ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE - ICBS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:
FISIOLOGIA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO
Croton cajucara BENTH
E SEUS EFEITOS SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO
NO DIABETES MELLITUS EXPERIMENTAL
Éder Marcolin
Porto Alegre – RS, 2008.
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Éder Marcolin
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO Croton cajucara BENTH
E SEUS EFEITOS SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO
NO DIABETES MELLITUS EXPERIMENTAL
Orientadora: Prof. Dra. Norma Possa Marroni
Co-Orientador: Prof. Dr. Marc François Richter
Porto Alegre – RS, 2008.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Fisiologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito para a obtenção
do título de mestre em Fisiologia.
ads:
Este trabalho foi realizado nas instalações do Centro de Pesquisas do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre, no Laboratório de Hepatologia Experimental e Fisiologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) e no Centro de Pesquisas em
Ciências Médicas no Laboratório de Farmacocinética da Universidade Luterana do
Brasil (ULBRA). Foi fomentado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior (CAPES) e pelo Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos do
HCPA (FIPE).
Dedicatória
Aos meus pais, Américo e Ana, que me ensinaram a amar com intensidade tudo o
que se faz, para se fazer da melhor maneira possível. Pais que eu amo e que são
exemplos de pessoas às quais eu sigo. Muito obrigado por todo o esforço para me
fazer o que eu sou. Devo tudo a vocês!
Ao meu irmão, Edriano, pelo exemplo de maturidade centrada, que me coloca
muitas vezes na realidade dos momentos da vida! És meu parceiro das brincadeiras
e piadas, dos momentos onde preciso estar de mãos dadas!
A história do Menino Arqueiro
O Sol e a Lua, em pleno fim de inverno, se enamoraram frutificando dois seres
irmãos: o Menino com Pés de Vento e o Menino Arqueiro.
Durante a sua jornada, o Menino Arqueiro punha em prática todos os
ensinamentos de Sol e Lua, dia após dia, lançando suas flechas cada vez mais
longe, mais próximas ao horizonte.
Numa bela manhã de primavera, sua tutora na arte de lançar flechas, a Fada
Mestra, lhe apresentou o Menino do Arco, que havia lançado uma flechada para
muito longe e estava iniciando sua jornada em busca de sua flecha. A mestra olhou
o Menino Arqueiro e falou, com sua voz suntuosa e inebriada de encanto: -Você já
está pronto Menino Arqueiro, lance sua melhor flecha! E ele, mesmo estando um
pouco temeroso, preparou-se o melhor que pôde, esforçou-se até a exaustão
puxando a corda do arco e lançou a sua melhor flecha, uma flecha dourada que
havia recebido de Sol e Lua, chamada Vida. Seus braços pareciam não tolerar todo
aquele esforço, seus dedos tremiam como se fossem romper-se, mas ele lançou, e a
flecha voou tão alta e tão rápida que se perdeu no horizonte, por detrás de imensas
montanhas, rumo à algum lugar desconhecido. Junto ao Menino existiam outros e
outras, todos aprendendo e tentando lançar suas flechas, cada qual a sua maneira,
mas todos juntos aprendendo mutuamente a arte dos arqueiros.
A Fada Mestra olhou sorridente para o Menino Arqueiro, vendo todo o seu
esforço, e lhe disse: - Agora que lançastes sua flecha, siga o caminho e vá encontrá-
la.
Mas que caminho era este? Quantas dificuldades teria ele que enfrentar para
buscar a sua flecha? Mas, ele não estaria sozinho no caminho, Sol e Lua sempre a
velá-lo, Fada Mestra e sua corte também.
E o Menino Arqueiro, de peito aberto, começou a andar, meio sem jeito a
percorrer o caminho chamado Destino, até as grandes montanhas onde acreditava
que sua Flecha Vida estava a lhe esperar. Olhava para os lados e via muitos outros
percorrendo seus caminhos, até a Menina de Cabelo de Ouro, que teve seu ventre
preenchido de esperança, ao caminhar pela perigosa estrada.
Ao chegar a uma grande curva do Destino, em lugar com muito vento e frio,
costeando um grande despenhadeiro, o Menino Arqueiro já cansado, indeciso, foi
alvo de um dos perigos do caminho. Ele foi alvejado por uma lança negra, sem saber
de onde ela tinha vindo, só sabia que ela o havia atravessado e acertado seu
coração. Desfalecido, o Menino Arqueiro que estava em busca de sua flecha Vida,
caiu ao solo e, como num pesadelo, não conseguia se mexer, não via mais nada, só
sentia muita dor. Deitado na terra negra e quase sem vida, ouve a aproximação de
alguns seres. Sente uma mão tocando em sua cabeça e em seu peito. Era a Fada
dos Sonhos com seu grupo de Anjos de Uma Só Asa. O Menino Arqueiro, desde
então, não sentia mais dor, só permaneceu uma cicatriz que se tornava menor a
cada instante. A Fada com seus olhos negros e sorriso largo o fez levantar e o
lançou novamente a caminho em busca da flecha Vida.
Caminhando, mesmo um pouco perdido e com a sua cicatriz, ele encontra a Fada
Mestra sentada numa grande árvore. A fada o mirou e lhe disse que não poderia
mais percorrer o caminho por esta estrada. Ordenou que ele migrasse para o Terra
dos Leões e se apresentasse aos Mestres Leoneses. A única instrução era: - Siga o
caminho das Conchas Douradas.
E o Menino, buscando o Caminho das Conchas, encontrou o Novo Velho Mundo,
onde os meninos e as meninas, que se chamavam de Ticos e Ticas, falavam de uma
maneira diferente, hablavam de una forma rara y muy hermosa, dançavam pelas
pequenas calles, com uma maturidade ingênua e bonita de se ver, deixando o
Menino muito feliz. Havia uma fonte de água que lançava jatos para todos os lados,
e aí estava a Menina Arqueira, irmã de alma do Menino, a lhe esperar. Ela precisava
levá-lo aos Mestres Leoneses, que o esperavam. Eles partiram pelas conchas
chegando a um enorme templo de pedras também douradas com uma enorme
mandala azul brilhante no topo. Lá estavam os Mestres da Terra dos Leões, que o
preparam para seguir novamente o caminho em busca de sua Vida.
O Menino Arqueiro, que agora já não era mais apenas um menino, estava mais
forte, mais rápido e mais experiente quanto aos perigos do trajeto, vislumbrou suas
montanhas ao longe, como quem se prepara para acertar um alvo. E lá ele foi, dias
andando até chegar nas altas Montanhas de Strictus Sensus, onde sua flecha Vida o
aguardava. Lá, também estava a Fada Mestra lhe aguardando. Ele, ansioso, correu
para encontrá-la pois estava muito próximo de Vida. A Fada o acolheu, mirou em
seu olhos e disse: - Homem Arqueiro, você usou toda a sua técnica e força para
lançar sua flecha, ela não está aqui. Você precisa continuar a caminhar, pois a sua
flecha lhe espera mais além...!
Agradecimentos
A Deus, por estar comigo em cada momento e me presentiar com amigos.
Aos meus pais, Ana e Américo, simplesmente minha Lua e meu Sol.
Ao meu irmão, Edriano, que com voa pelo mundo como se houvesse asas
nos pés.
Em especial a minha Fada Mestra, a Dra. Norma Possa Marroni, minha
orientadora, pela sua exigente orientação que me torna cada dia mais preciso
em tudo o que faço. Obrigado por ter me apresentado um mundo novo de
expectativas e por ter entrado na minha vida desde a minha graduação.
Também, pelo carinho e atenção, por ser muito mais que uma orientadora,
por ser uma amiga, mama e companheira de muitas viagens.
Ao Dr. Marc François Richter, meu co-orientador, verdadeiro mago das
cromatografias, por todos os ensinamentos, por me preparar tão bem e me
ensinar a domar um HPLC. Obrigado pela sua simplicidade e incentivo desde
o início de minha trajetória.
