( PDF ) Polifenóis e capacidade antioxidante em alimentos orgânicos e convencionais

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Ana Luísa Kremer Faller

POLIFENÓIS, VITAMINA C E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE

ALIMENTOS ORGÂNICOS E CONVENCIONAIS

Rio de Janeiro

2008

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- ii -

ANA LUÍSA KREMER FALLER

POLIFENÓIS, VITAMINA C E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE

ALIMENTOS ORGÂNICOS E CONVENCIONAIS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Nutrição,

Instituto de Nutrição Josué de Castro,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Nutrição.

Orientadora: Eliane Fialho de Oliveira

Rio de Janeiro

2008

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- iii -

ANA LUÍSA KREMER FALLER

POLIFENÓIS, VITAMINA C E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE

ALIMENTOS ORGÂNICOS E CONVENCIONAIS

Banca Examinadora:

Profª. Eliane Fialho de Oliveira

Profª. Adjunto do Departamento de Nutrição Básica e Experimental/ INJC / UFRJ

Orientadora

Profª. Vera Lúcia Valente Mesquita

Profª. Adjunto do Departamento de Nutrição Básica e Experimental/ INJC / UFRJ

Revisor

Prof. Antônio Gomes Soares

Pesquisador do Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos, CTAA,

EMBRAPA.

Profª. Carmen Marino Donangelo

Profª. Titular do Departamento de Bioquímica/ IQ / UFRJ

Profª. Adriana Farah de Miranda Pereira

Profª. Visitante do Departamento de Bioquímica/ IQ / UFRJ

Suplente Externo

Profª. Lucia Maria Jaeger de Carvalho

Profª. Adjunto do Departamento de Nutrição Básica e Experimental/ INJC / UFRJ

Suplente Interno

- iv -

Ficha catalográfica

Faller, Ana Luísa Kremer

Polifenóis, Vitamina C e Capacidade Antioxidante de Alimentos Orgânicos e

Convencionais/Ana Luísa Kremer Faller. Rio de Janeiro: UFRJ/INJC, 2008

de folhas xviii, 189 p.

Dissertação: Mestre em Nutrição – Universidade Federal do Rio de Janeiro,

INJC

1. Polifenóis 2. antioxidante 3. frutas e hortaliças 4. Dissertação

I. Polifenóis, Capacidade Antioxidante de Alimentos Orgânicos e

Convencionais.

II. Mestre

- v -

Este trabalho foi realizado no laboratório de Química e Bioquímica de

Alimentos no Instituto de Nutrição, sob orientação da Professora Eliane

Fialho de Oliveira, na vigência de auxílios concedidos pela Fundação

Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ), Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB-ALV) e

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

- vi -

Dedico esta dissertação às minhas

famílias biológica e acadêmica, por

todo incentivo, apoio e amizade.

- vii -

Agradecimentos

Agradeço, primeiramente, aos meus pais, Maria Ester e Newton, pelo apoio e

incentivo incondicional, estimulando a seguir meu próprio caminho, não

importando qual que fosse minha escolha;

À minha mãe, minha irmã Maria Clara e ao Rubens, por agüentar muitas vezes

minha falta de paciência e de humor por estar com a cabeça voltada para o

trabalho e não para a família;

À Lili, minha orientadora, por ser a pessoa batalhadora, incentivadora e

competente que é, capaz de cobrar e dar conselhos da maneira certa e na hora

certa, fazendo de seus alunos não só amigos mas realmente colegas de

trabalho;

Ao meu namorado Marcelo, que assim como a família teve de agüentar

momentos estressantes, além de perder a companhia da namorada em

diversos finais de semana;

A toda minha família, que mesmo não sabendo exatamente o que eu faço,

sempre teve muito orgulho;

À minha família científica! Laços criados e cultivados no laboratório, onde

muitas vezes ficávamos mais tempo juntos do que com nossas famílias

biológicas: Fabi, Vagner, Chris, Dani, Renatinha, Daniel, Jaqueline, Paula...

- viii -

Às professoras Vera Valente e Maria Lúcia, pelo ótimo período como colegas

de sala;

Ao Laboratório de Bioquímica de Insetos, especialmente à Heloísa, não só pelo

uso do HPLC como pela paciência por ensinar todos os aspectos do

equipamento, além da minha presença quase ininterrupta nessa etapa final;

Dedico também ao meu filhote, Tico, que certamente ajudou como válvula de

escape em momentos de tensão e ansiedade;

Por fim, dedico especialmente a meu pai, que mesmo não estando mais

presente, sei que está sempre me guiando, me protegendo e me orientando na

vida. Te amo.

- ix -

Resumo

O consumo de frutas e hortaliças está relacionado com a redução da incidência

de doenças crônicas não-transmissíveis. Os benefícios proporcionados por

estes alimentos devem-se, em parte, à sua composição química rica em

substâncias antioxidantes, como polifenóis e o ácido ascórbico. A agricultura

orgânica baseia-se na ausência de agroquímicos sintéticos, o que

proporcionaria maior exposição das plantas cultivadas a situações de estresse

biótico e abiótico. Como resultado, pode haver um maior estímulo à síntese de

compostos de defesa, como os polifenóis, podendo aumentar a uma maior

capacidade antioxidante nos alimentos cultivados na agricultura orgânica. O

objetivo deste trabalho foi avaliar diferenças no teor de polifenóis, vitamina C e

na capacidade antioxidante de frutas e hortaliças in natura, e suas diferentes

frações, produzidas sob cultivo orgânico e convencional, assim como após a

cocção das hortaliças. Os alimentos selecionados foram aqueles de consumo

freqüente no Brasil, de acordo com a Tabela de Aquisição Domiciliar per capita

da Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF) de 2002/2003 do IBGE. Estes

foram processados obtendo-se um extrato fluido, o qual foi utilizado para as

análises de polifenóis solúveis e hidrolisáveis, através do método de Folin-

Ciocalteu, ácido ascórbico e dehidroascórbico por CLAE e capacidade

antioxidante por DPPH. Os resultados mostram que as frutas são mais

suscetíveis à modulação do teor de polifenóis pelo tipo de agricultura do que as

hortaliças. Da mesma forma, as frutas apresentaram maior variação do

conteúdo destes fitoquímicos entre as frações analisadas. As capacidades

antioxidantes das hortaliças orgânicas e convencionais in natura não foram

estatisticamente diferentes, enquanto que para a maioria das frutas as cascas

- x -

orgânicas apresentaram maior capacidade antioxidante. O teor de ácido

ascórbico e dehidroascórbico variaram de acordo com a hortaliça analisada,

sendo estatisticamente superior nas folhas e flores de brócolis convencional. A

adição de ácido ascórbico em alguns alimentos mostrou ter efeito positivo

sobre a quantificação de polifenóis solúveis, apresentando menor influência

sobre os polifenóis hidrolisáveis. A cocção levou à redução do teor de

polifenóis na maioria das hortaliças, sendo acompanhado pela redução da

capacidade antioxidante. Os polifenóis solúveis e as hortaliças orgânicas foram

mais sensíveis ao efeito térmico. Os resultados sugerem que as frutas são

mais suscetíveis do que as hortaliças à modulação no teor de polifenóis e na

capacidade antioxidante pelo tipo de agricultura aplicado, apresentando

frequentemente diferenças significativas entre as frações analisadas. No

entanto, diferenças observadas entre orgânicos e convencionais parece variar

de acordo com a espécie vegetal analisada.

- xi -

Abstract

Fruit and vegetable intake is associated with the reduction of chronic diseases.

The benefits provided by these food groups are due to their chemical

composition rich in antioxidant susbtances, such as polyphenols and vitamin C.

Organic agriculture is based on the absence of synthetic agrochemicals, leading

the plant to a higher exposure of biotic and abiotic stresses, causing the

induction of the synthesis of defense compounds. Among these compounds are

polyphenols, which could enhance the antioxidant capacity of organic foods.

The objective of this work was to evaluate differences in polyphenol, vitamin C

and antioxidant capacity of different fractions of raw fruits and vegetables

produced by organic and conventional agricultures, as well as after cooking of

vegetables. Foods were selected according to the Tabela de Aquisição

Domiciliar per capita of Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF) 2002/2003

database from IBGE. Fruits and vegetables were processed into fluid extracts

which were used for the analyses of soluble and hydrolysable polyphenols,

using the Folin-Ciocalteu method, ascorbic acid and dehydroascorbic acid

contents were measured by HPLC, and antioxidant capacity by DPPH method.

Results showed higher sensitivity of fruits to agricultural modulation of

polyphenols when compared to the vegetables. Fruits also showed higher

variation of polyphenols contents between the food fractions analysed. No

significative difference was observed between organically and conventionally

grown raw vegetables, while for fruits there was a tendency favoring the organic

production. Ascorbic acid and dehydroascorbic acid varied according to the

vegetables evaluated, having no diferences between the two types of

agriculture. The adition of ascorbic acid, however, resulted in a positive effect in

- xii -

the quantification of soluble polyphenols. Cooking resulted in deleterious effects

on the polyphenol contents for most vegetables, followed by the reduction in the

antioxidant capacity. This work shows that the type of agriculture does not

modulate the synthesis of polyphenols. Cooking of vegetables can lead to a

reduction of polyphenols and antioxidant capacity. Results indicate that fruits

are more susceptible to variations in polyphenol content and antioxidant

capacity due to different agricultural practices. Polyphenol and ascorbic acid

contents, along with antioxidant capacity modulation, did vary, however,

according to the plant food analysed.

- xiii -

Lista de Abreviaturas

µL Microlitros

µM Micromolar

µg Micrograma

Absorbância no tempo zero

Absorbância no tempo em questão

AA Ácido ascórbico

APX Ascorbato peroxidase

CAT Catalase

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CV Convencional

DCV Doenças cardiovasculares

DHA Ácido dehidroascórbico

DPPH 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil

E. coli

Escherichia coli

EAG Equivalentes de ácido gálico

EF Extrato fluido

EH Extrato hidrolisável

ERO’s Espécies reativas de oxigênio

ES Extrato solúvel

FAL Fenilalanina amônia liase

FAO Food and Agriculture Organization

g Grama

GSH Glutationa

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IFOAM

International Federation of Organic Agricultural

Movements

M Molar

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

mcg Micrograma

mg Miligrama

min Minutos

nm Nanômetros

OG Orgânico

pH Potencial hidrogeniônico

POF Pesquisa de Orçamentos Familiares

PPO Polifenoloxidase

SE Solução de extração

SOD Superóxido dismutase

SRL Seqüestro de radicais livres

v/v Volume por volume

- xiv -

Lista de Ilustrações

Figura 1. Principais Grupos de Fitoquímicos.

Figura 2. Estrutura química dos principais ácidos fenólicos: (A) ácido gálico;

(B) ácido ferúlico.

Figura 3. Estrutura química do resveratrol.

Figura 4. Estrutura química básica dos flavonóides.

Figura 5. Estrutura das Principais Classes de Flavonóides, Compostos

Bioativos e Fontes Alimentares.

Figura 6. Integração entre Metabolismos Primário (carboidratos) e

Secundário (fenilpropanóides).

Figura 7. Diferentes Situações de Estresse e Aumento da Síntese de Alguns

Fitoquímicos.

Quadro 1. Interações Negativas entre o Conteúdo de Compostos Fenólicos e

Agroquímicos.

Tabela 1. Estudos Relacionando Polifenóis e Alimentos Orgânicos.

Quadro 2. Alimentos e Frações Utilizadas para Análises

Quadro 3. Tempo de Cozimento das Hortaliças de Acordo com Diferentes

Métodos de Cocção.

Tabela 2. Conteúdo de Polifenóis Solúveis em Hortaliças Orgânicas e

Convencionais.

Tabela 3. Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis em Hortaliças Orgânicas e

Convencionais.

Figura 8. Variação do Conteúdo de Polifenóis Solúveis nas Diferentes

Frações de Hortaliças.

Figura 9. Variação do Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis nas Diferentes

Frações de Hortaliças.

Tabela 4. Conteúdo de Polifenóis Solúveis em Frutas Orgânicas e

Convencionais.

Figura 10. Variação do Conteúdo de Polifenóis Solúveis nas Diferentes

Frações de Frutas.

Tabela 5. Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis em Frutas Orgânicas e

Convencionais.

Figura 11. Variação do Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis nas Diferentes

Frações de Frutas.

Figura 12. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante de Hortaliças

Orgânicas e Convencionais pelo Método DPPH.

- xv -

Tabela 6. Capacidade de Seqüestro de Radicais Livres em Hortaliças

Orgânicas e Convencionais.

Figura 13. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante de Hortaliças

Orgânicas e Convencionais pelo Método DPPH.

Tabela 7. Capacidade de Seqüestro de Radicais Livres em Frutas Orgânicas

e Convencionais.

Figura 14. Perfil Cromatográfico do Conteúdo de Ácido Ascórbico e do Ácido

Dehidroascórbico.

Figura 15. Curva Padrão de Ácido Ascórbico (A) e Ácido Dehidroascórbico

(B).

Tabela 8 - Teor de Ácido Ascórbico e Ácido Dehidroascórbico em Hortaliças

Orgânicas e Convencionais.

Figura 16. Curvas Padrão de Ácido Ascórbico (A) e Ácido Gálico (B) com

Reagente Folin-Ciocalteu

Figura 17. Polifenóis solúveis e hidrolisáveis em alimentos na ausência e na

presença de ácido ascórbico

Figura 18. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante dos Extratos

Solúveis e Hidrolisáveis Adicionados de Ácido Ascórbico.

Tabela 9 – Capacidade Antioxidante dos Extratos Solúveis e Hidrolisáveis

Adicionados de Ácido Ascórbico

Tabela 10 - Variação do pH dos Extratos Adicionados de Ácido Ascórbico

Tabela 12. Resumo dos Resultados Obtidos para Hortaliças Orgânicas e

Convencionais.

Tabela 13. Resumo dos Resultados Obtidos para Frutas Orgânicas e

Convencionais.

- xvi -

Sumário

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1

1.1. COMPOSTOS FENÓLICOS

1.1.1. Metabolismo e Biodisponibilidade 3

1.1.2. Classificação, Estrutura e Fontes Alimentares 7

1.1.2.1. Ácidos Fenólicos 7

1.1.2.2. Estilbenos 8

1.1.2.3. Cumarinas 9

1.1.2.4. Lignanas 10

1.1.1.5. Flavonóides 10

1.2. COMPOSTOS FENÓLCIOS EM ALIMENTOS VEGETAIS

1.2.1. Síntese e Localização Celular

1.2.2. Efeitos Fisiológicos dos Compostos Fenólicos

1.2.3. Processamento de Alimentos Sobre o Conteúdo de

Polifenóis

1.3. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DO CONTEÚDO DE POLIFENÓIS E

CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM ALIMENTOS

1.4. VITAMINA C EM ALIMENTOS VEGETAIS 27

1.5. AGRICULTURA ORGÂNICA

1.5.1. Panorama Brasileiro da Agricultura Orgânica

1.5.2. Qualidade do Alimento Orgânico

1.5.3. Polifenóis na Agricultura Orgânica 36

1.6 JUSTIFICATIVA

- xvii -

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

2.2. ESPECÍFICOS

3. MATERIAL E MÉTODOS 43

3.1 MATERIAL

3.2. SELEÇÃO E AQUISIÇÃO DOS ALIMENTOS 43

3.3. PREPARO DAS AMOSTRAS 44

3.4. COCÇÃO DE HORTALIÇAS

3.5. DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS SOLÚVEIS E

HIDROLISÁVEIS

3.5.1. Extração de Polifenóis Solúveis e Hidrolisáveis

3.5.2. Quantificação de Polifenóis Solúveis e Hidrolisáveis

3.5.3. Percentual de Diferença entre Formas de Cultivo 48

3.6. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE

3.6.1. Capacidade Antioxidante pelo Método do Radical DPPH

3.7. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO 49

3.8. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A

DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE POLIFENÓIS E

CAPACIDADE ANTIOXIDANTE POR DPPH

3.9. DISPONIBILIDADE DE POLIFENÓIS EM ALIMENTOS

NACIONAIS

3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 53

4.1. POLIFENÓIS EM HORTALIÇAS E FRUTAS ORGÂNICAS E

CONVENCIONAIS

- xviii -

4.2. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM HORTALIÇAS E FRUTAS

ORGÂNICAS E CONVENCIONAIS

4.3. CONTEÚDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM HORTALIÇAS

ORGÂNICAS E CONVENCIONAIS

4.4. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A

DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE POLIFENÓIS E

CAPACIDADE ANTIOXIDANTE POR DPPH

4.5. EFEITO DE DIFERENTES MÉTODOS DE COCÇÃO SOBRE O

TEOR DE POLIFENÓIS E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE

HORTALIÇAS ORGÂNICAS E CONVENCIONAIS

4.6. DISPONIBILIDADE DE POLIFENÓIS EM ALIMENTOS

NACIONAIS

5. CONCLUSÕES

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95

ANEXOS

Anexo A - MANUSCRITO - POLYPHENOL AND ANTIOXIDANT CAPACITY

OF ORGANICALLY AND CONVENTIONALLY GROWN

VEGETABLES AFTER DOMESTIC COOKING

113

Anexo B - MANUSCRITO - FRUTAS, HORTALIÇAS E DISPONIBILIDADE

DE POLIFENÓIS NO BRASIL

141

Anexo C - MANUSCRITO - MÉTODOS DE ANÁLISE DA CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE EM ALIMENTOS

163

Revisão Bibliográfica

1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. COMPSOTOS FENÓLICOS

Os fitoquímicos são, por definição, compostos bioativos não-nutritivos dos

vegetais e compreendem carotenóides, alcalóides, compostos organosulfurados,

compostos não-nitrogenados e polifenóis (figura 1). Os compostos fenólicos,

freqüentemente chamados de polifenóis, correspondem por uma das maiores

classes de fitoquímicos, incluindo mais de 8.000 substâncias já identificadas e outras

demais ainda não investigadas (LIU, 2004).

Figura 1. Principais Grupos de Fitoquímicos. Adaptado de: Liu, R. H., 2004.

A principal característica estrutural dos compostos fenólicos é a presença de

pelo menos um anel aromático associado à, no mínimo, um radical hidroxila,

constituindo assim um grupamento fenólico. A presença do radical hidroxila é uma

das principais responsáveis pela capacidade antioxidante destes compostos, tendo

relação direta entre o número e sua posição na estrutura química e a capacidade de

Fitoquímicos

Carotenóides

Alcalóides

Compostos

Fenólicos

Compostos

não-nitrogenados

Compostos

Organosulfurados

Ácidos Fenólicos

Flavonóides

Estilbenos

Cumarinas

Lign

Revisão Bibliográfica

neutralizar radicais livres. Outra característica importante é a existência de polifenóis

nas formas aglicona e glicosídica. A forma aglicona, raramente encontrada na

natureza, é formada pela estrutura fenólica quando esta não está associada a um

radical glicosídico. Esta característica aumenta a facilidade de extração da molécula

a partir da matriz alimentar, assim como favorece a mais rápida absorção no trato

digestório a partir da sua ingestão. Nos vegetais, os flavonóis e proantocianidinas

são os únicos grupos cujas formas agliconas podem ser encontradas em alimentos

(MANNACH ET AL., 2004). Já as formas glicosídicas compreendem estruturas

fenólicas associadas a glicosídeos, sendo os principais resíduos de açúcar que as

compõem a glicose, podendo ser também constituído por arabinose, galactose,

glicoramnose, lignina, L-ramnose e xilose, estando muitas vezes associada a

polissacarídeos da parede celular. Algumas estruturas se encontram também sob a

forma acilada, como ocorre no caso das antocianinas (KÜHNAU, 1976).

Os polifenóis são substâncias presentes exclusivamente em plantas, uma vez

oriundas de seu metabolismo secundário. Ao contrário do metabolismo primário, no

qual são utilizados nutrientes essenciais para o desenvolvimento do vegetal, como

moléculas de carboidratos, proteínas e lipídeos, o metabolismo secundário sintetiza

outros compostos, não-essenciais. Dentre eles podemos citar pigmentos que

conferem a coloração característica de flores e frutos, como no caso das

antocianinas. Apesar de não essenciais ao desenvolvimento do vegetal, os

compostos fenólicos exercem papel importante na fisiologia da planta atuando como

atrativos à polinização, protetores contra o ataque de predadores, patógenos e

parasitas, reguladores do crescimento, fitohormônios além de participarem de

estruturas da parede celular (GRINDER-PEDERSEN ET AL., 2003). Outra

característica importante dos polifenóis é que síntese pode ser estimulada por

Revisão Bibliográfica

fatores externos, como radiação solar, alterações climáticas e de solo (PRICE ET

AL., 1995).

1.1.1. Metabolismo e Biodisponibilidade

O número de estudos avaliando a biodisponibilidade dos compostos fenólicos

vem aumentando, no entanto, apenas algumas substâncias já apresentam suas vias

de absorção, metabolização e excreção bem esclarecida. De maneira geral, sabe-se

que o metabolismo e a biodisponibilidade estão associadas a sua estrutura química.

As formas agliconas vêm sendo descritas como aquelas que apresentam maior e

mais rápida absorção no trato gastrointestinal, podendo ser absorvidas ainda no

intestino delgado. Acredita-se ainda, que as formas agliconas, por terem

característica mais lipofílica, possam ser mais facilmente absorvidas ao utilizar

mecanismos de transporte passivo nas membranas celulares (MANNACH ET AL.,

2004).

As moléculas glicosídicas são tidas como moléculas de maior polaridade,

tendo maior peso molecular e caráter mais hidrofílico. Isso permite com que sejam

armazenadas no interior de vacúolos, sendo esta uma razão para a maior

concentração de formas glicosídicas nos vegetais. A glicosilação ocorre

principalmente no carbono 3 (C-3) podendo também, com menor freqüência, estar

no carbono 7 (C-7). Em função de sua ligação a diferentes radicais glicosídicos, sua

absorção normalmente ocorre após a hidrólise por enzimas intestinais ou por ação

da microflora colônica, através de β-glicosidases bacterianas. A enzima florizina

lactase hidrolase, presente na borda em escova, parece atuar sobre a deglicosilação

de compostos fenólicos, permitindo a difusão de algumas formas agliconas através

da membrana (DAY ET AL., 2000).

Revisão Bibliográfica

Quando há ação das bactérias intestinais freqüentemente ocorre extensa

metabolização da substância nativa, uma vez que após a deglicosilação, as

bactérias podem agir ainda sobre as formas agliconas liberadas pela matriz

alimentar, levando a formação de diversos ácidos aromáticos, como os ácidos

fenilvalérico, fenilpropiônico, fenilacético e benzóico (MANNACH ET AL., 2004).

Dessa forma, sabe-se que a forma na qual a estrutura molecular normalmente atinge

a circulação é bastante distinta daquela presente nos alimentos. Além disso, a

diversa gama de novas substâncias que são formadas durante o processo de

metabolização, dificulta seu rastreamento, em especial em estudos realizados in

vivo. Sabe-se, que as concentrações plasmáticas dos polifenóis são bastante

pequenas, não ultrapassando concentrações micromolares (KROON ET AL., 2004).

Os mecanismos envolvidos na absorção de compostos fenólicos ainda não

estão totalmente esclarecidos, uma vez que para cada substância as vias de

absorção podem ser diferentes. A maioria dos polifenóis possue caráter hidrofílico

dificultando a passagem pelas membranas dos enterócitos por difusão passiva.

Dentre alguns fatores que influem na absorção intestinal estão o peso molecular da

molécula, tipo de glicosilaçao e esterificação. O tipo de carboidrato ao qual o

polifenol está ligado, assim como a sua posição também influencia sua absorção, o

que resulta em diferenças nas biodisponibilidades de uma mesma substância a partir

de fontes alimentares distintas. Dentre os compostos já estudados, aqueles que

apresentam maior absorção, em ordem decrescente, são ácido gálico, isoflavonas,

catequinas, flavanonas e glicosídeos de quercetina. Antocianinas e antocianidinas

são os menos absorvidos, em virtude de sua estrutura mais complexa e

polimerizada (HOLLMAN ET AL., 1999).

A absorção gástrica é bastante restrita para compostos fenólicos, e, sendo

Revisão Bibliográfica

eles resistentes à acidez do estômago, a maioria chega na forma intacta ao

intestino. Estando a maior parte dos compostos fenólicos na forma glicosilada em

alimentos, a metabolização e hidrólise ainda no trato gastrointestinal pode ter um

efeito positivo sobre a liberação da matriz alimentar e acessibilidade à absorção.

Recentemente, pesquisadores espanhóis demonstraram, através de modelo de

digestão in vitro que do total de polifenóis ingeridos na dieta habitual, 48%

apresentavam disponibilidade de absorção no intestino delgado, 42% no intestino

grosso, enquanto que o restante não seria passível de absorção (SAURA-CALIXTO;

SERRANO; GOÑI, 2007). Isso demonstra que grande parte dos compostos fenólicos

ingeridos só são disponibilizados para digestão após fermentação colônica,

demonstrando um papel importante do intestino grosso no metabolismo de

polifenóis.

Um mecanismo de transporte ativo já bem definido para os compostos

fenólicos envolve transportadores de membrana dependentes de sódio, saturáveis,

que estão envolvidos na absorção dos ácidos ferúlicos e cinâmico, por exemplo.

Outros mecanismos vem sendo sugeridos, como a participação de transportares de

glicose dependentes de sódio, como o SGLT1, o qual já foi identificado ser capaz de

absorver glicosídeos de quercetina. Neste caso foi observado que a deglicosilação

ocorreu após absorção, no interior dos enterócitos (HOLLMAN ET AL., 1995). O

transporte de forma glicosídicas também já foi demonstrado através de

transportadores de glicose, como o GLUT2, atuando competitivamente com a

glicose (SONG ET AL., 2002).

Durante o processo de absorção e metabolização, os compostos fenólicos

sofrem conjugação ainda no intestino delgado e posteriormente no fígado, passando

pelos metabolismos de primeira e segunda passagem comuns à maioria dos

Revisão Bibliográfica

xenobióticos. Em função desta passagem pelo fígado, os compostos fenólicos

interagem com as enzimas do complexo citocromo P450, inclusive modulando

muitas vezes a sua atividade. Este complexo é constituído por diferentes isoenzimas

responsáveis pela detoxificação de metabólitos endógenos e substâncias exógenas,

reduzindo o seu grau de toxicidade e aumentando seu caráter hidrofílico, o que

possibilita mais rápida excreção via biliar ou urinária. Durante este processo, os

polifenóis podem ser conjugados à radicais metila, sulfatos ou glicuronídeos, sendo

a sulfatação mais freqüente em moléculas de baixo peso molecular, enquanto que a

glicuronidação é mais presente em moléculas de alto peso molecular. A

glicuronidação de alguns flavonóides já foi identificada por enzimas como (UDP)-

glicuronosiltransferase e O-metil-transferases (KROON ET AL., 2004).

A conjugação dos compostos fenólicos resulta na baixa presença de formas

agliconas circulando no plasma, tendo ainda seus derivados conjugados

normalmente circulando ligados à albumina. O acúmulo de polifenóis nos tecidos

ainda é bastante questionável, sabendo-se apenas que a absorção é mais facilitada

naqueles tecidos que metabolizam compostos fenólicos. Uma vez não apresentando

tecidos de reserva, o consumo freqüente de alimentos-fonte de polifenóis deve ser

garantido, a fim de manter níveis plasmáticos desejáveis. Um fator que prolonga a

meia via dos compostos fenólicos no organismo é a circulação entero-hepática. Ao

serem secretados na bile, os compostos podem sofrer nova metabolização,

exercendo novamente ação local tendo, ou não, posterior reabsorção intestinal. A

circulação entero-hepática justifica a ocorrência de novos picos plasmáticos 10 a 12

horas após a administração de algumas substâncias como as isoflavonas ou a

hesperetina, por exemplo, (WATANABE ET AL., 1998; MANACH ET AL., 2003).

Revisão Bibliográfica

1.1.2. Classificação, Estrutura e Fontes Alimentares

A classificação dos compostos fenólicos é variável de acordo com o autor,

podendo ser feita de acordo com a quantidade de anéis fenólicos presentes e pelos

elementos que fazem a ligação entre os anéis. Por esta classificação, os principais

grupos de polifenóis são os ácidos fenólicos, estilbenos, cumarinas, lignanas e

flavonóides (HARBORNE; WILLIAMS, 2000).

1.1.2.1. Ácidos Fenólicos

Este grupo de polifenóis pode ser novamente subdividido em derivados do

ácido hidroxibenzóico e derivados do ácido hidroxicinâmico. Os derivados do ácido

hidroxibenzóico têm como principais representantes os ácidos gálico, p-

hidroxibenzóico, vanílico e siríngico. Os compostos oriundos do ácido

hidroxicinâmico incluem os ácidos caféico, p-cumárico e ferúlico, além do éster

clorogênico. As estruturas básicas de alguns destes compostos estão demonstradas

na figura 2.

( A ) ( B )

Figura 2. Estrutura química dos principais ácidos fenólicos: (A) ácido gálico;

(B) ácido ferúlico

Revisão Bibliográfica

Os ácidos hidroxibenzóicos são pouco estudados diretamente a partir de

alimentos, devido a sua pequena concentração em vegetais que constituem a

alimentação humana. No entanto, vêm sendo bastante estudados por comporem os

principais metabólitos de compostos fenólicos mais complexos. Freqüentemente se

apresentam na forma esterificada, fazendo parte de complexos da parede celular

como as ligninas (CLIFFORD; SCALBERT, 2000).

Os ácidos hidroxicinâmicos, no entanto, são mais comuns e estão presentes

em maiores quantidades na alimentação humana, sendo freqüentemente

encontrados sob a forma de ésteres associados à celulose, lignina e proteínas. O

ácido ferúlico constitui o principal ácido fenólico encontrado nas partes mais

externas dos cereais, conjugado a mono, di e polissacarídeos da parede celular,

além de glicoproteínas, poliaminas e ligninas, sendo assim seu conteúdo no

alimento diretamente influenciado pelo grau de processamento e refinamento do

grão (HATCHER; KRUGER, 1997). O éster clorogênico é um dos mais conhecidos e

estudados ácidos hidroxicinâmicos, estando em altas concentrações em bebidas

como o café. Apresenta ingestão estimada entre 70 e 350mg por xícara, de 200mL,

de café, sendo variável de acordo com o tipo e processamento do grão e do método

de preparo da bebida (HIGDON; FREI, 2006).

1.1.2.2. Estilbenos

Presente de forma mais restrita na dieta, seu principal representante é o

resveratrol (figura 3), presente em alimentos como uva e vinho tinto, e, mais

reentemente identificado, em oleaginosas como as nozes. O resveratrol ganhou

evidência científica a partir de uma série de estudos que correlacionaram o consumo

do vinho tinto com a redução do risco de doenças cardiovasculares (DCV), atuando

Revisão Bibliográfica

positivamente ao induzir o relaxamento do músculo endotelial. Atualmente, sabe-se

que o resveratrol atua ainda na prevenção de diversas doenças como o câncer e

doenças neurodegenerativas (PERVAIZ ET AL., 2003).

