperatura de 25 °C para as análises em sistema estático e 5° C e 25
°C para as análises em sistema dinâmico; o sensor utilizado foi o cone-placa (C60/2Ti°).
Antecedendo as análises reológicas, foi efetuada a determinação da
inércia do aparelho com o sensor em posição de análise, a fim de descontar os valores das
forças centrífuga e centrípeta, geradas durante os experimentos. Este procedimento se
repetiu a cada troca de amostra. Os testes foram executados em duplicata, sendo efetuado
a triplicata quando os valores da duplicata se mostravam muito diferentes. Durante as
análises a temperatura ambiente foi mantida entre 20 e 21 °C.
46
Figura 6 – A) Reômetro HAAKE RS75 Rheostress; B) Sensor cone-placa (C60/2Ti°) ; C)
Amostra sobre a placa estacionária do reômetro; D) Exopolissacarídeo R
3
após varredura, a 25 °C.
4.3.2 Preparo das soluções dos exopolissacarídeos
Para os experimentos de reologia, os exopolissacarídeos (R
1
, R
2
, R
3
e R
4
)
foram individualmente solubilizados em água deionizada à temperatura de ± 20 °C, nas
concentrações de 2 g/L, 5 g/L e 10 g/L (Figura 7). As amostras foram mantidas sob
agitação mecânica constante, à temperatura de ±20 °C por 18 horas. Com o objetivo de
47
avaliar o comportamento reológico dos biopolímeros na presença de sais, os mesmos
foram solubilizados em NaCl 0,2 M na concentração de 5 g/L.
Figura 7. Soluções aquosas do EPS R
2
à temperatura de 25 ºC. (a) 5 g/L e (b) 10 g/L.
4.3.2.1 Determinação das viscosidades absolutas
O sensor cone-placa (C60/2Ti°) foi utilizado para analisar as soluções
poliméricas em concentrações de 2, 5 e 10 g/L. Este instrumento consiste de uma placa
plana inferior estacionária e um cone rotatório superior com diâmetro de 60 nm e ângulo
de 2º. O fluido permanece entre a placa e o cone, sem espalhar-se, devido à tensão
superficial, preenchendo inteiramente o espaço entre eles, de modo que as medições não
sejam alteradas. O cone atua em velocidades de deformação ( ) controladas, e o arraste
viscoso sob o cone rotativo exerce uma força de rotação que é proporcional à tensão de
cisalhamento (τ).
48
4.3.2.2 Curvas de fluxo
As curvas de fluxo (tensão de cisalhamento x taxa de deformação)
foram realizadas em modo CR (Controlled Rate Rheometers) a 25 ºC, com variação da
taxa de deformação ( ) de 0 até 200,0 s
-1
, no intervalo de tempo de 300 s para
concentrações de 2, 5 e 10 g/L, com aquisição de 200 pontos em escala logarítmica. As
amostragens foram realizadas em duplicata à temperatura de 25 °C. Quando os valores
encontrados para as duplicatas eram muito díspares, procedia-se a terceira análise ou a
triplicata. Os reogramas, para cada uma das seis concentrações de cada EPS, foram gerados
utilizando software RheoWin (versão 3.20).
Modelos de fluxo e parâmetros reológicos
Os modelos testados para estudar o comportamento de fluxo estão
resumidos na tabela 2.
Tabela 2 – Modelos ajustados e suas equações.
Modelo Equação Eqs.
Lei da Potência
τ
=
K
.
n
(1)
Herschel-Bulkley
τ
=
τ
0 +
K
.
n
(2)
Casson
τ
1/2
=
K
oc
+
K
c
1/2
(3)
Onde:
τ = Tensão de cisalhamento (Pa)
= Taxa de deformação (s
-1
)
τ
0
= Tensão de cisalhamento inicial (Pa)
K = Coeficiente de consistência (Pa.s)
n = Índice de comportamento (adimensional)
K
oc
= Tensão inicial do modelo de Casson (Pa)
K
c
= Viscosidade plástica de Casson (mPa.s)
Os parâmetros das Equações (1), (2) e (3) apresentados na tabela 2
foram estimados a partir do ajuste dos reogramas experimentais aos modelos da Lei da
Potência, Herschel- Bulkley e Casson.
49
A escolha do modelo adequado foi baseada em parâmetros estatísticos
do Coeficiente de regressão ou determinação (R
2
) e Chi-quadrado (χ
2
). O modelo
considerado mais apropriado é aquele com maiores valores de Coeficiente de regressão
(R
2
) e menores valores Chi-quadrado (χ
2
) (HAMINIUK et al., 2006).
4.3.3 Determinação da tixotropia em sensor cone-placa
A determinação da tixotropia foi efetuada em sensor cone-placa
(C60/2Ti°) nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, para cada EPS. Foi realizada a curva de
histerese (τ x ) na qual se verificou a subida (ascendente) da curva durante 300 s, e a
descida (descendente) também por 300 s, com taxa de deformação de 0 até 200,0 s
-1
, à
temperatura de 25 °C.
4.3.4 Análise oscilatória em sistema Dinâmico - Varredura de tensão e varredura de
frequência
Esta análise foi realizada com a solução polissacarídica nas
concentrações de 2, 5 e 10 g/L, sensor do tipo cone-placa (C60/2Ti°) em modo CS
(Controlled Stress Rheometers), com variação da amplitude da tensão de 0,01 Pa até
100,0 Pa.
Devido à faixa de viscoelasticidade linear ser dependente da freqüência,
inicialmente o teste foi realizado com a freqüência fixada em 1 Hz a fim de se determinar a
região viscoelástica linear das amostras, isto é, a região em que os módulos elástico (G’) e
viscoso (G”) permanecem lineares e paralelos, sem variação com o aumento da
deformação ( ).
Após determinar a deformação dentro da região viscoelástica linear das
amostras, foram realizadas as análises oscilatórias dinâmicas, por varredura de frequência,
numa amplitude de 10
-2
a 10
2
Hz. Foram medidos os valores dos módulos elástico (G’) e
viscoso (G”) em função da freqüência (f). Todas as análises foram efetuadas em duplicatas
na temperatura de 25 °C. Quando os valores encontrados para as duplicatas eram muito
díspares, procedia-se a terceira análise ou a triplicata.
50
4.3.5 Varredura de temperatura
Para conhecer a influência da temperatura sobre o comportamento
reológico das amostras, foram realizadas medidas no sistema oscilatório, com variações de
temperatura entre 5 a 95 °C (1,5 °C/min) por 60 minutos e de 95 °C para 5 °C, também por
60 minutos, frequência de 1 Hz e tensão de 0,6 Pa. Para essa análise utilizou-se o reômetro
citado no item 4.3.1, acoplado a um sistema controlador de temperatura, denominado
sistema Peltier (TC81). Todas as análises foram realizadas em duplicatas na concentração
de 5 g/L, para cada EPS. Quando os valores encontrados para as duplicatas eram muito
díspares, procedia-se a terceira análise ou a triplicata. Para prevenir a evaporação do
solvente foi aplicada uma camada de óleo mineral ao redor da placa de análise.
51
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Quantificação dos exopolissacarídeos
No processo de obtenção dos exopolissacarídeos (EPS) a determinação
dos parâmetros de fermentação (composição do meio de cultivo, o pH e a temperatura de
incubação) influencia na síntese, no rendimento e na composição das moléculas. Cada cepa
bacteriana difere em sua resposta ao efeito das mudanças ambientais e à fonte de carbono
utilizada que tem parte convertida pela célula microbiana em biopolímero (SOUZA;
GARCIA-CRUZ, 2004).
Os EPS utilizados neste trabalho foram fornecidos pela Profa. Dra.
Eliana Gertrudes de Macedo Lemos conforme descrito no item 4.1.1. Antes de todas as
análises os exopolissacarídeos foram, individualmente, dialisados (72 horas) em tubos de
12 KDa, concentrados a baixa temperatura (38 °C) e liofilizados (Figura 8). Foram
mantidos desta forma até o momento do uso.
Figura 8: (A) Ilustração do EPS R
1
seco e moído; (B) EPS R
1
dialisado e liofilizado.
Os exopolissacarídeos R
1
, R
2
, R
3
e R
4
foram quantificados para açúcares
totais e redutores, proteínas e ácidos urônicos. Os resultados das análises quantitativas são
mostrados na tabela 3.
52
Tabela 3 – Quantificações de açúcares totais e redutores, proteínas e ácido urônico dos
exopolissacarídeos produzidos por diferentes linhagens de bactérias do gênero Rhizobium e
Mesorhizobium.
Exopolissacarídeos/
Microrganismos
produtores
Açúcar
total (%)
Açúcar
redutor (%)
Proteína (%) Ácido
urônico (%)
R
1
(Rhizobium tropici)
94,6 0,10 3,0 2,4
R
2
(Rhizobium tropici)
94,1
0,11
4,2
1,7
R
3
(Mesorhizobium)
87,1
0,12
4,5
8,4
R
4
(Rhizobium sp.)