Ao Dr. Alexandre Simões Dias, mestre, doutor e colega, que mesmo sem
saber, é personagem fundamental, ao despertar o meu interesse pela
pesquisa, sendo um exemplo como fisioterapeuta, como pesquisador, como
amigo e como ser humano. Obrigado por ser o Menino do Arco, o qual pude
observar e almejar um caminho a seguir.
Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Hepatologia Experimental
e Fisiologia, em especial, a Sílvia, Graziella, Rafael, Dra. Marilene, Dr.
Henrique, Dr. Cláudio, Nelson, Lidiane, Cíntia, Luís, Maurício, Meninos e
Meninas do Caminho, e todos que estiveram comigo percorrendo este
caminho. Obrigado por enriquecer de forma ímpar o meu trabalho, pelos
conhecimentos e técnicas, pelo empenho e dedicação e pela amizade.
Ao Giovanni, pelo apoio constante e auxílio, não somente técnico, mas com
suas palavras sempre agradáveis e confiantes.
À minha grande amiga e colega de mestrado Camila Marques Ávila, menina,
mulher e mãe de cabelos de ouro, obrigado pelo carinho, confiança, amizade,
companheirismo nos dias felizes e tristes. Lembre sempre do nosso
juramento: “Vamos rir muito disso”.
À Patrícia Flores, que soube me guiar em tempos difíceis até um mundo
sonhos felizes, pela maestria de entender minhas angústias e medos sabendo
onde eu tinha lançado minha flecha. Obrigado pela ajuda nos tropeços do
caminho.
Aos meus grandes amigos Beto, Carla, Fernanda, Alexsandra, Ana, minha
afilhada Mariana, grupo Água Viva e todos aqueles amigos-irmãos que são
meus anjos de uma só asa.
À irmã de alma, Juliana Tieppo, pela sempre atenciosa amizade, pelo
carinho e afetividade. Obrigado pelas nossas aventuras e não esqueça do
nosso compromisso, temos um livro a escrever.
A todos os amigos e hermanos de León pela amizade, carinho e pelas
tapas.
A todos do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidad de
León, Espanha, pela acolhida e confiança.
A todos do Departamento de Fisiologia da UFRGS, aos professores,
colegas e as secretárias Alice e Fabiana, obrigado pela atenção, pelo carinho,
pelos ensinamentos, por fazerem parte da minha vida e pela oportunidade de
participar deste programa de Pós-Graduação.
A todos do Centro de Pesquisa Experimental do Hospital de Clínicas de
Porto Alegre, Unidade de Experimentação Animal e ao GPPG, obrigado pelo
carinho, atenção, confiança, respeito, organização e pela recepção do nosso
grupo neste centro.
"Algumas pessoas sonham com o sucesso, outras
levantam cedo e batalham para alcançá-lo"
Aleksander Mandic
RESUMO
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença endócrino-metabólica freqüente, com
expectativa de alcançar 350 milhões de pessoas no mundo em 2025, segundo a
Organização Mundial da Saúde (OMS). Estudos experimentais e clínicos sugerem
que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão desta
doença. A espécie Croton cajucara BENTH (CcB) é uma planta da região amazônica
que tem suas folhas e casca do caule utilizadas pela população na forma de chá ou
cápsulas, para tratar várias doenças, dentre elas, o DM. Este estudo tem como
objetivo observar o efeito do extrato aquoso da casca do Croton cajucara BENTH em
relação ao estresse oxidativo, avaliando o seu potencial antioxidante, in vitro, pelo
sistema enzimático da Xantina Oxidase (XO) e, in vivo, pelo potencial de
sobrevivência da levedura Saccharomyces cerevisiae e pelo tratamento de ratos
diabéticos, induzidos por estreptozotocina (STZ). Foram avaliados os níveis de
glicemia, colesterol e triglicerídeos e as enzimas indicadoras de função hepática
Aspartato-aminotransferase (AST), Alanina- aminotransferase (ALT) e Fosfatase
alcalina (FA). Estando o DM envolvido com os níveis de lipoperoxidação,
padronizou-se e validou-se uma metodologia para determinação de Malondialdeído
(MDA) através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ou CLAE). Avaliou-
se também, a atividade da enzima antioxidante endógena glutationa peroxidase
(GPx). Utilizou-se ratos machos Wistar, pesando entre 250 e 350 gramas, que foram
divididos nos grupos: controle (CO); controle com tratamento de 5 dias com CcB
(CO5d); controle com tratamento de 20 dias com CcB (CO20d); diabéticos (DM);
diabéticos com tratamento de 5 dias com CcB (DM5d); e diabéticos com tratamento
de 20 dias com CcB (DM20d). O DM foi induzido por administração intraperitonial de
STZ na dose de 70mg/Kg. Os resultados obtidos demonstraram uma capacidade
antioxidante dependente de volume e dose através do teste enzimático da XO e pelo
ensaio in vivo com a levedura de S. cerevisiae. O CcB, no modelo experimental de
DM, não apresentou variações sobre o peso corporal dos animais mas, apresentou
uma tendência mais forte na redução dos níveis de glicemia, colesterol e
triglicerídeos nos diabéticos tratados por 5 dias, bem como, a redução dos níveis de
ALT e FA. E, através das medidas realizadas pela metodologia implantada e
validada, demonstrou-se uma queda nos níveis de MDA nos grupos diabéticos
tratados com CcB. Porém, não foram observadas alterações significativas na GPx.
Com base nestes resultados, acredita-se que a planta Croton cajucara BENTH
possua ação antioxidante sobre os modelos estudados.
Palavras-chave: Diabetes Mellitus, Croton cajucara BENTH, Estresse Oxidativo e
HPLC.
ABSTRACT
Diabetes Mellitus (DM) is a endocrine-metabolic frequent disease, with, according to
the expectations of the World Health Organization (WHO), may reach 350 million
people worldwide in 2025. Experimental and clinical studies suggest that the
oxidative stress is involved in the pathogenesis and progression of this disease. The
species Croton cajucara BENTH (CcB) is a plant from the Amazon region and its
leaves and stem-bark are used by the population in the form of tea or capsules for
treating different diseases, including DM. The aim of the present study is to observe
the effect of the aqueous extract of the bark of Croton cajucara BENTH in relation to
oxidative stress, assessing its potential in vitro antioxidant activity, using the Xantina
Oxidase (XO) enzyme-based system and, its in vivo activity, using the a survival
assay in yeast Saccharomyces cerevisiae cells, and by treating diabetic rats, which
are induced with streptozotocyne (STZ). We evaluated the glucose-, cholesterol- as
well as triglycerides levels, and enzyme indicators Aspartate aminotransferase (AST),
Alanine aminotransferase (ALT) and Alkaline Phosphatase (FA) for evaluation of liver
function. Due to the relation of DM and levels of lipoperoxidation, we standardized
and validated a methodology for determination of Malonedialdehyde (MDA) by high
performance liquid chromatography (HPLC). Also the activity of the endogenous
antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx) was evaluated. Male Wistar rats,
weighing between 250 and 350 grams, were used, which were divided in the
following groups: control group (CO); control group with 5 days of CcB treatment
(CO5d); diabetic group with 20 days of CcB treatment (CO20d); diabetic group (DM);
diabetic group with 5 days of CcB treatment (DM5d); diabetic group with 20 days of
CcB treatment (DM20d). DM was induced by intraperitoneal administration of STZ at
a dose of 70mg/Kg. Results show a dose- and volume-dependent antioxidant
capacity in the XO enzymatic assay, and in vivo with yeast S. cerevisiae. CcB, using
the experimental model of DM, had no effect on variations of the weight, but
presented a stronger trend in reducing levels of blood glucose, cholesterol and
triglycerides in diabetic rats treated for 5 days, and showed also a reduction of ALT
and FA levels. In addition, measuring MDA levels by HPLC, a drop in MDA-levels
could be shown in both diabetic groups treated with CcB. However, no significant
changes were observed in GPx. Based on these results, we believe that the Croton
cajucara BENTH plant have an antioxidant activity in the studied models.