Figura 3. Estrutura química do resveratrol.

1.1.2.3. Cumarinas

As cumarinas, especialmente as furanocumarinas, estão presentes em

plantas pertencentes às famílias Umbelliferae, Rutaceae, Moraceae e Leguminosae.

Apesar da sua função fisiológica nos vegetais ainda não estar completamente

definida, sabe-se que apresentam função importante ao proteger o vegetal contra

insetos e microrganismos. Em humanos, diversos estudos vêm demonstrando sua

alta capacidade de modular enzimas do citocromo P450. Alimentos-fonte, como a

toranja, por exemplo, já teve a sua ingestão associada à alteração do metabolismo

de diversos medicamentos (GUO, YAMAZOE, 2004).

Revisão Bibliográfica

1.1.2.4. Lignanas

A principal fonte alimentar deste polifenol é a semente de linhaça (Linum

usitatissimum L.) e o seu óleo, e, atualmente, já foram identificadas quantidades

pequenas deste grupo de polifenóis em outros alimentos, tais como gergelim, broto

de alfafa, lentilha, trigo, alho, entre outros. No entanto, o conteúdo de lignanas na

linhaça chega a ser até 1000 vezes maior que nos demais alimentos. Uma vez

ingeridas, as lignanas presentes na linhaça formando os metabólitos enterodiol e

enterolactona através da ação da microflora. Além da ação antioxidante, as lignanas

possuem também ação estrogênio-símile. Em função de sua estrutura semelhante

ao do hormônio endógeno feminino, estes compostos fenólicos podem atuar como

competidores do estrogênio na sua ligação aos receptores presentes nos tecidos

(DIXON, 2004).

1.1.2.5. Flavonóides

Como já mencionado anteriormente, os flavonóides constituem o maior grupo

dentre os polifenóis, não somente pelo número de compostos já identificados como

também por estarem largamente distribuídos na alimentação. Além disso, os

flavonóides são encontrados em quantidades significativas nos alimentos,

constituindo a principal classe de compostos fenólicos na dieta humana

(MIDDLETON, 1998). Sua estrutura química é caracterizada pela presença de três

anéis aromáticos, de baixo peso molecular, interligados associados à, no mínimo,

uma hidroxila (figura 4). A classificação dos flavonóides pode ser realizada

subdividindo-os em seis grupos de acordo com a sua capacidade de oxidação,

flavonas, flavonóis, flavanonas, flavanóis, antocianidinas e isoflavonas (ROSS,

KASUM, 2002).

Revisão Bibliográfica

Figura 4. Estrutura química básica dos flavonóides

A distribuição dos flavonóides pode ser restrita a alguns tipos de alimentos,

como as isoflavonas, presentes na soja e algumas leguminosas, e as flavanonas

típicas de frutas cítricas. Outros flavonóides, por outro lado, apresentam distribuição

mais abrangente, englobando diversos grupos alimentares, como ocorre com os

flavonóis (ROSS, KASUM, 2002) (figura 5).

Os flavonóis são considerados os flavonóides mais abundantes em alimentos,

tendo como principais representantes a quercetina e o campeferol, freqüentemente

encontrados glicosilados a moléculas de glicose ou raminose. As principais fontes

alimentares de flavonóis incluem a cebola, maçã, couve, alho-poró, brócolis e chá

preto, por exemplo, (ROBBINS ET AL., 2006).

Figura 5 - Estrutura das Principais Classes de Flavonóides, Compostos Bioativos e Fontes Alimentares. Adaptado de Roos e Kasum, 2002.

Flavonas

(exemplos: apigenina,

luteolina, diosmetina)

Principais Fontes:

Salsinha, tomilho, aipo

pimentão vermelho

Flavonóis

(exemplos: quercetina,

miricetina, campeferol)

Principais Fontes:

Cebola, couve, brócolis,

maçã, cereja, erva-doce,

chás

Flavanonas

(exemplos: naringenina,

hesperidina)

Principais Fontes:

Frutas cítricas e ameixas

Flavanóis

(exemplos: catequina,

epicatequina, galato de catequina)

Principais Fontes:

Chás, maçã, cacau

Antocianidinas

(exemplos: pelargonidina,

malvidina, cianidina)

Principais Fontes:

Cerejas e uvas

Isoflavonas

(exemplos: genisteína,

daidzeína)

Principais Fontes:

Soja e leguminosas

Revisão Bibliográfica

Em relação à biodisponibilidade dos flavonóis, Hollman et al. (1995)

demonstraram que a absorção da quercetina ocorre preferencialmente sob a forma

glicosídica em relação à aglicona. O tempo e o ritmo de absorção, no entanto,

variam de acordo com o tipo de ramificação, tendo os glicosídeos de ramnose

absorção mais lenta. No plasma, 20% a 40% da quercetina é encontrada conjugada

a grupamentos metil. A quercetina apresenta uma meia vida de 11 a 28 horas, o que

sugere extensa circulação entero-hepática, o que não ocorre para todos os

polifenóis (WILLIAMSON; MANACH, 2005).

As flavonas são pouco consumidas pela população, sendo constituídas

principalmente, por glicosídeos de luteolina e apigeína, e encontradas em aipo,

salsinha, trigo e na casca de algumas frutas cítricas (SARTELET ET AL., 1996).

As isoflavonas têm como principal alimento fonte a soja e seus derivados,

sendo um dos polifenóis mais estudados em relação à biodisponibilidade. Os

principais compostos que constituem este grupo são a daidzeína e a genisteína, as

quais foram atribuídas atividade estrogênio-símile desde a década de 50 (CHENG

ET AL., 1953; 1954). A ação da microflora colônica sobre as isoflavonas gera como

principal metabólito a substância equol, cuja atividade estrogênica é considerada

mais potente do que das isoflavonas precursoras. A produção desta substância é

favorecida quando a forma aglicona da daidzeína, daidzina, já está presente no

alimento consumido. Dados da literatura demonstram que a capacidade de produção

de equol é interindividual, sugerindo que apenas 30% a 40% da população ocidental

teria esta capacidade bem desenvolvida. Os fatores que influem na capacidade de

produção de equol ainda não estão completamente esclarecidos. Sabe-se,

entretanto, que há um fator genético associado a hábitos alimentares e a

composição da flora intestinal (ATKINSON; FRANKENFELD; LAMPE, 2005).

Revisão Bibliográfica

As flavanonas, representadas por hesperidina, naringenina, narirutina, entre

outros, estão presentes especialmente em frutas cítricas, como laranjas e

tangerinas, e também no tomate. Possuem um processo de hidrólise lento, de

aproximadamente 5 horas, até a transformação da forma glicosídica em aglicona,

para posterior absorção no cólon. Após degradação pela flora bacteriana, as

flavanonas geram substâncias como ácido p-hidroxifenilpropiônico, p-cumarínico, p-

hidroxibenzóico e ácido fenilpropiônico. A excreção urinária ocorre em torno de 8,6%

e 8,8% do total ingerido para naringenina e hesperidina, respectivamente (GRAF;

MILBURY; BLUMBERG, 2005).

Os flavanóis, tendo como uma das principais constituintes a catequina, podem

ser encontrados principalmente nos chás verde e preto, além do chocolate e vinho

tinto. Outros compostos, além da catequina, extensamente estudados são as

epigalocatequinas, galato de epigalocatequina e galato de epicatequina. Atualmente,

estudos sugerem que a epigalocatequina seria o único polifenol a exercer sua

atividade biológica como substância não conjugada, uma vez que se estima que

77% a 90% do total plsmático esteja sob a forma livre (FENG ET AL., 2006). Os

metabólitos microbianos gerados a partir das catequinas apresentam importante

ação local, além de constituir um mecanismo importante para manutenção dos

níveis circulatórios elevados (KARAKAYA ET AL., 2004).

As antocianidinas incluem dois principais grupos de moléculas, as

proantocianinas ou taninos condensados, e as antocianinas. Proantocianinas são

encontradas como polímeros, que podem variar entre 2 e 11 unidades. São

responsáveis pelo sabor adstringente que alguns alimentos, como cacau, maçã,

pêra e uva, podem apresentar. As formas poliméricas não são assim absorvidas, e

mesmo dímeros apresentam redução de 100 vezes na absorção em relação aos

Revisão Bibliográfica

monômeros. Porém, muitos efeitos biológicos associados as proantocianidinas são

localizados no trato digestório, protegendo a mucosa de danos oxidativos e

carcinógenos, de forma a não depender da ocorrência de hidrólise e absorção

(PRIOR; GU, 2005).

As antocianinas são pigmentos que conferem coloração característica

acerola, açaí, cerejas, ameixas, morangos, amoras, uvas e vinhos. Estudo

demonstrou uma possível absorção de antocianinas ainda no estômago, uma vez

que a ingestão de concentrações entre 150mg e 2000mg resultou na detecção

plasmática após apenas 1,5 horas. Além disso, as antocianinas parecem apresentar

baixa excreção urinária e pouca influência microflora intestinal, uma vez que a maior

parte dos glicosídeos encontrados na circulação apresentavam estruturas iguais aos

compostos originais (McGHIE; WALTON, 2007).

1.2. COMPOSTOS FENÓLICOS EM ALIMENTOS VEGETAIS

1.2.1. Síntese e Localização Celular

Os compostos fenólicos são sintetizados durante o processo de

desenvolvimento do tecido vegetal, tendo a quantidade produzida modulada por

estímulos internos e externos sofridos pelo vegetal. Como estímulo interno podemos

citar fitohormônios, como o ácido salicílico e o ácido abscícico, e, como estímulo

externo, injúrias, tanto físicas quanto microbiológicas (PRICE ET AL., 1995).

Inicialmente, os polifenóis foram caracterizados simplesmente como

compostos que conferiam, ou não, pigmentação. Porém, posteriormente verificou-se

que, além de conferir coloração, os polifenóis exerciam diversas funções, dentre elas

Revisão Bibliográfica

sinalização hormonal e para polinização, facilitador da formação do tubo de pólen,

protetor contra raios UV, fitoalexina, alelopatia, entre outros (TAYLOR;

GROTEWOLD, 2005).

A síntese dos polifenóis ocorre a partir do metabolismo primário dos

carboidratos que, ao entrarem na via do ácido chiquímico, podem ser desviados

para o metabolismo secundário ou continuarem no metabolismo primário. Através da

via do chiquimato, uma série de reações químicas leva à síntese de fenilalanina, a

qual pode ser utilizada para a síntese de proteínas ou de metabólitos secundários,

tais como os polifenóis. Conforme pode ser observado na figura 6, a fenilalanina,

sob a ação da enzima fenilalanina amônia liase (FAL), forma o primeiro ácido

fenólico; de forma que a FAL é considerada enzima chave entre os metabolismos

primário (via do ácido chiquímico) e secundário (fenilpropanóides) (RITTER,

SCHULTZ, 2004).

A via dos fenilpropanóides e a atividade da FAL estão diretamente

relacionadas ao sistema de defesa do vegetal, acionado a partir de estímulos de

estresse, sejam bióticos ou abióticos. Sabe-se que composição dos solos,

disponibilidade de nutrientes, situações de estresse, dentre outros fatores podem

interferir no metabolismo de polifenóis de vegetais (DIXON; PAIVA, 1995) (Figura 7).

A distribuição dos compostos fenólicos nos diferentes tecidos vegetais

apresenta diferenças qualitativas e quantitativas. Os polifenóis são encontrados

principalmente em vacúolos, sendo a grande maioria sintetizada em cloroplastos,

estando principalmente nas formas glicosiladas, mais hidrosolúveis. Apenas

pequenas frações são observadas no espaço livre, não estando clara a sua

presença no citoplasma

(KEFELI; KALERVITCH; BORSANI, 2003).

Revisão Bibliográfica

Figura 6. Integração entre Metabolismos Primário (carboidratos) e Secundário

(fenilpropanóides)

Algumas teorias sugerem uma explicação para a compartimentalização dos

polifenóis em vacúolo. A primeira propõe que os polifenóis seriam substâncias

remanescentes do processo evolutivo vegetal, compostos que já foram essenciais,

porém não são mais primordiais ao desenvolvimento da planta, ficando estocados

no interior de organelas. Outra teoria argumenta que a estocagem destes compostos

em vacúolos se dá pela possível toxicidade destes compostos para a célula, sendo

mantidos sem contato com o citoplasma. No entanto, esta segunda hipótese

encontra exceções, como a lignina ou outras moléculas mais simples que se

associam a carboidratos da parede celular (ésteres de ácido ferúlico, por exemplo).

Os compostos solúveis normalmente são encontrados na epiderme e subepiderme,

e em menor quantidade, no mesocarpo (BECKMAN ET AL, 2000).

Carboidrato

Dihidrochiquimico

Chiquimato

Chiquimato-3-

fosfato

Fenilalanina

Glicosinolato

FAL

Ácido 4 Cumárico

Malonil

CoA

Estilbeno

Ác. Clorogênico

Lignina

Isoflavona

Flavanona

Ac. Cinâmico

Revisão Bibliográfica

Figura 7. Diferentes Situações de Estresse e Aumento da Síntese de Alguns

Fitoquímicos (adaptado de Dixon & Paiva, 1995).

Além da compartimentalização, a estocagem de polifenóis na forma

glicosídica, também é um mecanismo de defesa contra sua toxicidade, uma vez que

não são tóxicos ao protoplasma vegetal quando glicosilados. A própria planta

apresenta glicosidases, mantidas em compartimento celular diferente do substrato,

mantendo o controle sobre a produção de estresse e toxicidade no meio celular. O

acúmulo de glicosidases freqüentemente se dá próximo ao local de utilização da

futura forma aglicona, como no caso de glicosidases presentes no apoplasto,

associadas à lignificação. Alguns tecidos, como o xilema de raízes de algumas

espécies, apresentam grande concentração de vacúolos com polifenóis, justamente

para rápida participação no processo de lignificação (MUELLER; BECKMAN, 1974,

1976).

Revisão Bibliográfica

A liberação de compostos fenólicos dos vacúolos é normalmente estimulada

pelo contato com microrganismos patogênicos ou após alguma injúria tecidual. Estes

então se difundem na célula, onde são oxidados e polimerizados entre si e com

outros componentes, como proteínas e carboidratos da parede celular, formando

estruturas lignificadas estáveis. Dessa forma, o processo de lignificação está

relacionado com a função protetora dos polifenóis, capazes de bloquearem locais de

infecção e gerar substâncias tóxicas para os microrganismos (BECKMAN;

MUELLER; MACE, 1974).

1.2.2. Efeitos Fisiológicos dos Compostos Fenólicos

O conceito de que os compostos fenólicos presentes nos alimentos vegetais

eram capazes de exercer efeito antioxidante iniciou-se em 1937, quando Szent-

Györgyi, ganhador do prêmio Nobel, demonstrou que o flavonóide hesperidina se

comportava de maneira semelhante ao ascorbato ao manter a permeabilidade

capilar (BENTSÁTH, RUSZNYÁK, SZENT-GYÖRGYI, 1937). Além do efeito

antioxidante já descrito na literatura, efeitos pró-oxidantes e citotóxicos também vêm

sendo relatados (YAMANAKA, ODA, NAGAO, 1997; SUGIHARA ET AL., 1999). Este

caráter pró ou antioxidante dos polifenóis é dependente de diversos parâmetros,

como potencial de reduzir metais, ação quelante, pH e solubilidade dos compostos

(DECKER, 1997).

A ação antioxidante protetora ocorre precocemente, ainda durante o próprio

metabolismo da planta. Os compostos fenólicos são capazes de equilibrar a geração

de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante o transporte de elétrons, na cadeia

Revisão Bibliográfica

respiratória, mecanismo que ocorre naturalmente durante o processo fotossintético,

assim como das EROs formadas em situações específicas de estresse

(HALLIWELL, GUTTERIDGE, 1985).

Durante a fotossíntese, o primeiro radical livre gerado é o radical superóxido,

transformado em peróxido de hidrogênio pela ação da superóxido dismutase (SOD).

Apesar de pouco reativo e danoso, o peróxido de hidrogênio pode gerar radical

hidroxil em presença de metais de transição, que são extremamente reativos e

perigosos para a homestase da planta (GRASSMANN, HIPPELI, ELSTNER, 2002).

Normalmente, os subprodutos do peróxido de hidrogênio formados no

transporte de elétrons fotossintéticos são detoxificados a água, ainda no cloroplasto,

pelo ciclo ascorbato-glutationa (FOYER, 1993). No entanto, em condições severas

de estresse, a capacidade de seqüestro de radicais do cloroplasto pode ser

excedida, à medida que o pool de ascorbato nos plastídeos se torna oxidado

(GRACE, LOGAN, 2000). Neste momento, os polifenóis atuam como antioxidantes,

dando suporte ao sistema de detoxificação dependente de ascorbato, agindo como

um sistema de defesa secundário, sendo oxidados a radicais fenoxil e evitando

assim danos oxidativos (SAKIHAMA ET AL., 2002).

Além do combate às EROs, a oxidação dos polifenóis pode ocorrer

propositalmente, levando a formação de outras substâncias de defesa. Takahama e

Hirota (2000) demonstraram que as camadas mais externas de cebola apresentam

uma maior proporção de polifenóis oxidados capazes de agir na defesa contra o

ataque de fungos. Esta oxidação e geração de radicais fenoxil podem ainda atuar

como sinalização para o início de reações cruzadas com diferentes moléculas e

componentes estruturais, como no processo de lignificação (COHEN, SAKIHAMA,

Revisão Bibliográfica

YAMASAKI, 2001). Dessa forma, os polifenóis apresentam função dupla no

metabolismo e fisiologia vegetal. Normalmente, quando em baixas concentrações,

atuam como antioxidantes. Porém, quando presentes em concentrações mais

elevadas ou sob ataque de patógenos, por exemplo, são capazes de atuar como

substratos para enzimas, como peroxidases e oxiredutases, agindo como substrato

para reações pró-oxidativas (POURCEL ET AL., 2007).

Assim como nas plantas, o potencial antioxidante é o principal fator atribuído

aos efeitos biológicos observados em humanos a partir do consumo de compostos

fenólicos. Danos causados por radicais livres em células e biomoléculas, como

lipídeos, proteínas e DNA, são considerados como uma das principais causas do

desenvolvimento de doenças. A produção de radicais livres também ocorre

normalmente em humanos, decorrente do metabolismo oxidativo e da respiração

celular. Além disso, outros compostos radicalares podem ser introduzidos no

organismo na forma pré-formada, através do fumo de cigarros ou pelo consumo de

alimentos fritos ou defumados, como hidrocarbonetos, acroleína e aminas

aromáticas policíclicas. Quando esta exposição se torna excessiva e superior a

capacidade de defesa, pode-se gerar o quadro de estresse oxidativo

(DEVASAGAYAM ET AL., 2004).

Ao mesmo tempo em que o organismo é responsável pela geração de parte

dos radicais livres, ele possui um sistema de defesa inato composto por enzimas

antioxidantes como, por exemplo, glutationa peroxidase (GSH), superóxido

dismutase (SOD), catalase (CAT), que procura manter o equilíbrio entre espécies

oxidativas e compostos antioxidantes. Além do mecanismo endógeno de defesa,

uma série de outros compostos exógenos, obtidos principalmente através da dieta,

exerce função protetora contra o estresse oxidativo (ARUOMA, 2003).

Revisão Bibliográfica

Os efeitos benéficos do consumo de frutas e hortaliças estão justamente

pautados na composição química destes alimentos que, além de fibras, contêm

diversas substâncias com ação antioxidante, como ácido ascórbico, carotenóides,

tocoferol e compostos bioativos, tais como os compostos fenólicos. Dessa forma,

evidências demonstram papel importante dos compostos fenólicos na prevenção de

diversas doenças associadas ao estresse oxidativo, como Doença de Parkinson,

Alzheimer, câncer e doenças cardiovasculares (SCALBERT ET AL., 2005).

Estudos recentes têm demonstrado, no entanto, outras ações dos polifenóis

não relacionadas ao mecanismo antioxidante, como, por exemplo, a modulação de

enzimas chaves do metabolismo de mamíferos, como quinases, fosfolipases,

ATPases, lipooxigenases e ciclooxigenases, adenilato ciclase, óxido nítrico sintase,

citocromo P450 redutase, amilase, dentre outras (SCALBERT, JOHNSON,

SALTMARSH, 2005).

A grande variedade e complexidade de compostos fenólicos presentes nos

alimentos, assim como as diversas modificações ocorridas nas moléculas após sua

ingestão, dificultam identificação plasmática e condução de estudos epidemiológicos

e in vivo. Além disso, a presença de estruturas agliconas e glicosídicas na matriz

alimentar, além de algumas substâncias associadas a estruturas celulares, pode

levar inclusive à subestimação de seu conteúdo nos alimentos. Estudos

demonstraram que o uso de soluções hidro-alcóolicas leva à extração parcial de

polifenóis, especialmente lignanas, taninos hidrolisáveis, ácidos fenólicos e outras

substâncias associadas à parede celular, sendo necessária a acidificação do meio

para aumentar a hidrólise e, conseqüentemente, a extração destes polifenóis

(PÉREZ-JIMÉNEZ, SAURA-CALIXTO, 2005).

Revisão Bibliográfica

1.2.3. Processamento de Alimentos Sobre o Conteúdo de Polifenóis

Os polifenóis, em especial os flavonóides, apresentam certa resistência à

exposição ao calor, enquanto que o oxigênio e a acidez podem alterar

significativamente estes compostos durante o processamento e a cocção de

alimentos (CROZIER ET AL., 1997). Dewanto et al. (2002) avaliaram o efeito do

tratamento térmico em milhos. Como esperado, o estudo demonstrou perda de

vitamina C durante o aquecimento, uma vez que esta vitamina é termolábil. No

entanto, os teores de fenólicos livres aumentaram conforme o aumento da

temperatura, alcançando níveis até 48% superiores ao milho cru. Em contrapartida,

o conteúdo de polifenóis glicosilados sofreu redução significativa, com o aumento da

temperatura e do tempo de aquecimento, sugerindo um que o tratamento térmico

pode levar à ruptura de ligações químicas aumentando os níveis de polifenóis

deglicosilados.

Na desidratação, processo pelo qual o alimento é submetido ao calor seco,

normalmente ocorre concentração de macronutrientes em função da perda de água

pelo alimento. A estabilidade dos polifenóis frente ao calor seco foi avaliada durante

o processo de desidratação de ameixas. Embora o tratamento tenha resultado em

perdas no teor de ácido clorogênico, ácido neoclorogênico, antocianinas e flavonóis

totais, houve um aumento da capacidade antioxidante. Este aumento foi atribuído

não somente à redução do teor de umidade da fruta como também a formação de

produtos oriundos da reação de Maillard (PIGA ET AL., 2003).

O processamento doméstico de alimentos, especialmente hortaliças, inclui

ainda pré-preparo previamente à exposição térmica. Acredita-se que a principal

perda no teor de polifenóis ocorra ainda no pré-preparo, quando freqüentemente os

alimentos são descascados e/ou são inutilizadas frações ricas nestes fitoquímicos,

Revisão Bibliográfica

como folhas e talos (AHERNE; O’BRIEN, 2002). O método de cocção adequado tem

sido considerado um importante fator na manutenção do conteúdo de polifenóis.

Makris & Rossiter (2001), em estudo realizado com cebolas e aspargos frescos,

observaram alterações no conteúdo de flavonóis e na capacidade antioxidante

durante procedimentos comuns de pré-preparo e cocção dos alimentos. Apesar do

estudo ter utilizado um tempo de cocção bastante superior ao utilizado na prática

doméstica (60 minutos), as perdas de rutina chegaram a 80% nos aspargos. O teor

de quercetina, no entanto, pouco variou na cebola, sugerindo efeitos diferentes da

cocção de acordo com a substância presente no alimento.

A cocção pode exercer efeito negativo sobre o conteúdo de polifenóis não

somente através de perdas de compostos fenólicos para o meio de cocção, como,

também, pela diluição de nutrientes, caso o alimento absorva quantidades

significativas de líquido do meio (LOMBARD ET AL., 2005). Dessa forma, a cocção

em água seria o método menos indicado para cocção de hortaliças, inclusive por

levar a perda de vitaminas hidrossolúveis como ácido ascórbico e do complexo B.

No entanto, o efeito da cocção sobre o conteúdo de polifenóis e capacidade

antioxidante tem se mostrado bastante variável de acordo com o tipo de alimento e

procedimento aplicado, sendo alguns mais sensíveis que outros (ISMAIL; MARJAN,

FOONG, 2004; TURKMEN ET AL., 2005; SULTANA; ANWAR; IQBAL, 2007). O uso

correto da técnica dietética, utilizando-se o mínimo de água, binômio tempo/

temperatura baixo e sempre que possível o aproveitamento da água de cocção, são

portanto essenciais para melhor aproveitamento dos compostos fenólicos. A

quantificação de polifenóis em alimentos coccionados, por sua vez, é essencial já

que a análise de alimentos crus pode não corresponder ao valor realmente

consumido pela população (ANDLAUER ET AL., 2003).

Revisão Bibliográfica

1.3. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DO CONTEÚDO DE COMPOSTOS

FENÓLICOS E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM ALIMENTOS

Os métodos para a extração de compostos fenólicos variam de acordo com o

protocolo utilizado na pesquisa, variando em função do tipo de amostra que será

analisada, alimento sólido ou líquido, com alto ou baixo teor de gordura,

suplementos nutricionais, extratos vegetais, assim por diante. No entanto, alguns

procedimentos básicos são comuns, incluindo algum processo de maceração, corte

ou extração de sucos vegetais - obtendo maior liberação dos polifenóis dos

compartimentos celulares dos vegetais - adição de diferentes solventes orgânicos,

aquecimento e, freqüentemente acidificação do meio para obter hidrólise compostos

fenólicos glicosilados. Os solventes mais utilizados para as soluções hidro-alcóolicas

de extração são o metanol e a acetona, podendo também ser utilizado etanol. A

proporção destes solventes podem variar de 50% a 80% (YLMAZ; TOLEDO, 2006).

Na literatura, o método de determinação de polifenóis mais comumente

utilizado é o colorimétrico, através de espectrofotometria, estimando a quantidade de

“polifenóis totais”, como normalmente são denominados. A qualificação e

quantificação das substâncias específicas presentes numa amostra requerem, no

entanto, análise mais elaborada, realizada normalmente através de cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE). O método espectrofotômetro, desenvolvido por

Singleton e Rossi (1965) é realizado utilizando o reagente Folin-Ciocalteu. Este

reagente é composto por dois ácidos, fosfotungestênico (H

) e

fosfomolibdêmico (H

PMo

). A mistura destes dois ácidos, ao entrar em contato

com substâncias capazes doar hidrogênios, são reduzidas a óxidos de tungstênio

) e molibdênio (Mo

), que possuem coloração azul. Esta reação

Revisão Bibliográfica

colorimétrica ocorre preferencialmente em meio alcalino, sendo normalmente

utilizada solução de carbonato de sódio para tal alcalinização. A leitura em

espectrofotômetro pode ser realizada em absorbâncias que variam entre 700nm e

795nm. O padrão utilizado para quantificação de polifenóis totais varia de acordo

com o protocolo em questão, no entanto, são utilizados com freqüência ácido gálico,

ácido clorogênico, catequina, ácido tânico e rutina (HUANG, OU, PRIOR, 2005).

As principais vantagens do uso do reagente de Folin-Ciocalteu são a rapidez

e praticidade na leitura das amostras, assim como o baixo custo, tanto em relação

aos reagentes como em função da utilização de espectrofotômetro, equipamento

comum em laboratórios também utilizado para dosagens de proteínas e de ferro, por

exemplo. Porém, este método possui a desvantagem da transferência de elétrons

não ser específica para os compostos fenólicos podendo ter reação e sofrer

interferência de outras substâncias presentes na amostra. Componentes com a

capacidade de se oxidar podem intensificar a cor da amostra interferindo na leitura

do espectrofotômetro e superestimando a dosagem.

As principais substâncias interferentes, em ordem de importância, são ácido

ascórbico, açúcares redutores e alguns aminoácidos, variando o grau de importância

de acordo com a natureza e composição química da amostra. Quando significativa

esta interferência pode ser computada e posteriormente deduzida da quantificação

dos polifenóis. No entanto, o método utilizado para a extração de polifenóis do

alimento pode eliminar em até 85% o teor destas substâncias, reduzindo

significativamente o grau de interferência na sua quantificação (AINSWORTH,

GILLESPIE, 2007).

Apesar da existência de diferentes métodos para a análise da capacidade

antioxidante em alimentos, não há um consenso sobre o método padrão a ser

Revisão Bibliográfica

utilizado. Alguns dos principais métodos utilizados para avaliação da capacidade

antioxidante incluem ORAC, TRAP, TOSC, CUPRAC, oxidação do LDL, sistema

beta-caroteno, FRAP, TEAC e DPPH. Cada método apresenta um mecanismo de

reação diferente podendo ser a partir da transferência de elétrons, da transferência

de átomos de hidrogênio ou de mecanismos mistos, que envolvem os dois citados.

Apesar das diferenças em termos de especificidade e precisão, métodos mais

rápidos, baratos e simples, como o DPPH, são os mais utilizados na análise de

alimentos.

A revisão referente a esta parte da dissertação pode ser visualizada no

manuscrito, a ser submetido ao periódico “Química Nova”, que se encontra no anexo

C (página 163).

1.4. VITAMINA C EM ALIMENTOS VEGETAIS

O ácido ascórbico é o principal antioxidante das plantas, presente em

diferentes compartimentos celulares em concentrações que variam de 300mM, em

cloroplastos do estroma, a menos de 20mM em outros tecidos (VALPUESTA,

BOTELLA, 2004). O ascorbato pode ser oxidado por oxigênio, radicais superóxido,

peróxido de hidrogênio e oxigênio singleto, formando monodehidroascorbato que,

por ter alta instabilidade, rapidamente se decompõe em ácido ascórbico (AA) e ácido

dehidroascórbico (DHA). A oxidação mediada pela enzima ascorbato peroxidase

(APX) apresenta função importante, sendo a principal responsável por detoxificar o

peróxido de hidrogênio formado durante o processo de respiração celular

(SMIRNOFF, 2000).

A importância da vitamina C na manutenção do estado redox se dá em

especial no apoplasto, onde outras substâncias antioxidantes, como a glutationa,

Revisão Bibliográfica

estão ausentes ou em baixas concentrações. Além da capacidade antioxidante, o

ácido ascórbico atua como cofator de enzimas, regula o crescimento e a divisão

celular e atua na sinalização celular. A APX está presente em diferentes

compartimentos celulares na forma de isoformas, sendo, junto ao ácido ascórbico, a

principal responsável pela manutenção do estado redox (NOCTON, FOYER, 1998).