95,1
0,10
4,1
0,8
O teor de açúcares totais dos EPS ficou compreendido entre 87 % e
95 %. Os EPS R
1
e R
2
foram obtidos a partir do mesmo microrganismo (Rhizobium tropici)
com variações no método de produção que pode acarretar diferenças na estrutura química
fina e, provavelmente, nas propriedades físico-químicas. Os baixos valores encontrados na
quantificação de açúcares redutores sinalizam que os carboidratos presentes em solução
estão, principalmente, na forma de polissacarídeos e o elevado teor de ácido urônico
(8,4 %) presente no polissacarídeo produzido pelo Mesorhizobium (R
3
) indica um polímero
aniônico. No preparo das soluções polissacarídicas para as reações de quantificação o R
3
apresentou-se menos viscoso e, de acordo com a literatura, o comportamento reológico de
polímeros acídicos é diferente daquele apresentado pelos polímeros neutros. A presença de
ácidos glucurônico e pirúvico na goma xantana, confere ionicidade à mesma, promovendo
alterações na conformação molecular e aumentando a solubilidade de suas soluções
(DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004).
53
5.2 Análise da homogeneidade dos exopolissacarídeos por cromatografia de filtração
em gel (HPSEC)
Para que os resultados das análises, inclusive reológicas, sejam atribuídos
exclusivamente à solução polissacarídica, é necessário se estabelecer o grau de pureza do
material estudado. Os métodos cromatográficos são os mais utilizados para esse fim e, em
particular, a cromatografia de filtração em gel (BOYER, 1993). O comportamento dos
polissacarídeos na filtração em gel informa sobre a pureza da macromolécula. Uma forma
apropriada para determinar o grau de homogeneidade e polidispersividade é a utilização da
cromatografia de filtração em gel a alta pressão denominada GPC (gel permeation
chromatography) acoplada a detectores de índice de refração e espalhamento de luz a laser
(light scattering). A utilização de colunas sequenciadas com géis de diferentes
porosidades, pressão elevada e detectores sensíveis permitem, pela mudança da fase móvel
(H
2
O; solução de NaCl; solução diluída de NaOH e dimetil sulfóxido), se chegar ao peso
molecular absoluto, bem como, a soluções poliméricas de menor grau de
polidispersividade (WYATT, 1993).
Para os polissacarídeos, podemos inferir sobre o grau de pureza da
amostra (homogeneidade) pelo número de picos e sobre a polidispersividade do material,
através da forma do pico. A simetria no pico de eluição é um forte indicativo de
homogeneidade (PAZUR, 1994). Todos os EPS em estudo foram submetidos a esta análise
(Figura 9).
Sabendo-se que os exopolissacarídeos R
1
e R
2
foram produzidos pelo
mesmo microrganismo (Rhizobium tropici), nota-se que as condições de cultivo utilizadas
para a produção do R
2
forneceram um polissacarídeo mais homogêneo e com menor
polidispersividade, assim como para o EPS R
3
. A polidispersividade deve-se
provavelmente ao processo de síntese dos polissacarídeos, cujas unidades
monossacarídicas são aleatoriamente dispostas na molécula, diferentemente das proteínas
que seguem um molde molecular. Essa situação de síntese, sem um molde prévio, gera
moléculas semelhantes com diferentes massas moleculares (CORRADI DA SILVA et al.,
2006).
Os exopolissacarídeos R
1
e R
4
apresentaram um perfil heterogêneo, com
um pequeno ombro junto ao pico principal, o que pode sugerir à existência de mais de um
polissacarídeo com massas moleculares distintas.
54
Figura 9: Perfil de eluição para os EPS R
1,
R
2,
R
3
e R
4
por HPSEC equipado com um detector de
índice de refração diferencial. Colunas de gel permeação dispostas em série, com limites de
exclusão de 1.10
6
, 4.10
5
, 8.10
4
e 5.10
3
. Total de EPS aplicado: 200 µg; fluxo: 0,6 mL/min. Eluente:
NaNO
3
0,1M contendo azida sódica 0,03%, pressão de 1422 Psi a 37 ºC.
55
5.3 Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD dos exopolissacarídeos
A estrutura química primária de um EPS é definida por sua composição
monossacarídica, configuração e posição da ligação glicosídica, entre outras características
(PAZUR, 1994). A determinação da estrutura primária consiste na despolimerização total
ou parcial, por hidrólise ácida, com diferentes tipos de ácidos, temperaturas e tempos.
Estes tratamentos produzem monossacarídeos ou oligossacarídeos que são posteriormente
analisados por cromatografia líquida de íons em alta presssão (HPAEC – high performance
anionic exchange chromatography) acoplada a um detector de óxido redução (PAD –
pulsed amperometric detector) (BONGIOVANI, 2008). O HPAEC/PAD é uma poderosa
ferramenta para a análise e separação dos carboidratos, não derivatizados, em níveis de
nanomoles (nmol). As colunas empregadas devem ser específicas para a separação e
análise de mono-, oligo- e polissacarídeos de baixa massa molecular. Portanto, a primeira
medida a ser tomada a respeito da análise estrutural de um polissacarídeo é conhecer suas
unidades monossacarídicas (NELSON; COX, 2000; CORRADI DA SILVA et al., 2006).
As condições de hidrólise ácida utilizadas neste trabalho foram capazes
de liberar apenas os monossacarídeos neutros, embora os resultados positivos encontrados
na quantificação de ácidos urônicos (Tabela 3) mostrem que monossacarídeos ácidos
fazem parte da estrutura química desses polímeros. A análise da composição
monossacarídica dos EPS, por cromatografia líquida de íons (Figura 10), mostrou a
presença de glucose como componente majoritário em todos os EPS estudados, além de
galactose e traços de manose. De acordo com a literatura microrganismos de linhagens
diferentes ou com diferenças apenas nas condições de cultivos, produzem polissacarídeos
semelhantes nos quais a cadeia principal, normalmente, é a mesma, com variações no grau
de ramificação. Esses resultados também foram, parcialmente, demonstrados por
Castellane e Lemos (2007).
Segundo Hisamatsu e colaboradores (1997) o ácido glucurônico presente
nos polissacarídeos de Rhizobium necessita de condições severas de hidrólise para sua
liberação do polímero. Portanto neste trabalho os ácidos urônicos foram quantificados por
métodos colorimétricos, como mostrado no Item 5.1, Tabela 3.
56
Figura 10 - Análise dos monossacarídeos provenientes da hidrólise ácida dos EPS R
1
, R
2
, R
3
e R
4
por HPAEC/PAD. Padrões de açúcares neutros (Pd), com tempos de retenção em minutos: fucose
(6.03); arabinose (9.58) ramnose (10.32); galactose (12.57); glucose (14.03); manose (15.31).
Condições da corrida: isocrática (NaOH 14 mM, 25 minutos). Coluna: CarboPac PA1. Condições
de hidrólise: TFA 5 M, 12 horas, 100 ºC. Quantidade de material hidrolisado: 50 µg.
57
5.4 Comportamento reológico das soluções formadas pelos exopolissacarídeos
produzidos pelo Rhizobium
As medidas reológicas possibilitam a caracterização de polímeros em
soluções e géis, fornecendo dados importantes para o desenvolvimento dos processos
tecnológicos, para o controle de qualidade das matérias-primas e produtos padronizados, e
para a determinação de dados na pesquisa e desenvolvimento de um material específico
(TOSIN, 2008). Após a caracterização química prévia das moléculas as soluções de cada
polissacarídeo foram submetidas às análises reológicas, que tem como um dos primeiros
experimentos as Curvas de Fluxo.
5.4.1 Curvas de fluxo
A curva de fluxo, definida a partir das medidas de tensão de cisalhamento
(τ) x taxa de deformação ( ) permite verificar o comportamento de fluxo das soluções
polissacarídicas. A partir da construção do reograma é possível estabelecer se um líquido
apresenta um comportamento de fluxo Newtoniano ou não Newtoniano, em determinadas
condições de tensão ou taxa de deformação (BONGIOVANI et al., 2009).
Os resultados apresentados nas Figuras 11, 12, 13 e 14 evidenciam um
comportamento de fluxo de líquidos não-Newtonianos para os quatro exopolissacarídeos
estudados. O aumento da tensão de cisalhamento a partir do aumento da taxa de
deformação, caracteriza-os como fluidos pseudoplásticos. Soluções formadas pelo EPS
450, produzido pelo Bacillus sp, também apresentam comportamento pseudoplástico,
assim como outras soluções de polissacarídeos microbianos (KUMAR et al., 2004;
ROTTAVA, 2005).
58
Figura 11 – Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
1
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
Figura 12 – Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
2
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
59
Figura 13 – Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
3
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
Figura 14 – Reograma (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
4
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
60
5.4.2 Modelos reológicos
A descrição do comportamento reológico dos materiais pode ser feita
através de modelos que relacionam como a tensão de cisalhamento varia com a taxa de
deformação. Dentre os modelos matemáticos existentes, alguns dos mais utilizados para os
sistemas de alimentos são Ostwald-de-Waele (Lei da Potência), Casson, Herschel-Bulkley
e Mizrahi-Berki. Os dois primeiros utilizam equações matemáticas com dois parâmetros e
os demais com três parâmetros (HAMINIUK et al., 2006).