Key-Words: Diabetes Mellitus, Croton cajucara BENTH, Oxidative Stress and HPLC.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Efeito da hiperglicemia na formação da proteína glicosilada e da auto-
oxidação da glicose, bem como a formação das espécies ativas de oxigênio (EAO) e
o aumento da via do sorbitol. GSH- glutationa reduzida ...........................................34
Figura 2. Atuação da estreptozotocina nas células pancreáticas beta (produtoras de
insulina).....................................................................................................................37
Figura 3. Redução do oxigênio molecular (O
2
) na mitocôndria até a formação de
água (H
2
O)................................................................................................................41
Figura 4. Decomposição catalítica pelos íons Fe
2+
do peróxido de hidrogênio ou
hidroperóxidos, com conseqüente formação de radicais hidroxil (OH
) ....................42
Figura 5. Representação esquemática da reação da LPO.......................................44
Figura 6. Vista geral da planta Croton cajucara BENTH em seu ambiente natural..50
Figura 7. Vista geral das folhas de Croton cajucara BENTH....................................51
Figura 8. Cascas do caule do Croton cajucara BENTH............................................52
Figura 9. Componentes da raiz, casca e folhas do Croton Cajucara BENTH ..........53
Figura 10. Substâncias isoladas da folha do Croton Cajucara BENTH....................54
Figura 11. Fases de crescimento de uma levedura selvagem quando iniciada em
meio completo...........................................................................................................61
Figura 12. Esquema do ensaio para medir atividades antioxidantes utilizando o
sistema da Hipoxantina/Xantina Oxidase..................................................................71
Figura 13. Reação do ácido salicílico com os radicais hidroxila formando 2,3- e 2,5-
DHBA ........................................................................................................................74
Figura 15. Pontencial antioxidante in vitro de várias concentrações e volumes de
EAC de CCB. ............................................................................................................87
Figura 16. Potencial antioxidante in vitro do CcB.....................................................89
Figura 17. Dispersão dos Dados do Potencial antioxidante in vitro do CcB
correlacionando as variáveis de DHBA, dose e concentração..................................89
Figura 18. Potencial antioxidante in vivo do CcB......................................................90
Figura 19. Diferenças médias dos pesos corporais e Intervalo de Confiança 95%..92
Figura 20. Diferenças médias para os níveis glicêmicos e Intervalo de Confiança
95%...........................................................................................................................93
Figura 21. Diferenças médias para os níveis de colesterol e Intervalo de Confiança
95%...........................................................................................................................94
Figura 22. Diferenças médias para os níveis de triglicerídeos e Intervalo de
Confiança 95%..........................................................................................................95
Figura 23. Médias e desvios padrão das médias para os níveis de aspartato-
aminotransferase.......................................................................................................97
Figura 24. Diferenças médias e desvios padrão das médias para os níveis de
alanina-aminotransferase..........................................................................................98
Figura 25. Diferenças médias e desvios padrão das médias para os níveis de
Fosfatase Alcalina.....................................................................................................99
Figura 26. Cromatogramas de MDA.......................................................................102
Figura 27. Diferenças médias e desvios padrão das médias para as áreas
cromatográficas de concentração de MDA, tendo sido realizadas 3 mensurações por
dia em 3 dias distintos para avaliar o método. ........................................................103
Figura 28. Médias ± desvios padrão das médias para os níveis de Malondialdeído
................................................................................................................................104
Figura 29. Médias ± desvios padrão das médias para os níveis de Glutationa
Peroxidase ..............................................................................................................105
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Pontencial antioxidante in vitro de várias concentrações e volumes de EAC
de CCB......................................................................................................................86
Tabela 2. Coeficientes das variáveis de Regressão Linear Múltipla para o desfecho
DHBA (%)..................................................................................................................88
Tabela 3. Correlação de Pearson para percentagem de DHBA, dose e concentração
de EAC de CcB.........................................................................................................88
Tabela 4. Médias Basais dos grupos experimentais.................................................91
Tabela 5. Peso Corporal...........................................................................................92
Tabela 6. Níveis glicêmicos. .....................................................................................93
Tabela 7. Níveis de colesterol...................................................................................94
Tabela 8. Níveis de triglicerídeos..............................................................................95
Tabela 9. Atividade das Aminotransferases Hepáticas.............................................96
Tabela 10. Atividade da enzima Glutationa Peroxidase (GPx). ..............................105
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ROO˙ Radical peroxil
°C Graus Celsius
AAA Ácido acetil aleuritólico
ALT Alanina-aminotrasferase
AST Aspartato-aminotrasferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CcB Croton cajucara BENTH
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CO Controle
CO 5d Controle tratado por 5 dias
CO 20d Controle tratado por 20 dias
CTN Trans-crotonina
Cu
2+
Íon Cobre
CuSO
4
Sulfato de cobre
CuZnSOD SOD cobre e zinco
d/L Decilitro
DCTN Trans-dehidrocrotonina
DHBA Dihidroxi-ácido-benzóico
DM Diabetes Mellitus
DM 5d Diabético tratado por 5 dias
DM 20d Diabético tratado por 20 dias
DMSO Dimetilsulfóxido
DNPH Dinitrofenihidrazina
e
-
Elétron
EA Extrato aquoso
EAC Extrato aquoso da casca
EAO Espécies Ativas de Oxigênio
EDTA Ácido etilendiamminotetraacetico
FA Fosfatase alcalina
Fe
2+
Íon ferro
FeSOD SOD ferro
g Grama
GPx Glutationa Peroxidase
GSH Glutationa Reduzida
GSSH Glutationa Oxidada
H
2
O Água
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
HCl Ácido Clorídrico
HClO
4
Ácido perclórico
HPLC High Perfornance Liquid Chromatography
KCl Cloreto de Potássio
Kg Quilograma
L Litro
LPO Lipoperoxidação
M Molar
MDA Malondialdeído
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
mmol Micromol
MnSOD SOD manganês
NaCl Cloreto de Sódio
NAD Adenina dinucleotideo
NADP Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato
NADPH Fosfato nicotinamida adenina dinucleotídeo
NaHCO
3
Bicarbonato de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
O
2
Oxigênio
O
2
Radical ânion superóxido
OH Radical Hidroxila
P Fosfato
pH Potencial de Hidrogênio
PKA Proteína quinase A
POD Piruvato oxidase
RL Radical Livre
ROOH Peróxido orgânico
rpm Rotação por minuto
SOD Superóxido Dismutase
STZ Estrepzotocina
TBA Ácido tiobarbitúrico
t-BOOH Hidroperóxido de tert-butila
U Unidade
v/v Volume por volume
Zn
2+
Zinco
µ Micra
µg Micrograma
µl Microlitro
XO Xantina Oxidase
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO.......................................................................................................................................22
1 REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................................................................27
1.1 Diabetes Mellitus (DM).................................................................................................................27
1.2 Diabetes Mellitus Experimental....................................................................................................35
1.3 Espécies Ativas de Oxigênio e Estresse Oxidativo.....................................................................38
1.4 Diabetes Mellitus e o Estresse Oxidativo ....................................................................................47
1.5 Croton cajucara BENTH ..............................................................................................................48
1.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.....................................................................................56
1.7 Levedura Saccharomyces cerevisiae como Modelo de Estudo..................................................59
1.7.1 Defesas antioxidantes da levedura Saccharomyces cerevisiae ..........................................61
2 OBJETIVOS........................................................................................................................................64
2.1 Objetivo Geral..............................................................................................................................64