O papel protetor da vitamina C em plantas ficou evidenciado quando se

demonstrou a sensibilidade de mutantes Arabidopsis deficientes em ascorbato a

diferentes estresses, como radiação UV-B e exposição ao ozônio (PIGNOCCHI,

FOYER, 2003). No entanto, baixas concentrações ou oxidação aumentada de

vitamina C poderiam induzir a planta a aumentar a síntese de outros compostos com

ação antioxidante. Esta hipótese sugere uma inter-relação do conteúdo de AA com a

modulação da síntese de compostos fenólicos em plantas submetidas a situações

de estresse (REYS, VILLAREAL, CISNEROS-ZEVALLOS, 2007).

1.5. AGRICULTURA ORGÂNICA

A agricultura orgânica se refere ao processo produtivo, industrial ou agrícola,

que utiliza tecnologias que otimizam o uso de recursos naturais e sócio-econômicos,

com objetivo de alcançar auto-sustentabilidade, maximizar benefícios sociais,

minimizar a dependência por energia não-renovável, e ao não utilizar agroquímicos,

produtos tóxicos sintéticos, organismos geneticamente modificados, radiação

ionizante em nenhum momento da cadeia produtiva - produção, armazenamento e

consumo - privilegia a saúde humana e do meio ambiente e assegura a

transparência em todas etapas dos processos de produção e transformação (FAO,

1999). O alimento ou produto orgânico, para ser assim declarado para fins de

Revisão Bibliográfica

comercialização, deve obrigatoriamente conter estes princípios em todas as etapas

cadeia produtiva.

Legalmente, o primeiro regulamento direcionado à agricultura orgânica,

desenvolvido pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), foi a

Instrução Normativa nº 7 de maio de 1999 (MAPA, 1999) onde foram estabelecidos

regulamentos técnicos de produção orgânica. Esta Instrução Normativa dispõe

detalhadamente sobre as normas de produção, tipificação, processamento, envase,

distribuição, identificação e certificação da qualidade para os produtos orgânicos de

origem vegetal e animal no Brasil.

Posteriormente, esta instrução normativa foi alterada pela Lei 10.831, de 23

de dezembro de 2003. Esta lei foi considerada o principal marco legal da agricultura

orgânica, onde se estabeleceram procedimentos importantes da comercialização,

tais como a certificação facultativa para venda direta (produtor-consumidor) e o

reconhecimento de todos os tipos de certificação (CASA CIVIL, 2003). Atualmente,

está vigente a Instrução Normativa n° 16, de 11 de junho de 2004, a qual estabelece

tais procedimentos de registro e comercialização de produtos orgânicos enquanto os

trabalhos de regulamentação da Lei n° 10.831 ainda não estão concluídos (MAPA,

2004).

A certificação de um produto orgânico é concedida àquelas empresas que

comprovam que sua cadeia produtiva se enquadra em todos os padrões

estabelecidos. No mundo existem diversas agências certificadoras, podendo ter

pequenas diferenças nas regulamentações de acordo com o país. Algumas destas

empresas podem ainda ter respaldo da International Federation of Organic

Agricultural Movements (IFOAM), se operarem de acordo com os padrões

Revisão Bibliográfica

internacionais estabelecidos pela IFOAM Basic Standards. No Brasil, as entidades

certificadoras são pessoas jurídicas sem fins lucrativos, que apresentam

credenciamento junto aos Órgãos Colegiados, Nacional e Estadual, criados a partir

da Instrução Normativa n°7, citada acima. São exemp los de empresas certificadoras

a AAOCert, Abio, IBD, ECOCERT, Coolméia, dentre outras (FONSECA, 2001).

1.5.1. Panorama Brasileiro da Agricultura Orgânica

O mercado de alimentos orgânicos apresenta o maior crescimento do setor

alimentício nos últimos anos. O Brasil, em 2005, se tornou o segundo país em área

de produção agrícola orgânica do mundo, com 6,5milhões de hectares, após a

inclusão de áreas de extrativismo sustentável. Esta forma específica de cultivo

representa, 5,7 milhões de hectares do total contabilizado pelo MAPA, estando

concentrada principalmente na região amazônica, em produções de castanha, açaí,

pupunha, dentre outras espécies. O Brasil conta ainda com aproximadamente 20 mil

produtores certificados, a maioria agricultores familiares, que ocupam uma área de

900 mil hectares de terras plantadas. A distribuição desta área se dá

prioritariamente na região Sul do país, (68%), seguida pelo Nordeste (13%) e o

Sudeste (10%) (SEBRAE, 2005).

Atualmente, cerca de 75% da produção nacional de orgânicos é exportada,

sendo os principais mercados consumidores a Europa (principalmente Alemanha e

Holanda), os Estados Unidos e o Japão. Os produtos mais visados para este fim

incluem soja, açúcar branco e açúcar mascavo, café, sucos cítricos, mel, arroz,

frutas como manga, banana, melão e mamão papaya; porém soja, café e açúcar

lideram as exportações. No mercado interno, os produtos mais comumente

Revisão Bibliográfica

consumidos são as hortaliças, seguidos por café, açúcar, sucos e cereais (DIAS,

2006).

Em função do evidente aumento na produção e comercialização de orgânicos,

muitos pesquisadores têm se interessado em identificar o principal motivo da

aquisição de um produto orgânico pelo consumidor, o que estaria diretamente

relacionado com o aumento da demanda por tais alimentos. Estudos realizados até

o momento revelam diferenças no motivo de escolha do produto orgânico tanto entre

países como entre grupos sociais e faixas etárias. Nos Estados Unidos, as principais

características atribuídas ao produto orgânico para sua aquisição são: segurança,

frescor, benefícios gerais a saúde, valor nutricional, efeito no meio ambiente, sabor e

método de produção em geral (BEBARREL, MAC FIE, 1991). Outro aspecto,

observado por Schifferstein & Ou de Ophnis (1998) na Holanda, foi que a principal

motivação para a aquisição de produtos orgânicos pelos consumidores não usuais

era a manutenção da saúde, enquanto que para os consumidores usuais era a

manutenção do ecossistema saudável.

1.5.2. Qualidade do Alimento Orgânico

O conceito de que os alimentos cultivados sob agricultura orgânica trazem

benefícios para saúde e/ou são mais nutritivos vem sendo avaliado sob diferentes

aspectos. A ausência do uso de agroquímicos, a carga residual de agentes

químicos, o teor de nitrato e a contaminação microbiológica são alguns aspectos

considerados. Adicionalmente, estudos avaliando a composição de macro e

micronutrientes, assim como de compostos bioativos nesse grupo de alimentos vêm

aumentando.

Revisão Bibliográfica

A principal característica que é ressaltada sobre a agricultura orgânica é a

ausência de pesticidas, observado inclusive pelo Whole Foods Market em 2005

como a principal resposta dada por 70% dos entrevistados na pesquisa (WINTER,

DAVIS, 2006). Apesar de crucial e evidente, esta diferença na produção foi pouco

explorada cientificamente, tendo poucos estudos disponíveis na literatura avaliando

o teor de resíduos de pesticidas em alimentos orgânicos e convencionais. Baker et

al., (2002) realizou um dos estudos mais abrangente sobre o tema. A partir de três

bancos de dados sobre resíduos de pesticidas em alimentos, os autores

demonstraram que a ocorrência de pesticidas em alimentos orgânicos é realmente

menor que os alimentos cultivados por métodos convencionais. A probabilidade de

haver resíduo de pesticidas nos produtos convencionais foi de três a cinco vezes

maior. Outro estudo mais recente, realizado na Bélgica, obteve resultados

semelhantes ao demonstrar risco quatro vezes maior de se detectar pesticidas nos

alimentos convencionais do que nos orgânicos (PUSSEMIER ET AL., 2006).

A menor exposição a pesticidas é de extrema importância já que diferentes

doenças vêm sendo associadas aos efeitos de agentes químicos utilizados na

agricultura, especialmente em crianças. O incentivo ao uso de alimentos

provenientes de agricultura orgânica na alimentação infantil, em especial nas

escolas, pode ser uma maneira eficiente de reduzir a exposição à pesticidas e,

ainda, estimular a produção orgânica. Estudo realizado em Boston, Estados Unidos,

demonstrou que crianças que receberam refeições produzidas com alimentos

orgânicos tiveram menor exposição a pesticidas organofosforados do que aquelas

que receberam alimentos provenientes de agricultura convencional (CURL,

FENSKE, ELGETHUN, 2003).

Revisão Bibliográfica

Ao mesmo tempo, a produção orgânica, por não utilizar defensivos químicos e

sim adubos biológicos, poderia levar a uma maior carga microbiológica, aumentando

os riscos de contaminação e infecção por microrganismos. Muitas empresas

certificadoras mantêm regras específicas para o uso de esterco e adubos biológicos

na agricultura orgânica, como por exemplo, o uso de tratamento térmico (a fim de

eliminar patógenos humanos como a Escherichia coli (E. coli)) e da sua aplicação no

mínimo 90 dias antes da colheita. Produtores orgânicos são ainda submetidos a

auditorias anuais pelas empresas certificadoras, de forma que o risco de

contaminação microbiológica na agricultura orgânica não seria maior do que na

convencional, onde também se utiliza adubo biológico, porém sem o mesmo controle

do tipo e forma de utilização (BOURN; PRESCOTT, 2002).

Um dos estudos mais abrangentes sobre os riscos de contaminação

microbiológica entre os dois tipos de agricultura foi realizado por Mukherjee et al.

(2004) que analisaram 476 produtos orgânicos e 129 convencionais da região de

Minnesota, nos Estados Unidos, verificando a contaminação por E. coli , Salmonella

e E. coli 0157:H7. A detecção de E. coli foi de 4,6% em produtos certificados

orgânicos e de 1,6% em convencionais, sendo a diferença não significativa.

Nenhuma amostra apresentou E. coli 0157:H7 e apenas duas amostras de produtos

orgânicos tiveram Salmonella detectada. Importante citar que nas amostras de

fazendas não certificadas, o nível de contaminação foi maior que os de fazendas

certificadas, o que reforça a eficácia do controle e supervisão das empresas

certificadoras sobre os métodos de produção, assim como a importância da

aquisição de produtos orgânicos com o selo certificador.

Revisão Bibliográfica

A comparação entre os teores de minerais em alimentos constitui uma das

formas mais simples de se avaliar as diferenças qualitativas de produtos orgânicos e

convencionais. A avaliação do teor de nitratos nos alimentos reside no potencial

carcinogênico desta substância no trato gastrointestinal e na sua possível

interferência no crescimento vegetal e na síntese de metabólitos secundários. O uso

de fertilizantes inorgânicos levaria ao fornecimento de nitrogênio na forma de nitrato

inorgânico e, de acordo com alguns estudos, esta forma permite maior e mais fácil

absorção e captação de nitrogênio pelas plantas em comparação com o nitrogênio

orgânico. O nitrogênio sendo mais biodisponível poderia induzir a um crescimento

mais acelerado e à formação de alimentos de volume maior (WOESE ET AL., 1997).

A aceleração do crescimento e obtenção de produtos de maior volume seria

favorável, comercialmente, para os produtores. No entanto, para o consumidor final,

poderia resultar em alimentos com menor teor de nutrientes, já que é durante a

maturação que a maioria é sintetizada. Além disso, o aumento do volume do vegetal

poderia gerar diluição dos nutrientes. Woese et al. (1997) sugerem, ainda, que os

teores de nitrato podem interferir diretamente na síntese de metabólitos secundários

oriundos da via dos fenilpropanóides, por impedir a entrada da fenilalanina na via.

Por último, sugere-se ainda que os vegetais possam se desenvolver de formas

distintas de acordo com a razão entre carbono e nitrogênio disponíveis. O nitrogênio

mais biodisponível levaria ao maior fornecimento deste nutriente em relação ao

carbono, acarretando menor síntese de compostos bioativos com base carbônica,

como os compostos fenólicos (HAUKIOJA ET AL., 1998).

Considerando estas hipóteses, estudos vêm sendo realizados a fim de se

verificar possíveis diferenças na composição de compostos bioativos e capacidade

Revisão Bibliográfica

antioxidante de alimentos orgânicos e convencionais. Nestes trabalhos, diferentes

metodologias são aplicadas, incluindo a análise química de produtos orgânicos e

convencionais adquiridos no varejo, avaliação da composição nutricional de culturas

experimentais com diferentes tipos de fertilizantes, análise da composição química

de alimentos produzidos em fazendas orgânicas e convencionais, assim como a

avaliação do efeito do consumo de dietas com alimentos orgânicos em animais ou

humanos (BOURN; PRESCOTT, 2002).

A realização de estudos com variáveis bem controladas é extremamente

difícil, uma vez que requerem o uso de fazendas orgânicas e convencionais em

regiões próximas a fim de se beneficiarem do mesmo solo, exposição solar, volume

de precipitação, entre outros fatores. Além disso, mesmo eliminando-se as

diferenças entre a composição mineral dos solos, são ainda necessários cuidados

com a variedade genética, clima e umidade, irrigação, tipo de rotação de solo,

período de colheita, entre outros. Em contrapartida, este tipo de estudo apresenta

alto custo e longos períodos de realização. Estudos com variação do tipo de

fertilizantes em cultivos experimentais, são mais freqüentemente utilizados, por

serem mais baratos e rápidos de serem conduzidos. No entanto, não refletem

fidedignamente o cultivo de uma fazenda orgânica (BOURN; PRESCOTT, 2002).

Os estudos que avaliam a composição nutricional dos alimentos adquiridos

em varejo ou o consumo destes em animais e humanos, podem não determinar

diferenças específicas entre o cultivo e o manejo produtivo de cada agricultura.

Porém, traçam um perfil do efeito destes dois tipos de alimento sobre a saúde do

consumidor final, pois englobam as práticas realizadas nas fazendas, assim como o

Revisão Bibliográfica

processo produtivo de colheita e transporte até o momento da aquisição e consumo

(BOURN; PRESCOTT, 2002).

1.5.3. Polifenóis na Agricultura Orgânica

Alegações sobre benefícios do consumo de alimentos orgânicos em função

da composição nutricional mais favorável ainda são controversas. O uso de

diferentes agroquímicos no cultivo convencional pode influenciar as concentrações

de compostos secundários em plantas, tanto aumentando como os reduzindo

(DANIEL ET AL., 1999). O prejuízo da síntese dos polifenóis estaria pautado na

redução da fixação de carbono pelas plantas, reduzindo a proporção de carbono

direcionado para a síntese de compostos secundários. No entanto, foram

demonstrados tanto efeitos positivos como negativos, sugerindo que o uso de

diferentes tipos de pesticidas pode resultar em modulações distintas da síntese de

compostos secundários (quadro 1).

Quadro 1. Interações Negativas e Positivas entre o Conteúdo de Compostos

Fenólicos e Agroquímicos*

Herbicida Espécie Vegetal Composto Secundário Fator de

Alteração

Atrazina Soja Antocianina ↓ 4

Butidazol Milho Antocianina ↓ 4.3

Dinoterb Ervilha Flavonóis ↓ 3.3

Glifosato Feijão Faseolina ↓ 1.4-1.5

Metribuzin Batata Fenóis totais ↓ 1.1-3.3

Sethoxydim Framboesa

o-fenóis

↓ 2

Clometoxifeno

Arroz Bifenil-2-ol ↑ 3

Clorsulfuron Soja Antocian ↑ 1.77

Aveia Fenóis totais ↑ 1.43

Glifosato

Soja Ácido gálico ↑ 2.22

Ervilha Pisatina ↑ 19

Acifluorfen

Feijão Faseolina ↑ 47

* Adaptado de Daniel et al., 1999.

Revisão Bibliográfica

Em estudo mais recente realizado com trigo, o uso do herbicida cloquintocete-

mexilo após a germinação das sementes demonstrou efeito de aumentar o turnover,

além de redirecionar o metabolismo dos compostos fenólicos. Nesse estudo foi

observada redução de C-glicosídeos de flavonas, como os conjugados de luteolina e

acúmulo de ácido ferúlico e tricina, sugerindo que este herbicida estaria aumentando

a degradação dos glicosídeos de flavonas. Em contrapartida, houve um aumento de

compostos fenólicos metilados, principalmente em função do aumento da atividade

de enzimas envolvidas neste metabolismo, sugerindo que alguns pesticidas podem

favorecer o metabolismo de ramificações específicas da via de síntese dos

compostos fenólicos (CUMMINS ET AL., 2006).

Estudos que avaliam o teor de polifenóis e a capacidade antioxidante em

alimentos produzidos nas duas formas de agricultura apresentam resultados

inconsistentes, variando bastante em função do alimento estudado, assim como do

composto fenólico analisado. A tabela 1 ilustra alguns dos estudos realizados. Dos

onze trabalhos publicados a partir de 2000, quatro demonstraram um efeito positivo

da agricultura orgânica sobre o conteúdo de polifenóis, enquanto que outros quatro

estudos não observaram diferenças significativas. Os demais autores observaram

resultados variados, de acordo com o parâmetro analisado e o alimento em questão,

demonstrando a falta de consenso na literatura sobre os maiores teores de

polifenóis em alimentos orgânicos.

Revisão Bibliográfica

Tabela 1. Estudos Relacionando Polifenóis e Alimentos Orgânicos

Autor Análises Alimentos Resultados

Hakkinen e

Torronen

(2000)

Flavonóis e polifenóis

totais

Morangos e

mirtilo

Cultivo OG não resultou em

alterações consistentes destes

compostos

Ren et al.

(2001)

Flavonóides Hortaliças

Alimentos OG apresentaram em

geral, valores maiores de

flavonóides

Mikkonen et

al. (2001)

Flavonóis Cassis

Cultivo OG não resultou em

alterações consistentes destes

compostos

Carbonaro et

al. (2002)

Polifenóis totais,

polifenoloxidase

(PPO), vitamina C,

ácido cítrico,

tocoferol.

Pêra e pêssegos

Maior polifenol e atividade PPO

em variedade OG. Ácidos

ascórbico e cítrico maior em

pêssego OG, alfa-tocoferol

maior em pêra OG

Asami et al.

(2003)

Compostos fenólicos

e ácido ascórbico

Berries, milho e

morango

Teores maiores de polifenóis e

ácido ascórbico em alimentos

OG. Maiores valores na

agricultura sustentável

Caris-Veyrat

et al. (2004)

Vitamina C, licopeno,

compostos fenólicos

e seus teores no

plasma

Tomate in natura

e purê de tomate

Tomate OG mais vitamina C,

carotenóides e polifenóis

(exceto ác. clorogênico). Purê

de tomate OG sem diferença

com exceção de mais polifenóis

e vitamina C no OG. Consumo

dos dois purês sem diferenças

nos teores plasmáticos

Lombardi-

Boccia et al.

(2004)

Vitaminas C, E e

beta caroteno,

fenólicos totais,

ácidos fenólicos e

flavonóis

Ameixas

Vitamina C, tocoferol,

betacaroteno, kaempferol e

mirecitina maior nos OG.

Fenólicos totais e quercetina

maior nos CV

Young et al.

(2005)

Polifenóis Vegetais folhosos

Sem diferenças entre OG e CV

Veberic et al.

(2005)

Polifenóis Maçã

Polifenóis em teor maior na

polpa de OG; sem diferença

significativa entre CV e OG para

casca

Chassy et al.

(2006)

Fenólicos totais,

sólidos solúveis, vit.

C, quercetina,

campeferol e

luteolina

Tomate e

pimentão

Variações significativas somente

no tomate

Toor et al .

(2006)

Peso seco, sólidos

solúveis, acidez

titulável, vit C,

fenólicos totais,

licopeno, AOX

Tomate

Menor acidez CV, mais fenólicos

e vitamina C no OG

Abreviaturas: OG (orgânico); CV (convencional).

Revisão Bibliográfica

Atualmente, existem duas principais hipóteses propostas para explicar os

possíveis aumentos de compostos fenólicos em alimentos orgânicos, a modulação

do metabolismo vegeta em função do tipo de fertilização e o maior estímulo à

síntese endógena de polifenóis. Dessa forma, alguns autores sugerem que o uso de

fertilizantes sintéticos forneceria nitrogênio numa forma mais biodisponível,

acelerando seu desenvolvimento, crescimento e interferindo na razão

carbono/nitrogênio da planta (TOOR, SAVAGE, HEEB, 2006; HAUKIOJA ET AL.,

1998). A segunda hipótese se baseia na maior exposição dos vegetais produzidos

na agricultura orgânica a situações agressivas, como ataque de microrganismos

patógenos, o que induziria a uma resposta da planta aumentando a síntese de

compostos de defesa (WINTER; DAVIS, 2006). No entanto, a literatura ainda

apresenta dados bastante controversos.

Revisão Bibliográfica

1.6 JUSTIFICATIVA

Estudos epidemiológicos demonstram que o consumo de frutas e hortaliças

está inversamente relacionado com a incidência de doenças crônicas não-

transmissíveis. A presença de polifenóis e outros compostos com potencial

antioxidante são responsáveis, em parte, por este benefício. A literatura sugere que

diferenças na forma de cultivo e o uso de agroquímicos podem modificar o teor de

compostos bioativos em alimentos. Os estudos que avaliam o conteúdo de polifenóis

e capacidade antioxidante em alimentos orgânicos e convencionais apresentam

resultados variados, não apresentando consenso. Não existem estudos que avaliem

estes parâmetros em alimentos orgânicos e convencionais produzidos no Brasil.

Dessa maneira, a avaliação do teor de polifenóis e de ácido ascórbico e da

capacidade antioxidante de alimentos orgânicos e convencionais nacionais é

essencial, assim como a avaliação de alterações nestes conteúdos decorrentes dos

processos de cocção rotineiramente aplicados pela população. Estes resultados

permitiriam avaliar possíveis diferenças nos benefícios proporcionados ao

consumidor a partir do consumo de alimentos cultivados por cada tipo de agricultura.

Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. GERAL

Avaliar a diferença nos teores de polifenóis e vitamina C e na capacidade

antioxidante entre alimentos e suas frações cultivados na agricultura orgânica e

convencional, submetidos ou não à cocção.

2.2. ESPECÍFICOS

Determinar os teores de polifenóis solúveis e hidrolisáveis nas diferentes frações

frutas e hortaliças mais freqüentemente consumidas no Brasil;

Verificar a capacidade antioxidante das respectivas frações de frutas e hortaliças

investigadas;

Quantificar o teor de ácido ascórbico em cada fração dos alimentos estudados

nas duas formas de cultivo, orgânico e convencional;

Analisar o efeito da adição de ácido ascórbico exógeno na determinação de

polifenóis e na capacidade antioxidante;

Avaliar alterações sobre os teores de polifenóis solúveis e hidrolisáveis, de ácido

ascórbico e na capacidade atividade por DPPH das hortaliças orgânicas e

convencionais após diferentes processos de cocção;

Objetivos

Estimar o consumo nacional e por região geográfica de polifenóis de acordo com

a Tabela de Aquisição Domiciliar per capita da POF 2002/ 2003, do IBGE;

Identificar os principais alimentos-fonte de polifenóis na alimentação brasileira e

nas principais regiões nacionais.

Materiais e Métodos

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL

O DPPH (1,1-Difenil-2-picrilhidrazil) foi obtido da SIGMA FINE CHEMICALS

(St. Louis, MO,USA). O reagente Folin-Ciocalteu, o L-ácido ascórbico, o metanol e o

etanol da firma MERCK. Os demais reagentes utilizados foram de pureza analítica.

3.2. SELEÇÃO E AQUISIÇÃO DOS ALIMENTOS

Foram selecionados doze alimentos comumente consumidos no Brasil, sendo

seis frutas com a classificação de “frutas tropicais”, segundo a Tabela de Aquisição

Domiciliar de Alimentos da POF 2002/ 2003 do IBGE, e seis hortaliças, sendo duas

sob a classificação de “hortaliças folhosas e florais”, duas como “hortaliças frutosas”

e duas como “hortaliças tuberosas”. As frutas incluíram abacaxi pérola (Ananas

comosus (L) Merril), banana prata (Musa acuminata Colla), laranja lima (Citrus

sinensis), mamão papaya (Carica papaya L.), manga tommy (Mangifera indica L.) e

tangerina ponkan (Citrus reticulata). As hortaliças foram representadas por batata

inglesa (Solanum tuberosum L.), brócolis comum (Brassica oleracea var. Italica),

cebola nacional (Allium cepa L.), cenoura (Daucus carota L.), repolho branco

(Brassica oleracea var. Capitata) e tomate (Lycopersicon esculentum var. Carmem).

Posteriormente, a maçã (Malus domestica Borkh, cv. Gala) foi incluída em

substituição ao abacaxi nas análises comparativas entre os tipos de agricultura, em

função da maior facilidade de acesso a esta fruta nas duas formas de cultivo, tendo

também alto consumo nacional.

Os alimentos de ambos os tipos de cultivo foram adquiridos em mercados

varejistas da cidade do Rio de Janeiro (RJ), sendo adquiridos aproximadamente

Materiais e Métodos

1,0Kg de cada vegetal ou no mínimo três unidades para frutas ou hortaliças de

grande volume (abacaxi, manga, brócolis, repolho) por momento de análise. Os

alimentos de origem orgânica foram adquiridos de empresas certificadas dos

estados do Rio de Janeiro e São Paulo (Fazenda Santo Onofre – SP; Korin – SP,

Vale das Palmeiras – RJ e Vida Sustentável – RJ). Os alimentos convencionais

adquiridos tiveram a origem identificada a fim de que seu cultivo fosse restrito aos

estados de São Paulo e Rio de Janeiro.

3.3. PREPARO DAS AMOSTRAS

Os alimentos foram lavados em água fria e corrente e secos com papel

toalha. Em seguida foram descascados manualmente (banana e tangerina), com

auxílio de uma faca (demais frutas, incluindo o tomate, cebola, repolho e brócolis);

ou, com descascador manual de legumes (batata e cenoura), resultando na

separação das frações de acordo com o quadro abaixo (quadro 2):

Quadro 2. Alimentos e Frações Utilizadas para Análises

Alimento Fração

Frutas, batata, cenoura e

tomate

Casca e polpa

Repolho Folhas externas e internas

Brócolis Folha, talo e flor

Cebola Polpa

Alimentos danificados ou com injúrias foram descartados. Cada fração dos

alimentos foi posteriormente extraída utilizando o extrator de suco Samsom GB-9001

(Greenbison Inc., Califórnia, EUA), a fim de se obter um extrato fluido (EF), o qual foi

utilizado para as análises de polifenóis, ácido ascórbico e capacidade antioxidante.

Materiais e Métodos

As análises foram feitas em duplicata em três diferentes momentos, com

aquisição de alimentos frescos (agosto, setembro e novembro de 2006). Os

resultados foram expressos com base na média dos valores obtidos nos três meses.

3.4. COCÇÃO DE HORTALIÇAS

As hortaliças in natura foram coccionadas de acordo com três métodos

comumente utilizados em nível doméstico: fervura em água em ebulição, cocção em

microondas e cocção à vapor, de acordo com metodologia descrita por Turkmen et

al. (2005). Após descasque com descascador manual, a cenoura e a batata foram

cortadas em rodelas de aproximadamente 0,5cm e em cubos de 2cm de lado,

respectivamente. A cebola foi fracionada transversalmente obtendo-se 8 partes

iguais. O brócolis e o repolho foram picados em pedaços de tamanho homogêneo.

Para os diferentes métodos de cocção aplicados, 100g de cada alimento foram

separados, sendo os experimentos realizados em triplicatas.

Os tempos de cozimento de cada hortaliça foram determinados por

experimentos prévios do grupo de pesquisa (quadro 3), sendo estes o menor tempo

necessário para a ocorrência do abrandamento do tecido vegetal. A fervura em água

consistiu na imersão do alimento em água fervente, em panela de inox. O volume

utilizado de água foi de 150mL para cada hortaliça, com exceção da batata, em que

foram utilizados 300mL. A cocção a vapor foi realizada em recipiente próprio, sendo

este posicionado acima de uma panela com água fervente. A cocção em

microondas foi realizada em equipamento doméstico (Brastemp Clean), com

potência de 5000 watts. Os alimentos foram dispostos em tigelas refratárias em que

foram adicionados 6mL de água (12mL para a batata). Os recipientes foram

cobertos com papel filme, perfurados com garfo, a fim de se obter pequenos furos.

Materiais e Métodos

Quadro 3. Tempo de Cozimento das Hortaliças de Acordo com Diferentes

Métodos de Cocção

Tempo de Cozimento (minutos)

Hortaliça

Água em Ebulição Microondas Vapor

Batata

6,5 3 10

Brócolis

6 4 8

Cebola

8 4 10

Cenoura

8 3 8

Repolho

5 3,5 10

Cada hortaliça foi pesada antes e após a cocção, a fim de se determinar

perdas ou ganhos de peso devido a perda ou absorção de água para cada tipo de

cocção. Após a cocção, foram preparados extratos fluídos de cada hortaliça,

utilizando o extrator de suco Samsom GB-9001. Os extratos foram congelados a -

20°C para posterior análise de polifenóis solúveis e hidrolisáveis, capacidade

antioxidante e ácido ascórbico. As análises foram realizadas dentro do período de

uma semana, tempo no qual não foram observadas alterações no potencial

antioxidante de alimentos in natura, teor de polifenóis e ácido ascórbico, quando

congelados em freezer a -20°C (POLINATI; FALLER; FI ALHO, 2007).

3.5. DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS SOLÚVEIS E HIDROLISÁVEIS

3.5.1. Extração de Polifenóis Solúveis e Hidrolisáveis

A extração de polifenóis solúveis e hidrolisáveis ocorreu de acordo com o

protocolo descrito por Vinson et al. (2001). Para a extração de polifenóis solúveis foi

utilizada solução de extração (SE) composta por água deionizada e metanol (1:1 v/v)

na proporção de 1:5, amostra e solução de extração, respectivamente. Alíquotas de

100

µL do extrato fluido (EF) das frutas e hortaliças foram acondicionadas em

Materiais e Métodos

microtubos, onde foram acrescentados de 500µL da SE e agitados manualmente. As

amostras foram colocadas em banho-maria à 90ºC por 3 horas com agitação. Após

este período, as amostras foram retiradas, resfriadas em temperatura ambiente

(25°C), e o volume completado a 1000 µL com metanol P.A.. Os microtubos foram,

então, centrifugados a 12000g por 5 minutos. O sobrenadante recolhido,

denominado extrato solúvel (ES), contém principalmente polifenóis na forma

aglicona e/ou dissociados a estruturas celulares, sendo solúveis em soluções hidro-

alcóolicas.

A extração dos polifenóis hidrolisáveis foi realizada de acordo com o

procedimento descrito acima, com o acréscimo de ácido clorídrico (12M) a SE, a fim

de se obter uma concentração final de 1,2M (VINSON ET AL., 2001). O

sobrenadante, denominado extrato hidrolisável (EH), permite uma maior

quantificação dos polifenóis presentes, uma vez que a acidificação do meio com

ácido clorídrico leva à hidrólise parcial de formas glicosídicas e de ligações dos

polifenóis com componentes da matriz celular.