Há diferentes fatores que influenciam na escolha do modelo reológico
ideal para descrever o comportamento de escoamento de um fluido em particular. Muitos
modelos, além dos acima apresentados, são utilizados para representar o comportamento
de fluidos não-Newtonianos (BRANCO; GASPARETTO, 2005; BRETAS; D’ÁVILA,
2005; FERREIRA; GUIMARÃES; MAIA, 2008). Os modelos matemáticos também
podem relacionar as propriedades reológicas de um fluido com grandezas práticas como
concentração e temperatura, principalmente. Esse conhecimento é indispensável no
controle de qualidade, no controle intermediário em linhas de produção, no projeto e
dimensionamento dos processos (TONELI; MURR; PARK, 2005).
Para as soluções formadas pelos exopolissacarídeos produzidos pelas
diferentes linhagens de Rhizobium e Mesorhizobium, nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L o
modelo de Ostwald-de-Waele proporcionou os melhores ajustes, com maiores valores do
coeficiente de regressão ou de determinação (R
2
) e menores valores para χ
2
(Tabela 4), o
qual expressa a diferença entre os valores previstos pelo modelo e os valores obtidos
experimentalmente.
O desvio do índice de comportamento de fluxo (n) da unidade indica o
grau de desvio do comportamento newtoniano. Valores de n < 1 definem comportamento
pseudoplástico. As soluções polissacarídicas estudadas neste trabalho apresentaram n < 1,
caracterizando-as com comportamento pseudoplástico em todas as concentrações
analisadas, conforme mostrado na tabela 4.
É possível, ainda, observar a partir do índice de consistência (K) (Tabela
4) um aumento progressivo da viscosidade com o aumento da concentração das soluções
de todos EPS. Nota-se uma tendência da solução do exopolissacarídeo R
1
ser mais viscosa
do que as soluções de R
2
, R
3
e R
4
, principalmente em concentrações maiores (10 g/L). R
3
apresenta menores valores de K, em qualquer uma das concentrações analisadas, em
comparação aos demais EPS.
61
Tabela 4 - Parâmetros reológicos obtidos pela análise das soluções exopolissacarídicas pela
aplicação do modelo da Lei da Potência.
Amostra
Concentração
(g/L)
Índice de
Consistência
(K)
Índice de
Comportamento
de Fluxo (n)
Coeficiente de
Regressão (R
2
)
χ
χχ
χ
2
EPS R
1
2 0.51 0.30 0,99 0,05
5 3.14 0.11 0,98 0,08
5 em NaCl* 3.36 0.19 0,99 0,04
10 9.30 0.12 0,99 0,05
EPS R
2
2 0.52 0.30 0,99 0,09
5 3.70 0.09 0,99 0,06
5 em NaCl* 3.80 0.17 0,99 0,08
10 7.33 0.14 0,99 0.06
EPS R
3
2 0.04 0.73 0,99 0,06
5 0.52 0.50 0,99 0,06
5 em NaCl* 0.32 0.55 0,99 0.06
10 4.90 0.28 0,99 0,07
EPS R
4
2 0.50 0.32 0,99 0,06
5 3.24 0.10 0,98 0,09
5 em NaCl* 4,31 0.21 0,99 0,02
10 7.13 0.13 0,99 0,04
* Solução de NaCl 0,2 M
Também na tabela 4 é possível observar que as soluções dos
exopolissacarídeos R
1
, R
2
e R
4
, na concentração de 5 g/L, em presença de NaCl 0,2 M,
apresentam um pequeno aumento no valor do índice de consistência (K) quando
comparados com as mesmas soluções, nas mesmas concentrações, na ausência do sal. Isso
indica que a adição do eletrólito à solução aquosa favorece a viscosidade desses polímeros.
Um valor menor de K para o exopolissacarídeo produzido pelo Mesorhizobium (R
3
), em
presença de sal, na concentração de 5 g/L, pode ser atribuído à interação entre resíduos
carregados de ácido urônico (8,4%) e dos íons provenientes da dissociação do sal.
(CARRINGTON et al., 1996; SHIMADA et al., 1997).
A dissolução do hidrogel quitosana-xantana em meio eletrolítico promove
o aumento da viscosidade, enquanto para a goma xantana sozinha, em baixas
concentrações, a adição de um eletrólito, por exemplo, NaCl, reduz a viscosidade;
62
entretanto, em concentrações elevadas a presença do eletrólito tem efeito oposto, embora
um gel fraco de xantana seja formado (MARTÍNEZ-RUVALCABA; CHORNET;
RODRIGUE, 2007).
5.4.3 Curvas de viscosidade
A viscosidade, que descreve a propriedade física de um líquido em
resistir ao fluxo induzido pelo cisalhamento, pode depender de alguns parâmetros tais
como temperatura, a natureza física da substância, pressão, taxa de deformação, entre
outros. Os diferentes tipos de curvas de fluxo têm suas correspondentes curvas de
viscosidade, que no caso dos líquidos Newtonianos, são representados por uma reta
paralela à abscissa, mostrando que independente da taxa de cisalhamento, a viscosidade
não se altera. Fluidos que sofrem diminuição da viscosidade com o aumento da taxa de
cisalhamento são chamados de pseudoplásticos (SCHRAMM, 2006).
As curvas de viscosidade para os exopolissacarídeos R
1
, R
2
, R
3
e R
4
estão
apresentadas nas figuras 15 a 18. As medidas da viscosidade (η) x taxa de deformação ( )
efetuadas nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L foram reunidas em um único gráfico, para
cada um dos EPS estudados.
Pelos resultados obtidos é possível observar que a viscosidade aumenta
com o aumento da concentração dos polímeros, esse comportamento foi notado
visualmente em todos os EPS, mas apenas mostrado para o R
2,
na figura 7. Também, de
acordo com as curvas de viscosidade, os EPS estudados apresentaram comportamento
pseudoplástico, ou seja, as viscosidades das soluções polissacarídicas, em qualquer uma
das concentrações analisadas, decresceram de maneira substancial com o aumento da taxa
de deformação.
Schramm (2006) avalia que soluções poliméricas, quando em repouso,
mantêm suas moléculas entrelaçadas e enoveladas numa ordem interna irregular que se
caracteriza por uma considerável resistência interna ao fluxo, manifestando-se através da
viscosidade elevada. Com o aumento das taxas de deformação, ocorre uma ordenação ou
alinhamento das partículas na direção do fluxo, provavelmente pelas interações desfeitas.
Ainda, segundo o mesmo autor, o cisalhamento pode induzir a quebra dos agregados,
auxiliando o material a escoar mais rapidamente.
De acordo com Diaz e colaboradores (2004) a viscosidade da solução
aquosa de um polissacarídeo está diretamente relacionada com a rigidez de sua molécula
63
que, por sua vez, depende da sua estrutura, principalmente primária e secundária, a qual
está diretamente relacionada à bactéria utilizada e às condições operacionais do processo.
A viscosidade pode, portanto, ser afetada pela presença das ramificações, as quais reduzem
o grau de enrolamento de uma cadeia linear, sendo a viscosidade de um polímero
ramificado menor que a de um linear de mesma composição química e peso molecular. A
queda da viscosidade com o aumento da ramificação sempre ocorre quando os ramos não
excedem a um determinado comprimento, estando relacionado com a alteração no
movimento cooperativo dos segmentos da cadeia. Entretanto, alguns pesquisadores relatam
que o aumento das ramificações aumenta a viscosidade e que isto pode ocorrer quando as
ramificações são longas e enrolam-se entre as cadeias, com comprimento maior que o
crítico da cadeia (NAVARRO, 1997, RAO, 1999)
A diminuição da viscosidade com aumento da taxa de deformação foi
demonstrada para o polissacarídeo rhamsana, com muitas ramificações, produzido por
Alcaligenes sp. Gelana, um polissacarídeo não ramificado, produzido por Pseudomonas
elodea, mostrou menor comportamento pseudoplástico (KUMAR et al., 2004).
Provavelmente, as ramificações do rhamsana são longas o suficiente para explicar a
elevada viscosidade de suas soluções.
Figura 15 – Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação ( ) das soluções
polissacarídicas do EPS R
1
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
64
Figura 16 – Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação ( ) das soluções
polissacarídicas do EPS R
2
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
Figura 17 – Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação (
) das soluções
polissacarídicas do EPS R
3
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
65
Figura 18 – Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação ( ) das soluções
polissacarídicas do EPS R
4
nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, à temperatura de 25 ºC.
O sal na formulação dos alimentos industrializados tem função de
realçador de sabor e de conservação (BOBIO, 1992). Além disso, a presença de sais
inorgânicos é um fator modificador da viscosidade nas soluções polissacarídicas, podendo
incrementar ou diminuir a viscosidade da solução (DIAZ; VENDRUSCOLO;
VENDRUSCOLO, 2004).