2.2 Objetivos Específicos...................................................................................................................64
3 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................................67
3.1 Delineamento da Pesquisa..........................................................................................................67
3.2 Animais ........................................................................................................................................67
3.3 Considerações Bioéticas .............................................................................................................68
3.4 Delineamento Experimental.........................................................................................................68
3.5 Marcação e Pesagem..................................................................................................................69
3.6 Indução do Diabetes Mellitus.......................................................................................................69
3.7 Preparação do Extrato Aquoso da Casca do caule de Croton cajucara BENTH........................69
3.8 Avaliação do Potencial Antioxidante in vitro do Croton cajucara BENTH pelo sistema enzimático
Xantina Oxidase por HPLC................................................................................................................70
3.9 Avaliação do Potencial Antioxidante in vivo do Croton cajucara BENTH através da levedura de
Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................................75
3.9.1 Meios de cultura e soluções.................................................................................................75
3.9.2 Detecção da atividade antioxidante in vivo em Saccharomyces cerevisiae........................75
3.10 Morte dos Animais .....................................................................................................................76
3.11 Obtenção do Plasma e Determinação da Glicemia, Colesterol e Triglicerídeos.......................76
3.12 Atividade das Aminotransferases (AST, ALT e FA) – Provas de Integridade Hepática............77
3.13 Preparo do Homogeneizado......................................................................................................78
3.14 Quantificação das Proteínas......................................................................................................79
3.15 Determinação do Estresse Oxidativo ........................................................................................79
3.15.1 Mensuração de Malondialdeído (MDA) por HPLC.............................................................79
3.15.2 Atividade da Glutationa Peroxidase (GPx).........................................................................80
3.16 Análise Estatística......................................................................................................................81
4 RESULTADOS....................................................................................................................................83
4.1 Potencial Antioxidante in vitro do Croton cajucara BENTH pelo sistema enzimático Xantina
Oxidase por HPLC.............................................................................................................................83
4.2 Atividade Antioxidante in vivo do Croton cajucara BENTH através da levedura Saccharomyces
cerevisiae...........................................................................................................................................90
4.3 Avaliações Basais........................................................................................................................91
4.4 Peso Corporal..............................................................................................................................91
4.5 Níveis de Glicemia, Colesterol e Triglicerídeos...........................................................................93
4.6 Provas de Função Hepática através da atividade das transaminases AST (aspartato-
aminotransferase), ALT (alanina-aminotransferase) e da FA (Fosfatase Alcalina) ..........................96
4.7 Determinação do Estresse Oxidativo.........................................................................................100
4.7.1 Mensuração de MDA (malondialdeído) via HPLC..............................................................100
4.7.2 Glutationa Peroxidase (GPx)............................................................................................. 105
5 DISCUSSÃO.....................................................................................................................................107
CONCLUSÃO ......................................................................................................................................123
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................................126
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO__________________
O Diabetes Mellitus (DM) é uma doença que apresenta elevada incidência e
prevalência na população em diversas partes do mundo. É uma doença que
acomete diversos sistemas corporais com complicações freqüentes, decorrentes das
alterações teciduais e vasculares, manifestando-se através de doença vascular
periférica, doença isquêmica cardíaca e doenças cerebrovasculares
[1]
.
No Brasil, estima-se a existência de 6 milhões de diabéticos, metade dos quais
faz acompanhamento nas Unidades Básicas do Sistema Único de Saúde (SUS)
[2]
.
O DM emergiu como uma das principais ameaças à saúde mundial. A incidência
crescente do diabetes em indivíduos jovens é particularmente preocupante, pois a
doença pode evoluir por anos
[3]
e, há evidências de que o estresse oxidativo
aumente as complicações diabéticas, o que indica o seu envolvimento na instalação
e desenvolvimento da doença
[4, 5]
.
O DM é uma doença metabólica que se caracteriza pelo aumento da glicose
sangüínea, produzindo sérias conseqüências ao organismo, como aumento na
formação de Espécies Ativas de Oxigênio (EAO), que causam alterações no balanço
intracelular, razão pela qual se valoriza a importância da análise do real papel dos
antioxidantes sobre o DM
[6]
.
Com a dicotomia do metabolismo oxidativo, entre a geração e a varredura de
EAO, é intuitivo pensar no estresse oxidativo como uma forma de aumento na
produção ou redução da clearance de EAOs, devido ao enfraquecimento dos
mecanismos de defesa antioxidante. Enquanto esse paradigma pode ser esclarecido
Introdução 23
em diversas doenças humanas, como na arteriosclerose e na lesão miocárdica da
isquemia-reperfusão, no DM ainda não foi avaliado e há evidências que a rota de
defesas antioxidantes permanece ativa, se não hiperativa, na resistência insulínica e
diabetes
[6]
.
O envolvimento das EAO como fatores de lesão da membrana celular, dos ácidos
nucléicos e das proteínas constituintes da célula, gerando inúmeras doenças, vem
se confirmando através dos recentes estudos
[7]
. As fontes exógenas de geração de
EAO incluem radiação, fumo, estresse, medicamentos e substâncias como
xenobióticos, compostos azo aromáticos e bipiridil
[8]
.
Nas membranas mitocondriais, encontram-se as proteínas transportadoras de
elétrons, principalmente os citocromos, que reduzem uma molécula de oxigênio à
água durante o processo da respiração celular. Essa redução requer quatro
sucessivas transferências de elétrons. Esta teoria foi denominada de redução
univalente. Dois desses intermediários são chamados de radicais livres. São eles: o
ânion superóxido (O2
-
) e o radical hidroxil (OH
)
[4]
.
Para proteger o organismo destas EAO e do estresse oxidativo existem os
antioxidantes endógenos, como a catalase, glutationa peroxidase, superóxido
dismutase e, antioxidantes que também podem ser exógenos como a vitamina A, a
vitamina E e o ácido ascórbico. Vários autores descrevem ainda que os fitoterápicos,
entre eles os bioflavonóides, teriam também uma ação antioxidativa. Alguns
flavonóides, como a rutina e a quercetina, estão sendo estudados e apresentaram
bons resultados como antioxidantes
[9-11]
.
Estudos mostram que várias doenças são associadas com danos oxidativos, pela
formação de EAO e outros radicais livres, que podem ser produzidos por fontes
exógenas ou endógenas. Uma forma adequada de amenizar essa situação é o uso
de substâncias antioxidantes
[4]
.
Muitas plantas são citadas quanto aos seus efeitos antioxidativos
[12]
. A espécie
Croton cajucara BENTH (Euphorbiaceae) é encontrada na região Norte do Brasil e,
na Amazônia, onde é popularmente conhecida como Sacaca, que significa “feitiço”
na língua Tupi, representa um recurso medicinal de grande importância no
tratamento de várias doenças
[13]
.
Introdução 24
A folha e a casca do caule dessa planta são utilizadas de forma empírica pela
população na forma de chá, para o tratamento do DM, diarréia, malária, febre e
distúrbios gastrintestinais, renais, hepáticos e no controle de níveis elevados de
colesterol
[13]
.
O Croton cajucara BENTH (CcB) é uma de muitas plantas que são indicadas em
tratamentos de disfunções hepáticas, controle de hiperglicemia e hiperlipidemia
usadas pela população, sem que haja dados precisos quanto às interações e
posologia para sua utilização. Mesmo sendo recomendada para tratamento de
alterações hepáticas, não estão claros seus prováveis efeitos positivos ou negativos
sobre a função hepática, assim como sua ação anti ou pró-oxidante e sua atividade
mutagênica
[14]
.
Os estudos de ação do CcB iniciaram a partir da verificação do seu uso freqüente
pela população do Norte do país, visando a comprovação dos efeitos relacionados
ao seu uso prolongado e efeitos relacionados com casos de hepatite tóxica ocorridos
em Belém
[15]
.