3.5.2. Quantificação de Polifenóis Solúveis e Hidrolisáveis

A quantificação de polifenóis solúveis e hidrolisáveis foi realizada utilizando o

reagente Folin-Ciocalteu e o ácido gálico como padrão, segundo metodologia

descrita por Karou et al. (2005). Em microtubos, 75µL de reagente de Folin-Ciocalteu

(50%) foram adicionados de 30µL do ES ou EH, permanecendo em repouso, em

temperatura ambiente, por 5 minutos. Após este período, foram adicionados 75µL de

carbonato de sódio (20% carbonato de sódio anidro) e após 30 minutos, em

temperatura ambiente, foi feita leitura em espectrofotômetro a 750nm. O teor de

polifenóis solúveis e hidrolisáveis foi expresso em mg de equivalente de ácido gálico

(EAG) / mL de EF. A curva padrão do ácido gálico foi elaborada a partir da plotagem

Materiais e Métodos

das absorbâncias geradas pelo ácido gálico, nas concentrações de 2.5, 5, 7.5, 10,

15 e 20 mcg/mL, de acordo com o procedimento acima.

3.5.3. Percentual de Diferença entre Formas de Cultivo

Os teores de polifenóis solúveis e hidrolisáveis analisados entre os alimentos

obtidos por cultivo orgânico ou convencional foram expressos em valor absoluto (mg

EAG/ mL EF) e na forma de percentual. Este será referente à diferença dos teores

observados nos vegetais orgânicos em relação aos convencionais, de forma que

percentuais negativos significam valores superiores nos alimentos convencionais e

vice versa, de acordo com a fórmula abaixo:

% = (mg EAG/ mL EF orgânicos - mg EAG/ mL EF convencionais) x 100

mg EAG/ mL EF orgânicos

3.6. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE

3.6.1. Capacidade Antioxidante pelo Método do Radical DPPH

A capacidade antioxidante aferida pelo método do radical DPPH foi realizada

de acordo com Kuskoski et al. (2006). Uma solução de DPPH a 100µM foi preparada

utilizando solução de metanol em água destilada (8:2 v/v). A leitura da solução de

DPPH no tempo zero, antes da adição das amostras, foi realizada em espectro a

517nm a fim de verificar a absorbância em torno de 1.1, sendo este o A

. Em tubo de

ensaio foram pipetados 0,1mL do extrato fluido de cada amostra, acrescidos de

3,9mL da solução de DPPH 100µM. Os tubos foram agitados manualmente e

mantidos no escuro até os tempos determinados para a realização das leituras (15,

Materiais e Métodos

30 e 60 minutos), sendo estes representados por A

. Para o cálculo da capacidade

antioxidante e a elaboração dos gráficos foi utilizado o percentual de radical DPPH

remanescente após cada tempo de leitura, segundo a fórmula abaixo:

% DPPHrem = 1 – [ (A

- A

) / A

]

Para a comparação das capacidades antioxidantes e análise estatística das

mesmas, foi utilizado o percentual de seqüestro de radicais livres (SRL) no tempo

máximo de reação (60 minutos). Para isto, foi calculado o percentual de SRL

segundo a equação abaixo:

% SRL = (A

- A

) / A

3.7. DETERMINAÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO

A análise de AA foi realizada por cromatografia de alta eficiência (CLAE),

segundo metodologia descrita por Paulo et al. (1999). As análises cromatográficas

foram realizadas utilizando coluna e pré-coluna C18 em sistema isocrático com

tampão fosfato de potássio 2% (KH

), pH 2,32. A absorbância foi monitorada a

243nm e 254 nm, em detector UV de fotodiodo Shimadzu SPD-M10A (Kyoto,

Japão). O fluxo utilizado foi de 0,4 mL/min e as corridas conduzidas em 20 minutos.

Para a quantificação do AA, foi utilizada curva de calibração com padrão de L-ácido

ascórbico com concentrações de 2,0µg/mL a 20µg/mL. O padrão de AA foi diluído no

tampão KH

2%, adicionado de 50µL (5mg/mL) de ditiotreitol (DTT). Os

resultados foram expressos em µg de AA/mL de EF. Os comprimentos de onde

utilizados, 243 e 254nm, foram referentes à detecção de AA e ácido

dehidroascórbico (DHA), respectivamente.

Materiais e Métodos

3.8. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A

DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE POLIFENÓIS E CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE POR DPPH

A avaliação da influência da adição de vitamina C sobre a determinação do

conteúdo de polifenóis e a capacidade antioxidante por DPPH foi realizada em duas

etapas. A primeira, representada pela determinação da possível interação do ácido

ascórbico com o reagente Folin-Ciocalteu de forma semelhante aos polifenóis. Para

isto, foram utilizadas soluções padrão de ácido ascórbico e ácido gálico, nas

concentrações 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20 mcg/ mL, para a elaboração de curvas padrão,

de acordo com a metodologia descrita no item 3.4.2. Com os resultados foram

obtidos curvas padrão para o ácido ascórbico e para o ácido gálico, sendo

realizadas análise de regressão linear e geradas as respectivas equações da reta.

A segunda etapa consistiu da avaliação da influência da adição do ácido

ascórbico em extratos fluidos de alimentos fonte ou não de vitamina C, após a

aplicação da metodologia de extração de polifenóis utilizada neste trabalho. A cebola

foi escolhida como amostra de alimento com baixo teor de vitamina C e a laranja

,como amostra de alimento fonte. Aos EF de cada alimento foram adicionadas

diferentes concentrações de ácido ascórbico, a fim de se obter, no momento da

quantificação de polifenóis por espectrofotometria, concentrações de 0.25, 0.5 e

0.75mcg/ mL. Após a adição de ácido ascórbico em amostra de EF, foram aplicadas

as metodologias para extração e quantificação de polifenóis solúveis e hidrolisáveis,

tais como descritas nos itens 3.4.1 e 3.4.2, assim como da determinação da

capacidade antioxidante por DPPH, conforme item 3.5.1.

Materiais e Métodos

A avaliação de variações no pH dos extratos foi aferida utilizando pHmetro

digital com controle interno de temperatura calibrado previamente com soluções

padrão de pH 4.0 e 7.0 (Incibras, Rio de Janeiro, Brasil).

3.9. ESTIMATIVA DA DISPONIBILIDADE DE POLIFENÓIS EM ALIMENTOS

NACIONAIS

A disponibilidade nacional de polifenóis foi estimada a partir dos valores

obtidos por grama de peso fresco de cada fruta e hortaliça analisada neste estudo.

O teor de polifenóis por gramatura foi calculado utilizando o valor de polifenóis

hidrolisáveis da fração comestível de cada alimento, dividido pelo rendimento

correspondente durante o preparo do extrato fluido no extrator de sucos, segundo

fórmula abaixo:

Teor de polifenóis (mg EAG/ g peso fresco) = mg EAG/ mL suco / rendimento

Em que rendimento se refere à:

Rendimento = peso fresco (g) / volume de suco obtido (mL)

O valor diário per capita no Brasil e regiões foi calculado a partir da soma do

aporte diário de polifenóis fornecido por cada alimento, segundo a fórmula a seguir:

Aporte diário por alimento: conteúdo de polifenóis (g) x aquisição anual

365 dias

A representatividade de cada vegetal no aporte diário de polifenóis foi

calculado a partir do teor de compostos fenólicos oferecido por cada alimento, em

Materiais e Métodos

um dia, dividido pela disponibilidade total diária, sendo o valor expresso em

percentual, como na fórmula expressa a seguir:

% = aporte de polifenóis por dia (para cada vegetal) x 100

disponibilidade diária de polifenóis

3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos para polifenóis livres e totais e para capacidade

antioxidante foram submetidos à análise de variância ANOVA, sendo as médias

comparadas pelo teste de Bonferroni (p = 0,05). Os valores de polifenóis e

capacidade antioxidnte foram analisados por correlação de Pearson. O programa

utilizando foi o software GraphPad Prism versão 5.0.

Resultados e Discussão

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. POLIFENÓIS EM HORTALIÇAS E FRUTAS ORGÂNICAS E

CONVENCIONAIS

Os teores de polifenóis solúveis nas diferentes frações de batata, brócolis,

cebola, cenoura, repolho e tomate estão descritos na tabela 2. O percentual de

diferença, quando com sinal negativo, demonstra maior conteúdo de polifenóis a

favor do cultivo convencional. As hortaliças orgânicas apresentaram valores

superiores de polifenóis solúveis, com exceção da cebola e das flores de brócolis.

Apesar do maior conteúdo de polifenóis solúveis nas hortaliças orgânicas, apenas a

casca da batata apresentou diferença significativa entre os tipos de agricultura.

Tabela 2. Conteúdo de Polifenóis Solúveis em Hortaliças Orgânicas e Convencionais.

* Diferença significativa entre os valores em alimentos orgânicos e

convencionais. Teste de Bonferroni (p <0,05).

Polifenóis Solúveis (mg EAG/ mL EF)

Alimento

Orgânico Convencional Diferença (%)

Batata

Casca

0,42 ±0,10 0,23 ±0,01 45,2 *

Polpa

0,40 ±0,08

0,33 ±0,09 17,5

Brócolis

Folha

1,24 ±0,15 1,17 ±0,45 5,6

Talo

0,66 ±0,08 0,64 ±0,41 3,0

Flor

0,88 ±0,07 1,01 ±0,05 -14,8

Cebola 0,20 ±0,07 0,32 ±0,06 -60,0

Cenoura

Casca

0,64 ±0,24 0,53 ±0,18 17,2

Polpa

0,79 ±0,49 0,40 ±0,19 49,4

Repolho

Externo

0,42 ±0,02 0,41 ±0,07 2,4

Interno

0,56 ±0,17 0,45 ±0,13 19,6

Tomate

Casca

1,21 ±0,18 1,07 ±0,03 11,6

Polpa 1,81 ±0,03 1,70 ±0,17 6,1

Resultados e Discussão

A análise do conteúdo de polifenóis solúveis entre as frações de cada

hortaliça pode ser observada na figura 8. Os tomates orgânico e convencional

apresentaram maior teor de polifenóis solúveis na polpa do que em relação à casca

(figura 8D). O brócolis, de ambos os tipos de agricultura, apresentou valores

significativamente diferentes apenas entre as folhas e os talos (figura 8E). As demais

frações analisadas não resultaram em valores estatisticamente diferentes.

O conteúdo de polifenóis hidrolisáveis pode ser visualizado na tabela 3.

Dentre as doze amostras analisadas, incluindo as diferentes frações de cada

hortaliça, oito apresentaram valores superiores para o cultivo orgânico e quatro para

o cultivo convencional. Apesar das variações, diferenças estatísticas só foram

observadas na casca da batata e na cebola, favorecendo o cultivo orgânico, e na

fração externa do repolho, favorecendo o cultivo convencional.

Tabela 3. Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis em Hortaliças Orgânicas e

Convencionais.

Polifenóis Hidrolisáveis (mg EAG/ mL EF)

Alimento

Orgânico Convencional Diferença (%)

Batata

Casca

0,62 ±0,05 0,51 ±0,03 17,7 *

Polpa

0,45 ±0,17 0,42 ±0,06 6,7

Brócolis

Folha

2,31 ±0,22 2,01 ±0,29 13,0

Talo

0,95 ±0,23 1,23 ±0,55 -29,5

Flor

1,64 ±0,48 1,53 ±0,20 6,7

Cebola 1,20 ±0,05 0,93 ±0,08 22,5 *

Cenoura

Casca

1,02 ±0,11 1,23 ±0,21 -20,6

Polpa

0,79 ±0,12 0,81 ±0,12 -2,5

Repolho

Externo

0,72 ±0,05 1,40 ±0,20 -94,4 *

Interno

1,69 ±0,24 1,36 ±0,35 19,5

Tomate

Casca

0,72 ±0,15 0,70 ±0,04 2,8

Polpa

1,23 ±0,13 1,04 ±0,14 15,4

* Diferença significativa entre os valores em alimentos orgânicos e

convencionais. Teste de Bonferroni (p <0,05).

Resultados e Discussão

Batata

Cas

Polpa OG

Cas

Polpa CV

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

mg EAG/ mL EF

Cenoura

sca

Polpa

Casc

0.0

0.5

1.0

1.5

mg EAG/ mL EF

Repolho

Exte

Interno OG

tern

no CV

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

mg EAG/ mL EF

Tomate

a OG

Polpa

a CV

Polpa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg EAG/ mL EF

Brócolis

Folha OG

Fol

a CV

Flor CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg EAG/ mL EF

Figura 8. Variação do Conteúdo de Polifenóis Solúveis nas Diferentes Frações de

Hortaliças. Valores determinados pelo reagente Folin-Ciocalteu, expressos em mg

equivalente de ácido gálico (EAG) por mL de extrato fluido (EF) de batata (A), cenoura (B),

repolho (C), tomate (D) e brócolis (E). Letras iguais nas colunas demonstram que não há

diferença estatística (p < 0,05) entre as frações orgânicas (OG) e convencionais (CV)

analisadas.

A B

Resultados e Discussão

No entanto, ao contrário do observado para os polifenóis solúveis, os

hidrolisáveis apresentaram um maior número de diferenças estatisticamente

significativas. O tomate orgânico e o convencional apresentaram teores superiores

na polpa do que na casca (figura 9D), seguindo o mesmo padrão dos polifenóis

solúveis. Para as cascas de batata orgânica (figura 9A) e de cenoura convencional

(figura 9B), porém, os teores de polifenóis hidrolisáveis foram maiores que nas

respectivas polpas analisadas. Dentre os alimentos orgânicos, o repolho obteve

valor superior para as folhas internas, quando comparado com as folhas externas

(figura 9C), e o brócolis orgânico apresentou diferença significativa entre as três

frações analisadas, enquanto que no convencional apenas o talo apresentou teor

distinto das demais frações (figura 9E).

Os alimentos que obtiveram maior teor de polifenóis solúveis não foram os

mesmos que apresentaram maior conteúdo de polifenóis hidrolisáveis, com exceção

da casca de batata. Estes resultados sugerem que o tipo de agricultura pode

modular de forma distinta o tipo de composto fenólico sintetizado de acordo com a

espécie de hortaliça analisada. Além disso, o maior acúmulo de compostos fenólicos

sejam solúveis ou hidrolisáveis, nas cascas e partes externas dos alimentos parece

também ser variável de acordo com o cultivar analisado.

Resultados e Discussão

Batata

Polpa OG

a CV

pa CV

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

mg EAG/ mL EF

Cenoura

Casca OG

lpa

Cas

ca CV

Polpa

0.0

0.5

1.0

1.5

mg EAG/ mL EF

Repolho

Exte

no OG

Interno OG

Externo CV

no CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg EAG/ mL EF

Tomate

Casca

lpa

Casca

lpa CV

0.0

0.5

1.0

1.5

mg EAG/ mL EF

Brócolis

Flor OG

Talo OG

Folha CV

Flor CV

Talo CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

mg EAG/ mL EF

Figura 9. Variação do Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis nas Diferentes Frações de

Hortaliças. Valores determinados pelo reagente Folin-Ciocalteu, expressos em mg

equivalente de ácido gálico (EAG) por mL de extrato fluido (EF) de batata (A), cenoura (B),

repolho (C), tomate (D) e brócolis (E). Letras iguais nas colunas demonstram que não há

diferença estatística (p < 0,05) entre as frações orgânicas (OG) e convencionais (CV)

analisadas.

Resultados e Discussão

Os teores de polifenóis solúveis de banana, laranja, maçã, mamão, manga e

tangerina cultivados sob agricultura orgânica e convencional estão descritos na

tabela 4. Os polifenóis solúveis contidos nas frutas apresentaram um padrão misto,

apresentando resultados que privilegiaram ambos os tipos de agricultura. Apesar da

variação observada, diferença estatística só foi observada a favor do cultivo

orgânico, para a casca da laranja e a polpa do mamão.

Quando comparadas em termos de diferença do teor de polifenóis solúveis

entre casca e polpa, a maioria das frutas apresentou valores superiores nas cascas

quando em comparação à polpa (figura 10). Duas frutas, laranja e tangerina,

apresentaram diferenças significativas nos dois tipos de agricultura, além do mamão

orgânico (figura 10D) e da manga convencional (figura 10E).

Tabela 4. Conteúdo de Polifenóis Solúveis em Frutas Orgânicas e

Convencionais

Polifenóis Solúveis (mg EAG/ mL EF)

Alimento

Orgânico Convencional

Diferença (%)

Banana

Casca

1,96 ±0,43

3,17 ±0,26 -61,7

Polpa

0,88 ±0,05

0,91 ±0,73 -3,4

Laranja

Casca

2,78 ±0,04

2,42 ±0,06 12,9 *

Polpa

0,51 ±0,02

0,47 ±0,06 7,8

Maçã

Casca

1,94 ±0,09

2,19 ±0,20 -12,9

Polpa

1,83 ±0,02

2,21 ±0,18 -20,8

Mamão

Casca

0,54 ±0,0 0,38 ±0,14 29,6

Polpa

0,98 ±0,10

0,11 ±0,03 88,8 *

Manga

Casca

0,61 ±0,21

0,76 ±0,35 -24,6

Polpa

0,46 ±0,18

0,29 ±0,11 37,0

Tangerina

Casca

3,06 ±0,23

2,87 ±0,30 6,2

Polpa

0,63 ±0,02

0,96 ±0,14 -52,4

* Diferença significativa entre os valores em alimentos orgânicos e

convencionais. Teste de Bonferroni (p <0,05).

Resultados e Discussão

Banana

Casca CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mg EAG/ mL EF

Laranja

Casca OG

Polp

Polpa CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mg EAG/ mL EF

Maçã

a O

ca CV

a C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

mg EAG/ mL EF

Mamão

Casca OG

Polpa OG

Casca CV

Polpa CV

0.0

0.5

1.0

1.5

mg EAG/ mL EF

Manga

Polp

Casca CV

Polpa

0.0

0.5

1.0

1.5

mg EAG/ mL EF

Tangerina

Cas

Polpa

ca CV

Polp

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mg EAG/ mL EF

Figura 10. Variação do Conteúdo de Polifenóis Solúveis nas Diferentes Frações de

Frutas. Valores determinados pelo reagente Folin-Ciocalteu, expressos em mg equivalente

de ácido gálico (EAG) por mL de extrato fluido (EF) de banana (A), laranja (B), maçã (C),

mamão (D), manga (E) e tangerina (F). Letras iguais nas colunas demonstram que não há

diferença significativa (teste de Bonferroni p < 0,05) entre as frações analisadas. Orgânica

(OG) e convencional (CV).

A B

C D

Resultados e Discussão

Em relação ao conteúdo de polifenóis hidrolisáveis nas frutas, assim como

para os solúveis, a diferença observada nos teores destes compostos bioativos não

foi predominante em nenhuma das duas formas de cultivo. No entanto, com

exceção da casca da banana, todas as diferenças estatísticas foram observadas a

favor do cultivo orgânico, nas cascas de laranja e de tangerina, além da casca e

polpa do mamão (tabela 5). Ao compararmos casca com polpa (figura 11), podemos

observar novamente um teor destes polifenóis nas cascas da maioria das frutas,

sendo esta diferença significativa para banana, laranja e tangerina, em ambos os

tipos de cultivo (figuras 11A, B e F).

Tabela 5. Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis em Frutas Orgânicas e Convencionais

Polifenóis Hidrolisáveis (mg EAG/ mL EF)

Alimento

Orgânico Convencional Diferença (%)

Banana

Casca

3,09 ±0,29 3,63 ±0,09 -17,5 *

Polpa

2,15 ±0,17 2,16 ±0,03 -0,5

Laranja

Casca

3,90 ±1,67 3,45 ±0,03 11,5 *

Polpa

1,24 ±0,54 1,18 ±0,02 4,8

Maçã

Casca

2,88 ±0,17 2,65 ±0,46 8,0

Polpa

2,70 ±0,13 2,67 ±0,41 1,1

Mamão

Casca

2,01 ±0,25 0,55 ±0,07 72,6 *

Polpa

2,08 ±0,13 0,60 ±0,01 71,2 *

Manga

Casca

1,30 ±0,37 1,78 ±0,11 -36,9

Polpa

1,90 ±0,50 1,44 ±0,22 24,2

Tangerina

Casca

4,58 ±0,06 3,39 ±0,08 26,0 *

Polpa

1,80 ±0,37 1,96 ±0,10 -8,9

* Diferença significativa entre os valores em alimentos orgânicos e

convencionais. Teste de Bonferroni (p <0,05).

Resultados e Discussão

Banana

ca OG

Casca CV

lpa C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mg EAG/ mL EF

Maçã

ca OG

Polpa OG

asca C

Polpa CV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

mg EAG/ mL EF

Mamão

a OG

Polpa OG

Casca C

pa C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

mg EAG/ mL EF

Manga

Casca

a OG

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

mg EAG/ mL EF

Tangerina

Casca OG

Polpa OG

Casca

olpa

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

mg EAG/ mL EF

Figura 11. Variação do Conteúdo de Polifenóis Hidrolisáveis nas Diferentes Frações

de Frutas. Valores determinados pelo reagente Folin-Ciocalteu, expressos em mg

equivalente de ácido gálico (EAG) por mL de extrato fluido (EF) de banana (A), laranja (B),

maçã (C), mamão (D), manga (E) e tangerina (F). Letras iguais nas colunas demonstram

que não há diferença significativa (teste de Bonferroni p < 0,05) entre as frações analisadas.

Orgânica (OG) e convencional (CV).

A B

C D

Laranja

lpa OG

Cas

lpa C

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

mg EAG/ mL EF

Resultados e Discussão

Os resultados sugerem que, para as hortaliças, o tipo de agricultura apresenta

um efeito menos acentuado na modulação dos teores de compostos fenólicos.

Apesar do conteúdo de polifenóis solúveis ter sido superior nas variedades

orgânicas, a diferença não foi estatisticamente diferente. O cultivo orgânico parece

ser mais influente na modulação de compostos fenólicos das frutas, onde a maioria

das variações observadas foram estatisticamente diferentes favorecendo este tipo

de cultivo. A maior distribuição de polifenóis nas cascas e partes externas estão

também mais evidentes nas frutas. Tanto nas hortaliças como nas frutas, os

polifenóis hidrolisáveis parecem ser mais suscetíveis a modulação do que os

polifenóis solúveis.

A diferença observada nos polifenóis solúveis da cebola e da flor do brócolis a

favor da agricultura convencional pode ter sido, em parte, em função dos teores de

ácido ascórbico apresentados neste alimento. Os teores de ácido ascórbico na

cebola e na flor de brócolis convencionais foram aproximadamente quatro e duas

vezes maiores, respectivamente, que na versão orgânica. O maior conteúdo de

vitamina C nestes alimentos pode ter influenciado a quantificação de polifenóis

solúveis, uma vez que os resultados deste trabalho indicam que, em determinadas

concentrações, o ácido ascórbico pode interferir na determinação de polifenóis

solúveis.

Apesar de já estar bem estabelecido que a exposição da planta a situações

agressivas e de estresse induz modificações no metabolismo, como a ativação da

síntese de compostos fenólicos decorrentes da ativação da fenilalanina amônia liase

(FAL), estas podem variar de um alimento para o outro. A modulação de compostos

fenólicos pelo tipo de agricultura pode ainda variar entre cultivares, devido à

Resultados e Discussão

variação genética, ou por diferenças nas funções que estas substâncias exercem no

metabolismo e fisiologia do vegetal (REYS; VILLARREAL; CISNEROS-ZEVALLOS,

2007).

Estudo realizado ao longo de três anos com dois cultivares de tomate e dois

cultivares de pimentão sob agricultura convencional e orgânica, demonstrou que os

tomates parecem ser mais suscetíveis a variações na forma de cultivo do que os

pimentões, resultando em valores maiores para ácido ascórbico e compostos

fenólicos totais (CHASSY ET AL., 2006). Diferenças foram ainda observadas entre

os cultivares de tomate estudados. Isto demonstra as diferentes respostas que cada

alimento, e ainda, cada cultivar, podem ter sobre um mesmo estímulo externo. Em

nosso estudo, os teores de polifenóis solúveis e hidrolisáveis foram maiores na

casca e polpa de tomate orgânico. No entanto, esta diferença não foi significativa.

Além disso, o efeito do tipo de agricultura como forma de estímulo externo à

síntese de polifenóis pode induzir a diferentes direcionamentos dos novos

compostos sintetizados, o que pode ter influenciado as diferentes respostas entre os

alimentos orgânicos e convencionais. Reyes et al. (2007) sugerem que a ativação da

FAL e o aumento da síntese de compostos fenólicos podem atuar diretamente na

defesa da planta, agindo sobre espécies reativas de oxigênio, como antioxidantes,

estando principalmente na forma livre (OROZCO-CÁRDENAS, 2001) ou serem

direcionadas para sofrerem polimerização, formando e/ou se associando às ligninas,

recuperando a estrutura vegetal (RAZEM; BERNARDS, 2002).

Um outro aspecto é a metodologia aplicada para a determinação dos

compostos fenólicos. Mesmo utilizando uma solução de extração acidificada com

ácido clorídrico, cujo objetivo é aumentar a capacidade de extração de alguns

Resultados e Discussão

compostos glicosilados, os teores de polifenóis podem ter sido subestimados.

Substâncias fenólicas associadas a componentes da parede celular, ou mesmo a

ocorrência de hidrólise e extração incompletas podem ter favorecido os resultados

obtidos neste estudo (PINELO, ARNOUS, MEYER, 2006).

Este fato se torna mais evidente quando se compara a batata aos demais

alimentos estudados. Com exceção deste tubérculo, as frutas e hortaliças

apresentaram valores para polifenóis hidrolisáveis muito superiores aos de polifenóis

solúveis. Uma explicação para esta diferença pode ser a própria composição

química da batata, rica em polisacarídeos e amido, e a possível interação destes

componentes com os polifenóis. Um mecanismo proposto a fim de explicar esta

interação sugere a formação de complexos de ligações de hidrogênio entre os

grupamentos hidroxil dos polifenóis e átomos de oxigênio de polissacarídeos da

parede celular vegetal. Esta interação levaria a formação de géis capazes de

encapsular compostos fenólicos (FREITAS, CARVALHO, MATEUS, 2003).

Outro mecanismo sugere a formação de cavidades hidrofóbicas a partir da

capacidade de alguns polissacarídeos de formar estruturas secundárias, como

nanotubos. Estas regiões hidrofóbicas também seriam capazes de encapsular e

complexar polifenóis (LE BOURVELLEC, BOUCHET, RENARD, 2005). Apesar de os

estudos que evidenciaram estas interações terem sido realizados em maçãs e uvas,

esta poderia ser uma explicação para a menor diferença observada entre as

quantificações de polifenóis solúveis e hidrolisáveis encontradas para a batata.

O conteúdo de polifenóis apresentou, tanto para as hortaliças, como para as

frutas, diferenças mais evidentes entre as frações analisadas de cada alimento. A

exposição de alimentos, ainda durante o plantio, a efeitos externos pode contribuir

Resultados e Discussão

para o aumento de compostos fenólicos, especialmente nas partes do vegetal que

estão mais expostos e suscetíveis a estes fatores. A maior exposição à luz solar, por

exemplo, resultou no aumento da concentração de flavonóis em flores de brócolis

(GLISZCZYŃSKA-ŚWIGLO ET AL., 2007). Da mesma forma, as folhas e flores de

brócolis orgânico analisado neste trabalho apresentaram valores superiores ao talo.

Esta diferença pode ser devido à maior exposição destas frações a fatores

ambientes, como a luz UV, quando comparada ao talo.

Apesar destas evidências, o tomate apresentou maior teor de polifenóis

solúveis e hidrolisáveis na polpa do que na casca, em ambos os tipos de agricultura.

O mesmo foi observado no repolho orgânico, onde os polifenóis hidrolisáveis nas

folhas internas foram superiores ao das folhas externas. Outros autores já haviam

demonstrado que quando expostos à situação agressiva, pode haver diminuição do

conteúdo de compostos fenólicos, em função do seu direcionamento ao combate à

espécies reativas, sendo o tipo de resposta específico de cada espécie vegetal

(REYS; VILLARREAL; CISNEROS-ZEVALLOS, 2007).

Para as frutas, a maioria apresentou valores superiores de compostos

fenólcios, solúveis e hidrolisáveis, nas cascas quando comparado às polpas, tanto

nas variedades orgânicas como nas convencionais. Hagen et al. (2007) demonstrou

que a exposição à luz UV após a colheita de maçãs resultou em maior acúmulo de

compostos fenólicos na casca do que na polpa. As maçãs analisadas neste estudo,

porém, não apresentaram diferença estatística entre casca e polpa, tanto para

polifenóis solúveis como para hidrolisáveis. Outros trabalhos já vêm demonstrando

que cascas de frutas são ricas em polifenóis e outros compostos antioxidantes,

confirmando os dados obtidos neste estudo. A importância das cascas de frutas,

Resultados e Discussão

normalmente sub-produtos da indústria, como fontes de polifenóis já foram

atribuídas à manga (AJILA ET AL., 2007) e a frutas cítricas (GORINSTEIN, MARTÍN-

BELLOSO, PARK, 2001).

O conteúdo de polifenóis solúveis foi inferior ao de polifenóis hidrolisáveis em

quase todos os alimentos e suas frações analisadas. Como exceção, há o tomate,

orgânico e convencional, cujo conteúdo de polifenóis solúveis foi superior ao de

polifenóis hidrolisáveis. No entanto, pode ter ocorrido uma interferência da vitamina

C na determinação do conteúdo de polifenóis solúveis, já que este fruto apresentou

teores consideráveis desta vitamina. O maior conteúdo de polifenóis na fração

hidrolisável, já era esperado. Recentemente, estudos vêm demonstrando que a

extração de polifenóis através de soluções hidro-alcóolicas é incompleta, estando

presente no resíduo uma proporção importante de polifenóis não solúveis, influindo

também na determinação da capacidade antioxidante das amostras (PÉREZ-

JIMÉNEZ, SAURA-CALIXTO, 2005).

A acidificação do meio permite obter teores de polifenóis mais próximos

àqueles realmente presentes no alimento, pois permite a ocorrência de hidrólise e

dissociação de polifenóis da matriz alimentar. Isso demonstra que, dependendo da

metodologia aplicada, os valores de polifenóis e capacidade antioxidante podem ser

subestimados, tanto em relação ao seu conteúdo nos alimentos, quanto a sua

bioacessibilidade no organismo (SERRANO, GOÑI, SAURA-CALIXTO, 2007).