Por esta razão foi efetuado um estudo comparativo da viscosidade das
soluções, aquosa e aquosa contendo 0,2 M de NaCl, de cada um dos biopolímeros, nas
concentrações de 5 g/L. Para esta análise foram selecionadas as taxas de deformação de 10,
50 e 100 s
-1
, que correspondem, respectivamente, a valores das regiões de baixa, média e
alta taxa de cisalhamento ou deformação.
Os resultados da análise são mostrados na tabela 5, juntamente com o
percentual de ácidos urônicos.
66
Tabela 5 – Viscosidade absoluta (η) das soluções aquosa e salina dos EPS R
1
, R
2
, R
3
e R
4
, 5 g/L,
nas taxas de deformação ( ) 10; 50 e 100 (s
-1
), à temperatura de 25 °C.
Viscosidade (η) (Pa.s)
Ácido urônico (%) 10 s
-1
50 s
-1
100 s
-1
R
1
2,4 5 g/L em H
2
0 0,41 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,51 0,14 0,08
R
2
1,7 5 g/L em H
2
0 0,45 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,54 0,14 0,08
R
3
8,4 5 g/L em H
2
0 0,14 0,07 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,10 0,05 0,04
R
4
0,8 5 g/L em H
2
0 0,44 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,44 0,12 0,07
Maiores valores de viscosidade foram encontrados em baixas taxas de
deformação (10 s
-1
), com R
3
apresentando os menores valores. O decréscimo da
viscosidade aparente com o aumento da taxa de deformação pode ser atribuído a mudança
estrutural dos polímeros devido às forças hidrodinâmicas geradas e ao maior alinhamento
das moléculas na direção da tensão aplicada (FERREIRA; GUIMARÃES; MAIA, 2008).
Em taxas de deformação mais elevadas (100 s
-1
) os valores de viscosidade para os quatro
polímeros são praticamente semelhantes, provavelmente devido à ação de deformação
sobre a estrutura das moléculas.
É também possível observar, a partir da Tabela 5, que os EPS R
1
e R
2
solubilizados em solução aquosa de NaCl (0,2 M) apresentaram maior viscosidade quando
comparados com os respectivos polímeros dissolvidos apenas em água. Resultados
semelhantes foram encontrados para goma xantana quando uma alta concentração de sais
foi adicionada (DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004).
A goma xantana se comporta como um gel em concentrações acima de
1 %. Como é um polieletrólito, espera-se que suas propriedades reológicas sofram
67
alterações com a força iônica e concentração do polímero (MARTÍNEZ-RUVALCABA;
CHORNET; RODRIGUE, 2007). Conforme se aumenta a concentração da solução de
goma xantana e a força iônica do sistema, eleva-se a ordenação intramolecular através de
ligações de hidrogênio (CARRINGTON et al., 1996) e consequentemente, a viscosidade.
O EPS R
3
manteve-se como o menos viscoso entre os quatro polímeros
estudados, tanto em meio aquoso quanto em solução aquosa contendo NaCl,
provavelmente devido ao maior percentual de ácidos urônicos (8,4%) em sua estrutura,
seguido dos EPS R
1
(2,4 %), EPS R
2
(1,7 %) e EPS R
4
(0,8 %) (Tabela 3). Carrington e
colaboradores (1996) afirmam que a variação no grau dos substituintes de um
polissacarídeo altera suas propriedades reológicas em solução.
Freitas e colaboradores (2009)
estudaram o comportamento reológico de
um exopolissacarídeo acídico produzido por Pseudomonas oleovorans NRRLB-14682, em
solução aquosa, e constataram que possui propriedades viscoelásticas similares à goma
guar, mas com grande afinidade aos sais, como resultado de sua característica de
polieletrólito.
5.4.4 Tixotropia
A tixotropia é a capacidade de um gel se liquefazer a medida que uma
determinada taxa de deformação é aplicada (COSTA, 2006). A diminuição da viscosidade
aparente com o tempo é devido à quebra da estrutura organizada no fluido. Se deixarmos
um sistema tixotrópico em repouso por algum tempo, a viscosidade aparente aumentará
devido à formação de uma estrutura mais organizada das partículas. Este fenômeno é
importante no preparo de alimentos, uma vez que a agitação rompe o gel, e em repouso, o
gel se refaz (VRIESMANN, 2008).
O produto tixotrópico tende a ter maior vida de prateleira (“shelf-life”)
durante o armazenamento, mantendo a viscosidade constante, o que dificulta a separação
dos constituintes da formulação (CORRÊA et al., 2005).
Testes reológicos em que a amostra é submetida ao aumento da taxa de
deformação seguido pela diminuição da mesma, servem para observar a tixotropia do
material. A ocorrência é verificada quando a curva de aumento da taxa não coincide com a
curva de decréscimo no gráfico de tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( ),
formando uma curva denominada de histerese (ARAÚJO; NASCIMENTO, 2007;
SAMPAIO; NASCIMENTO, 2007; BONGIOVANI et al., 2009).
68
As curvas de histerese (τ x ) dos quatro polissacarídeos de Rhizobium
estudados na concentração de 10 g/L, estão representadas nas Figuras 19 a 22. Os
resultados mostram que o EPS R
1
apresentou comportamento tixotrópico quando
submetido a baixas taxas de deformação na concentração estudada.
Acredita-se que para os polímeros de Rhizobium e Mesorhizobium
avaliados, sejam necessárias concentrações maiores de material para que os EPS
apresentem tixotropia, pois nas concentrações de 10 g/L todos apresentaram uma leve
tendência ao comportamento tixotrópico (Figuras 19 a 22), exceto o EPS R
3
(Figura 21).
Beyer e colaboradores (1987) encontraram efeito de histerese em soluções a 10 g/L de EPS
de Rhizobium CB744, o que poderia indicar tixotropia.
Figura 19 – Curva de histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
1
na concentração de 10 g/L, à temperatura de 25 °C.
69
Figura 20 – Curva de histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
2
na concentração de 10 g/L, à temperatura de 25 °C.
Figura 21 – Curva de histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
3
na concentração de 10 g/L, à temperatura de 25 °C.
70
Figura 22 – Curva de histerese (tensão de cisalhamento (τ) x taxa de deformação ( )) das soluções
polissacarídicas do EPS R
4
na concentração de 10 g/L, à temperatura de 25 °C.
5.4.5 Análise em sistema dinâmico
As propriedades viscoelásticas de polissacarídeos podem ser determinadas
através de medidas em sistema dinâmico que é um dos mais utilizados no estudo do
comportamento viscoelástico em componentes de alimentos (LAMBO-FODJE et al.,
2007).
Os polissacarídeos podem apresentar características de viscoelasticidade,
ou seja, exibem simultaneamente características de sólido e líquido. É possível determinar
a predominância do caráter sólido ou líquido de uma amostra através de medidas
dinâmicas representados pelos módulos G’ e G”, os quais referem-se ao caráter viscoso e
elástico do material, respectivamente (SCHRAMM, 2006; BUSATO et al., 2009).
Qualquer teste dinâmico para amostras desconhecidas deve começar com
uma varredura de tensão na qual poderá ser determinada a amplitude que mantém a região
de viscoelasticidade linear para a amostra. Nesta condição a estrutura original da amostra
não sofre perturbação significativa do sistema e assim pode-se proceder a outros testes
71
reológicos, para verificar o comportamento do material (IAGHER; REICHER; GANTER,
2002).
Os valores de tensão de cisalhamento para os testes de varreduras de
frequência nas concentrações de 2 g/L e 10 g/L para os quatro EPS estudados foram de
0,2 Pa e 1,5 Pa, respectivamente. Já na concentração de 5 g/L o valor de tensão para os
EPS R
1
,
R
2
e R
4
foi de 0,6 Pa e para o EPS R
3
foi de 0,3 Pa. Nestas condições, os polímeros
apresentaram comportamento viscoelástico linear, ou seja, a tensão ou deformação
aplicada não alterou a estrutura física dos EPS. Após determinar a deformação dentro da
região viscoelástica linear das amostras, foram realizadas as análises dinâmicas por
varredura de frequência para os EPS de Rhizobium e Mesorhizobium e os resultados
obtidos estão representados nas figuras 23 a 26.
72
Figura 23 - Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
1
nas
concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de 25 °C - (A), (B), (D) em
solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.
73
Figura 24 - Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
2
nas
concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de 25 °C - (A), (B), (D) em
solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.
74
Figura 25 - Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
3
nas
concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de 25 °C - (A), (B), (D) em
solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.
75
Figura 26 - Análise do comportamento viscoelástico das soluções polissacarídicas do EPS R
4
nas
concentrações de 2 g/L (A), 5 g/L (B) e (C) e 10 g/L (D), à temperatura de 25 °C - (A), (B), (D) em
solução aquosa; (C) em solução aquosa de NaCl 0,2 M.
76
Os módulos de estocagem (G’) e perda (G”), ambos em função da
frequência, fornecem informações sobre a estrutura do polímero em solução ou de seu gel
(PIERMARIA; CANAL; ABRAHAM, 2008).