Inúmeros métodos são aplicados para a determinação do potencial antioxidante
de compostos em ensaios laboratoriais
[16]
e uma tecnologia que está cada vez mais
incorporada às rotinas científicas, devido à sua apurada sensibilidade e eficiência, é
a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou, como é internacionalmente
identificada, HPLC – High Perfornance Liquid Chromatography)
[17]
.
Pretende-se, neste estudo, mimetizar o uso terapêutico da planta pela população
humana em um modelo animal de ratos Wistar diabéticos e avaliar se a casca do
Croton cajucara BENTH tem atividade antioxidante, através de estudos químicos e
biológicos.
Para avaliar a capacidade antioxidante in vitro do extrato aquoso de Croton
cajucara BENTH foi empregada uma metodologia a base da enzima Xantina
Oxidase, através de HPLC e, por meio de ensaios biológicos in vivo, a levedura
Saccharomyces cerevisiae, previamente tratada com CcB para avaliar o percentual
de sobrevivência à exposição ao agente oxidante peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
determinando assim, o potencial antioxidante. Utilizou-se também, um modelo
animal com ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina, para verificar o efeito da
Introdução 25
administração do extrato aquoso da casca de Sacaca, avaliando o peso corporal dos
animais; o nível de glicemia, colesterol e triglicerídeos; a atividade das
aminotransferases AST (aspartato-aminotransferase) e da ALT (alanina-
aminotransferase) e da FA (Fosfatase Alcalina) no plasma, como indicadores de
dano hepático. Objetivou-se ainda, desenvolver, adaptar e implantar uma
metodologia para medir o malondialdeído (MDA) via HPLC em homogeneizados de
fígado, um dos principais produtos formados pelo processo oxidativo de
hidroperóxidos lipídicos
[16]
, empregado para avaliação do dano tecidual provocado
pela peroxidação lipídica, que está implicada em diversas doenças, incluindo o
Diabetes Mellitus. Também, a atividade da enzima Glutationa Peroxidase (GPx) foi
avaliada, pois faz parte de um importante sistema de defesa enzimático contra o
aumento de radicais livres
[18]
.
A natureza nos oferece uma fonte de inúmeros produtos naturais, representados
pela flora e fauna brasileira, que apresentam um extraordinário reservatório de
substâncias com potencial terapêutico. O CcB é uma planta utilizada empiricamente
pela população no tratamento de diversas enfermidades, o que a torna passível de
investigação para verificar suas possíveis propriedades antioxidantes.
REFERENCIAL TEÓRICO
1 REFERENCIAL TEÓRICO__________________
O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto a
civilização humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país e até mesmo nas
grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras livres,
mercados populares e encontradas em quintais residenciais
[15]
.
“Observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribuem de forma relevante para divulgação das virtudes terapêuticas
dos vegetais, prescritos com freqüência, pelos efeitos medicinais que
produzem, apesar de não terem seus constituintes químicos
conhecidos”
[15]
.
1.1 Diabetes Mellitus (DM)
As células do organismo necessitam de energia para se manterem vivas e para
realizar inúmeras reações intra e extracelulares. O ciclo metabólico inicia-se na
ingesta e na absorção dos nutrientes. A partir daí, a energia será estocada nos
grandes “reservatórios” corporais: o fígado, tecido adiposo e muscular. O tecido
hepático estoca a glicose absorvida sob a forma de glicogênio hepático e, com gasto
energético aumentado no metabolismo corporal, o glicogênio hepático é degradado
na forma de moléculas de glicose, que são liberadas na circulação e utilizadas pelas
células que as necessitam
[19]
.
Referencial Teórico 28
O tecido adiposo contribui na formação de energia através da liberação do ácidos
graxos e glicerol, a partir da degradação dos triglicerídeos. Este processo, a lipólise,
ocorre por intermédio da ação da enzima lipase
[20]
, pelo estímulo hormonal da
insulina, indutora do aumento intracelular do 2º mensageiro, a Adenosina
Monofosfato Cíclico (AMP Cíclico), a qual ativa a proteína quinase A (PKA), que por
sua vez ativa a lipase. Esta hidrolisa os triglicerídeos armazenados em glicerol e
ácidos graxos liberados na circulação e utilizados por diferentes tecidos corporais. O
glicerol, depois de fosforilado e oxidado, se isomeriza e ingressa na via glicolítica,
seja para forma glicose (gliconeogênese) ou para se transformar em piruvato e,
participar das reações de ciclo de Krebs. Os ácidos graxos são transportados,
ligados à albumina e, podem ser oxidados em uma série de reações, até
participarem da β-oxidação
[20]
.
O perfeito funcionamento dessa maquinaria metabólica, para a glicose entrar na
célula e participar no processo de formação de energia celular, depende da insulina
sangüínea, que se liga a um receptor de membrana celular específico e aumenta o
transporte da glicose sangüínea para o interior da célula. As alterações na ligação
insulina-receptor, dificultarão a entrada de glicose no interior celular, como nos
diabéticos que, conforme o tipo tem redução na secreção de insulina ou alteração na
sinalização intracelular, posterior à ligação insulina-receptor
[21]
.
Os primeiros relatos de DM datam da era egípcia. Entre os hebreus há relatos
com suspeita da ocorrência do diabetes gestacional. No entanto, somente cerca de
2000 mil anos depois, por volta de 70 d.C, Areteu da Capadócia, na Grécia,
descreveu o diabetes. Areteu observou que aquele silencioso problema desenvolvia
quatro complicações: muita fome (polifagia), muita sede (polidipsia), muita urina
(poliúria) e fraqueza (poliastenia) e quase sempre, as pessoas com esses sintomas
entravam em coma antes da morte. Era algo “grave e misterioso”. Afinal, mesmo
com a fartura de alimentos que entravam pela boca, a falta de energia corporal
permanecia
[22]
.
Desde Areteu, num período de 1600 anos, a Medicina não evoluiu no estudo do
diabetes. Só em 1670 é que o médico inglês Thomas Willis descobriu, provando a
urina de indivíduos que apresentavam os sintomas descritos anteriormente, que ela
era "muitíssimo doce, cheia de açúcar". Em 1815 o Dr. M. Chevreul demonstrou que
Referencial Teórico 29
o açúcar dos diabéticos era glicose. Por esta razão, os médicos passaram a provar a
urina das pessoas sob suspeita de diabetes e a doença passou a chamar-se
"diabetes açucarada" ou "Diabetes Mellitus". A palavra "Mellitus" provém do latim e
quer dizer "mel ou adocicado"
[22]
.
O DM, conhecido por afetar seres humanos desde os tempos antigos, foi descrito
como a doença que culminava em conseqüências calamitosas. Arateus (81-138
d.C.) escreveu sobre a “maravilhosa” natureza da doença, que consistia em
“desfazer o corpo em urina”, e era acompanhada por uma terrível sede que não
podia ser saciada. A concentração abundante de glicose carregada pela urina deu à
doença seu nome. Diabetes refere-se ao fluxo de fluido através do sifão e mellitus
vem da palavra mel. Na idade média, o DM era conhecido como “a doença da má
urina”
[23]
.
Posteriormente, em 1889, dois cientistas alemães, Von Mering e Minkowski,
descobriram que o pâncreas produz uma substância capaz de controlar o açúcar no
sangue e evitar os sintomas do diabetes. Não havia o conceito de hormônio ou
secreção interna. Em 1849, Arnold Adolph Berthold (1803-1861), fisiologista em
Goettingen, por meio de experiências realizadas em galos, demonstrou a existência
de vazamento de “alguma substância interna”
[22]
.
Mas foi Claude Bernard, quem usou pela primeira vez o termo “secreção interna”.
A denominação Endocrinologia entrou em uso no século XX, derivada de endon
(interno) e krino (separar), ambos do grego clássico. O termo hormônio foi utilizado
pela primeira vez pelo Prof. Ernest H. Starling. Nesta época já havia relatos de que o
mau funcionamento do pâncreas seria o responsável pelo diabetes
[22]
.