Resultados e Discussão

4.2. CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM HORTALIÇAS E FRUTAS

ORGÂNICAS E CONVENCIONAIS

A capacidade antioxidante obtida pelo método do radical DPPH das hortaliças

e suas frações analisadas está ilustrada na figura 12. Os gráficos demonstram o

perfil de decaimento da absorbância gerada pelo radical DPPH em função do tempo,

considerando como 100% a absorbância do DPPH no tempo zero. Quanto menor o

percentual de DPPH após 60 minutos de reação, maior é, conseqüentemente, a

capacidade antioxidante da fração em questão. Para a batata e a cenoura, as

cascas apresentaram maior capacidade antioxidante quando comparados com as

polpas, tanto para o cultivo orgânico como para o convencional (figuras 12A e D). O

mesmo ocorreu com o repolho convencional em relação ao orgânico, para as folhas

externas e internas (figura 12E).

A tabela 6 demonstra o percentual de seqüestro de radical livre (SRL) após 60

minutos de reação, onde apenas o talo de brócolis apresentou diferença estatística

entre a versão orgânica e a convencional. Em ambos os tipos de agricultura as

frações de brócolis foram aquelas que apresentaram maior capacidade antioxidante.

As principais diferenças foram observadas na cebola e polpa da batata, onde a

versão orgânica apresentou aproximadamente o dobro da capacidade antioxidante

que a versão convencional, e para o repolho, em que ocorreu o inverso.

Resultados e Discussão

Batata

0 20 40 60 80

100

120

Casca OG

Casca CV Polpa CV

Polpa OG

Tempo (min)

% DPPH

Brócolis

0 20 40 60 80

100

120

Talo CV

Talo OG

Folha CV

Folha OG

Flor CV

Flor OG

Tempo (min)

% DPPH

Cebola

0 20 40 60 80

100

120

Convencional Orgânico

Tempo (min)

% DPPH

Cenoura

0 20 40 60 80

100

120

Casca CV

Casca OG Polpa CV

Polpa OG

Tempo (min)

% DPPH

Repolho

0 20 40 60 80

100

120

Externo CV

Externo OG

Interno CV

Interno OG

Tempo (min)

% DPPH

Tomate

0 20 40 60 80

100

120

Casca CV

Casca OG Polpa CV

Polpa OG

Tempo (min)

% DPPH

Figura 12. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante de Hortaliças Orgânicas e

Convencionais pelo Método DPPH. A capacidade antioxidante dos EF foi aferida

utilizando solução de DPPH 100µM. Os valores são expressos em percentual de

decaimento da absorbância de DPPH, em função do tempo, a partir do tempo zero. (A)

batata, (B) brócolis, (C) cebola, (D) cenoura, (E) repolho e (F) tomate.

C D

Resultados e Discussão

Tabela 6

Capacidade de Seqüestro de Radicais Livres em Hortaliças Orgânicas

e Convencionais

Capacidade Antioxidante

(% SRL) de Hortaliças Orgânicas e

Convencionais em 60 minutos

Hortaliça Orgânica Convencional

Casca

38,9

±0,14

28,8

±0,08

Batata

Polpa

23,1

±0,17

9,1

±0,06

Talo

61,0

±0,06

81,9

±0,01 *

Flor

73,8

±0,03

78,9

±0,02

Brócolis

Folha

79,2

±0,01

76,6

±0,01

Cebola

41,9

±0,26

26,4

±0,32

Casca

61,9

±0,10

61,2

±0,19

Cenoura

Polpa

19,0

±0,28

48,3

±0,01

Externo

38,7

±0,33

68,4

±0,21

Repolho

Interno

30,

0 ±0,16

70,1

±0,21

Casca

38,3

±0,01

34,2

±0,17

Tomate

Polpa

44,8

±0,12

41,8

±0,02

Valores expressos em percentual de seqüestro de radicais livres (SRL).

* Valores estatisticamente diferentes, teste Bonferroni (p<0,05). OG: orgânico, CV:

convencional.

Interessante notar que, não houve predominância de nenhuma agricultura

para a capacidade antioxidante, semelhante ao observado para os polifenóis

hidrolisáveis. A cebola, em especial, que apresentou valores de polifenóis solúveis

bastante superiores na variedade convencional, não obteve maior capacidade

antioxidante neste tipo de cultivo. O brócolis, tanto orgânico como convencional,

apresentou maior capacidade antioxidante entre as hortaliças analisadas. Este fato

sugere que outros componentes da matriz alimentar possam estar atuando como

antioxidantes, incluindo o ácido ascórbico, além de outros compostos bioativos, tais

como carotenóides e glicosinolatos (PRIOR ET AL., 2003).

Alterações na composição qualitativa dos polifenóis podem ainda vir a

modificar a capacidade antioxidante total, uma vez que cada substância apresenta

determinada atividade antioxidante em função de sua estrutura química,

Resultados e Discussão

principalmente em relação ao número de radicais hidroxila livres (RICE-EVANS;

MILLER; PAGANG, 1997). Esta hipótese, envolvendo alterações no perfil qualitativo,

também pode estar influenciando os dados de capacidade antioxidante obtidos entre

as hortaliças orgânicas e convencionais.

A capacidade antioxidante das frutas orgânicas e convencionais está

demonstrada na figura 13. De maneira geral, as cascas e polpas das frutas

analisadas apresentaram um perfil de reação parecida para ambos os tipos de

cultivo. O pequeno aumento no percentual de DPPH, entre 30 e 60 minutos,

observado na casca e polpa da manga convencional pode ser decorrente da

interferência de outros componentes no método utilizado. De acordo com Noruma et

al. (1997), os carotenóides podem interferir com o método DPPH, o que poderia

explicar o aumento observado na manga convencional, uma vez que este alimento é

fonte destes fitoquímicos.

A capacidade de seqüestro de radicais livres (SRL) foi significativamente

superior no cultivo orgânico para todas as cascas analisadas, com exceção da

banana e da laranja. Já no caso das polpas, maior capacidade de seqüestro de

radicais foi observada na maioria das frutas oriundas da agricultura convencional,

sendo esta diferença significativa no caso do mamão e da tangerina (tabela 7).

Resultados e Discussão

Banana

0 20 40 60 80

100

120

Tempo (min)

% DPPH

Laranja

0 20 40 60 80

100

120

Tempo (min)

% DPPH

Maçã

0 20 40 60 80

100

120

Tempo (min)

% DPPH

Mamão

0 20 40 60 80

100

120

Tempo (min)

% DPPH

Manga

0 20 40 60 80

100

120

CV - casca OG - casca

Tempo (min)

% DPPH

Tangerina

0 20 40 60 80

100

120

CV - polpa

OG - polpa

Tempo (min)

% DPPH

Figura 13. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante de Hortaliças Orgânicas e

Convencionais pelo Método DPPH. A capacidade antioxidante dos EF foi aferida

utilizando solução de DPPH 100µM. Os valores são expressos em percentual de

decaimento da absorbância de DPPH, em função do tempo, a partir do tempo zero. (A)

banana, (B) laranja, (C) maçã, (D) mamão, (E) manga e (F) tangerina.

Resultados e Discussão

Tabela 7. Capacidade de Seqüestro de Radicais Livres em Frutas Orgânicas e

Convencionais.

Capacidade Antioxidante (% SRL)*de Frutas Orgâncias e Convencionais em 60

minutos

Fruta Casca OG Casca CV Polpa OG Polpa CV

Banana 54,1

±2,05

41,1

±13,51

47,5

±5,35

50,5

±0,14

Laranja 66,7

±3,73

92,0

±0,98

* 83,0

±0,02

85,1

±0,25

Maçã 74,9

±0,04

68,7

±3,28

66,0

±0,08

62,5

± 1,56

Mamão 89,9

±4,62

76,7

±0,28

79,6

±3,63

93,1

±0,94

Manga 89,5

±5,60

75,2

±0,04

91,6

±1,89

47,1

±2,93

Tangerina 89,2

±3,08

68,8

±3,27

50,8

±2,99

62,7

±1,51

Valores expressos em percentual de seqüestro de radicais livres (SRL).

* Valores estatisticamente diferentes, teste Bonferroni (p<0,05). OG: orgânico, CV:

convencional.

As cascas, por envolverem as frutas na sua integralidade, estão mais sujeitas

ao estímulo para síntese de substâncias de defesa endógenas, podendo apresentar

maior concentração destes compostos, como foi observado no presente estudo e

demonstrado anteriormente (LI ET AL., 2006). Outra hipótese sugere alterações na

distribuição destes compostos recém sintetizados pelos tecidos vegetais, uma vez

que, sendo compostos de defesa, as cascas tendem a apresentar concentrações

maiores destes em relação à polpa, alterando, também, a capacidade antioxidante

(BALASUNDRAM, SUNDRAM, SAMMAN, 2006).

No entanto, a maior capacidade antioxidante das cascas orgânicas em

relação às convencionais não deve estar sendo influenciada diretamente pelo teor

de compostos fenólicos, uma vez que estes não seguiram o mesmo padrão da

capacidade antioxidante. Outras substâncias, como o ácido ascórbico, podem estar

exercendo este efeito, porém este parâmetro não foi contemplado no momento por

este estudo.

Resultados e Discussão

Estudos comparativos entre alimentos convencionais e orgânicos avaliando o

conteúdo de polifenóis e capacidade antioxidante demonstram resultados variados.

O teor de polifenóis totais foi superior em ameixas sob cultivo convencional,

enquanto que o conteúdo de ácido ascórbico foi superior na variedade orgânica

(LOMBARDI-BOCCIA ET AL., 2004). Neste estudo, os autores observaram ainda

diferenças no perfil qualitativo dos compostos fenólicos entre as duas agriculturas,

tendo a ameixa orgânica mais campeferol e mirecitina e a variedade convencional,

maior conteúdo de quercetina, como já mencionado anteriormente.

As capacidades antioxidantes observadas em pêssegos e pêras, orgânicas e

convencionais, foram similares em estudo realizado por Carbonaro et al. (2002).

Porém, outros nutrientes antioxidantes foram encontrados em diferentes proporções,

dependendo da fruta e do tipo de cultivo, de forma que os pêssegos orgânicos

apresentaram maior concentração de ácidos ascórbico e cítrico, enquanto que as

pêras obtiveram maior teor de tocoferol. Dessa forma, mudanças quantitativas e

qualitativas em relação aos compostos fenólicos e outros componentes

antioxidantes, podem alterar a capacidade antioxidante total avaliada.

Adicionalmente, diferentes afinidades destas substâncias com o radical DPPH

podem, ainda, influenciar os resultados obtidos a respeito das capacidades

antioxidantes de cada alimento (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002).

Em outro estudo, realizado com diferentes vegetais submetidos a

fracionamentos, como corte mecânico e, conseqüentemente, a ruptura celular,

verificou-se um aumento no teor total de polifenóis solúveis em alface, aipo,

cenoura, nabo e batata doce, enquanto que para repolho branco e roxo, batata

inglesa, rabanete e abobrinha, o teor de polifenóis reduziu após a lesão tecidual

Resultados e Discussão

(REYS; VILLARREAL; CISNEROS-ZEVALLOS, 2007). A atividade antioxidante dos

vegetais que apresentaram aumento do teor de polifenóis após o estresse mecânico

também foi superior a dos alimentos íntegros, com exceção do repolho branco, cujo

aumento de atividade antioxidante não apresentou diferença significativa. Neste

estudo houve relação direta entre o aumento do conteúdo de polifenóis e o aumento

da atividade antioxidante.

4.3. CONTEÚDO DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM HORTALIÇAS ORGÂNICAS E

CONVENCIONAIS

Os perfis cromatográficos obtidos pelo padrão de ácido ascórbico (AA) e de

ácido ascórbico da folha de brócolis in natura estão demonstrados na figura 14,

como exemplos das análises realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE).

As curvas padrão e equações da reta para o ácido ascórbico e o ácido

dehidroascórbico, a partir das leituras a 243nm e 254nm, respectivamente, podem

ser visualizadas na figura 15.

Resultados e Discussão

Padrão de Ácido Ascórbico

0 200 400 600 800

500

1000

1500

2000

2500

Tempo

Absorbância

0 200 400 600 800

500

1000

1500

2000

2500

Tempo

Absorbância

Folha de Brócolis Convencional

0 200 400 600 800

500

1000

1500

2000

2500

Tempo

Absorbância

0 200 400 600 800

500

1000

1500

2000

2500

Tempo

Absorbância

Figura 14. Perfil Cromatográfico do Conteúdo de Àcido Ascórbico e Ácido

Dehidroascórbico. O teor de AA e DHA foram quantificados por CLAE utilizando tampão

fosfato pH 2.32, fluxo 0,4mL/ minuto e solução padrão de ácido ascórbico nas

concentrações de 2 a 20µg/ mL. As leituras foram realizadas a 243nm e 254nm para AA e

DHA, respectivamente. (A) perfil cromatográfico do AA a 20µg/ mL em 243nm, (B) perfil

cromatográfico do AA a 20µg/ mL em 254nm, (C) perfil cromatográfico da folha de brócolis

convencional in natura em 243nm, (D) perfil cromatográfico da folha de brócolis

convencional in natura em 254nm.

C D

A B

Resultados e Discussão

Ácido Ascórbico

y = 0,2135x - 0,1288

= 0,9443

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Área do Pico

Conteúdo de AA (mcg/ mL)

Ácido Dehidroascórbico

y = 0,243x - 0,6117

= 0,9565

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0

Área do Pico

Concentração de DHA (mcg/ mL)

Figura 15. Curva Padrão de Ácido Ascórbico (A) e Ácido Dehidroascórbico (B). Curvas

padrão a partir de solução de ácido ascórbico nas concentrações 2, 5, 10, 15 e 20µg, por

CLAE, nos comprimentos de onda 243nm para AA e 254nm para DHA.

Resultados e Discussão

O conteúdo de ácido ascórbico e ácido dehidroascórbico presente nas

hortaliças está descrito na tabela 8. As amostras de batata e cenoura, de ambos os

tipos de cultivo, não apresentaram quantidade de ascorbato ou dehidroascorbato

capazes de serem detectadas pela metodologia empregada. O mesmo ocorreu para

o repolho convencional e o orgânico, com exceção do ácido ascórbico na versão

orgânica.

Tabela 8 - Teor de Ácido Ascórbico e Ácido Dehidroascórbico em Hortaliças

Orgânicas e Convencionais

Ácido Ascórbico

(µg/ mL EF)

Ácido Dehidroascórbico

(µg/ mL EF)

Alimento

Orgânico Convencional Orgânico Convencional

Batata

Casca

nd nd nd nd

Polpa

nd nd nd nd

Brócolis

Talo

509,58 ±11,7 479,29 ±137,0 448,47 ±1,6 425,44 ±126,6

Flor

259,93 ±49,7 497,19 ±5,9 * 236,95 ±51,0 467,32 ±5,0 *

Folha

1009,71 ±68,0 1218,84 ±0,1 * 996,36 ±47,0 1253,69 ±4,1 *

Cebola

24,36 ±7,7 89,75 ±60,4 nd 69,52 ±66,6

Cenoura

Casca

nd nd nd nd

Polpa

nd nd nd nd

Repolho

Externo

22,19 ±0,1 nd nd nd

Interno

25,53 ±1,1 nd nd nd

Tomate

Casca

96,25 ±16,9 * 32,33 ±9,0 81,72 ±31,8 7,75 ±3,0

Polpa

122,90 ±19,7 123,18 ±23,4 123,04 ±41,6 120,36 ±46,6

* Valores estatisticamente diferentes, teste Bonferroni (p<0,05) entre. OG: orgânico, CV:

convencional.

nd – quantidade não detectada.

Apesar dos resultados apresentados quanto aos teores de AA, diferenças

significativas só foram observadas na flor e folha de brócolis, favorecendo a

agricultura convencional, e na casca do tomate favorecendo o cultivo orgânico. No

caso do ácido dehidroascórbico, as diferenças significativas entre as variedades

orgânicas e convencionais foram observadas nos talos e folhas do brócolis.

Resultados e Discussão

Cabe destacar que, ao compararmos o teor de ácido ascórbico segundo a

tabela de composição de alimentos da USDA, o repolho e a batata, apresentaram

valores superiores ao do tomate e da cebola. A USDA apresenta teores de 36,6 e

19,7mg/100g peso fresco para repolho e batata, respectivamente, enquanto que,

neste estudo, o teor de vitamina C não pode ser identificado, especialmente na

versão convencional.

O ascorbato é o antioxidante predominante das células vegetais, estando

presente em todos os compartimentos intracelulares em concentrações que variam

de 20 a 300mM. Em situações de estresse oxidativo, é o ascorbato, através da

enzima ascorbato peroxidase (APX), que combate os radicais livres, especialmente

o peróxido de hidrogênio (SMIRNOFF, 2000). Durante o processo de degradação do

ácido ascórbico, este é primeiramente convertido à dihidroascórbico. Este processo

de conversão pode ter ocorrido no repolho convencional, cujos valores de ascorbato

não foram detectados.

No caso da batata inglesa, em que não foi identificada nenhuma forma de

vitamina C nas amostras orgânicas ou convencionais, o processo de degradação

pode ter sido ainda mais acentuado, uma vez que esta hortaliça apresenta alta

atividade da enzima polifenol oxidase (PPO). Han et al. (2004) demonstram que a

vitamina C pode ser utilizada como substrato desta enzima durante o processo de

escurecimento enzimático, sendo este processo intensificado durante o

processamento. Dessa forma, o conteúdo de ácido ascórbico pode ter sido reduzido

durante o tratamento dado às amostras, tanto pela ação da APX e da PPO, como

pela degradação pelo próprio oxigênio.

Resultados e Discussão

Estudos sugerem ainda que o teor de ácido ascórbico naturalmente presente

no vegetal pode ser um fator que influencia o destino dado aos compostos fenólicos

recém sintetizados. Em tecidos vegetais, o ácido ascórbico é o antioxidante utilizado

para estabilizar o desequilíbrio redox do meio intracelular, sendo um dos primeiros

compostos antioxidantes a serem utilizados em vegetais com concentrações mais

elevadas desta vitamina (MITTLER, 2002). Em outros vegetais, onde há menor

concentração de ácido ascórbico, os compostos fenólicos podem ser utilizados

preferencialmente com a função de antioxidante (REYS; VILLARREAL; CISNEROS-

ZEVALLOS, 2007).

Considerando esta hipótese, a cebola orgânica contendo um teor de ácido

ascórbico inferior ao da cebola convencional (24,36 e 89,75 µg/ mL de suco,

respectivamente), teria maior proporção dos polifenóis sintetizados destinados ao

combate de radicais livres. Isso resultaria em menor quantidade de polifenóis

solúveis comparada a de polifenóis hidrolisáveis, assim como maior capacidade

antioxidante da cebola orgânica. Embora estes resultados tenham sido observados

neste trabalho, cabe ressaltar que este comportamento não se repetiu em todas as

variedades de hortaliças analisadas.

O maior teor de vitamina C encontrado nas flores de brócolis convencional,

chegando a quase o dobro do obtido para a versão convencional, pode ter

contribuído para os maiores valores de polifenóis solúveis vista nesta fração

convencional. O ácido ascórbico é conhecido como um interferente na metodologia

de quantificação de polifenóis pelo reagente de Folin-Ciocalteu (AINSWORTH,

GILLESPIE, 2007).

Resultados e Discussão

4.4. INFLUÊNCIA DA ADIÇÃO DE ÁCIDO ASCÓRBICO SOBRE A

DETERMINAÇÃO DO CONTEÚDO DE POLIFENÓIS E CAPACIDADE

ANTIOXIDANTE POR DPPH

A avaliação da interação da vitamina C com o reagente de Folin-Ciocalteu,

assim como a interferência da adição de ácido ascórbico na quantificação de

polifenóis e da capacidade antioxidante foram avaliadas, uma vez que estudos

indicam uma possível interação levando a superestimação do conteúdo de polifenóis

(SOUCI; FACHMANN; KRAUT, 2006; AINSWORTH, GILLESPIE, 2007).

As curvas-padrão das soluções de ácido ascórbico e ácido gálico utilizadas na

reação com o reagente Folin-Ciocalteu estão ilustradas na figura 16, onde é

observada uma interação positiva de ambas substâncias testadas com o reagente.

Através de regressão linear dos pontos plotados nas figuras 16A e B, e da

conseqüente equação da reta, observamos que para gerar 1 unidade de

absorbância são necessários, aproximadamente, 13,1µg de vitamina C. Já para o

ácido gálico, apenas 8,7 µg já resultaria na mesma absorbância, demonstrando que

o ácido ascórbico necessita estar em maiores concentrações para gerar mesma

absorbância que o ácido gálico numa mesma concentração.

O grau de interferência da vitamina na determinação de polifenóis através do

reagente de Folin-Ciocalteu foi estimado por Singleton e Rossi (1965), que

observaram que 0,7mg de equivalentes de catequina correspondia a 1mg de ácido

ascórbico, ou aproximadamente 40-46% do total de polifenóis em alimentos fonte de

ácido ascórbico (SOUCI; FACHMANN; KRAUT, 2006). Neste trabalho, o uso de

soluções de ácido ascórbico e ácido gálico, como padrões para o reagente de Folin-

Ciocalteu, ratificou a reação da vitamina C com este reagente.

Resultados e Discussão

Ácido Ascórbico

y = 14,46x - 1,3737

= 0,9937

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Absorbância

Concentração de AA (µg/ mL)

Ácido Gálico

y = 9,1173x - 0,4466

= 0,9964

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Absorbância

Concentração de AG (µg/ mL)

Figura 16. Curvas Padrão de Ácido Ascórbico (A) e Ácido Gálico (B) com Reagente

Folin-Ciocalteu. Soluções de AA e AG utilizadas nas concentrações 2.5, 5, 7.5, 10, 15 e

20µg/ mL em meio alcalino (solução de carbonato de sódio 20%).

Resultados e Discussão

A influência da adição, em EF, de diferentes concentrações de ácido

ascórbico na determinação de polifenóis solúveis e hidrolisáveis está demonstrada

na figura 18. Esse procedimento permite avaliar o efeito da vitamina C na

metodologia aplicada neste estudo, além de verificar diferenças desta vitamina entre

alimentos fonte ou não, como a laranja e a cebola, respectivamente.

Para a cebola, a adição de AA nas concentrações de 0,5 e 0,75µg, resultou

em alteração significativa da determinação do conteúdo de polifenóis solúveis (figura

17A). A adição de ácido ascórbico à laranja levou ao aumento na detecção de

polifenóis solúveis na concentração de 0,75µg, porém sem diferença significativa

entre as diferentes concentrações adicionadas mesmo não foi observado quando as

mesmas concentrações foram adicionadas à laranja (figura 17B).

Já na determinação de polifenóis hidrolisáveis, pelo método de Folin-

Ciocalteu, a adição de ácido ascórbico à cebola não resultou em alteração

significativa em nenhuma das três concentrações testadas (figura 17C). No entanto,

quando adicionado à laranja na concentração de 0,25µg e 0,50µg ocorreu redução

do valor de polifenóis hidrolisáveis quando comparado ao controle. O mesmo não foi

observado na concentração de 0,75µg, assim como não houve diferença significativa

entre as três concentrações de vitamina C utilizadas (figura 17D).

A metodologia aplicada para extração de polifenóis, que utiliza banho-maria a

90°C por três horas, pode justificar as diferenças observadas entre o uso do ácido

ascórbico como padrão e adicionado ao alimento, já que recentemente foi

demonstrado que este procedimento pode reduzir em até 85% a interferência por

vitamina C e outros compostos (AINSWORTH, GILLESPIE, 2007).

Resultados e Discussão

Polifenóis Solúveis

Cebola

Control

mcg

75mcg

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

b b

mg EAG/ mL EF

Laranja

ont

0,25mcg AA

5mc

g AA

0,75mc

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg EAG/ mL EF

Polifenóis Hidrolisáveis

Cebola

Control

mcg

75mcg

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

mg EAG/ mL EF

Laranja

Controle

0,25mcg AA

0,5mcg AA

0,75mcg AA

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

b ab

mg EAG/ mL EF

Figura 18. Polifenóis solúveis e hidrolisáveis em alimentos na ausência e na presença

de ácido ascórbico. Determinação do conteúdo de polifenóis solúveis e hidrolisáveis de EF

de cebola e laranja adicionados ou não de diferentes concentrações de AA. Extração

realizada com solução de MeOH 50% (polifenóis solúveis) ou MeOH 50%1,2M HCl

(polifenóis hidrolisáveis) em banho-maria, 90°C, 18 0 minutos. Quantificação de polifenóis

realizada pelo reagente Folin-Ciocalteu com solução de carbonato de sódio 20%, valores

expressos em mg de equivalentes de ácido gálico por mL extrato. Gráficos (A) e (B)

demonstram conteúdo de polifenóis solúveis e (C) e (D) polifenóis hidrolisáveis em cebola e

laranja, respectivamente. Letras iguais nas colunas representam ausência de diferença

estatística (Bonferroni p < 0,05).

Resultados e Discussão

A vitamina C pode apresentar efeito negativo na quantificação de polifenóis,

uma vez que, conforme descrito anteriormente interfere no método. Entretanto, pode

atuar evitando a oxidação polifenóis, garantido maior estabilidade, pois os mesmos

tendem a ser instáveis em condições oxidativas (HATANO ET AL., 2007). Dessa

forma, alimentos com baixo conteúdo de ácido ascórbico, como a cebola, podem ser

mais suscetíveis à oxidação dos polifenóis. Neste caso, a adição de vitamina C em

concentração mais elevada que a endógena poderia agir prevenindo esta

degradação. Em contrapartida, em alimentos com maior conteúdo de ácido

ascórbico, como a laranja, a vitamina C adicionada não teria este efeito, uma vez

que a estabilidade já é garantida pelo conteúdo endógeno.

A adição de 0.25, 0.5 ou 0.75 microgramas de AA nos extratos fluidos de

cebola e de laranja, apresentou o mesmo perfil para capacidade antioxidante,

conforme pode ser visualizado na figura 18. Para os extratos solúveis, observamos

um efeito dose dependente, onde a capacidade de redução da absorbância do

radical DPPH aumenta de acordo com o aumento da concentração de ácido

ascórbico adicionado (figuras 18A e C). Ao contrário, a adição de diferentes

concentrações de ácido ascórbico não resultou em diferença no perfil de reação dos

extratos hidrolisáveis de cebola e laranja (figuras 18B e D).

Quando analisados estatisticamente, verificamos que os extratos solúveis,

tanto de cebola como de laranja, apresentaram diferença tanto entre as amostras

adicionadas de ácido ascórbico em relação ao controle, como entre as

concentrações de vitamina C (tabela 9).

Resultados e Discussão

Cebola

0 20 40 60 80

100

120

Controle 0,25mcg AA

Extrato Solúvel

Tempo (min)

% DPPH

Extrato Hidrolisável

0 20 40 60 80

100

120

0,5mcg AA 0,75mcg AA

Tempo (min)

% DPPH

Laranja

Extrato Solúvel

0 20 40 60 80

100

120

Controle 0,25mcg AA

Tempo (min)

% DPPH

Extrato Hidrolisável

0 20 40 60 80

100

120

0,5mcg AA 0,75mcg AA

Tempo (min)

% DPPH

Figura 18. Curso Temporal da Capacidade Antioxidante dos Extratos Solúveis e

Hidrolisáveis Adicionados de Ácido Ascórbico. Os EF de cebola e laranja foram

adicionados de 0,25, 0,5 ou 0,75mcg de AA tendo posteriormente a capacidade antioxidante

avaliada com solução de DPPH 100µM. (A) e (C) demonstram a capacidade antioxidante

dos extratos solúveis e (B) e (D) dos extratos hidrolisáveis de cebola e laranja,

respectivamente.

A B

C D

Resultados e Discussão

Para o extrato hidrolisável de cebola, não houve diferença significativa entre

as diferentes concentrações de ácido ascórbico, no entanto, todas as concentrações

utilizadas apresentaram capacidade de seqüestro de radicais livres superior ao

controle. O extrato hidrolisável de laranja apresentou o mesmo padrão, porém a

adição de 0,75mcg de ácido ascórbico resultou em um maior aumento, quando

comparadas às demais concentrações utilizadas.

Tabela 9 – Capacidade Antioxidante dos Extratos Solúveis e Hidrolisáveis

Adicionados de Ácido Ascórbico

Capacidade Antioxidante (% SRL) em 60 minutos

Extrato Controle

0,25mcg AA 0,5mcg AA 0,75 mcg AA

Solúvel 2,6 a 10,3 b 19,9 c 33,5 d

Cebola

Hidrolisável

46,8 a 52,6 b 53,6 b 53,8 b

Solúvel 8,7 a 24,0 b 38,8 c 47,2 d

Laranja

Hidrolisável

52,4 a 55,7 b 55,2 ab 64,0 c

Letras iguais na mesma linha representa valores sem diferença significativa, teste

de Bonferroni (p<0,05).

A mesma estabilidade dos polifenóis garantida pela vitamina C nos extratos

solúveis pode ser responsável pela maior capacidade antioxidante destes extratos.

Além de prevenir alterações estruturais nos compostos fenólicos pela oxidação, o

próprio ácido ascórbico pode estar induzindo ao aumento nesta capacidade. A

vitamina C é uma potente substância no combate à radicais livres, sendo inclusive

utilizada como padrão em algumas metodologias que avaliam a capacidade

antioxidante de alimentos (KIM; JEONG; LEE, 2004).

A variação do pH dos extratos adicionados de ácido ascórbico em relação ao

controle está descrita na tabela 10. Os extratos hidrolisáveis da cebola e da laranja

apresentaram valores bastante ácidos e com pouca variação, de acordo com o

Resultados e Discussão

aumento das concentrações de AA adicionadas. A acidez do meio pode ser devida a

presença de ácido clorídrico na solução de extração para polifenóis hidrolisáveis.

O efeito desta vitamina no potencial antioxidante dos extratos solúveis, e não

nos hidrolisáveis, pode ser também consequência das diferenças observadas no pH

dos meios. Os extratos solúveis apresentaram uma gradual redução no pH, à

medida que se adicionou vitamina C, o que não ocorreu nos extratos hidrolisáveis,

onde o pH se manteve constante e mais ácido.

Tabela 10 - Variação do pH dos Extratos Adicionados de Ácido Ascórbico

Extrato Controle

0,25mcg AA 0,5mcg AA 0,75 mcg AA

Solúvel 5,74 3,81 4,04 4,00

Cebola

Hidrolisável

0,25 0,23 0,15 0,15

Solúvel 4,11 3,99 4,20 2,86

Laranja

Hidrolisável

0,18 0,20 0,14 0,13

Estudo realizado com dezesseis cultivares de uva mostrou que, quando o pH

variava entre 3,0 e 4,0, apresentava correlação negativa com a capacidade

antioxidante, ou seja, valores de pH mais ácidos resultavam em maior capacidade

antioxidante, o que foi observado neste trabalho para os extratos solúveis. No

entanto, o cultivar que apresentou menor pH (0,27) foi também o que apresentou

menor capacidade antioxidante entre as dezesseis amostras, semelhante ao efeito

encontrado nos extratos hidrolisáveis (ORAK ET AL., 2007). Tal fato sugere que a

redução do pH tem um efeito positivo sobre a capacidade antioxidante; porém, esta

relação pode não ser a mesma em meios mais ácidos, com pH inferior a 1,0, por

exemplo

Resultados e Discussão

As principais variações, entre os tipos de agricultura, nos conteúdos de

polifenóis solúveis, hidrolisáveis, ácido ascórbico e capacidade antioxidante das

hortaliças e frutas analisadas in natura podem ser visualizadas nas tabelas 11 e 12.