De acordo com os dados apresentados nas figuras 23, 24 e 26 as soluções
dos EPS R
1
, R
2
e R
4
apresentam comportamento viscoelástico na concentração de 2 g/L,
isto é, exibem comportamento de fluxo semelhante ao de um líquido, em baixas
frequências, nas quais há predomínio de G”. Conforme a frequência aumenta ocorre
distorção da rede e G’ aumenta mais rapidamente que G”. Desta forma, os módulos
tornam-se praticamente iguais e se cruzam num ponto denominado ponto de gelificação, a
partir do qual G’ é maior que G” e há predomínio do caráter sólido, apresentando
comportamento de géis fracos (XU; LIU; ZHANG, 2006). Torres e colaboradores (2006)
encontraram resultados semelhantes para soluções do polímero quitosana, uma
glucosamina glucana, a 0,035 g/mL.
As figuras 23 e 24 mostram que as soluções dos exopolissacarídeos R
1
e
R
2
(5g/L), tanto em água quanto em solução salina, exibem comportamento de gel, com
valor de G’ superior ao valor de G”. Doublier e Couvelier (1996) APUD Martínez-Padilla
e colaboradores (2004) encontraram comportamento viscoelástico semelhante para
soluções de xantana em KCl a 5 g/L.
Já o EPS R
4
(Figura 26), na concentração de 5 g/L, apresenta o valor do
módulo viscoso (G”) maior que o módulo elástico (G’) somente em baixos valores de
frequência, mantendo esse comportamento mesmo em presença de NaCl, mostrando que
exibe comportamento viscoelástico de gel mais fraco quando comparado aos EPS R
1
e R
2
.
As soluções dos polímeros R
1
, R
2
e R
4
, na concentração de 10 g/L,
apresenta valores de G’ superiores aos de G”. Nota-se que G’ e G” independem da
frequência e a viscosidade dinâmica complexa η* diminui linearmente com o aumento da
frequência, apresentando comportamento viscoelástico com caráter sólido. Este
comportamento é típico de gel forte (PIERMARIA; CANAL; ABRAHAM, 2008).
As soluções do EPS R
3
(Figura 25) nas concentrações de 2 e 5 g/L (com e
sem NaCl) mostram predominância de G” sobre G’, exibindo comportamento de solução
diluída. Observamos também que a viscosidade complexa permanece linear com aumento
da frequência. Este comportamento está provavelmente associado com o alto conteúdo de
ácido urônico deste EPS. Cargas negativas pertencentes à cadeia do polímero fazem com
que a conformação da cadeia seja influenciada pela salinidade (IAGHER; REICHER;
GANTER, 2002). Comportamento semelhante foi descrito por Martínez-Ruvalcaba e
77
colaboradores (2005) para soluções do polímero xantana a 0,1 g/L. É possível observar
ainda que na concentração de 10 g/L o polímero R
3
exibe comportamento viscoelástico de
gel fraco.
A dependência do módulo elástico (G’) com a concentração do polímero
na frequência de 10
-1
e 10
0
Hz é mostrada na Tabela 6.
Tabela 6 - Valores do módulo G’ nas varreduras de frequências dos EPS R
1
, R
2,
R
3
e R
4
, nas
frequências (f) 10
-1
e 10
0
(Hz), à temperatura de 25 °C e 5 ºC; valor do ponto de cruzamento (Hz).
G' (Pa)
10
-1
(Hz) *
25 ºC
10
0
(Hz) *
25 ºC
10
0
(Hz) *
5 ºC
Ponto de
Cruzamento (Hz) *
2 g/L 0,25 0,98 --- 0,28
5 g/L em H
2
0 4,37 8,21 9,74 ---
5 g/L em NaCl 4,35 8,43 --- ---
R
1
10 g/L 24,60 37,83 --- ---
2g/L 0,15 0,86 --- 0,91
5 g/L em H
2
0 3,65 7,22 7,5 ---
5 g/L em NaCl 4,50 8,75 --- ---
R
2
10 g/L 21,72 34,20 --- ---
2 g/L 0,00 0,01 --- ---
5 g/L em H
2
0 0,03 0,52 0,97 ---
5 g/L em NaCl 0,02 0,43 --- ---
R
3
10 g/L 2,14 9,08 --- 0,36
2 g/L 0,14 0,83 --- 1,31
5 g/L em H
2
0 2,98 6,52 7,10 0,01
5 g/L em NaCl 2,02 5,17 --- 0,03
R
4
10 g/L 19,22 32,09 ---- ---
*Frequência (Hz)
78
Pelos resultados obtidos (Tabela 6) é possível observar o aumento de G’
com o aumento da concentração dos polímeros, o que pode ser explicado pelo aumento no
número e no tamanho dos pontos de junção entre as moléculas (BRITO et al., 2005;
MARTÍNEZ-RUVALCABA; CHORNET; RODRIGUE, 2007).
A partir dos valores do módulo elástico (G’) observados na Tabela 6, o
EPS R
1
acredita-se que tem comportamento de gel mais forte, seguida por R
2
e R
4
, com
valores intermediários, e R
3
formando soluções diluídas e gel fraco.
O ponto de cruzamento ou ponto de gelificação, no qual há inversão dos
valores de G’ e G”, fornece um indicativo do comportamento viscoelástico do material.
Quanto mais baixos os valores do ponto de cruzamento, maior a contribuição do módulo
elástico (G’) no sistema (IAGHER; REICHER; GANTER, 2002; LAMBO-FODJE et al.,
2007). Através dos dados apresentados na Tabela 6, notamos que em baixas concentrações
(2 g/L) o valor do ponto de cruzamento foi menor em R
1
indicando que adquire caráter
elástico antes que todos os outros EPS, formando, portanto, um gel fraco nesta
concentração.
Observamos também que em concentração maior (10 g/L) apenas os EPS
R
3
apresenta valor no ponto de cruzamento demonstrando comportamento de gel fraco,
indicando que apresenta caráter elástico quando submetido a frequências mais elevadas. O
fato do EPS R
3
não apresentar valores de ponto de cruzamento nas concentrações de 2 e
5 g/L demonstra que este polímero forma soluções diluídas a baixas concentrações, e que o
módulo viscoso (G”) permanece superior ao módulo elástico (G’) em toda faixa de
frequência analisada (Figura 25 (A), (B) e (C)).
Ao contrário dos EPS R
1
e R
2
, o EPS R
4
apresenta baixos valores de ponto
de cruzamento na concentração de 5 g/L em solução aquosa e salina (Tabela 6). Apesar da
viscosidade absoluta da solução aquosa formada pelo EPS R
4
a 5 g/L ser ligeiramente
inferior ao mesmo EPS em solução salina (Tabela 5), este polímero apresenta menor valor
do ponto de cruzamento em solução aquosa, indicando que forma um gel mais rapidamente
em água que em NaCl. Dados também mostrados na Figura 26 (B) e (C).
Simsek e colaboradores (2009) em estudo com linhagens da bactéria
Sinorhizobium, produtora do polímero succinoglucana, encontraram diferentes valores para
o ponto de cruzamento, e sugerem que possa ser atribuída a presença de substituintes
carregados na molécula como piruvato, acetato e succinato.
Ainda a partir da Tabela 6, notamos que os valores do módulo elástico
(G’) a 5 ºC é maior que G’ a 25 ºC na concentração de 5 g/L em todos EPS, demonstrando
79
a formação de gel mais forte a baixas temperaturas. Mohammed e colaboradores (2007)
descreveram comportamento semelhante para soluções de goma xantana a 5 g/L.
5.4.6 Varredura de temperatura
A varredura de temperatura é um experimento que tem como objetivo
estudar o comportamento viscoelástico do gel, utilizando um gradiente linear, crescente e
decrescente, de temperatura. As quatro amostras dos exopolissacarídeos produzidos pelas
bactérias do gênero Rhizobium e Mesorhizobium foram analisados em uma varredura de
temperatura de 5 a 95 °C (ascendente) e de 95 a 5°C (descendente), com um aumento de
1,5 °C/min, e os resultados obtidos estão representados nas figuras 27 a 30.
Figura 27 – Varredura de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
1
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min. Setas vermelhas:
aquecimento; setas azuis: resfriamento.
80
Figura 28 – Varredura de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
2
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min. Setas vermelhas:
aquecimento; setas azuis: resfriamento.
Figura 29 – Varredura de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
3
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min. Setas vermelhas:
aquecimento; setas azuis: resfriamento.
81
Figura 30 – Varredura de temperatura das soluções polissacarídicas (5 g/L) do EPS R
4
. Curva
ascendente (5 a 95 °C) e descendente (95 a 5 °C), com aumento de 1,5 °C/min. Setas vermelhas:
aquecimento; setas azuis: resfriamento.
A partir dos dados do EPS R
1
(Figura 27), notamos que os valores dos
módulos elástico (G’) e viscoso (G”), na faixa de 5 ºC até aproximadamente 65 ºC,
mantém-se com pequena variação. Esse comportamento também pode ser observado para
as solução do EPS R
2
(Figura 28) e EPS R
4
(Figura 30).