A definição do Diabetes Mellitus (DM) está baseada em critérios descritos por
Harris e Cahill (1978), dividindo-se em duas classes: DM tipo I, que compreende
10% do total de casos, caracterizado pela deficiência das células beta das ilhotas de
Langerhans do pâncreas em produzir a insulina e DM tipo II, abrangendo cerca de
90% do total de casos, caracterizando por uma resistência na captação da glicose
sangüínea
[24, 25]
.
Referencial Teórico 30
Outra forma atual de classificar o DM é por estágios de desenvolvimento,
incluindo estágios pré-clínicos e clínicos, estando neste último incluídos os estágios
avançados em que a insulina é necessária para controle ou sobrevivência
[25]
.
O DM é um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia
crônica e associadas a complicações, disfunções e insuficiência de vários órgãos,
especialmente olhos, rins, nervos, cérebro, coração e vasos sangüíneos
[25]
e
distúrbios no metabolismo dos glicídios, lipídios e proteínas, resultantes de
deficiências na secreção ou ação da insulina, ou ambas. Pode apresentar sintomas
característicos tais como sede, poliúria, visão turva e perda de peso e, em casos
mais graves, pode desenvolver cetoacidose, ou um estado hiperosmolar não-
cetônico que pode conduzir à letargia, coma e, na ausência de tratamento
adequado, à morte
[26]
.
O DM é uma doença endócrino-metabólica freqüente, de incedência crescente,
que afeta mais de 30 milhões de pessoas em todo o mundo
[27]
e continua a ser um
desafio terapêutico apesar dos avanços no seu tratamento e prognóstico no último
século, pois permanece como uma doença de alta morbidade e mortalidade. A
prevenção, o tratamento e a cura do Diabetes Mellitus são desafios de ordem
mundial, visto que se estima uma cifra 5,4% da população adulta mundial afetada
pela doença até 2025
[25, 28]
.
Dados sobre a incidência e prevalência do DM, no Brasil e no mundo, não são
muito acurados porém, sabe-se que mais de 18 milhões de americanos vivem com a
doença atualmente e aproximadamente 1,3 milhões de novos casos são
diagnosticados a cada ano
[28]
.
Em 2000, havia aproximadamente 171 milhões de diabéticos no mundo e estima-
se que este número aumente para 366 milhões em 2030
[29]
. No Brasil, segundo
estimativas do Ministério da Saúde, em 1996 havia aproximadamente 5 milhões de
diabéticos, sendo 90% destes do tipo II e 10% do tipo I
[2]
.
O “Diabetes Health Economics Study Groups” da Federação Internacional de
Diabetes, estima que em 2025, cerca de 300 milhões de pessoas apresentarão esta
doença
[30]
. Embora o DM tipo II seja o mais preocupante devido a sua prevalência
crescente nos últimos anos, o DM tipo I cresce paralelamente
[31]
.
Referencial Teórico 31
No Brasil, existem poucos estudos epidemiológicos sobre o DM tipo I
[31]
. Estudos
em três cidades do interior paulista, constataram a incidência de 7,6/100.000
habitantes naquela população
[32]
e em Londrina, no estado do Paraná, a taxa
encontrada foi de 12,7/100.000 habitantes
[33]
.
As complicações secundárias, segundo componente deste enfoque sobre o DM,
são decorrentes da exposição crônica do organismo a níveis elevados de glicose e,
são observadas em 30% a 50% dos pacientes com DM
[34]
. Resultam, também, no
comprometimento da qualidade de vida, na incapacidade para o trabalho e podem
provocar a morte prematura, além de onerarem excessivamente o sistema de
saúde
[29, 35]
.
A prevalência do diabetes vem crescendo de forma notável e o advento da
industrialização e urbanização populacional ocorrido nos últimos anos acelera este
processo
[31]
. As mudanças no estilo de vida reduziram a atividade física que,
juntamente com uma alimentação mais calórica, favorecem a ocorrência de
obesidade, estresse e hipertensão arterial
[36]
.
O DM está envolvido tradicionalmente com um distúrbio metabólico na geração e
conservação da energia e, mais recentemente, no metabolismo danificado do ácido
graxos e no depósito de gordura ectópica que conduzem à resistência insulínica
[5]
.
Esta doença apresenta uma variedade de alterações bioquímicas, mas a
fundamental é a redução da entrada de glicose nos tecidos periféricos e o aumento
na liberação de glicose circulante pelo fígado
[37]
. Antes de 1921, a principal causa de
morte entre os pacientes diabéticos era a cetoacidose diabética. Entretanto, desde a
descoberta da insulina, em 1921, a principal causa de morte entre os pacientes
diabéticos envolve as alterações dos grandes e pequenos vasos sanguíneos
[38]
.
Conforme Boundy (2004), as causas do diabetes tipos I e II ainda não são
totalmente conhecidas
[39]
e fatores genéticos podem estar influindo no
desenvolvimento desta doença.
Os distúrbios auto-imunes e infecções virais estão apontados como fatores de
risco para o DM tipo I. Outros fatores são:
-A obesidade, que contribui para a resistência à insulina endógena.
Referencial Teórico 32
-O estresse fisiológico ou emocional, que pode causar elevação prolongada dos
níveis dos hormônios do estresse (cortisol, epinefrina, glucagon e hormônio do
crescimento) e em seguida aumentar a glicose sanguínea e acentuar as demandas
impostas ao pâncreas.
-A gravidez, que causa ganho ponderal e aumenta os níveis do estrogênio e dos
hormônios placentários.
-Alguns fármacos, incluindo diuréticos tiazídicos, corticóides supra-renais e
anticoncepcionais orais, antagonizadores dos efeitos da insulina.
A exposição do organismo a níveis séricos elevados de glicemia durante anos é o
fator de risco principal para o desenvolvimento de complicações crônicas, como
doenças cardiovasculares e vasculares periféricas, retinopatia, nefropatia,
dermopatia diabética, neuropatia periférica e vasculopatia, sendo o controle rigoroso
da glicose, em níveis normoglicêmicos de fundamental importância para retardar ou
evitar as complicações secundárias do DM
[34, 39]
.
Em geral, a neuropatia periférica acomete as mãos e os pés e pode causar
parestesia ou dor. A neuropatia autônoma evidencia-se de várias maneiras,
incluindo-se gastroparesia (que retarda o esvaziamento gástrico e acarreta sensação
de náuseas e plenitude pós-prandial), diarréia noturna, disfunção sexual e
hipotensão postural
[39]
.
A hiperglicemia diminui a resistência do hospedeiro a infecções, porque a
concentração de glicose na epiderme e na urina favorece o crescimento bacteriano.
Por isso, o paciente é suscetível a infecções da pele e do trato urinário
[39]
. Alguns
autores acreditam que as complicações determinadas pelo DM em diversos tecidos
podem ser causadas pelo estresse oxidativo, podendo-se incluir a alteração da
condução nervosa, auto-oxidação da glicose sangüínea, formação de glicosilação
avançada e um aumento da enzima aldose redutase
[40]
.
Diversos fatores podem estar envolvidos nos mecanismos responsáveis pelas
alterações metabólicas decorrentes do DM e, a hiperglicemia se destaca como a
principal alteração clínica, pois contribui para o aumento nas ligações da glicose
circulante com as proteínas sangüíneas (principalmente a albumina), o qual é
Referencial Teórico 33
denominada glicosilação não enzimática
[41]
, bem como com a auto-oxidação da
glicose
[42, 43]
, conforme representado na FIGURA 1.
A contribuição do estresse oxidativo para o estabelecimento de um quadro de
neuropatia periférica tem sido bem estabelecida por estudos realizados por Cameron
et al.