Apesar dos indícios da modulação da síntese de compostos de defesa a partir

da exposição da planta a situações agressivas, o cultivo orgânico não resultou em

alterações bem definidas no conteúdo de polifenóis nas frutas e hortaliças

analisadas. Poucas diferenças estatisticamente significativas foram observadas para

os teores de polifenóis solúveis e hidrolisáveis no caso das hortaliças. Tendo ainda

pouca variação entre as frações analisadas. Já as frutas, os resultados sugerem que

sejam mais suscetíveis a modulação pelo tipo de agricultura utilizado, apresentando

inclusive maior variação na distribuição de polifenóis entre cascas e polpas

analisadas. As cascas inclusive apresentaram maior capacidade antioxidante nas

versões orgânicas, o que é positivo uma vez que, procurando aproveitar as frutas

integralmente, utilizando as cascas, há um menor risco da presença de resíduos de

agroquímicos.

De maneira geral, o teor de polifenóis e a capacidade antioxidante mostraram

perfis distintos para cada espécie vegetal, não havendo um padrão para todos os

alimentos de acordo com o tipo de agricultura. Os resultados sugerem que há uma

tendência de acúmulo de compostos fenólicos e, conseqüentemente maior

capacidade antioxidante, nos alimentos cultivados pela agricultura orgânica, porém

esta associação ainda não está totalmente clara e parece ser variável de acordo

com o cultivar, sendo essencial a realização de novos estudos.

Tabela 12. Resumo dos Resultados Obtidos para Hortaliças Orgânicas e Convencionais.

Cédulas assinaladas com X representam maior conteúdo do parâmetro analisado no tipo de agricultura em questão. * representa

diferença significativa entre os tipos de agricultura analisados, OG: orgânica; CV: convencional.

Polifenóis Solúveis Polifenóis Hidrolisáveis Vitamina C Capacidade Antioxidante

Hortaliças

OG CV OG CV OG CV OG CV

Batata

Casca

X * X * nd nd X

Polpa

X X nd nd X

Brócolis

Folha

X X X X

Talo

X X X * X *

Flor

X X X X

Cebola X X * X * X

Cenoura

Casca

X X nd nd X

Polpa

X X nd nd X

Repolho

Externo

X X * X nd X

Interno

X X X nd X

Tomate

Casca

X X X * X

Polpa

X X X X

Tabela 13. Resumo dos Resultados Obtidos para Frutas Orgânicas e Convencionais.

Polifenóis Solúveis Polifenóis Hidrolisáveis Capacidade Antioxidante

Frutas

OG CV OG CV OG CV

Banana

Casca

X X * X

Polpa

X X X

Laranja

Casca

X * X * X *

Polpa

X X X

Maçã

Casca

X X X *

Polpa

X X X

Mamão

Casca

X X * X *

Polpa

X * X * X *

Manga

Casca

X X X *

Polpa

X X X

Tangerina

Casca

X X * X *

Polpa

X X X *

Cédulas assinaladas com X representam maior conteúdo do parâmetro analisado no tipo de agricultura em

questão. * representa diferença significativa entre os tipos de agricultura analisados, OG: orgânica; CV:

convencional.

Resultados e Discussão

4.5. EFEITO DE DIFERENTES MÉTODOS DE COCÇÃO SOBRE O TEOR

DE POLIFENÓIS E CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DE HORTALIÇAS ORGÂNICAS

E CONVENCIONAIS

A cocção de batata, cenoura, cebola, brócolis e repolho pelos métodos de

água em ebulição, microondas e à vapor, resultou na redução do conteúdo de

polifenóis solúveis e hidrolisáveis, assim como na diminuição da capacidade

antioxidante, quando comparados aos alimentos crus. As hortaliças orgânicas

apresentaram maior sensibilidade às perdas ocasionadas pelo processamento

térmico, sendo a cocção a vapor a que resultou no menor conteúdo de polifenóis

solúveis e hidrolisáveis. A cebola orgânica não apresentou este perfil, podendo ser

resultado da síntese de novos compostos mais solúveis durante o processo de

cocção. De maneira geral, as hortaliças de ambos os tipos de agricultura

apresentaram maiores perdas no conteúdo de polifenóis solúveis do que nos

hidrolisáveis, sugerindo uma maior suscetibilidade dos primeiros ao calor. A

capacidade antioxidante diminuiu na maioria das hortaliças orgânicas e

convencionais, com exceção do brócolis. A maior capacidade antioxidante desta

hortaliça após a cocção, mesmo ocorrendo perdas no conteúdo de polifenóis, pode

ser em função da presença de outras substâncias na matriz alimentar. O efeito

negativo dos métodos de cocção aplicados sobre o conteúdo de polifenóis e

capacidade antioxidante de hortaliças demonstra que o consumo dietético destes

compostos é inferior ao estimado pela análise de alimentos in natura.

Os resultados e discussão referentes a esta parte da dissertação podem ser

visualizados na íntegra no manuscrito, a ser submetido para o periódico “Food

Chemistry”, que se encontra no anexo A (página 113).

Resultados e Discussão

4.6. DISPONIBILIDADE DE POLIFENÓIS EM ALIMENTOS NACIONAIS

O teor de polifenóis nos doze alimentos estudados variou de 15,35 a

214,84mg EAG/100g peso fresco. A disponibilidade nacional, a partir destes

alimentos, foi estimada em 47,76mg/dia, tendo as regiões Sudeste e Centro-Oeste

os maiores e menores valores, respectivamente. A banana foi o alimento que

representou o maior aporte diário de polifenóis no Brasil; no entanto, este perfil

variou em cada região. A disponibilidade brasileira de polifenóis foi semelhante à de

outros países, porém apresentou variações regionais, refletindo diferenças no hábito

alimentar. A adoção da recomendação diária de frutas e hortaliças representaria um

aumento de 16 vezes deste valor, demonstrando a relação entre o consumo deste

grupo alimentar e a ingestão de substâncias benéficas à saúde.

Os resultados e discussão referentes a esta parte da dissertação podem ser

mais bem visualizados no manuscrito, a ser submetido para o periódico “Cadernos

de Saúde Pública”, que se encontra no anexo B (página 141).

Conclusões

5. CONCLUSÕES

As hortaliças apresentaram influência positiva da agricultura orgânica sobre o

conteúdo de polifenóis, solúveis e hidrolisáveis, assim como sobre a capacidade

antioxidante, porém apresentaram poucas diferenças significativas entre os dois tipos

de agricultura;

As frutas foram mais suscetíveis à variação do tipo de agricultura em relação às

hortaliças, apresentando valores significativamente maiores para polifenóis solúveis,

hidrolisáveis e capacidade antioxidante;

Em geral, as hortaliças orgânicas apresentaram maior conteúdo de polifenóis

solúveis, enquanto que as frutas orgânicas obtiveram teores mais elevados para

polifenóis hidrolisáveis;

As cascas das frutas orgânicas apresentaram capacidade antioxidante

estatisticamente maior do que as cascas das convencionais, com exceção da banana e

laranja, enquanto que as polpas apresentaram distribuição variada;

A agricultura orgânica não resultou em um mesmo padrão de modulação de

polifenóis solúveis, hidrolisáveis e capacidade antioxidante para as hortaliças e frutas,

demonstrando efeito variado de acordo com a espécie vegetal;

Conclusões

O maior conteúdo de ácido ascórbico na cebola e na flor de brócolis

convencional pode estar influenciando o maior teor de polifenóis solúveis observado

nestes alimentos, uma vez que o ácido ascórbico em concentrações mais elevadas

pode interferir na determinação de polifenóis solúveis;

A adição de concentrações variadas de ácido ascórbico em cebola e laranja

parece não influenciar a determinação de polifenóis hidrolisáveis, assim como a

capacidade antioxidante dos extratos, porém interfere de maneira positiva nos extratos

solúveis;

A modulação da capacidade antioxidante parece estar relacionada às diferenças

no pH dos extratos;

Os métodos de cocção utilizados, água em ebulição, microondas e vapor,

resultaram em efeitos deletérios sobre o conteúdo de polifenóis solúveis e hidrolisáveis,

tendo os polifenóis solúveis e as hortaliças orgânicas maior sensibilidade ao tratamento

térmico;

A capacidade antioxidante diminui após a aplicação dos diferentes métodos de

cocção sem, entretanto, apresentar diferença significativa entre eles.

Referências Bibliográficas

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Anexo A

Manuscrito a ser submetido ao periódico Food Chemistry

Polyphenol and antioxidant capacity of organically and conventionally

grown vegetables after domestic cooking

113

Polyphenol and antioxidant capacity of organically and conventionally grown 1

vegetables after domestic cooking 2

Faller, A.L.K.ª; Fialho, E.ª

* 4

ª Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Nutrição Josué de Castro, 12

Departamento de Nutrição Básica e Experimental, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, 13

Brazil 14

* Corresponding author: 16

Departamento de Nutrição Básica e Experimental, Instituto de Nutrição Josué de 17

Castro, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 18

UFRJ, Caixa Postal 68041, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, 19

CEP 21941-590, Brasil 20

Email address:[email protected] 22

Fax number: + 55 21 2280 8343 23

Tel number: + 55 21 2562 6602 24

114

Abstract 25

Vegetable consumption is associated with health benefits. Organic foods are 27

thought to have higher contents of antioxidant substances. The objective of this 28

work is to evaluate the contents of soluble and hydrolysable polyphenols, ascorbic 29

acid and antioxidant capacity in fresh conventional and organic vegetables, 30

evaluating the effect of cooking on these parameters. The recovery rate for soluble 31

and hydrolysable polyphenols was variable according to the vegetable analyzed. 32

Recovery rate for soluble polyphenols were lower than hydrolysable phenolics after 33

cooking. Organic vegetables showed higher sensitivity to heat processing than 34

conventionally grown ones. Cooking leads to reductions of the antioxidant capacity 35

for most vegetables, with little differences between the cooking methods applied. 36

Even with the alterations in the polyphenol contents, they showed a positive 37

correlation with antioxidant capacity in raw and cooked vegetables from both types 38

of agriculture. 39

Keywords: polyphenol / antioxidant capacity / organic / vegetables / cooking 41

115

1. Introduction 49

Fruit and vegetable intake has long been associated with a reduced risk of 51

chronic diseases, especially cardiovascular diseases and certain types of cancer 52

(Williamson, 1996). However, recently the interest on these food groups has grown 53

among the scientific community due to the identification of new compounds in their 54

chemical composition. Fruits and vegetables are well known sources of vitamins, 55

such as vitamin C and folic acid, carotenoids and fiber, and naturally free of 56

saturated fat and cholesterol (Brat et al., 2006). In addition, these foods contain 57

significant amounts of polyphenols, a group of phytochemicals recognized as the 58

most abundant antioxidants in our diet (Manach, Scalbert, Morand, Rémésy & 59

Jimenez, 2004). Polyphenols comprehend over 8000 substances already identified 60

and it can be divided in groups according to its chemical structure, such as 61

phenolic acids, stilbenes, coumarins, lignins and flavonoids, the last being the 62

largest group (Ross & Kasum, 2002). 63

Quantity and quality of polyphenols present in plant foods can vary 64

significantly due to different factors such as plant genetics and cultivar, soil 65

composition and growing conditions, maturity state, post harvest conditions, among 66

others (Jaffery, Brown, Kurilich, Keek, Matusheski & Klein, 2003). However, since 67

polyphenols constitutes part of the plants innate defense mechanism, its synthesis 68

has been shown to be stimulated under stress conditions, such as temperature 69

alterations, UV exposure and pathogenic attacks (Dixon & Paiva 1995). The 70

organic agriculture, in general, is characterized by its restriction against the use of 71

116

synthetic pesticides and fertilizers eventhough the organic production itself is not 72

only one cultivation method. 73

This basic characteristic has lead researchers to two main hypotheses by 74

which organically grown fruits and vegetables may result in plant foods with higher 75

polyphenol content. The first reflects the impact of the different fertilization 76

practices on the plant metabolism. Synthetic fertilizes offers more bioavailable 77

sources of nitrogen which accelerates the plant development, allocating plant 78

resources to growth purposes and not production of secondary metabolites such 79

as polyphenols. The second hypothesis is based on the exposure of the plant to 80

stressful situations provided by the absence of pesticides, such as the attack from 81

insects, weeds and pathogens, which would lead to the stimuli to enhance the 82

plants naturals defence substances, like phenolic compounds (Winter & Davis, 83

2006). 84

Studies investigating micronutrients, different phytochemicals and 85

antioxidant capacity, however, have had conflicting results. Literature suggests that 86

the higher content of phenolic compounds in organic or conventional foods can 87

vary among different especies or cultivars analysed, as well as in terms of the 88

phenolic compound that is being identified (Carbonaro, Mattera, Nicoli, Bergamo & 89

Cappelloni, 2002; Lombardi-Boccia, Lucarini, Lanzi, Aguzzi & Cappelloni, 2004). 90

Fruits are most commonly consumed raw, however, vegetables usually goes 91

through some type of processing before being ingested. Literature has shown that 92

domestic cooking can result in significant losses in the composition and 93

bioavailability of antioxidant compounds, being ascorbic acid and some 94

carotenoids very sensitive to heat and storage (Zhang & Hamauzu, 2004). In 95

117

contrast, polyphenols and flavonoids have shown certain stability when exposed to 96

high temperatures, reflecting in the maintenance of the antioxidant capacity 97

(Vallejo, Tomás-Barberán & Garcia-Viguera, 2003). Studies with different 98

vegetables under cooking procedures showed that total polyphenol content and 99

antioxidant capacity can either increased or decrease when compared to the fresh 100

food (Ismail, Marjan & Foong, 2004; Lombard, 2005; Turkmen, Sari & Velioglu, 101

2005). 102

In this work soluble and hydrolysable polyphenols and antioxidant capacity 103

of vegetables grown under organic and conventional agriculture are compared. 104

Additionally, we analyze differences between the polyphenol retention and 105

bioavailability after simulated domestic processing. 106

107

2. Material and Methods 108

109

2.1. Samples 110

Samples of five vegetables, i.e. potato (Solanum tuberosum L.), broccoli 111

(Brassica oleracea var. Italica), onion (Allium cepa L.), carrot (Daucus carota L.) 112

and white cabbage (Brassica oleracea var. Capitata) from organic and 113

conventional agricultures, were purchased from three different markets of Rio de 114

Janeiro, Brazil. The cultivars of the organically grown vegetables were chosen to 115

be the variety studied since the production is more restricted. The conventional 116

vegetable cultivars were then matched to the organic samples. Approximately 2.0 117

Kg of each vegetable from each agriculture method were randomly sampled from 118

the market shelfs. The organic foods were restricted to three companies (Fazenda 119

118

Santo Onofre, Vida Sustentável and Korin) which were certified by the Brazilian 120

Institute of Organic Certification. 121

122

2.2. Chemical and reagents 123

Folin-Ciocalteu’s reagent was purchased from Merck. DPPH was from 124

Sigma Aldrich (St. Louis, MO,USA). Gallic acid was purchased from CQA Química 125

(Campinas, SP, Brazil). All other chemicals and reagents were from analytical 126

quality grade. 127

128

2.3. Sample preparation and cooking 129

The pretreament and cooking procedures were adapted from Turkmen et al. 130

(2005) with exception of time and temperature applied which were determined by 131

the researchers in preliminary experiments. Vegetables were washed in water and 132

all inedible parts were removed manually or with help of a steel knife. All 133

vegetables were cut in equally shaped small pieces: potatos (2-2 cm cubes), 134

carrots (0.5 cm half-moons), white cabbage (0.5 cm /5 cm slices), onions (1 cm 135

cubes), broccoli (3 cm pieces, using the same proportions of stalks, leaves and 136

inflorescences). For each vegetable, 900 g were reserved for the cooking 137

procedures, using 300 g for each method applied. All cooking experiments were 138

done in triplicate, using 100 g of vegetables each time. The raw vegetable 139

analyses were done in duplicate, being used 100 g of vegetable each time. 140

141

142

143

119

2.3.1. Boiling 144

Each vegetable sample (100 g) was placed into a stainless steel pan with 145

150 mL of boiling distilled water and covered with a lid. The boiling times were 5 146

minutes for white cabbage, 6 minutes to broccoli, 6.5 minutes to potatoes and 8 147

minutes for onions and carrots. After this procedure the vegetables were drained, 148

having the excessive water removed, and cooled in water bath in a steel recipient. 149

150

2.3.2. Microwave 151

Each vegetable sample (100g) were placed in a glass dish and 6 mL of 152

distilled water was added, with the exception of potatoes in which was used 12 mL. 153

The dish was covered with plastic and small holes were made with a fork. The 154

vegetables were cooked using a domestic microwave oven (Brastemp Clean) at 155

full potency (power setting 9, capable of generating 2450 W). Cooking time took 3 156

minutes for carrots and potatoes, 3.5 minutes for white cabbage and 4 minutes 157

onions and broccoli. 158

159

2.3.3. Steaming 160

Vegetables (100g) were placed on a stainless steel steam cooker (Rochedo 161

Ellegance) which was covered with a lid and steamed over boiling water at 162

atmospheric pressure. The cooking times were 10 minutes for onions, potatoes 163

and white cabbage, and 8 minutes for carrots and broccoli. After this procedure the 164

vegetables were cooled in water bath in a steel recipient. 165

166

167

120

2.4. Polyphenol extraction 168

Samples of raw and cooked vegetables were homogenized using a 169

commercial juice extractor (Samsom GB-9001, Greenbison Inc., USA) obtaining a 170

fluid vegetable extract (VE). The VE were frozen at – 20°C until the time of 171

analysis, which did not exceed one week. Polyphenols extraction method was 172

adapted from Vinson, Su, Zubik & Bose (2001). Briefly, 100 µL of each VE were 173

extracted with 500 µL of 50% methanol (methanol:water, 50:50, v/v) for soluble 174

polyphenols and 1,2 M HCl 50% methanol (methanol:water, 50:50, v/v) for 175

hydrolysable polyphenols in screw capped eppendorfs. The samples were placed 176

in waterbath at 90°C for 180 minutes with constant shaking. After three hours the 177

samples were removed from waterbath and cooled at room temperature 178

(approximately 2 minutes). The volume was filled up to 1 mL with methanol 95% 179

and the eppendorfs were centrifuged at 12000 g for 5 minutes. The supernatants, 180

considered as polyphenol extracts, were immediately used for polyphenol 181

determination. 182

183

2.4.1. Determination of polyphenol content 184

The polyphenol contents were determined using the Folin-Ciocalteu’s 185

reagent as described by Karou, Dicko, Simpore & Traore (2005). In eppendorfs, 30 186

µL of the either soluble or hydrolyzable polyphenol extract was mixed with 75 µL of 187

Folin-Ciocalteu’s reagent diluted in distilled water (Folin:water, 50:50, v/v). The 188

mixture was allowed to stand for 5 minutes before adding 75 µL of 20% sodium 189

carbonate solution. After 30 minutes at room temperature the absorbance was 190

measured at 750 nm using a Beckman 6300 spectrophometer. The amount of free 191

121

and total polyphenol were calculated using a standard curve of gallic acid. The 192

results were expressed as mg of gallic acid equivalents (GAE)/mL VE. Gallic acid 193

was used as standard. 194

195

2.5. Total Antioxidant Capacity (DPPH) 196

The antioxidant capacity was measured by the DPPH radical method 197

according to Kuskoski et al., 2006. Briefly, a 100 µM DPPH solution was prepared 198

with 80% methanol giving an absorbance of 1.1 at 517 nm. In test tubes, 100 µL of 199

each VE, fresh or after cooking procedures, were weighted, being added 3,9 mL of 200

the DPPH solution (100 µM). The mixture was allowed to stand, in the absence of 201

light, and the absorbance was measured at 15, 30 and 60 minutes. DPPH solution 202

alone was measured before the addition of the samples (A

) and 80% methanol 203

was used as blank. The antioxidant capacity was represented as % radical 204

scavenging capacity (RSC) remaining after each time according to the equation 205

below: 206

207

% RSC = (A

– A

)/ A

208

209

Where A

represents

the absorbance of DPPH solution alone measured at 210

zero time, and A

is the absorbance for each sample at the times of 15, 30 and 60 211

minutes after the addition of the DPPH solution. The value of A

is considered 212

100%. 213

214

215

122

2.6. Statistical Analysis 216

The results obtained were analysed using one-way ANOVA for mean 217

differences among vegetables and agricultural types. The independent Tukey test 218

was used to analyse differences between fresh and cooked vegetables, and 219

organically and conventionally grown samples. Statistical test were done in 220

GraphPad Prism 5.0 program. 221

222

3. Results and discussion 223

224

3.1. Polyphenol content in organic and conventional vegetables after 225

cooking 226

Soluble polyphenol contents are shown in Table 1. Raw vegetables grown 227

under organic agriculture showed higher values when compared to the 228

conventionally grown samples, with the exception of onions. Soluble polyphenols in 229

raw organic vegetables varied from 0.195 mg GAE/mL VE in onions, to 1.237 mg 230

GAE/mL VE in broccoli. In the conventional vegetables carrots had the lowest 231

value of 0.289 mg GAE/mL VE and broccoli the highest with 1.173 mg GAE/mL 232

VE. Figure 1 ilustrates a tendecy for higher sensitivity to heat treatments from 233

organic vegetables. With the exception of onions, all cooking procedures applied 234

resulted in losses of the soluble polyphenol concentration in organic food, whereas 235

for convetional vegetables soluble polyphenols were more stable. Overall, in either 236

types of agriculture, steamming seemed to be the most desavantageous cooking 237

method. Despite the diferences observed, significant reductions were only 238

observed for organic carrots and broccoli, with no diference between the methods 239

123

applied. For conventional vegetables no significant reductions were observed when 240

compared to raw samples, in contrary, some cooked vegetables resulted in 241

significantly higher soluble polyphenol contents (table 1). 242

The increase in this parameter showed in some cooked vegetables, 243

specially conventional produced types, could be due to higher bioavailability of 244

these compounds after the whole sample preparation and cooking procedures. 245

Cutting of the vegetable tissue and the exposure to higher temperatures can lead 246

to cellular disruption and disassociation of some phenolic compounds from cellular 247

structures such as lignin and polyssacharides (Cohen, Sakihama, & Yamasaki, 248

2001). 249

Plant species presents different types of phenolic compounds, along with 250

different bounds between these phytochemicals and cell structures. These 251

variations can lead to different responses to heat treatments, which in turn can 252

promote higher or lower cleavage of phenolic bounds according to the type of heat 253

applied and the food being analyzed (Jeong, Kim, Kim, Jo, Nam, Ahn & Lee, 254

2004). Flavanols, for example, have different behaviors depending on the type of 255

cooking. Baking and sautéing lead to a 7% to 25% gain in quercetin concentration, 256

whereas boiling decreased in 18% the concentration of this flavonol. 257

Data from hydrolysable polyphenol in raw vegetables, showed the same 258

profile as soluble polyphenols, with organic variaties having higher concentrations 259

than conventional ones, with the exception of potatos (Table 2). Hydrolysable 260

polyphenols in organic raw vegetables ranged from 0.352 mg GAE/mL VE to 261

2.315mg GAE/mL VE in broccoli. Conventional samples also showed lowest 262

values for potato (0.422 mg GAE/ mL VE) and highest for broccoli (2.014 mg 263

124

GAE/mL VE). Hydrolysable polyphenols were more stable during cooking 264

procedures, when compared to soluble polyphenols (Figure 2). 265

Significant losses were mainly observed in broccoli and white cabbage, from 266

both types of agriculture (Table 2). With the exception of these two vegetables, 267

cooking resulted in higher or no significant diference in the recovery of 268

hydrolysable polyphenols. When comparing both agricultural types, significant 269

variation was more prevalent for hydrolysable than soluble polyphenols. 270

The mantainance or increase, in some cases, of phenolic compounds can 271

be due to their released from the food matrix after heating and disruption of the 272

plant tissue. The conversion of insoluble phenolics into more soluble forms can 273

also happen. Food processing can induce a softening or disruption of cell wall 274

bounds, modifying the structure of phenolic complexes associated to the food 275

matrix (Berhnhart & Schlich, 2005). The alteration in their chemical composition 276

can make them more extractable, being more readly detected in the supernatant of 277

the extractable polyphenols. 278

In this study, onions from both types of agricultures showed the highest 279

recovery of soluble phenolic compounds, after all three cooking procedure. This 280

could be due to modifications of polyphenol’s composition in food matrix. 281

Processing of onions has been shown to alter the types of flavonols present, with 282

novel flavonol susbtances being identified (Makris & Rossiter, 2001). These 283

modifications could result in more extractable and detectable substances after 284

cooking of onions, explainig, in part, the higher recovery rates observed. 285

When comparing the polyphenol contents of raw vegetables, it is clear that 286

hydrolysable forms comprehend a greater proportion of the polyphenols present, 287

125

having higher values than soluble polyphenols, as shown earlier. Potatoes were 288

the only vegetables which did not show the same profile. Probably, its chemical 289

composition, rich in polysaccharides and starch, can contribute to this evidence. 290

Two mechanisms have been proposed to explain interactions occuring 291

between polyphenols and polysaccharides. The first suggests the formation of 292

hydrogen bonds between phenol’s hydroxyl groups and oxygen atoms from sugar’s 293

ether bonds of cell wall polysaccharide, forming dextran gels able to encapsulate 294

polyphenols. The second is based on the ability on some polysaccharides to 295

develop secondary structures, like nanotubes, which creates hydrophobic cavities 296

able to encapsulate and complex polyphenols (Pinelo, Arnous & Meyer, 2006). 297

Although there’s no evidence of the occurance of these interactions in potatoes, it 298

could be a possible explanation for the low efficacy of extration and low recovery of 299

hydrolysable polyphenol observed. 300

301

3.2. Antioxidant capacity of organic and conventional vegetables after 302

cooking 303

The antioxidant capacity expressed as percentage of radical scavenging 304

capacity (% RSC) of raw and cooked vegetables from both agricultural practices 305

are shown in Table 3. Radical scavenging capacity of vegetables reduced after 306

cooking, independently to the procedure and the agricultural type. The same 307

pattern was observed in both types of agriculture, where cooked broccoli and 308

potatoes resulted in higher scavenging capacity than raw samples (figure 3). 309

Significant differences however were only found in organic and conventional 310

126

broccoli, and for organic potato. In both cases, there were no diferences between 311

the cooking methods. 312

Although cooking tended to decrease polyphenol contents in the vegetables 313

analysed, especially organically grown samples, the increase or reduction in the 314

antioxidant capacity was not directly affected by modifications of polyphenols 315

contents. Lower concentration of phenolic compounds could lead to lower 316

antioxidant capacities; however both organic and conventional onions showed a 317

reduction in the radical scavenging capacity despite having higher polyphenol 318

recovery rates after cooking. Broccoli, on the other hand, which increased its 319

antioxidant capacity in both types of agriculture, had recovery rates lower than 320

100% for almost all cooking procedures. 321

As shown earlier, food processing could lead not only to alterations in 322

polyphenol quantity, but it can alter the polyphenol’s composition (Makris and 323

Rossiter, 2001). Modulation of phenolic compounds quality could affect the 324

antioxidant capacity, since diferent chemical structures have distinct radical 325

scavenging properties. The formation of novel substances such as products of 326

Maillard reaction could also increase the antioxidant capacity, especially in 327

samples like potatoes (Manzocco, Calligaris, Masrrocola, Nicoli & Lerici, 2001). In 328

addition, each polyphenol compound has higher or lower affinity to the DPPH 329

radical, which could influence the variations observed in the antioxidant capacity 330

between vegetables and between the cooking methods used in this study (Heim, 331

Tagliaferro & Bobilya, 2002). 332

Despite the alterations in soluble and hydrolysable polyphenols contents 333

after cooking procedures, these compounds seem to play an important role in the 334

127

the antioxidant capacities. Table 4 shows Pearson’s correlation coefficient for all 335

vegetables analysed before and after each cooking method. Interestinglly, in raw 336

samples hydrolysable polyphenols showed higher correlation with the antioxidant 337

capacities. However, after being cooked, vegetable’s antioxidant capacity was 338

slightly more correlated to the soluble polyphenols, probably because they are 339

more available for reactions with free radicals and, in the methodology applied, 340

with the DPPH radical. Polyphenols in general, showed high correlations with the 341

antioxidant capacity of vegetables, independently of agricultural practice or cooking 342

treatment applied. 343

344

4. Conclusions 345

Previous works had shown that polyphenols quantities can vary during 346

cooking, although alterations are dependent of the vegetable in question. Food 347

processing and simulated domestic cooking can result in higher levels of 348

polyphenols than raw samples (Turkmen, Sari & Velioglu, 2005). In contrast, 349

deleterious effects of heat treatment have already been shown for polyphenols as 350

well as for their antioxidant capacity (Zhang & Hamauzu, 2004; Ismail, Marjan & 351

Foong, 2004; Sultana, Anwar & Iqbal, 2007). In our study, these variations 352

according to the plant species were also observed. Soluble polyphenols tended to 353

be more sensitive to cooking than hydrolysable polyphenols, shown by lower 354

recovery rate. In addition, organically grown vegetables suffered more deleterious 355

consequences than conventional vegetables. This work shows that cooking can 356

lead to alterations in phenolic contents, suggesting that the real intake of these 357

phytochemicals can be overestimated when using data from raw vegetables. In 358

128

addition, organically grown vegetables were more sensitive to heat treatment for 359

most plant varieties study. Despite the slightly higher concentration of polyphenols 360

in organic vegetables, these compounds were more stable in conventionally grown 361

vegetables. Independently of the agricultural practice polyphenols seems to be an 362

important contributor to the antioxidant capacity of vegetables. 363

364

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462

463

464

465

466

467

468

469

470

471

472

473

474

475

476

132

Figure Captions 477

478

Figure 1. Soluble Polyphenol Distribution in Fresh and Cooked Vegetables 479

480

Figure 2. Hydrolyzable Polyphenol Distribution in Fresh and Cooked 481

Vegetables 482

483

Table 1. Soluble Polyphenols in Raw and Cooked Vegetables 484

485

Table 2. Hydrolyzable Polyphenols in Raw and Cooked Vegetables 486

487

Figure 3. Radical Scavenging Capacity of Fresh and Cooked Vegetables 488

489

Table 3. Antioxidant Capacity of Fresh and Cooked Vegetables after 60 490

minutes 491

492

Table 4. Influence of Soluble and Hydrolysable Polyphenols on the 493

Antioxidant Capacity of Raw and Cooked Vegetables 494

495

496

497

498

Carro

nio

ite

0.0

0.5

1.0

1.5

ORGANIC

mg GAE.mL VE

-1

ato

Broccoli

Whit

0.0

0.5

1.0

1.5

Microwaved Steammed

Raw

Boiled

CONVENTIONAL

mg GAE.mL VE

-1

Faller & Fialho, 2008, Figure 1

Carrot

Onion

Potato

Brocco

hit

e Cabba

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

ORGANIC

mg GAE.mL VE

-1

Onion

tato

White Cabbage

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Microwaved Steammed

CONVENTIONAL

Raw Boiled

mg GAE.mL VE

-1

Faller & Fialho, 2008, Figure 2

rot

ion

Potato

Brocco

Whit

Cabbag

100

ORGANIC

% RSC

arrot

occoli

hit

abb

100

CONVENTIONAL

Microwaved Steammed

Raw

Boiled

% RSC

Faller & Fialho, 2008, Figure 3

Table 1. Soluble Polyphenols in Raw and Cooked Vegetables

% Recovery

Soluble

Polyphenols

Type of

Agriculture

Raw Vegetables

(mg GAE/ mL VE)