Os pontos díspares observados nos gráficos dos EPS R
1
, R
2
e R
4
(Figuras 27, 28 e 30) a partir de aproximadamente 65 ºC (linha verde) indicam a
desestabilização da estrutura da molécula quando submetidos a altas temperaturas, e
mostra a perda de força do gel (VRIESMANN; SILVEIRA; PETKOWICZ, 2009). A
conformação das moléculas em solução passa de um estado molecular ordenado, quando
em baixas temperaturas de dissolução, para um estado desordenado em temperaturas mais
elevadas (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).
Já para o polímero R
3
(Figura 29), o qual forma soluções mais diluídas,
notamos o comportamento de gel fraco durante o aquecimento (5 a 95 ºC), com G”
superior a G’, e durante o resfriamento (95 a 5 ºC) forma gel forte, com G’ superior a G”.
Segundo García-Ochoa e colaboradores (2000), a viscosidade da solução de xantana
82
diminui com o aumento da temperatura até 40 ºC. Entre 40 e 60 ºC, a viscosidade aumenta.
Para temperaturas acima de 60 ºC, a viscosidade diminui à medida que a solução é
aquecida. Este comportamento está, provavelmente, associado à interação das cargas na
conformação da molécula de xantana.
A varredura de temperatura da solução polissacarídica de R
4
(Figura 30)
mostra que, no aquecimento, G’ é superior a G”, formando um gel termo resistente.
Durante o resfriamento da solução, G” mantêm-se superior a G’ até aproximadamente
30 ºC, quando então, ocorre a inversão dos valores, formando, portanto, um gel forte a
baixas temperaturas.
Os exopolissacarídeos produzidos pelas diferentes linhagens de
bactérias do gênero Rhizobium e Mesorhizobium ou por modificações nas condições do
cultivo, apresentaram diferenças sutis em suas composições monossacarídicas (estrutura
primária) que, acredita-se, foram suficientes, para promover alterações da estrutura
secundária ou conformacional das moléculas. Isso pode ser constatado a partir dos
resultados encontrados nas análises reológicas, tanto em sistema estático quanto em
dinâmico, para cada um dos EPS estudados. Espera-se que os resultados apresentados neste
trabalho contribuam com informações que permitam considerar essas macromoléculas e
seus respectivos organismos produtores como objetos alvo de futura investigação e
aplicação industrial.
83
6. CONCLUSÕES
A análise da composição monossacarídica, após hidrólise ácida, detectou
a presença de glucose como componente majoritário em todos os EPS e a quantificação de
ácidos urônicos mostrou que monossacarídeos ácidos fazem parte da estrutura química
desses polímeros, sendo o EPS R
3
o que apresentou maior teor de ácidos urônicos (8,4 %).
Na cromatografia de filtração em gel os EPS R
2
e R
3
eluíram com um
único pico e mostraram um perfil homogêneo, sendo o R
2
com menor polidispersividade.
Conforme as curvas de fluxo e viscosidade os biopolímeros em solução
apresentaram comportamento não-Newtoniano, com características de soluções
pseudoplásticas e não tixotrópicas nas concentrações de 2, 5 e 10 g/L, e o modelo
reológico de Ostwald-de-Waele (Lei da Potência) proporcionou os melhores ajustes dos
dados reológicos.
Os EPS R
1
, R
2
e R
4
mostraram um ligeiro aumento na viscosidade em
presença de NaCl, e o EPS R
3
manteve-se como o menos viscoso, tanto em meio aquoso
quanto em solução salina, provavelmente devido ao maior percentual de ácidos urônicos
em sua estrutura.
Os resultados das análises dinâmicas complementaram os resultados
obtidos em sistema estático, mostrando comportamento viscoelástico de gel para os EPS de
Rhizobium. Nota-se que o EPS R
1
é o material que forma gel mais forte, seguida por R
2
e
R
4
, com valores intermediários, e R
3
formando soluções diluídas e gel fraco.
Ao analisar a influência de uma ampla faixa de temperatura (5 a 95°C)
sobre o comportamento viscoelástico dos géis, observou-se que as soluções dos EPS R
1
, R
2
e R
4
apresentaram características de gel forte, e todos EPS estudados demonstraram formar
gel mais forte a baixas temperaturas (5 ºC).
84
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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93
ANEXO
94
Carta de aceite de submissão de manuscrito
---------- Forwarded message ----------
From: <[email protected]>
Date: 2009/7/21
Subject: [QN] - SubmissãoTemporária - tmp tmp_4878
REF.: tmp tmp_4878
Prezado Prof. CORRADI DA SILVA, MARIA DE LOURDES
Obrigado por submeter seu manuscrito "PROPRIEDADES REOLÓGICAS E EFEITO DA
ADIÇÃO DE SAL NA VISCOSIDADE DE EXOPOLISSACARÍDEOS PRODUZIDOS
POR BACTÉRIAS DO GÊNERO RHIZOBIUM" para publicação na Química Nova, QN.
O NÚMERO TEMPORÁRIO é: tmp_4878 tmp.
Assim que o seu arquivo PDF for verificado, o seu manuscrito será inserido no sistema, e
você receberá um outro e-mail com o NÚMERO DE REFERÊNCIA, confirmando assim a
submissão (este novo e-mail poderá demorar até 3 dias úteis para ser enviado).
Caso você tenha alguma outra dúvida a respeito desta submissão, por favor, entre em
contato com a Gerente Editorial da QN no e-mail: [email protected]sp.br.
Atenciosamente,
Pricila Gil
SBQ - gerente editorial
95
Artigo encaminhado a Revista Química Nova
PROPRIEDADES
REOLÓGICAS
E
EFEITO
DA
ADIÇÃO
DE
SAL
NA
VISCOSIDADE
DE
EXOPOLISSACARÍDEOS
PRODUZIDOS
POR
BACTÉRIAS
DO
GÊNERO
R
HIZOBIUM
.
Gabriel Aranda-Selverio, Ana Lúcia Barretto Penna
Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-graduação
em Engenharia e Ciências de Alimentos – IBILCE, Universidade Estadual Paulista, CEP
15054-000 São José do Rio Preto – SP, Brasil
Luciana Frizarin Campos-Sás, Osvaldo dos Santos Junior, Ana Flora Dalberto
Vasconcelos e Maria de Lourdes Corradi da Silva
*
.
Departamento de Física, Química e Biologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia,
Universidade Estadual Paulista, CP 266, CEP 19060-900 Presidente Prudente – SP,
Brasil.
Eliana Gertrudes Macedo Lemos e João Carlos Campanharo
Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Universidade Estadual Paulista, CEP 14884-900 Jaboticabal – SP, Brasil
Joana Léa Meira Silveira
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, CP
19046, CEP81531990 Curitiba – PR, Brasil
__________________________________
Email: corradi@fct.unesp.br
96
RHEOLOGICAL PROPERTIES AND EFFECT OF THE SALT ADDITION ON THE
EXOPOLYSACCHARIDES VISCOSITY PRODUCED BY BACTERIA OF RHIZOBIUM
GENUS.
Abstract
Viscosity of some polysaccharides solutions supports that these molecules can be
applied in food sectors. Four exopolysaccharides (R
1
, R
2
, R
3
, R
4
) produced by different
Rhizobium strains were selected. Sugar composition and differences in the uronic acid
contents suggests that chemical structure of these molecules can varies when different
culture conditions and strains were analyzed. The Power Law was the rheological model
used to represent the experimental data of the shear stress versus shear rate. All
exopolysaccharides showed non-Newtonian behavior, with pseudoplastic characteristics.
R
1
, R
2
and R
4
showed a slight increase in viscosity in presence of 0,2 M NaCl.
Keywords: Rheological behaviour; Exopolyssacharides from Rhizobium, Pseudoplastic
solution.
97
1. INTRODUÇÃO
Há na natureza plantas e microrganismos que secretam polímeros, denominados
exopolissacarídeos (EPS), que podem ser classificados como homo- e
heteropolissacarídeos. Os primeiros são, geralmente, glucanas neutras, enquanto os
heteropolissacarídeos são, em sua grande maioria, polianiônicos devido à presença de
ácido urônico.
Os EPS microbianos são considerados substitutos ideais para polissacarídeos de
plantas, pois uma vez estabelecidas às melhores condições de cultivo as moléculas
produzidas apresentam características químicas e físicas constantes e, geralmente,
superiores às gomas naturais.
1
A aplicação desses biopolímeros em diferentes setores
industriais, tais como alimentício e farmacêutico,
2
se deve ao fato de alterarem as
propriedades físicas do meio onde se encontram, seja por conferirem alta viscosidade às
soluções ou por criarem redes intermoleculares coesivas. Na indústria de alimentos
podem ser utilizados como espessantes, estabilizantes, emulsificantes, coagulantes,
formadores de filmes, gelificantes, agentes de suspensão e dispersantes.
3
As características físico-químicas dos polissacarídeos dependem da seqüência
em que os açúcares estão dispostos na molécula, da presença de resíduos iônicos e da
forma como as cadeias se entrelaçam.
2
A solubilidade dos polímeros tende a ser maior
quando grupos ácidos ionizáveis estão presentes na molécula. Soluções aquosas de
polissacarídeos contendo sais inorgânicos podem ter suas viscosidades modificadas e,
por essa razão, os estudos reológicos normalmente investigam o comportamento dos
biopolímeros em tais condições.