[44]
, que determinam que o estresse oxidativo causado pelo DM leva a uma
diminuição do fluxo de sangue para a região endoneural, resultando em hipóxia para
essa região. Este aumento na formação de EAO impede um adequado suporte
neurotrófico e causa alteração no balanço intracelular, deficiência no aporte
energético, culminando na diminuição do mecanismo de transporte iônico.
Referencial Teórico 34
Figura 1. Efeito da hiperglicemia na formação da proteína glicosilada e da auto-oxidação da glicose,
bem como a formação das espécies ativas de oxigênio (EAO) e o aumento da via do sorbitol. GSH-
glutationa reduzida (adaptado de Van Dan
[45]
).
A importância do DM do ponto de vista social e econômico é inegável, devido às
altas taxas de morbidade, mortalidade e de incapacitação para o trabalho. Assim,
fica evidente que tal doença merece atenção e cuidados especiais no sentido de
uma detecção precoce dos indivíduos susceptíveis para que haja possibilidade de
intervenção profilática nos mesmos
[46]
.
Desta forma, a utilização de modelos animais experimentais torna-se de grande
valia para que o estudo no campo das doenças se difunda e possa colaborar
Referencial Teórico 35
principalmente na prevenção do processo auto-imunológico
[47]
. A utilização de
modelos animais, que expressam a doença de forma similar ao verificado em
humanos, proporciona um melhor entendimento da fisiopatologia, oferecendo
oportunidades de pesquisa na formulação de novas modalidades terapêuticas.
1.2 Diabetes Mellitus Experimental
Grande parte dos conhecimentos científicos que o homem adquiriu na área da
biomedicina visando, primordialmente, à saúde humana e à dos animais domésticos
foi possível, em grande parte, graças ao uso dos animais de laboratório em suas
pesquisas. Esta íntima relação entre pesquisa biomédica e uso de animais de
laboratório se deve, principalmente, ao conhecimento científico adquirido a respeito
destes animais
[48]
.
Animais de laboratório são definidos como aqueles criados e produzidos sob
condições ideais e mantidos em ambiente controlado, com conhecimento e
acompanhamento microbiológico e genético seguros, obtidos por monitoração
regular
[49]
.
Após vários anos de pesquisa, foram criadas numerosas linhagens de animais co-
sangüíneos e híbridos capazes de reproduzir as variáveis causadas por diferenças
genéticas e, mais recentemente, os animais foram classificados quanto ao “status”
sanitário ou ecológico, visando à prevenção de erros induzidos por diferenças
ambientais
[49]
. A padronização dos animais utilizados em pesquisa é indispensável,
pois diminui o número de animais necessários para atingir a exatidão ou
reprodutibilidade do experimento. Assim, o ambiente onde os animais são mantidos
e/ou criados deve prevenir erros induzidos por diferenças ambientais, denominados
padrão sanitário e, consequentemente, este deve ser definido conforme a relação
dos animais com o seu ambiente
[50]
.
Diversos modelos animais foram utilizados no estudo do DM experimental e
contribuíram para um melhor entendimento das causas, conseqüências e
tratamentos da doença. No primeiro estudo, envolvendo animais e alterações
metabólicas, foi removido o pâncreas de um cão e produzida uma condição clínica
Referencial Teórico 36
semelhante à apresentada por humanos. O mesmo modelo foi empregado por
Frederick Banting e Charles Best na Universidade de Toronto no ano de 1921, a
partir do qual descobriram a insulina e realizaram os primeiros estudos em busca de
uma terapêutica apropriada para tratar o DM
[51]
.
Considerando o DM pode ser transmitido geneticamente e pela demora na
instalação das alterações fisiológicas, os modelos experimentais podem ser
utilizados para aumentar a rapidez no desenvolvimento da doença
[19]
. Atualmente é
aceito que o DM tipo I se caracteriza pela destruição auto-imune das células beta
pancreáticas, responsáveis pela produção da insulina. A utilização de animais com
DM auto-imune e, mais recentemente, o aparecimento de modelos experimentais
transgênicos, que possuem a expressão imune para o desenvolvimento da doença,
tem ajudado a esclarecer as condições moleculares favoráveis à ocorrência em
humanos
[51]
.
Um dos principais problemas na geração do diabetes experimental em roedores
foi resolvido há alguns anos com a utilização da estreptozotocina, atuante direto na
indução da morte das células beta do pâncreas
[52]
.
A droga chamada estreptozotocina (STZ), é uma nitrosuréia isolada derivada da
bactéria Streptomyces griseus. Essa, quando utilizada em animais, determina uma
severa deficiência de insulina, verificando-se uma instalação imediata do quadro de
hiperglicemia. As experiências evidenciaram que as doses de STZ (podendo variar
de 50 a 100mg/kg de peso corporal) causam necrose das células beta e, o DM tipo I
se desenvolve em um ou dois dias, após a aplicação da droga
[52]
.
Este achado foi confirmado em estudo experimental realizado por Melo
[53]
, que
utilizou a STZ na indução do DM e ficou demonstrado que, 18 horas após a
aplicação da droga, houve a indução do DM. O mecanismo de ação da STZ é
semelhante ao de outra droga também utilizada para desenvolver o DM, o aloxano.
Após a administração do aloxano ou da STZ, ocorre destruição das membranas
celulares e indução de quebra no DNA, levando à ativação da enzima poli (ADP-
ribose) sintase e à depleção da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD)
[54]
. Esta
enzima está localizada no núcleo das células beta do pâncreas e necessita de NAD
para realizar o reparo do DNA nuclear. Um aumento na sua atividade pode levar à
Referencial Teórico 37
depleção do NAD intracelular, sendo impossível produzir insulina nas células beta do
pâncreas.
Os fenômenos citados anteriormente podem ser prevenidos através da
administração de nicotinamida e picolinamida, pois são substâncias que inibem a
ação da poli (ADP-ribose) sintase, ocorrendo assim uma homeostase nos níveis de
NAD intracelular e na produção de insulina
[55]
.
A formação de radicais livres parece ter implicação na destruição das células
beta, pois enzimas que conseguem neutralizar a formação destes radicais, como a
enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD), ao serem administradas em
animais que receberam a estreptozotocina diminuiam os efeitos diabetogênicos
determinados pela administração da droga
[56]
, conforme ilustrado na FIGURA 2.
Figura 2. Atuação da estreptozotocina nas células pancreáticas beta (produtoras de insulina).
Adaptado de Pickup e Williams
[51]
.
Like e Rossini desenvolveram o DM em camundongos após a aplicação de
repetidas doses subdiabetogênicas de STZ (5mg/kg de peso corporal). As alterações
decorrentes foram semelhantes às observadas em humanos, com grande
Referencial Teórico 38
quantidade de células inflamatórias nas ilhotas pancreáticas, sugerindo uma
resposta auto-imune, que influenciaria danos no DNA dos animais. A partir desses
achados, iniciaram-se os estudos com as linhagens de animais geneticamente
modificados para desenvolver o DM
[57]
.
Como o DM é considerado uma doença auto-imune, estudos recentes sugerem
que as EAO podem participar na sua patogênese
[58]
.
1.3 Espécies Ativas de Oxigênio e Estresse Oxidativo
O elemento oxigênio (símbolo químico O) existe como uma molécula diatômica,
O
2
. Acima de 99% do O
2
na atmosfera é composta por isótopos de oxigênio-16, mas
há traços de oxigênio-17 e oxigênio-18
[59]
.
Nos primórdios da Terra, os primeiros animais eram classificados como seres
anaeróbicos, pois existia uma quantidade restrita de oxigênio na atmosfera. Os
microorganismos anaeróbios ainda sobrevivem nos dias atuais, mas o seu
crescimento é inibido e podem ser freqüentemente destruídos quando expostos ao
oxigênio (O
2
) existente no ambiente (21%)
[4]
. Os descendentes desses seres
anaeróbios são aqueles que conseguiram se "adaptar" ao aumento nos níveis
atmosféricos de O
2
. Entretanto, outros organismos tiveram seu processo de
evolução envolvido com defesas antioxidantes para se protegerem da toxicidade do
O
2
[37]
.