Boiled Microwaved

Steammed

OG 0.521 a 40.9 b 43.5 b * 52.1 b

Carrot

CV 0.289 ab 110.7 a 150.3 a * 44.3 b

0.195 a 380.0 b 273.6 c 249.2 c

Onion

0.325 a 195.2 b 140.1 a 124.8 a

0.399 a 74.2 a *

111.0 a 87.0 a

Potato

0.327 a 263.7 b *

205.9 b 64.9 a

1.237 a 76.0 b 71.1 b 63.0 b

Broccoli

1.173 a 73.9 a 109.1 a 95.6 a

0.644 a 86.3 a 61.5 a 36.1 a

White Cabbage

0.525 ab 104.5 a 59.4 b 50.2 b

Rows with the same letters are not significantly different. * Significant difference between agriculture

types within cooking procedure (P<0.05, Tukey test). Values expressed as mg gallic acid equivalent

(GAE)/mL vegetable extract (VE). OG: organic; CV: conventional

Faller & Fialho, 2008, Table 1

Table 2. Hydrolyzable Polyphenols in Raw and Cooked Vegetables

% Recovery

Hydrolysable

Polyphenols

Type of

Agriculture

Raw Vegetables

(mg GAE/ mL VE)

Boiled Microwaved

Steammed

OG 0.808 a 77.6 a 87.3 a 80.2 a

Carrot

CV 0.626 a 112.7 a 108.9 a 123.3 a

OG 1.204 a * 74.6 b *

114.9 c 105.4 ac *

Onion

CV 0.932 a * 156.0 b *

155.3 b 163.2 b *

OG 0.352 a 181.4 a * 180.8 a 122.8 a

Potato

CV 0.422 a 355.9 b * 274.3 ab 85.6 a

OG 2.315 a 53.2 b 55.6 b 46.9 b *

Broccoli

CV 2.014 ac 65.0 b 81.4 bc 125.7 a *

OG 1.693 a 39.7 b 56.3 b 37.5 b *

White Cabbage

CV 1.365 a 34.9 b 55.2 b 100.6 a *

Rows with the same letters are not significantly different. * Significant difference between

agriculture types within cooking procedure (P<0.05, Tukey test). Values expressed as mg gallic

acid equivalent (GAE)/mL vegetable extract (VE). OG: organic; CV: conventional

Faller & Fialho, 2008, Table 2

Table 3. Antioxidant Capacity of Vegetables after 60 minutes

% Radical Scavenging Capacity (RSC)

Fresh Boiled Microwaved Steammed

40.4 a 5.6 b 8.4 b 9.2 b

Carrot

48.3 a 3.4 b 12.3 b 2.1 b

60.6 a 14.8 b 18.9 b 14.1 b

Onion

48.8 a 28.9 b 19.7 b 10.9 b

11.2 a 26.3 b * 30.3 b 32.4 b

Potato

13.0 a 11.0 a * 17.8 a 19.8 a

73.8 a * 87.0 b * 89.2 b 89.0 b

Broccoli

78.9 a * 91.7 b * 89.7 c 90.0 bc

41.0 a * 26.9 b 37.7 a 22.5 b *

White Cabbage

57.2 a * 18.0 b 30.4 c 10.8 b *

Rows with the same letters are not significantly different. * Significant difference between

agriculture types within cooking procedure (P<0.05, Tukey test). OG: organic; CV: conventional

Faller & Fialho, 2008, Table 3

Table 4. Pearson’s Correlation Coefficient of Soluble and Hydrolysable

Polyphenols and Antioxidant Capacity in Raw and Cooked Vegetables

Type of

Agriculture

Soluble

Polyphenol

Hydrolyzable

Polyphenol

OG 0.51 0.84 Raw

CV 0.77 0.92

OG 0.74 0.85 Boiled

CV 0.59 0.35

OG 0.90 0.45 Microwaved

CV 0.87 0.65

OG 0.85 0.28 Steammed

CV 0.97 0.78

OG: organic; CV: conventional

Faller & Fialho, 2008, table 4

Anexo B

Manuscrito a ser submetido ao periódico Cadernos de Saúde Pública

Frutas, Hortaliças e Disponibilidade de Polifenóis no Brasil

141

Frutas, Hortaliças e Disponibilidade de Polifenóis no Brasil

Fruits, Vegetables and Polyphenol Intake in Brazil

Disponibilidade de Polifenóis no Brasil

Ana Luisa Kremer Faller

e Eliane Fialho

Departamento de Nutrição Básica e Experimental, Instituto de Nutrição Josué de Castro,

UFRJ

Departamento de Nutrição Básica e Experimental, Instituto de Nutrição Josué de Castro,

Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Caixa Postal

68041, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, CEP 21941-590, Brasil.

142

Resumo

O consumo de frutas e hortaliças está associado a menor incidência de doenças crônicas não-

transmissíveis, em parte devido a presença de substâncias antioxidantes, como os polifenóis.

O objetivo deste trabalho é quantificar o conteúdo de polifenóis totais em frutas e hortaliças

comumente consumidas no Brasil, estimar a disponibilidade destes compostos no país e nas

principais regiões e caracterizar os alimentos-fonte. Os polifenóis foram determinados pelo

método Folin-Ciocalteu e a disponibilidade estimada com base na Pesquisa de Orçamentos

Familiares 2002/2003. O teor de polifenóis nos alimentos variou de 15,35 a 214,84mg

EAG/100g peso fresco. A disponibilidade nacional foi de 47,76mg/dia, tendo a região Sudeste

e a região Centro-Oeste os maiores e menores valores, respectivamente. A banana foi a

principal fonte de polifenóis no Brasil no entanto, este perfil variou em cada região. A

disponibilidade brasileira de polifenóis foi semelhante à de outros países, apresentando

diferenças regionais resultantes das diferenças no hábito alimentar da população. A adoção da

recomendação diária de frutas e hortaliças representa um aumento de 14 vezes na

disponibilidade nacional de polifenóis, demonstrando a relação entre o consumo destes grupos

alimentares com a ingestão de compostos bioativos benéficos à saúde.

PALAVRAS CHAVE: polifenóis / disponibilidade alimentar / frutas / hortaliças

143

Abstract

Fruit and vegetable intake has been associated with lower risk of developing chronic diseases

due to their composition on antioxidant compounds such as polyphenols. The objective of this

work is to quantify total polyphenols in fruits and vegetables commonly consumed in Brazil,

estimate the national and regional intakes, and characterize the main food sources.

Polyphenols were determined by the Folin-Ciocalteu reagent method and the disponibility

estimated according to the Pesquisa de Orçamentos Familiares 2002/ 2003. The polyphenol

food contents varied from 15,35 to 214,84 mg GAE/ 100 g fresh weight. Polyphenol intake in

Brazil was 47,76 mg/ day, having the southeast and center-west regions the highest and

lowest intakes, respectively. Banana was the main polyphenol food source in Brazil, however

this pattern varied between regions. The estimated polyphenol intake was similar to those

from other countries, however differences among regions was observed due to food habits.

The daily consumption of fruit and vegetable recommendation would represent a 16 times

increase in the polyphenol intake, showing the relationship between these food groups and the

consumption of beneficial bioactive compounds.

KEY WORDS: polyphenol / consumption / fruits/ vegetables

144

1. Introdução

Apesar dos primeiros estudos datarem da década de 30, a relação entre o hábito

alimentar e a incidência de doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) já é conhecida há

aproximadamente 2000 anos

. Desde então, evidências epidemiológicas vêm demonstrando a

relação inversa entre o elevado consumo de frutas e hortaliças e a incidência de DCNT, em

especial câncer

e doenças cardiovasculares

A associação entre o consumo de frutas e hortaliças e o menor risco de

desenvolvimento de DCNT se dá, principalmente, pela composição química natural destes

alimentos. Frutas e hortaliças, além de fornecerem componentes importantes para

desempenharem funções básicas do organismo como, por exemplo, ácido ascórbico,

betacaroteno e ácido fólico, são fontes de compostos bioativos diretamente associados à

prevenção de doenças. Os polifenóis, grupo de fitoquímicos que compreende mais de 8.000

substâncias já identificadas, é o maior grupo de compostos bioativos, largamente distribuído

em produtos de origem vegetal, sendo subdividido em classes de acordo com a estrutura

química das substâncias

. Os principais grupos de polifenóis são os ácidos fenólicos, tendo

como exemplos: o ácido clorogênico, presente no café; os estilbenos, como o resveratrol

presente nas uvas e vinho; as cumarinas, como as furanocumarinas do aipo; as ligninas, como

as lignanas da linhaça; e os flavonóides. Este último grupo é o maior e mais estudado,

possuindo mais de 5.000 compostos já identificados, e tem como principais alimentos-fonte

frutas e hortaliças, chás, cacau, soja, dentre outros

. No entanto, alguns compostos

específicos estão em maiores concentrações em determinados alimentos, como a quercetina

na cebola, miricetina no brócolis, as antocianinas em frutas de coloração vermelha-arroxeada,

tais como cereja, morango e uvas, e as flavanonas em frutas cítricas, como laranja e

tangerina

. As ações fisiológicas exercidas pelos polifenóis já foram relacionadas à prevenção

145

de doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, câncer, entre outras, principalmente em

função da elevada capacidade antioxidante

A alteração no padrão alimentar associada a maior oferta de alimentos processados de

baixo custo, favorece o aumento do consumo de alimentos com alta densidade energética e

baixa densidade nutricional

. A falta de conscientização quanto aos benefícios do consumo

de frutas e hortaliças, assim como de educação nutricional, desde a fase escolar, podem ainda

contribuir para a baixa procura da população por estes grupos alimentares. Recente trabalho

realizado em bairros de baixa renda do município de São Paulo, em 2004, resultou em

aumento de 2,9% nas calorias diárias provenientes de frutas e hortaliças, evidenciando a

importância de se elaborar medidas públicas de orientação nutricional que visem a

alimentação saudável

A avaliação e determinação de polifenóis totais em frutas e hortaliças produzidas no

Brasil e de consumo mais freqüente é essencial tanto para avaliar o grau de importância dos

compostos bioativos em alimentos, como para estimar a ingestão nacional, possibilitando a

comparação com a de outros países. A quantificação do teor de polifenóis nestes alimentos é

importante para subsidiar programas da OMS (“5 ao dia”)

e do Ministério da Saúde “Brasil

Saudável”

ao agregar conhecimento científico sobre a composição nutricional dos

alimentos e seus benefícios na prevenção de doenças, além de reforçar a importância do

consumo de, no mínimo, 400g de frutas e hortaliças diariamente.

Dessa forma, este trabalho tem como objetivo quantificar o conteúdo de polifenóis

totais em frutas e hortaliças estimando a sua disponibilidade no Brasil e nas principais regiões

geográficas. Visa também, avaliar os principais alimentos fonte e sugerir uma ingestão diária

que contemple a recomendação de cinco a nove porções de frutas e hortaliças.

146

2. Material e métodos

2.1. Seleção e preparo da amostra

Foram selecionados doze alimentos de maior consumo no Brasil, seis frutas e seis

hortaliças, segundo a Tabela de Aquisição Domiciliar de Alimentos da Pesquisa de

Orçamentos Familiares 2002/ 2003 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

. As

frutas selecionadas se encontravam dentro da classificação de “frutas tropicais” da própria

tabela, sendo elas abacaxi pérola (Ananás comosusl), banana prata (Musa acuminata), laranja

lima (Citrus sinensis), mamão papaya (Carica papaya), manga tommy (Mangifera indica) e

tangerina ponkan (Citrus reticulata). Das seis hortaliças selecionadas, duas se encontravam

sob a classificação de “hortaliças folhosas e florais”, brócolis comum (Brassica oleracea var.

Italica) e repolho branco (Brassica oleracea var. Capitata); duas como “hortaliças frutosas”

batata inglesa (Solanum tuberosum L.) e tomate (Lycopersicon esculentum var. Carmem); e

duas como “hortaliças tuberosas” cebola nacional (Allium cepa) e cenoura (Daucus carota).

Os experimentos foram realizados em duplicata em três momentos distintos durante os

meses de agosto e setembro de 2006. Os alimentos foram adquiridos em mercados varejistas

da cidade do Rio de Janeiro (RJ), sendo adquiridos aproximadamente 1,0kg de cada vegetal

ou no mínimo três unidades para vegetais de grande volume (abacaxi, manga, brócolis,

repolho) por momento de análise. Os cultivares de cada fruta e hortaliça foram escolhidos em

função da maior disponibilidade no mercado, uma vez que não são especificados pelo IBGE,

sendo estes os de maior disponibilidade nos mercados da cidade do Rio de Janeiro. Os

alimentos foram lavados em água fria e corrente e secos em papel toalha. Os mesmos foram

descascados manualmente no caso da banana e tangerina, com faca para as demais frutas,

incluindo o tomate e com descascador manual de legumes para o caso da batata e cenoura.

Para estes alimentos a polpa foi a fração analisada. O brócolis foi subdivido manualmente em

folhas, flores e talos, sendo utilizadas para as análises as três frações em proporções

147

semelhantes. Do repolho, a parte externa foi descartada (considerando-se as três folhas mais

externas), sendo a fração interna (restante do alimento) analisada, simulando o processo de

pré-preparo normalmente utilizado em nível doméstico. Alimentos danificados ou com

injúrias foram descartados. Após o pré-preparo, os alimentos foram processados em extrator

de suco modelo Samsom GB-9001, (Greenbison Inc, EUA), obtendo-se um extrato fluido

utilizado imediatamente nas análises.

2.2. Extração de polifenóis totais

A extração de polifenóis totais foi realizada segundo a metodologia de Vinson et al.

com algumas modificações. Amostras de 100µL do suco extraído fresco foram colocadas em

eppendorfs de rosca sendo posteriormente acrescidos de 500µL de solução de extração

contendo metanol a 50% acrescidos de ácido clorídrico a 1,2M. Os eppendorfs foram

colocados em banho-maria a 90ºC por 3h. Posteriormente, foram retirados do banho e, após

resfriados em temperatura ambiente, o volume foi completado a 1mL com metanol puro. Em

seguida, as amostras foram centrifugadas a 5000rpm por 5 minutos e os sobrenadantes foram

obtidos com auxílio de uma pipeta automática, sendo estes denominados extratos de

polifenóis. As extrações foram realizadas em duplicata.

2.3. Determinação de polifenóis totais

A determinação de polifenóis foi realizada utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu

segundo Karou et al.

. A solução de Folin foi preparada utilizando o reagente Folin-

Ciocalteu (Merck) e água deionizada 1:1 (v/v). Em eppendorf foram adicionados 30µL do

extrato de polifenol conforme descrito acima, acrescidos de 75µL da solução de Folin. Após

cinco minutos de reação foram adicionados 75µL de solução de carbonato de sódio (20%) e o

volume foi completado com água deionizada até 600µL. A solução reagiu por 30 minutos e

posteriormente foi realizada a leitura em espectrofotômetro (Beckman 6300) a 750nm

utilizando ácido gálico como padrão. Os resultados foram expressos em mg de equivalentes

148

de ácido gálico (EAG) por 100g de alimento peso fresco. A determinação de polifenóis foi

realizada em três experimentos independentes, cada um em duplicata.

2.4. Estimativa da disponibilidade nacional

A disponibilidade nacional de polifenóis foi estimada a partir dos valores obtidos por

grama de peso fresco de cada vegetal analisado neste estudo. O valor diário per capita no

Brasil e regiões foi calculado a partir da soma do aporte diário de polifenóis fornecido por

cada alimento, segundo a fórmula abaixo:

Aporte diário do alimento: conteúdo de polifenóis por grama x aquisição anual

365 dias

A representatividade de cada vegetal no aporte diário de polifenóis totais foi calculado

a partir do teor de compostos fenólicos oferecido por cada alimento, em um dia, dividido pela

disponibilidade total diária, sendo o valor expresso em percentual, como na fórmula expressa

a seguir:

% = aporte de polifenóis totais por dia (para cada vegetal) x 100

consumo diário de polifenóis totais

2.5. Sugestão de consumo

Uma sugestão de consumo, englobando a recomendação diária de frutas e hortaliças

(cinco a nove porções ao dia) e os alimentos analisados, foi elaborada a partir das

recomendações de porções alimentares descritas no “Guia Alimentar para a População

Brasileira” publicada pelo Ministério da Saúde em 2005

. O cardápio proposto apresenta

valor energético total (VET) de aproximadamente 2000kcal, podendo ter como público alvo a

população adulta saudável.

Para a elaboração do cardápio foram selecionadas preparações cujas composições e

valores calóricos foram obtidos a partir de Franco e Chaloub

, sendo estas: salada de alface,

cenoura cozida, salada de frutas, salada de repolho, pirão e brócolis cozido.

149

2.6. Estatística:

Os valores de média e desvio padrão foram calculados utilizando programa Microsoft Excel

do pacote Office 2007 para Windows.

3. Resultados

O conteúdo médio de polifenóis totais nas frutas analisadas variou de 15,3 a 215,7mg

EAG/ 100g de peso fresco, sendo as frutas com menor e maior teor de polifenóis,

respectivamente, o mamão e a banana (tabela 1). No caso das hortaliças, os valores médios

variaram de 13,7mg EAG/ 100g de peso fresco para o tomate e de 113,2mg EAG/ de 100g

peso fresco para a cebola (tabela 2). Os valores obtidos para polifenóis nas frutas e hortaliças

estudadas foram semelhantes àqueles apresentados na literatura, com algumas exceções, como

o mamão, a batata e o brócolis, cujos valores foram inferiores aos da literatura. A figura 1

demonstra o consumo diário per capita de polifenóis em relação ao volume consumido

diariamente das frutas e hortaliças estudadas. A disponibilidade média de polifenóis a partir

das frutas e hortaliças estudadas foi de 53,4mg/ dia no Brasil, sendo a região sudeste a que

apresentou maior valor (60,2 mg), seguida pelo sul (58,5 mg), nordeste (49,2 mg), norte (40,8

mg) e centro-oeste (32,2 mg). O maior consumo diário de frutas está positivamente

relacionado com um maior fornecimento destes compostos.

Em relação ao conteúdo de polifenóis fornecido diariamente por cada alimento

estudado, a banana foi aquela que se destacou, sendo responsável por 30,4% dos polifenóis

totais fornecidos diariamente por estes alimentos no Brasil. Em segundo e terceiro lugares

ficaram a cebola (20,1%) e a laranja (12,9%), respectivamente (tabela 3). Porém, as regiões

Sul e Centro-Oeste obtiveram outros alimentos como as principais fontes de polifenóis na

dieta.

O cardápio elaborado para adultos saudáveis (VET aproximado de 2000Kcal) como

150

sugestão de consumo destes doze alimentos, gerou um aumento em torno de 14 vezes na

ingestão de polifenóis, elevando de 53,4mg/ dia para 759,2mg/ dia.

4. DISCUSSÃO

O conteúdo de polifenóis em alimentos é bastante variável e sofre influência de

diferentes fatores, tais como: região geográfica de plantio, variação à exposição solar, método

de cultivo e fertilização aplicados, cultivar analisado, dentre outros, o que pode justificar as

diferenças observadas para o mamão, a batata e o brócolis, em relação à literatura. Com

exceção dos dados apresentados por Mélo et al.

, os demais trabalhos foram realizados em

outros países, apresentando condição climática, incidência solar e, provavelmente, cultivares

diferentes dos analisados. Dessa forma, mesmo sendo realizado no Brasil os alimentos foram

produzidos e adquiridos na região de Recife, enquanto este estudo foi realizado na região

sudeste, demonstrando a importância de análises regionais, especialmente em países de larga

extensão como o Brasil.

As maiores disponibilidades diárias per capita de polifenóis nas regiões sudeste e sul

provavelmente se devem ao maior poder aquisitivo da população destas regiões, que permite

maior aquisição e consumo de frutas e hortaliças

. O custo elevado de frutas e hortaliças

assim como a renda familiar são fatores diretamente associados à redução da participação

destes alimentos na dieta do brasileiro

. No entanto, o posicionamento do Nordeste em

terceiro, pode indicar que apenas o fator econômico não explica os resultados observados, já

que esta região compreende cidades reconhecidamente de menor poder aquisitivo. A maior

facilidade de acesso da população destas regiões a estabelecimentos que vendem frutas e

hortaliças pode ter contribuído para este resultado, uma vez que estudos mostram que a

facilidade de acesso está associada positivamente com o aumento do consumo destes grupos

de alimentos

. A literatura demonstra ainda, que o tamanho da seção destinada ao hortifruti

151

dos mercados, assim como a diversidade de produtos, são fatores que influenciam na maior

aquisição de produtos de origem vegetal

A variação na disponibilidade de polifenóis entre as regiões, em especial nas regiões

centro-oeste e norte, pode ser devida aos alimentos utilizados neste trabalho. Ao contemplar

alimentos de maior consumo nacional, foram desconsiderados os hábitos alimentares das

diferentes regiões, e estas, em especial, mantêm o consumo de alimentos típicos, diferentes do

restante do país

. O consumo de alimentos regionais é mais evidente ainda na ingestão de

frutas, devido a enorme diversidade natural nessas regiões, tendo como exemplos, açaí,

cupuaçu e taperebá no norte, e pequi e gabiroba no centro-oeste. Estudos vêm demonstrando

que frutas tropicais nativas do Brasil possuem conteúdo significativo de compostos fenólicos.

Lima et al.

verificaram que pitangas vermelhas apresentavam um teor de 257 mg de

equivalente de catequina por 100 g do fruto, valor semelhante ao de outras frutas vermelhas,

como mirtilo, ameixa e uva (270, 174 e 201 mg EAG/ 100g peso fresco, respectivamente),

que são frutas de clima temperado, reconhecidas como fonte de polifenóis

30, 31

. O açaí

apresenta um alto teor de antocianinas, um subgrupo de polifenóis, com valores de 267 mg/

100g de peso fresco

. Dessa forma, a disponibilidade de polifenóis nas regiões norte e

centro-oeste pode ter sido subestimada neste trabalho, uma vez que não foram avaliados

alimentos típicos e frutas nativas destas regiões. Mesmo assim, considerando-se apenas estes

doze alimentos, o consumo estimado para o Brasil é equivalente, e em alguns casos superior,

àquele estimado para outros países, como Espanha (18-31mg/ d)

, Dinamarca (23,46 mg/ d)

, Japão (25-40 mg/ d)

e Estados Unidos (20-34 mg/ d)

A influência do hábito alimentar de cada região pode ser também verificada em

relação ao aporte diário de polifenóis fornecido por cada fruta ou hortaliça. As regiões sul e

centro-oeste foram as únicas que não apresentaram a banana como principal fonte alimentar

de polifenóis, e sim a cebola (tabela 3). Da mesma forma, a batata na região sul oferece 15,2%

152

dos polifenóis diários, maior percentual observado para este alimento dentre as regiões. O

norte e nordeste apresentam alto consumo de outros tubérculos como mandioca, cará e batata

doce, o que leva a um aporte em torno de 5% dos polifenóis diários pela batata inglesa nestas

regiões. A banana, além de apresentar quantidade elevada de polifenóis totais por 100 g, valor

semelhante à maçã

, apresenta um grande volume adquirido anualmente, 2,7 kg per capita.

A batata, no entanto, contém aproximadamente um décimo do teor de polifenóis presente na

banana, porém o grande consumo, principalmente na região sul (10,3kg/ per capita ao ano)

a coloca como um alimento representativo no aporte de polifenóis. Os dados apresentados por

Vinson et al

mostram perfil semelhante na população norte americana, onde mesmo a

cebola contendo maior teor de polifenóis no alimento in natura, o grande consumo da batata

nos Estados Unidos a colocou como principal alimento-fonte da população.

Como já descrito anteriormente, diferentes fatores externos são capazes de influenciar

o conteúdo de polifenóis no alimento, como exposição solar, cultivar e composição do solo, o

que torna essencial analisar alimentos produzidos e consumidos nacionalmente. Em segundo

lugar, alimentos reconhecidos como fonte de polifenóis frequentemente não compreendem

alimentos comumente consumidos no Brasil, como é o caso de frutas vermelhas, soja e

bebidas como o chá

. A quantificação de polifenóis em outros alimentos consumidos em

território nacional poderá levar à identificação de novos alimentos fonte, além de agregar

informação aos dados obtidos levando a maior precisão da estimativa de disponibilidade de

polifenóis no Brasil.

O consumo de apenas 72 g/ dia de frutas e hortaliças oriundos dos doze alimentos

estudados é bastante reduzido frente à recomendação da Food and Agriculture Organization

(FAO) de 400 g ao dia. No entanto, a sugestão de cardápio proposta com base no “Guia

Alimentar para a População Brasileira” (tabela 4) indica que o aumento do consumo de frutas

e hortaliças levaria a um aumento no aporte de polifenóis. No cardápio hipotético, a ingestão

153

diária de polifenóis chega a 759 mg, o equivalente ao aumento de aproximadamente 14 vezes

ao estimado neste estudo. Ainda assim, este valor estará subestimado, uma vez que outros

alimentos da dieta do brasileiro, como, por exemplo, o arroz e o feijão, o café, e a alface, não

estão sendo analisados neste estudo.

5. CONCLUSÃO

Apesar da estimativa de disponibilidade de polifenóis a partir dos doze alimentos

analisados ser limitada, o valor encontrado para o Brasil foi semelhante às estimativas de

consumo para outros países. Em função da extensão territorial e das diferenças culturais entre

as regiões geográficas, novas análises devem ser realizadas em cada região brasileira, de

maneira a verificar particularidades de cada região. De maneira geral, fica claro que a adoção

de práticas alimentares saudáveis e o incentivo ao maior consumo de frutas e hortaliças leva

ao aumento no aporte de polifenóis pela população. Dessa forma, a identificação de

compostos bioativos em alimentos nacionais deve ser estimulada, a fim de se obter

informações sobre o seu conteúdo na dieta brasileira, conhecer as características regionais,

além de fornecer subsídios e conhecimento científico para embasar programas de promoção

ao consumo de frutas e hortaliças, como o “5 ao dia” e o “Brasil Saudável”.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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157

Tabela 1

Teor médio de polifenóis totais em frutas do Brasil e comparação com dados da literatura

Frutas Média* DP Literatura

66,3

94,3

Abacaxi

85,1 5,8

174,0

44,5

90,4

Banana 215,7 3,5

231,0

92,4

Laranja 114,6 1,3

217,0

57,6

Mamão 15,3 0,3

75,4

56,0

72,3

Manga 110,5 9,6

266,0

42,6

Tangerina

134,1 6,5

192,0

* Valores expressos em mg EAG/ 100g peso fresco

Mélo et al., 2006 (Brasil) /

Sun et al., 2002 (Estados Unidos) /

Wu et al., 2004

(Estados Unidos) /

Ciéslik et al., 2006 (Polônia) /

Lako et al., 2006 (Fiji) /

Luximon-Ramma

et al., 2003 (Espanha) /

Wang et al., 2007 (Taiwan).

158

Tabela 2

Teor médio de polifenóis totais em hortaliças do Brasil e comparação com dados da

literatura

* Valores expressos em mg EAG/ 100g peso fresco

Mélo et al., 2006 (Brasil) /

Sun et al., 2002 (Estados Unidos) /

Wu et al., 2004

(Estados Unidos) /

Ciéslik et al., 2006 (Polônia) /

Lako et al., 2006 (Fiji) /

Luximon-Ramma

et al., 2003 (Espanha) /

Wang et al., 2007 (Taiwan).

Hortaliças Média * DP Literatura

43,2

Batata 31,5 2,1

163,0

290,0

Brócolis 68,0 9,4

337,0

82,2

91,0

Cebola 113,2 3,8

150,0

12,9

16,0

Cenoura 45,1 4,7

125,0

47,3

Repolho 66,9 17,0

108,0

30,8

36,0

Tomate 13,7 1,2

62,0

159

Figura 1

Consumo nacional per capita de polifenóis totais e frutas e hortaliças nas principais regiões

do país.

53,4

58,5

60,2

49,2

40,8

32,2

72,0

44,6

59,6

90,2

82,4

49,9

Brasil Sul Sudeste Nordeste Norte Centro-

Oeste

Polifenóis (mg EAG/dia)

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Frutas e Hortaliças (g/dia)

Polifenóis Frutas e Hortaliças

160

Tabela 3

Quantidade de polifenóis totais fornecido por cada alimento em relação ao aporte diário per

capita.

Aporte Diário de Polifenóis Totais por Alimento (%)

Alimento

Brasil

Norte

Nordeste

Sudeste

Sul Centro Oeste

Abacaxi

3,7 2,6 5,1 3,4 2,1 5,4

Banana

30,4 52,1 40,4 28,5 14,8 19,1

Batata

8,5 5,0 4,8 8,7 15,2 8,1

Brócolis

0,4 0,0 0,0 0,6 0,5 0,1

Cebola

20,1 21,1 21,4 17,9 23,3 24,7

Cenoura

4,0 2,7 3,7 4,3 3,7 6,4

Laranja

12,9 5,4 9,8 15,2 13,3 14,3

Mamão

1,4 1,1 1,2 1,7 1,3 1,4

Manga

5,0 3,0 6,6 4,9 4,3 3,1

Repolho

3,4 2,6 1,8 3,0 6,6 6,0

Tomate

3,5 3,0 3,8 3,4 3,0 5,3

Tangerina

6,6 1,4 1,4 8,4 11,9 6,1

161

Tabela 4

Sugestão de cardápio para adultos saudáveis (2000 kcal)

∗

Refeição Composição da Refeição

Quantidade

(g/ mL)

Porções de

Frutas e

Hortaliças

Polifenóis

Kcal

Pão de forma integral 2 fatias 150

Queijo minas 50 120

Café puro 50mL

Desjejum

Mamão papaya (1/2 unidade) 150 1 23 70

Salada de alface *

alface americana

100 13

tomate

20 8 19

cebola

10 9

azeite

0,5

Arroz integral cozido 140 150

Feijão carioca cozido (1 concha) 86 55

Frango assado (sobrecoxa sem pele) 100 190

Cenoura cozida*

Cenoura (1 xícara cru)

100 1 38 42

tomate

20 8 19

cebola

10 9

óleo

2 18

Almoço

Sobremesa: tangerina 80 0,5 107 35

Salada de fruta* 139

Abacaxi

100 100

Laranja

100 77

Banana

107

Lanche

Cereal matinal de milho s/ açúcar 50 191

Salada de repolho*

repolho

100 62 21

tomate

20 8 19

cebola 10

0,5

azeite de oliva

2 18

Arroz integral cozido 140 150

Peixe cozido (merluza) 200 190

Pirão*

Brócolis cozido*

brócolis (1 xícara cru)

100 1 90 25

tomate

20 8 19

cebola

10 9

óleo

2 18

Sobremesa: manga 100 1 87 51

Iogurte natural desnatado

200 120

Aveia em flocos (1 col. sopa)

15 63

Jantar

Mel

10 29

Total 1100 7,5 759 1985

* Segundo “Guia Alimentar para a População Brasileira” publicada pelo Ministério da Saúde em 2005.