4
Polissacarídeos microbianos tais como xantana, gelana, alginatos, celulose
bacteriana, ácido hialurônico e succinoglucanos já são aplicados nas indústrias de
alimentos, química e farmacêutica.
1, 5
A aplicação da goma xantana na indústria de
alimentos se deve principalmente ao seu comportamento não-Newtoniano e formação de
soluções pseudoplásticas a baixas concentrações;
6
essas características reológicas são
dependentes da concentração do polímero e da presença de eletrólitos em solução.
7
98
Dentre os microrganismos produtores de polissacarídeos há um gênero de
bactérias, denominado genericamente de rizóbio, que secreta exopolissacarídeos com
diferentes funções biológicas.
8
Essas moléculas são necessárias no processo de invasão
da célula hospedeira e na formação de nódulos fixadores de nitrogênio em plantas
leguminosas. Um exemplo típico dessa interação envolve a bactéria gram-negativa, do
solo, Sinorhizobium meliloti e seu hospedeiro, alfafa. A bactéria secreta vários
polissacarídeos entre eles succinoglucanas e galactoglucanas, necessários para a
invasão da mesma.
9
Castellane e Lemos
10
cultivaram Rhizobium tropici SEMIA 4077 e SEMIA 4080,
em diferentes fontes de carbono, para produção de exopolissacarídeos e observaram que
eles eram constituídos, majoritariamente, por resíduos de glicose e galactose, com traços
de manose, ramnose e ácidos urônicos. Entretanto, as proporções de açúcar mostraram-
se variáveis para cada exopolissacarídeo produzido. Considerando-se que as
propriedades físico-químicas podem variar em função da composição química da
molécula, este trabalho tem como objetivo investigar o comportamento reológico dos
exopolissacarídeos produzidos pelas diferentes linhagens do Rhizobium.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Obtenção dos exopolissacarídeos e preparo de suas soluções
Os exopolissacarídeos utilizados para as análises foram fornecidos pela Profa.
Dra. Eliana Gertrudes de Macedo Lemos do Departamento de Tecnologia da Faculdade
de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, campus de Jaboticabal. Detalhes das
condições de cultivo dos microorganismos produtores destes EPS não foram
disponibilizados. Estas informações estão sob sigilo de patente com registro PI0304053-
4.
Três diferentes linhagens de bactérias do gênero Rhizobium foram utilizadas para
a produção dos exopolissacarídeos. Os EPS R
1
e R
2
foram produzidos a partir da mesma
estirpe, Rhizobium tropici, com diferenças nas condições de cultivo (dados não
99
disponíveis). O EPS R
3
foi produzido a partir de uma linhagem denominada
Mesorhizobium e o EPS R
4
a partir de uma estirpe selecionada conhecida como
Rhizobium sp.
Antes de todas as análises os exopolissacarídeos foram, individualmente,
dialisados (72 horas em água destilada corrente) em tubos de 12 KDa, concentrados a
baixa temperatura (38 °C) e liofilizados (Figura 1). Foram mantidos desta forma até o
momento do uso.
Figura 1. (A) Ilustração do EPS R
1
seco e moído; (B) EPS R
1
dialisado e liofilizado
2.2. Métodos analíticos
Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol-ácido sulfúrico
11
e os
açúcares redutores pelo método de Somogy e Nelson.
12
A glucose foi utilizada como
padrão em ambos os ensaios. Ácidos urônicos foram quantificados pelo método de
Filisetti-Cozzi e Carpita
13
e o ácido glucurônico foi utilizado como padrão. As proteínas
foram determinadas pelo método de Bradford
14
e soro albumina bovina foi utilizado como
padrão.
2.3. Hidrólise Ácida Total
Para se determinar a composição em monossacarídeos, cada EPS (50 µg em
açúcares totais) foi submetido à hidrólise ácida
15
(TFA 5 M, 100 ºC, 12 h), em tubo
selado. Após hidrólise, o excesso de ácido foi removido por co-destilação com água e
analisado por HPAEC-PAD (high performance anionic exchange chromatogaraphy-pulsed
100
amperometric detection). As condições da análise cromatográfica foram efetuadas como
descrito por Mendes e colaboradores.
16
2.4. Comportamento reológico
Para estudo do comportamento reológico os EPS foram solubilizados em água
deionizada à temperatura de ± 20 °C, nas concentrações de 2 g/L, 5 g/L e 10 g/L. As
soluções foram mantidas sob agitação mecânica constante, em velocidade média, à
temperatura de ± 20 °C por 18 horas.
As medidas reológicas das soluções polissacarídicas foram efetuadas em
reômetro HAAKE Rheostress, modelo RS75, acoplado a um banho termostatizado
HAAKE K15 e termocirculador de água DC5B3. Foi utilizado o sensor cone-placa com
diâmetro de 60 mm e ângulo do cone de 2 º. A taxa de cisalhamento ou deformação ( )
variou de 0 até 200 s
-1
com um tempo de 300 s, com aquisição de 200 pontos em escala
logarítmica. As amostragens foram realizadas em triplicata à temperatura de 25 °C. Os
reogramas, para cada uma das três concentrações de cada EPS, foram gerados
utilizando software RheoWin (versão 3.20). O modelo da Lei da Potência (Equação 1) foi
ajustado aos reogramas e os valores do índice de consistência e índice de
comportamento de fluxo do fluido foram determinados para as concentrações das
soluções analisadas
τ = K .
n
(Equação 1)
Onde: τ = tensão de cisalhamento (Pa)
= taxa de deformação (s
-1
)
K = índice de consistência (Pa.s)
n = índice de comportamento de fluxo do fluido (-)
101
2.5. Influência da salinidade na viscosidade
Com o objetivo de avaliar o comportamento reológico dos biopolímeros na
presença de sais, os mesmos foram solubilizados em NaCl 0,2 M na concentração de 5
g/L à temperatura de 25 ºC e as medidas reológicas foram efetuadas como no item 2.4.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Quantificação dos exopolissacarídeos
Os exopolissacarídeos, R
1
, R
2
, R
3
e R
4
, foram quantificados para açúcares totais e
redutores, proteínas e ácidos urônicos. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Os
baixos valores encontrados na quantificação de açúcares redutores
12
sinalizam que os
carboidratos presentes em solução estão, principalmente, na forma de polissacarídeos e
o elevado teor de ácido urônico (8,4 %) presente no polissacarídeo produzido pelo
Mesorhizobium (R
3
) indica um polímero aniônico. No preparo das soluções
polissacarídicas para as reações de quantificação o R
3
apresentou-se como menos
viscoso e, de acordo com a literatura, o comportamento reológico de polímeros acídicos é
diferente daquele apresentado pelos polímeros neutros. A presença de ácidos
glucurônico e pirúvico na goma xantana, confere ionicidade à mesma, promovendo
alterações na conformação molecular e aumentando a solubilidade de suas soluções.
4
Os resultados da hidrólise ácida, para açúcares neutros (Tabela 1), indicaram
uma pequena diferença na composição de R
1
e R
2
, ambos produzidos pelo mesmo
microrganismo, Rhizobium tropici, com pequenas variações no método de produção. A
presença majoritária da glucose em todos os exopolissacarídeos indica uma cadeia
principal constituída, principalmente, de glucose. De acordo com a literatura
microrganismos de linhagens diferentes ou com diferenças apenas nas condições de
cultivos, produzem polissacarídeos semelhantes nos quais a cadeia principal,
normalmente, é a mesma, com variações no grau de ramificação. Esses resultados
também foram, parcialmente, demonstrados por Castellane e Lemos.
10
102
Tabela 1 – Quantificações de açúcares totais e redutores, proteínas e ácido urônico
dos exopolissacarídeos produzidos por diferentes linhagens de bactérias do gênero
Rhizobium.
Exopolissacarídeos/
Microorganismos
produtores
Açúcar
total (%)
Açúcar
redutor
(%)
Proteína
(%)
Ácido
urônico
(%)
Composição em
açúcares
neutros (%)
R
1
(Rhizobium tropici)
94,6 0,10 3,0 2,4 Glc 77
Gal 18
Man 3
R
2
(Rhizobium tropici)
94,1
0,11
4,2
1,7
Glc 79
Gal 21
Man traços
R
3
(Mesorhizobium)
87,1
0,12
4,5
8,4
Glc 87
Gal 13
Man traços
R
4
(Rhizobium sp.)
95,1
0,10
4,1
0,8
Glc 80
Gal 20
Man traços
Traços significam < 1%
Considerando-se que os resultados apresentados na tabela 1 indicam que as
moléculas devem possuir algumas diferenças estruturais, foram preparadas soluções de
diferentes concentrações para averiguar o comportamento reológico de cada
exopolissacarídeo, selecionado para esse trabalho.
3.2. Comportamento reológico das soluções formadas pelos exopolissacarídeos
A curva de fluxo, definida a partir das medidas de tensão de cisalhamento (τ) x
taxa de deformação ( ) permite verificar o comportamento de fluxo das soluções
polissacarídicas. A partir da construção do reograma é possível estabelecer se um
líquido apresenta comportamento de fluxo Newtoniano ou não-Newtoniano, em
determinadas condições de tensão ou taxa de deformação. Um líquido Newtoniano é
representado, graficamente, por uma reta com início na origem da curva de fluxo. Os que
não exibem esse comportamento são chamados não-Newtonianos. A análise dos
reogramas com diferentes concentrações poliméricas permite evidenciar a transição de
um comportamento Newtoniano para não-Newtoniano.
17
103
O perfil apresentado nos reogramas mostrados na figura 2 permite estabelecer
que as soluções polissacarídicas R
1,
R
2,
R
3
e
R
4
têm comportamento de fluxo de líquidos
não-Newtonianos e o aumento da tensão de cisalhamento a partir do aumento
progressivo da taxa de deformação, caracteriza as soluções como fluidos
pseudoplásticos.
18
Soluções formadas pelo EPS 450, produzido pelo Bacillus SP,
também apresentam comportamento pseudoplástico assim como várias outras soluções
de polissacarídeos microbianos.
19
A descrição do comportamento reológico dos materiais pode ser feita através de
modelos que relacionam como a tensão de cisalhamento varia com a taxa de
deformação. Dentre os modelos matemáticos existentes, alguns dos mais utilizados para
os sistemas de alimentos são Ostwald-De-Waele (Lei da Potência), Casson, Herschel-
Bulkley e Mizrahi-Berki. Os dois primeiros utilizam equações matemáticas com dois
parâmetros e os demais com três parâmetros.
20
Para as soluções formadas pelos
exopolissacarídeos produzidos pelas diferentes linhagens de Rhizobium, nas
concentrações de 2, 5 e 10 g/L o modelo de Ostwald-De-Waele proporcionou os
melhores ajustes, com maiores valores do coeficiente de regressão (R
2
) e menores
valores para χ
2
(Tabela 2). O desvio de “n” da unidade indica o grau de desvio do
comportamento newtoniano. Valores de n < 1 definem comportamento pseudoplástico. As
soluções polissacarídicas estudadas neste trabalho apresentaram n < 1, indicando
comportamento pseudoplástico (Tabela 2).
104
Figura 2. Reogramas (tensão de cisalhamento x taxa de deformação) das soluções
polissacarídicas (A) R
1
, (B) R
2
, (C) R
3
e (D) R
4
nas concentrações de 2 g/L, 5 g/L e 10
g/L, à temperatura de 25 °C
105
Tabela 2. Parâmetros reológicos obtidos pela análise das soluções exopolissacarídicas
pela aplicação do modelo da Lei da Potência.
Amostra
Concentração
(g/L)
Índice de
Consistência
(K)
Índice de
Comportamento
de Fluxo (n)
Coeficiente
de Regressão
(R
2
)
χ
χχ
χ
2
EPS R
1
2 0.51 0.30 0,99 0,05
5 3.14 0.11 0,98 0,08
5 em NaCl 3.36 0.19 0,99 0,04
10 9.30 0.12 0,99 0,05
EPS R
2
2 0.52 0.30 0,99 0,09
5 3.70 0.09 0,99 0,06
5 em NaCl 3.80 0.17 0,99 0,08
10 7.33 0.14 0,99 0.06
EPS R
3
2 0.04 0.73 0,99 0,06
5 0.52 0.50 0,99 0,06
5 em NaCl 0.32 0.55 0,99 0.06
10 4.90 0.28 0,99 0,07
EPS R
4
2 0.50 0.32 0,99 0,06
5 3.24 0.10 0,98 0,09
5 em NaCl 4,31 0.21 0,99 0,02
10 7.13 0.13 0,99 0,04
É possível, ainda, observar a partir do índice de consistência (K) (Tabela 2) um
aumento progressivo da viscosidade conforme se aumenta a concentração das soluções
de todos EPS. Nota-se uma tendência da solução do exopolissacarídeo R
1
ser mais
viscosa do que as soluções de R
2
, R
3
e R
4
, principalmente em concentrações maiores
106
(10 g/L). R
3
apresenta menores valores de K, em qualquer uma das concentrações
analisadas, em comparação aos demais EPS.
A tabela 2 mostra que as soluções dos exopolissacarídeos R
1
, R
2
e R
4
, em
presença de NaCl 0,2 M, apresentam um pequeno aumento no valor do índice de
consistência (K) quando comparados com as mesmas concentrações das soluções
aquosas dos respectivos polissacarídeos, indicando que a presença desse eletrólito
favorece a viscosidade dos polímeros. Um valor menor de K para o exopolissacarídeo
produzido pelo Mesorhizobium (R
3
), em presença de sal na concentração de 5 g/L pode
ser atribuído à interação entre resíduos carregados de ácido urônico (8,4 %) e os íons
provenientes da dissociação do sal. A dissolução do hidrogel quitosana-xantana em meio
eletrolítico promove o aumento da viscosidade, enquanto para a goma xantana sozinha,
em baixas concentrações, a adição de um eletrólito, por exemplo, NaCl, reduz a
viscosidade; entretanto, em concentrações elevadas a presença do eletrólito tem efeito
oposto, embora um gel fraco de xantana seja formado.
7,21
3.3. Efeito da adição de sal na viscosidade
As curvas de fluxo têm suas correspondentes curvas de viscosidade.
17
Foram
realizados estudos quanto à viscosidade aparente das soluções aquosas (2, 5 e 10 g/L)
dos biopolímeros R
1
, R
2
, R
3
e R
4
. As medidas da viscosidade (η) x taxa de deformação ( )
foram reunidas em um único gráfico, para cada um dos EPS investigados. Pelos
resultados obtidos (Figura 3) é possível observar que a viscosidade aumenta com o
aumento da concentração dos polímeros, entretanto com o aumento da taxa de
deformação, para uma mesma concentração do polímero, ocorre a diminuição da
viscosidade. Fluidos que sofrem diminuição da viscosidade, quando a taxa de
deformação aumenta, são chamados pseudoplásticos.
22
Esse perfil caracteriza o
comportamento pseudoplástico de R
1
, R
2
, R
3
e R
4
107
Figura 3. Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de deformação ( ) de (A) R
1
, (B)
R
2
, (C) R
3
e (D) R
4
nas concentrações de 2 g/L, 5 g/L e 10 g/L, em solução aquosa, à
temperatura de 25 °C.
108
Um estudo comparativo da viscosidade das soluções aquosa e salina dos
biopolímeros (5 g/L), juntamente com o teor de ácidos urônicos, é apresentado na Tabela
3. Valores maiores de viscosidade são encontrados em baixas taxas de deformação
(10 s
-1
), com R
3
apresentando os menores valores. O decréscimo da viscosidade
aparente com o aumento da taxa de deformação pode ser atribuído a mudança estrutural
dos polímeros devido as forças hidrodinâmicas geradas e o maior alinhamento das
moléculas na direção da tensão aplicada.
23
Em taxas de deformação mais elevadas os
valores de viscosidade para os quatro polímeros são praticamente semelhantes,
provavelmente devido a ação de deformação sobre a estrutura das moléculas.
Tabela 3 – Viscosidade absoluta (η) das soluções aquosa e salina dos EPS R
1
, R
2
, R
3
e
R
4
, nas concentrações de 5 g/L e nas taxas de deformação ( ) 10; 50 e 100 (s
-1
), à
temperatura de 25 °C.
Viscosidade (η) (Pa.s)
Ácido urônico (%) 10 s
-1
50 s
-1
100 s
-1
R
1
2,4 5 g/L em H
2
0 0,41 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,51 0,14 0,08
R
2
1,7 5 g/L em H
2
0 0,45 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,54 0,14 0,08
R
3
8,4 5 g/L em H
2
0 0,14 0,07 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,10 0,05 0,04
R
4
0,8 5 g/L em H
2
0 0,44 0,10 0,05
5 g/L em NaCl 0,2 M 0,44 0,12 0,07
R
1
, R
2
e R
4
solubilizados em solução aquosa de NaCl apresentaram maior
viscosidade quando comparados com os respectivas polímeros dissolvidos apenas em
109
água. R
3
comportou-se como o menos viscoso, tanto em meio aquoso quanto em solução
aquosa contendo NaCl, provavelmente devido ao maior percentual de ácidos urônicos
(8,4 %) em sua estrutura. Freitas e colaboradores
24
estudaram o comportamento
reológico de um exopolissacarídeo acídico produzido por Pseudomonas oleovorans
NRRLB-14682, em solução aquosa, e constataram que possui propriedades
viscoelásticas similares a goma Guar, mas com grande afinidade aos sais, como
resultado de sua característica de polieletrólito.
4. CONCLUSÕES
Os resultados encontrados nos experimentos efetuados neste trabalho indicam
que linhagens diferentes (R
1
/R
2
/R
4
e R
3
) de um mesmo microrganismo produzem
moléculas de composição química semelhantes, entretanto com diferenças, ainda que
sutis, suficientes para alterar o comportamento reológico de suas soluções.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq pela bolsa de mestrado ao aluno Gabriel A. Selverio e à FAPESP (processo
05/53879-3).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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