Anexo C

Manuscrito a ser submetido ao periódico Química Nova

Métodos de Análise da Capacidade Antioxidante em Alimentos

163

MÉTODOS DE ANÁLISE DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM ALIMENTOS

Ana Luisa Kremer Faller, Eliane Fialho*

Departamento de Nutrição Básica e Experimental, Instituto de Nutrição Josué de

Castro, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro,

UFRJ, Caixa Postal 68041, Cidade Universitária, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro,

CEP 21941-590, Brasil.

• eli[email protected]

164

MÉTODOS DE ANÁLISE DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE EM ALIMENTOS

ABSTRACT

Interest has grown towards the evaluation of antioxidant capacity in foods and

plant extracts. This is due to its potential health benefits as well as the applicability

of these compounds in the food and pharmaceutical industries. Although different

methods have been developed there is no standard methodology for evaluating

antioxidant capacity in foods or supplements. Here, the hydrohen tranfer methods

ORAC, TRAP, TOSC, LDL oxidation, beta-carotene bleaching, single eletron

transfer methods FRAP, CUPRAC and TEAC and DPPH methods are reviewed as

well as their characteristics and applications.

Key-words: antioxidant capacity / methods / food

165

1. Introdução

O consumo de frutas e hortaliças, ricos em substâncias antioxidantes, vem

sendo associado à redução da incidência de doenças crônicas não transmissíveis

(DCNT), em especial alguns tipos de câncer, diabetes, doenças cardiovasculares,

artrite, degeneração macular e doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e

Parkinson. O principalmente mecanismo de ação exercido por estas substâncias é

o combate aos radicais livres (RL), sendo essencial saber o que são e como agem

para então analisar a capacidade antioxidante destas substâncias presentes na

alimentação humana

O RL pode ser descrito como qualquer espécie química capaz de existir

independentemente, possuindo um ou mais elétrons desemparelhados. Esta

característica lhes confere alta instabilidade, podendo seus elétrons reagir

rapidamente com diferentes substratos, como lipídeos, proteínas, moléculas de

DNA, carboidratos, lipoproteínas, levando à sua oxidação

. Na natureza são

encontrados radicais livres, mas também moléculas reativas de origem não-

radicalar, exemplificadas nas tabelas 1 e 2.

Apesar deste efeito indesejável dos RL, é essencial ressaltar que estes são

normalmente sintetizados pelo organismo. A cadeia transportadora de elétrons,

durante a respiração e metabolismo, é uma das maiores produtoras endógenas de

espécies reativas, de forma que a exposição do organismo à RL é inevitável. Em

acréscimo, diversas moléculas conhecidas como RL apresentam função fisiológica

importante no organismo, atuando, por exemplo, em sinalização celular ou em

mecanismos de defesa contra microrganismos. Dessa forma, os radicais livres

apresentam dupla função de acordo com as concentrações em que se encontram

166

no organismo: em concentrações fisiológicas são moléculas regulatórias e

sinalizadoras; enquanto que, em níveis elevados podem ser deletérios e

citotóxicos

A prevenção de efeitos danosos ao organismo por RL é, portanto, assegurada

pelos antioxidantes. Estes podem ser classicamente definidos como substâncias

capazes de, em concentrações menores que as dos substratos oxidáveis, impedir

a ocorrência de dano oxidativo. A ação antioxidante pode ocorrer precocemente,

prevenindo a formação de um RL ou impedindo o dano inical a uma molécula, ou

posteriormente, evitando a propagação do dano oxidativo ao freiar sua reação em

cadeia. Os seres humanos apresentam pelo menos quatro fontes, endógenas e

exógenas, de moléculas com potencial antioxidante

1. Enzimas: superóxido dismutase, glutationa peroxidase, catalase.

2. Proteínas transportadoras: albumina, ceruloplasmina, ferritina.

3. Micronutrientes: ácido ascórbico, tocoferol, ácido úrico, carotenóides.

4. Hormônios: estrogênio, angiotensina, melatonina.

As enzimas antioxidantes atuam principalmente na defesa intracelular. Já

os outros compostos endógenos não-enzimáticos, como proteínas e metabólitos,

assim como algumas vitaminas são os principais agentes defensores no plasma.

Interessante destacar que dos antioxidantes presentes no sangue, aqueles não-

vitamínicos são responsáveis por 50-80% do combate às espécies reativas,

mesmo esta não sendo sua função primária

A garantia da homeostase, assim como o correto funcionamento celular, é

mantido a partir de um equilíbrio entre as substâncias antioxidantes e pró-

oxidantes. Alterações neste balanço podem levar ao estado conhecido como

167

estresse oxidativo, que pode ocorrer por dois mecanismos básicos: pelo aumento

da concentração de espécies reativas derivadas de oxigênio, nitrogênio ou

carbono (por exemplo, pela maior liberação destes por fagócitos durante

processos de inflamação ou infecção); ou pela redução da concentração de

antioxidantes (por exemplo, mutações em enzimas endógenas ou redução da

ingestão de antioxidantes exógenos)

Recentemente, novas substâncias presentes nos alimentos vêm sendo

caracterizadas como fontes dietéticas, exógenas, de antioxidantes. Estas novas

substâncias, freqüentemente denominadas de compostos bioativos em alimentos

(CBA), incluem compostos fenólicos como as isoflavonas, catequinas, resveratrol,

compostos organosulfurados como glicosinolatos e isotiocianatos, além de luteína,

zeaxantina, β-criptoxantina entre outros. Isto impulsionou a realização de trabalhos

investigando a capacidade antioxidante de alimentos, bebidas, ervas e

especiarias.

No entanto, a determinação da capacidade antioxidante de alimentos é

importante não só para avaliar o seu efeito benéfico à saúde, como também para

fins tecnológicos, prevenindo, por exemplo, a oxidação de alimentos a partir da

introdução destas substâncias antioxidantes. Outro aspecto a ser analisado, é o

uso de análises da capacidade antioxidante para verificar efeitos nutricionais

benéficos ou deletérios do processamento de alimentos em relação aos alimentos

in natura

A avaliação da capaciadade antioxidante pode ser relaizada a partir de

ensaios químicos, in vitro, ou biológicos, in vivo. Experimentos in vitro apresentam

a vantagem de serem facilmente aplicados e baratos; no entanto, estes podem ser

168

bastante limitados quando avaliam apenas a eficácia de uma substância sobre o

seqüestro de radicais livres, por exemplo. Fatores como a presença de outros

compostos na matriz alimentar que podem exercer efeitos aditivos, sinérgicos ou

inibitórios, devem ser considerados. Para se avaliar a eficácia destes antioxidantes

na fisiologia humana e os fatores que influenciam a capacidade redox do plasma,

são necessários modelos in vivo, que são mais elaborados e demorados, uma vez

que requerem recrutamento de indivíduos ou coleta de amostras de sangue

periodicamente. Dessa forma, é importante o aperfeiçoamento de diferentes

métodos químicos para a avaliação da capacidade antioxidante, a fim de se obter

informações preliminares para estudos posteriores in vivo, abordando parâmetros

como absorção e biodisponibilidade

Apesar da maior facilidade de aplicação de modelos in vitro, um dos

principais obstáculos é a ausência de um método padrão para avaliação da

capacidade antioxidante em alimentos. Em 2004, foi realizado nos EUA o primeiro

congresso internacional de metodologias antioxidantes a fim de se propor um ou

mais métodos de análise para ser padronizado, incorporado à Association of

Official Analytical Chemists (AOAC) e utilizado em análises de rotina de alimentos,

fitoterápicos, compostos bioativos e outros suplementos dietéticos

. Esta

padronização permitiria comparações significativas entre dados na literatura

referente à sobre alimentos e produtos comerciais, além de serem aplicados para

controle de qualidade e futuras recomendações de ingestão de substâncias

antioxidntes.

A ausência de padronização metodológica se dá, em parte, pelas diferentes

características das substâncias antioxidantes e das amostras a serem analisadas,

169

que incluem desde sistemas biológicos até diferentes matrizes alimentares. Para

compostos bioativos especificamente há uma diversidade de substâncias, sendo

constantemente novas estruturas identificadas, cada uma atuando de forma

diferente e respondendo distintamente aos agente oxidante. Os carotenóides, por

exemplo, apresentam baixa capacidade de reação com radicais peroxil quando

comparados aos polifenóis. No entanto, são ótimos seqüestradores de oxigênio

singleto, aos quais os polifenóis são praticamente ineficazes

. O conhecimento da

substância antioxidante e a composição do alimento a ser analisado devem ser

considerados a fim de se escolher aquele com melhor aplicabilidade e eficácia.

Outro fator importante para análise da capacidade antioxidante de alimentos é

a forma de extração destas substâncias a partir da amostra em questão. A maioria

dos ensaios químicos avalia a capacidade antioxidante apenas do material que é

solubilizado após a extração com uma mistura de solventes. Mesmo utilizando

metodologias que visam aumentar a solubilidade e extração destes compostos da

matriz alimentar, compostos insolúveis, com papel importante na capacidade

antioxidante de alguns alimentos, não são contabilizados. Isso se dá

especialmente no caso de cereais, frutas e hortaliças, onde há a presença de

fibras dietéticas, além de produtos da reação de Maillard, como melanoidinas e

melanoproteínas. Em função disso, alguns métodos já vem sendo modificados,

como o TEAC e o DPPH, para permitir a análise da capacidade antioxidante

destas frações insolúveis

De maneira geral, os ensaios químicos se baseiam na adição de uma

substância antioxidante num meio compostos onde RL são gerados, previamente

ou concomitantemente ao antioxidante. Existem dois principais mecanismos de

170

ação pelos quais os compostos antioxidantes podem desativar RL: transferência

de átomos de hidrogênios (TAH) ou transferência de elétrons (TE). A maioria dos

métodos por TAH, a substância antioxidante e o substrato competem pelos

radicais peroxil gerados. A quantificação se dá pelo monitoramento das curvas de

cinéticas das reações

Nos métodos de TE a capacidade antioxidante é aferida pela habilidade de um

antioxidante de transferir elétrons ao RL em questão, tendo na alteração da cor do

RL reduzido a medida da capacidade antioxidante. Este tipo de reação é pH-

dependente e, como são reações de longa duração, normalmente os cálculos de

baseiam no percentual de redução do produto inicial

2. Principais Métodos de Avaliação da Capacidade Antioxidante

2.1. Métodos de Transferência de Átomos de Hidrogênio (TAH)

2.1.1. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity):

Primeiramente desenvolvido por Glazer e colaboradores

, o método

utilizava a proteína fluorescente β-picoeritrina, isolada a partir da alga vermelha

Porphyridium cruentum, como substrato para reação com o radical peroxil. No

entanto, posteriormente substâncias como fluorescina ou diclorofluorescina

passaram a ser mais freqüentemente utilizadas em função de algumas

desvantagens apresentadas pela β-picoeritrina

. Dentre elas podemos citar a

grande variabilidade dos resultados, sua fotoinstabilidade e interação não

específica com os polifenóis, especialmente proantocianidinas, o que levava ao

decaimento da fluorescência mesmo na ausência do radical peroxil

171

Inicialmente o ORAC apresentava alta especificidade por compostos

hidrofílicos, tendo baixa representatividade para antioxidantes lipofílicos. No

entanto, atualmente o método foi adaptado possibilitando a determinação dessas

duas classes, sendo uma característica importante em relação a outros métodos.

A utilização de solução de acetona e água (1:1), contendo 7% de β-ciclodextrina

metilada vêm sendo utilizada para solubilização de antioxidantes lipofílicos

A atividade antioxidante é aferida a partir do prolongamento do tempo e

manutenção da intensidade de fluorescência após um determinado tempo, sendo

medida pela área sob a curva das amostras em relação ao padrão, normalmente o

Trolox, análogo solúvel da vitamina E. O uso da área sob a curva como forma de

quantificação permite a avaliação de substâncias tempos de fase lag bastante

distintos

11.

O ORAC vem sendo utilizado pela indústria de alimentos que,

freqüentemente, estampa estes valores, expressos em equivalentes de Trolox, no

rótulo do produto.

Alguns fatores que influenciam negativamente o uso deste método é sua

sensibilidade ao calor, tendo que se controlar a temperatura no ambiente, no meio

de reação e no momento da leitura. A necessidade do uso de fluorímetros,

equipamento de elevado custo, também dificulta sua aplicação em muitos

laboratórios. Anteriormente, amostras contendo proteína podiam interferir com os

radicais peroxil; porém, esta interferência foi eliminada a partir da modificação do

método por Cao e colaboradores

, pela adição de ácido tricloroacético. Além

disso, o uso de placas de 96 poços pode levar a um maior coeficiente de variação

(CV) quando comparado à placas de 48 poços. A atividade da reação parece ser

172

menor nos poços mais a direita e para baixo da placa, ocasionalmente diferenças

na leitura

2.1.2. TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter)

Neste método, desenvolvido por Wayner e colaboradores

, os radicais peroxil

são normalmente gerados por azoiniciadores hidrossolúveis podendo ser utilziado

o AAPH (dicloridrato do 2,2’-azobis-(2-metilpropanoamidina)) ou ABAP (cloreto de

2,2’-azo-bis (2-amidinopropano)) tendo como substrato a R-picoeritrina ou mesmo

o ABTS (Ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenzatiazonila-6-sulfónico)). O uso de

azoiniciadores hidrossolúveis para geração de produtos da peroxidação lipídica

vem sendo questionado, uma vez que é um mecanismo que considerado não-

fisiológico.

O monitoramento ocorre através de fluorímetro e, quando se utiliza R-

picoeritrina e AAPH, são utilizados os comprimentos de onda 495nm e 575nm. Os

valores são expressos pelo aumento da fase lag, ou tempo, da reação da amostra

em relação ao padrão, sendo utilizado o Trolox, de forma semelhante ao ORAC.

O TRAP é utilizado mais freqüentemente para determinação da capacidade

antioxidante plasmática ou in vivo, uma vez que mede antioxidantes não

enzimáticos, como ácido úrico, proteínas plasmáticas e ácido ascórbico. O uso de

diferentes agentes geradores de radical peroxil, assim como de substratos,

dificulta a comparação dos resultados disponíveis na literatura.

173

2.1.3. TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity)

Desenvolvido por Winston e colaboradores

, este método é capaz de

medir a ação antioxidante específica para três potentes oxidantes: radicais

hidroxil, peroxil e peroxinitrito. Isto permite avaliar através de um mesmo método

substâncias antioxidantes com ações distintas. Neste ensaio, o ácido alfa-ceto-

gama-metilbutírico (KMBA) serve de substrato que, ao ser oxidado, forma etileno.

O tempo e quantidade de geração de etileno é aferido por cromatografia gasosa,

sendo a atividade antioxidante avaliada a partir da redução destes parâmetros. O

tempo de duração da reação pode ser longo, até 300 minutos, o que dificulta a

análise de grande volume de amostras. O uso de cromatógrafo a gás também

dificulta a sua aplicação em muitos laboratórios.

2.1.4. Oxidação de Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL)

A medida da oxidação da LDL ex-vivo foi inicialmente desenvolvida para

medir o status antioxidante do plasma

. Posteriormente, esta medida começou a

ser utilizada para verificar o potencial antioxidante de alimentos, ao prevenir a

oxidação da LDL, sendo um modelo de grande representatividade biológica. Estas

lipoproteínas, previamente isoladas do plasma, normalmente estão associadas à

vitamina E, de forma que esta vitamina é capaz de proteger a LDL de oxidação.

Uma vez oxidada, a vitamina E não é mais capaz de proteger a lipoproteína,

levando à formação e acúmulo de hidroperóxidos lipídicos. A indução da oxidação

da LDL pode ser realizada a partir de macrófagos, ferro, cobre ou AAPH sendo

esta aferida a 234nm

174

A ação antioxidante do alimento ou substância em questão pode ser

exercida diretamente, evitando a oxidação da vitamina E e do LDL, ou também

favorecendo a regeneração da vitamina E oxidada. Quando a oxidação é feita

através de AAPH, este método parece ter boa correlação com valores obtidos por

ORAC. No entanto, a necessidade de coleta freqüente de amostras de sangue é

um fator negativo para utilização desta metodologia.

2.1.5. Oxidação do sistema betacaroteno/ ácido linoléico

O betacaroteno é um carotenóide que pode sofrer autooxidação ou ser

oxidado por luz, calor ou por indução de radicais peroxil (AAPH), o que resulta na

perda de sua pigmentação. Como esta descoloração do beta-caroteno pode

ocorrer por diferentes vias, tem sido utilizado recentemente a crocina como

substância oxidante, o que permite com que o substrato seja oxidado somente por

estes radicais

. Este método tem uso exclusivo para amostras em alimentos,

tendo a como medida da capacidade antioxidante o monitoramento da perda de

cor, aferida a 450nm. No entanto, alguns pigmentos em alimentos, como os

carotenóides, podem interferir no método uma vez que são capazes de absorver

luz em comprimentos de onda parecidos, sendo necessário manter um controle da

possível interferência destes pigmentos na amostra em questão

2.2. Métodos de Transferência de Elétron (TE)

2.2.1. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Desenvolvido por Benzie e Strain

, o FRAP foi inicialmente designado para

avaliação da capacidade antioxidante do plasma, sendo posteriormente adaptado

175

para análise de alimentos. Este método utiliza um sal férrico, o TPTZ (2,4,6-

tripiridil-s-triazina férrica), como oxidante gerando um composto colorido, cujo

comprimento de onda é aferido em espectrofotômetro. O potencial redox do TPTZ

(≈ 0,70V) é semelhante ao do ABTS (≈ 0,68V), o que os torna bastante parecidos

em termos de reação. No entanto, o pH do meio é bastante distinto entre os dois

métodos, ocorrendo o TEAC em meio neutro enquanto o FRAP ocorre em meio

ácido (pH 3,6)

A manutenção do meio ácido garante a solubilidade do ferro, no entanto,

pode alterar a ionização de elétrons e o potencial redox de alguns compostos

antioxidantes, resultando em valores menores quando comparados aos demais

métodos. Por utilizar o ferro na forma reduzida, o qual pode ser propagador de

reações em cadeia por radicais livres via redução de hidroperóxido em RO°, o

FRAP também pode ser utilizado para avaliar atividades pró-oxidantes

O tempo de reação pode ser bastante variável de acordo com da afinidade

da substância pelo ferro. Grande afinidade resulta em reações de 4 a 6 minutos;

porém, com baixa afinidade, podem chegar a 30 minutos. Por ser m método

método simples, rápido e barato, que não requer equipamentos especializados, é

bastante utilizadona análise de alimentos. No entanto, é considerado de baixa

representatividade fisiológica, já que utiliza o íon férrico como agente oxidante.

2.2.2. CUPRAC (Ensaio de Redução do Cobre):

É um método variante do FRAP, no qual se utiliza o cobre ao invés do ferro.

Neste ensaio, a neocuproina (2,9-dimetil-1,10-fenantrolina) forma um complexo

com o Cu (I) gerando um cromóforo de absorbância máxima a 450nm. A

176

capacidade antioxidante é avaliada pela taxa de reação e concentração do

produto final desta complexação

Os complexos gerados com neocuproina apresentam baixa solubilidade,

sendo necessário dissolvê-los em solventes orgânicos, como etanol 95%. Porém,

o solvente pode variar de acordo com o antioxidante presente no alimento

analisado. O betacaroteno, por exemplo, não reage com reagente CUPRAC em

etanol, sendo necessário o uso de dicloroetano. O uso do cobre no lugar do ferro

resulta em reações mais seletivas, já que o seu potencial redox é inferior ao do

ferro. Isso leva a uma menor interferência de substâncias como açúcares e ácidos

orgânicos no CUPRAC, sendo mais comum no FRAP

. O tempo de reação varia

de acordo com a substância antioxidante e sua afinidade pelo cobre, de maneira

semelhante ao FRAP. Sabe-se que moléculas menos complexas, como ácido

ascórbico, ácido gálico e quercetina, a reação é mais rápida, enquanto que para

moléculas de maior peso molecular, mais polimerizadas, como proantocianidinas,

as reações são mais longas.

2.3. Ensaios de Mecanismo Misto

Normalmente classificados como reações de transferência de elétrons,

estes métodos são capazes de identificar substâncias antioxidantes que atuam por

transferência de elétrons ou de átomos de hidrogênio. O padrão de reação pode,

por isso, torna-se de difícil interpretação.

177

2.3.1. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant capacity) ou ABTS:

Neste método, primeiro descrito por Miller e Rice-Evans

, o ácido 2,2-

azino-bis-(3-etilbenzatiazonila-6-sulfónico), ABTS, é oxidado por radicais peroxil

ou outros oxidantes em seu cátion ABTS

°, levando a formação de cor amarela

aferida normalmente em 734nm. A capacidade antioxidante aferida pelo

impedimento da geração desta coloração, sendo normalmente utilizado como

padrão o Trolox. Atualmente, a formação do cátion tem sido realizada previamente

à adição do composto antioxidante, a fim de reduzir interferências como a reação

do antioxidante com a substância oxidante destinada ao ABTS

O cátion ABTS

° pode ser gerado por reações químicas com dióxido de

manganês, ABAP ou persulfato de potássio, ou por reações enzimáticas,

utilizando peroxidases que interagem com metamioglobina ou hemoglobina.

Dependendo do composto utilizado, o tempo necessário para a formação do

cátion pode ser longo (16 horas para persulfato de potássio) ou necessitar de altas

temperaturas (60°C para ABAP). O tempo necessário p ara gerar o ABTS

°, assim

como a espera para a realização dos experimentos, pode levar a alterações na

atividade da solução estoque e, conseqüentemente, menor reproducibilidade dos

resultados

. Além disso, o radical ABTS tem se mostrado bastante instável em

pH 7.4, sendo desejável a redução do pH para valores entre 3.0 e 6.5 para maior

estabilidade, tendo como pH ótimo sugerido 4.5

Operacionalmente, este método é bastante simples e rápido, sendo

largamente aplicado em laboratórios para análise de alimentos. O ABTS pode

ainda ser solúvel em água e solventes orgânicos, o que permite a avalaição de

compostos hidro e lipofílicos, além de fluidos corporais

. Em contrapartida, como

178

o radical ABTS não está presente em tecidos de animais, é considerado de baixa

representatividade fisiológica.

2.3.2. Ensaio de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil):

O DPPH é um radical de nitrogênio orgânico estável que apresenta

coloração roxa intensa, não precisando ser gerado previamente. A capacidade

antioxidante neste método, primeiramente descrito por Brand-Williams e

colaboradores

, é dada pela redução do DPPH, de forma a diminuir sua

intensidade de cor. Esta pode ser aferida por ressonância de spin de elétron

(EPR) ou por decréscimo da absorbância, medida em espectrofotômetro a 515 ou

517nm.

Os valores normalmente são expressos em percentual de DPPH

remanescente (% DPPH rem = 100 x DPPH

rem

/ DPPH

). O percentual

remanescente de DPPH é diretamente proporcial a capacidade antioxidante da

amostra. A concentração necessária para reduzir a concentração de DPPH em

50% é chamada de EC

e o tempo necessário para atingir o EC

é chamado de

tEC

. Para valores de eficiência antiradicalar (AE) pode-se utilizar estes dois

parâmetros na fórmula abaixo

AE = 1/EC

x tEC

A grande vantagem deste método é a rapidez, facilidade de execução e

baixo custo. No entanto, alguns carotenóides podem agir como interferentes na

coloração da reação e, conseqüentemente, na leitura da absorbância

. Moléculas

de baixo peso molecular, como ácidos fenólicos e ácido ascórbico, podem reagir

179

mais rapidamente com o DPPH, gerando uma falsa impressão de maior

capacidade antioxidante em função dos tipos de antioxidantes presentes na

amostra testada.

3. Considerações Finais

Diante da diversidade de métodos para aferição da capacidade antioxidante

de alimentos, a escolha daquele mais apropriado é essencial para gerar bons

resultados e boa reprodutibilidade. Fatores importantes a serem considerados

incluem o mecanismo de ação do método e sua relação com as substâncias-alvo

na amostra. Estudos comparativos vêm se propondo a identificar e correlacionar

as melhores metodologias a serem aplicadas.

Thaipong e colaboradores

, ao analisar a capacidade antioxidante de

extratos de goiaba, verificaram que os métodos DPPH e FRAP apresentaram boa

reproducibilidade de resultados, o que não ocorreu com o TEAC e ORAC. No

entanto, os quatro métodos utilizados apresentaram correlação entre si, o que já

havia sido demonstrado com outros alimentos como mirtilo

e sorgo

. A maior

correlação foi observada entre os métodos TEAC e FRAP (0,97), enquanto que a

menor correlação foi entre os métodos DPPH e ORAC.

Em outro estudo avaliando a capacidade antioxidante de 927 amostras de

hortaliças por diferentes métodos, os autores observaram baixa correlação entre o

ORAC e o FRAP. A partir dos resultados obtidos, os autores propõem o uso do

ORAC como método padrão para a avaliação da capacidade antioxidante de

alimentos. Tendo como principal vantagem sua representatividade biológica, ao se

basear na capacidade de seqüestro de radicais peroxil, enquanto que outros

180

métodos, como o FRAP se baseiam apenas na capacidade de reduzir compostos,

como, neste caso, o ferro

A comparação entre dados da literatura, no entanto, é bastante complicada,

especialmente pela falta de padronização das metodologias. Em função disso,

recentemente, o conceito de índice relativo da capacidade antioxidante (IRCA) foi

proposto, a fim de se permitir à comparação dos dados existentes

independentemente da metodologia aplicada

. Através de um modelo estatístico,

os autores eliminaram diferenças nas unidades utilizadas por cada metodologia ao

transformando os dados gerados previamente em escalas numéricas. Dessa

forma, é possível construir um ranqueamento dos alimentos, em função da sua

capacidade antioxidante, incorparando informações obtidas por diferentes

métodos de análise. Apesar da nova abordagem, informações a partir de métodos

in vitro ainda são necessários para gerar os dados iniciais não isentando a

necessidade do aperfeiçoamento destas metodologias.

A fim de se obter um parâmetro dos métodos que estão sendo utilizados na

prática, foi realizada uma busca por artigos científicos que avaliaram capacidade

antioxidante em alimentos através do sítio www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez

(tabela 4). No período de 2000 a 2007, tempo selecionado para a pesquisa

científica, observamos que foram publicados 634 trabalhos originais, e não

revisões científicas, quando utilizamos o termo food seguido de cada método de

capacidade antioxidante expresso em sigla na língua inglesa. O resultado desta

busca nos mostra que ainda há grande predominância do uso de métodos

simples, rápidos e que não necessitam de equipamentos sofisticados, como o

DPPH, mesmo este não sendo o mais indicado a se tornar o método padrão.

181

Conclui-se, então que, até o momento, nenhum método isoladamente é

capaz de refletir com exatidão a “capacidade antioxidante total” de um alimento. A

associação de métodos baseados em diferentes mecanismos, tanto de TAH como

TE, a aferição de extratos hidro e lipofílicos, além métodos de extração eficientes

devem ser considerados a fim de se obter informações mais fidedignas sobre a

capacidade antioxidante de alimentos.

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antioxidant capacity. J. Food. Sci., 2007, 72 (9), 159.

185

5. Lista de Tabelas

Tabela 1. Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

Tabela 2. Espécies Reativas de Nitrogênio

Tabela 3. Resumo dos Métodos de Determinação de Capacidade

Antioxidante e suas Principais Características

Tabela 4. Números de Trabalhos Obtidos no Pubmed entre os anos de

2000-2007

186

Tabela 1. Espécies Reativas de Oxigênio (ERO)

Radicalares Não-Radicalares

Hidroxil OH

●

Peroxinitrito ONOO

Superóxido O

●-

Ácido hipocloroso HOCl

Óxido nítrico NO

●

Peróxido de hidrogênio

Til RS

●

Oxigênio singlet O

-1

Peroxil RO

●

Ozônio O

Peróxido lipídico LOOH

Adaptado de: Somogyi e colaboradores, 2007

187

Tabela 2. Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN)

Òxido nitroso N

Cátion nitrosil NO

Peroxidonitrito OONO

Dióxido de nitrogênio NO

●

Ácido peroxinitroso ONOOH

Trióxido de dinitrogênio N

Ânion nitroxil NO

Ácido nitroso HNO

Cloreto de nitrila NO

Adaptado de: Somogyi e colaboradores, 2007

188

Tabela 3. Resumo dos Métodos de Determinação de Capacidade

Antioxidante e suas Principais Características*

Ensaio

Antioxidante

Simplicidade

Equipamento

Necessários

Relevância

Biológica

Antioxidante

Hidrofílicos

e Lipofílicos

Mecanismo

de Reação

Quantificação

ORAC

++ + +++ +++

TAH

Área embaixo

da curva

TRAP

--- -- +++ --

TAH IC

fase lag

TOSC

- - ++ ---

TAH

Área embaixo

da curva

Oxidação

LDL

+ -- ++ ---

TAH Fase lag

Sistema β-

caroteno

+ + ++

TAH IC

fase lag

FRAP

+++ +++ -- ---

∆OD tempo

fixo

CUPRAC

+++ +++ ---

∆OD tempo

fixo

TEAC

+ + - +++

∆OD tempo

fixo

DPPH

+ + - -

∆OD tempo

fixo

TAH – Transferência de átoma de hidrogênio; TEU – Transferência de elétron único

* Adaptado de: Prior e colaboradores, 2005

189

Tabela 4. Números de Trabalhos Obtidos no Pubmed entre os anos de 2000-

2007*

Método Números de

Trabalhos Obtidos

ORAC

TRAP

TOSC

Oxidação LDL

Sistema betacaroteno

FRAP

CUPRAC

TEAC

DPPH

322

TOTAL

634

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