Exceto por algumas espécies anaeróbicas e aerotolerantes, todos os organismos
requerem O
2
para produção eficiente de energia pelo uso da cadeia de transporte de
elétrons que, por fim, doam elétrons para o O
2
, como nas mitocôndrias de células
eucarióticas e nas membranas celulares de muitas bactérias
[59]
.
Todos os seres vivos necessitam de energia para continuar vivos e manter um
ambiente adequado para as células dos diversos tipos de tecido, mas, para que isso
ocorra, deve existir uma adequada cadeia de reações químicas. O termo
metabolismo se refere ao conjunto das reações químicas existentes dentro do corpo
humano, cujos produtos são continuamente degradados e sintetizados para manter
a célula viva
[37]
.
Referencial Teórico 39
Para que o metabolismo celular ocorra, faz-se necessário o uso de energia
derivada da oxidação dos nutrientes, a qual é dirigida para a formação de compostos
fosfatados de alta energia, dentre eles o mais importante é o adenosina trifosfato
(ATP). Assim, quando há necessidade de energia para a realização de exercícios,
ela é fornecida quimicamente, em forma de ATP, através da hidrólise de ATP
[60]
.
Todavia, o metabolismo do oxigênio também gera uma série de subprodutos reativos
e potencialmente tóxicos, conhecidos como radicais livres
[61]
.
No organismo, os radicais livres encontram-se envolvidos nos processos de
produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização
intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes. No entanto, seu
excesso apresenta efeitos prejudiciais, tais como a peroxidação dos lipídios de
membrana e agressão às proteínas dos tecidos e das membranas, às enzimas,
carboidratos e DNA. Dessa forma, encontram-se relacionados com várias doenças,
tais como artrite, choque hemorrágico, doenças do coração, diabetes mellitus,
catarata, disfunções cognitivas, câncer e AIDS, podendo ser a causa ou o fator
agravante do quadro geral
[62, 63]
.
As EAO se formam durante a redução do oxigênio à água na cadeia de transporte
de elétrons mitocondriais. O termo denominado de radical livre é determinado
quando uma espécie química, que pode ser um átomo, como o hidrogênio ou um
átomo de cloro, um metal de transição ou uma molécula, possui um elétron não
pareado no seu último orbital
[64]
. O elétron não pareado neste orbital confere uma
alta reatividade à molécula, a qual apresenta forte tendência a adquirir um segundo
elétron para este orbital. Essas espécies altamente reativas têm o potencial de
oxidar moléculas biológicas, incluindo proteínas, lipídios, glicídios e ácidos nucléicos.
Quantidades aumentadas de metabólitos oxidados destas moléculas têm sido
detectadas em pacientes com uma variedade de doenças
[65]
. A estabilidade do
radical livre é adquirida por remoção de elétrons de moléculas vizinhas, produzindo
um par eletrônico.
A reatividade química dos radicais livres é determinada pela molécula que
apresenta o elétron não pareado, podendo apresentar grande variedade nos
diferentes tipos de radicais. A forma que expressa e compara a reatividade química
é determinada pelo tempo de meia vida (t
1/2
) da espécie química, ou seja, um curto
Referencial Teórico 40
tempo de meia vida indica uma alta reatividade, sendo que o radical hidroxil parece
ser o mais reativo
[4]
.
Nas membranas mitocondriais se encontram as proteínas transportadoras de
elétrons, principalmente os citocromos, que reduzem uma molécula de oxigênio à
água durante o processo de respiração. A redução completa de uma molécula de
oxigênio à água requer quatro sucessivas transferências de elétron, duas dessas,
denominadas de redução univalente (FIGURA 3). Dois desses intermediários são
chamados de radicais livres, são eles o radical superóxido (O
2
-
) e o radical hidroxil
(OH
). A maior parte do oxigênio (aproximadamente 95%) recebe os quatro elétrons
de uma só vez, através do sistema oxidativo citocromo-oxidase, redução
tetravalente. Porém, em cerca de 5% dos casos, a redução é monovalente, ou seja,
a molécula de oxigênio recebe apenas um elétron de cada vez, proporcionando a
formação de intermediários reativos e tóxicos, denominados espécies ativas de
oxigênio
[66]
.
Referencial Teórico 41
Figura 3. Redução do oxigênio molecular (O
2
) na mitocôndria até a formação de água (H
2
O).
Várias espécies ativas de O
2
são formadas no processo. (Adaptado de Cohen, MV.)
[67]
O radical OH
é o mais deletério ao organismo, pois devido a sua meia-vida muito
curta, dificilmente pode ser seqüestrado in vivo. Estes radicais freqüentemente
atacam as moléculas por abstração de hidrogênio e por adição a insaturações
[62]
.
Essa espécie pode levar à injúria celular e de componentes estruturais do espaço
extracelular.
O radical OH
é formado no organismo principalmente por dois mecanismos:
reação de H
2
O
2
com metais de transição e homólise da água por exposição à
radiação ionizante
[68]
. O ferro reduzido (Fe
2+
) desenvolve uma importante rota na
geração de radicais tóxicos, particularmente quando reage com peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
)
[69]
. O radical hidroxil é formado quando o H
2
O
2
reage com o ânion
superóxido (O2
-
), com catálise de íons divalentes de metais de transição como ferro
e cobre, através da reação descrita por Haber-Weiss no ano de 1934
[4]
. É
Referencial Teórico 42
usualmente aceito que os efeitos tóxicos dos íons ferro são conseqüências da
decomposição catalítica pelos íons Fe
2+
do peróxido de hidrogênio ou hidroperóxidos
para a forma ativa do radical hidroxil, conforme reação (FIGURA 4):
Fe
2+
+ H
2
O
2
Fe
3+
+ HO
.
+ HO
-
Fe
2+
+ ROOH Fe
3+
+ RO
.
+ HO
-
Figura 4. Decomposição catalítica pelos íons Fe
2+
do peróxido de hidrogênio ou hidroperóxidos, com
conseqüente formação de radicais hidroxil (OH
)
[70]
.
Acredita-se que essas reações sejam o passo inicial de muitos processos de
danos causados por radicais livres, como lipoperoxidação, modificação oxidativa de
proteínas e lipoproteínas, e aumento de anomalias em cromossomos
[70]
.
A lipoperoxidação (LPO) é um processo natural de renovação das membranas
celulares. Entretanto, o estresse oxidativo aumenta a LPO e provoca severo dano
nas membranas celulares, promovendo aumento na fluidez da membrana e quebra
das funções secretórias e dos gradientes iônicos. A reação de oxidação pode ser
iniciada pelo radical hidroxil (OH
) ou pelo H
2
O
2
[71, 72]
.
Ao iniciar a lipoperoxidação, o radical livre remove um átomo de hidrogênio de um
ácido graxo poliinsaturado (FIGURA 5). Como o átomo de hidrogênio possui um
elétron, resta um elétron desemparelhado no átomo de carbono. Na fase de
propagação, acontecem duas outras reações: 1) o carbono radical do lipídio
poliinsaturado tende a se estabilizar por rearranjo molecular, produzindo dienos
conjugados, os quais, por sua vez, rapidamente reagem com o oxigênio formando
um radical peroxil; 2) o radical peroxil formado capta um próton de outra molécula de
lipídio formando um hidroperóxido. Esta última reação torna a se repetir inúmeras
vezes num processo de reação em cadeia. Na etapa final, dois radicais peroxil
reagem entre si, formando um tetróxido instável que se decompõe, dando origem ao
oxigênio singlete e a carbonilas excitadas, os quais podem emitir luz e serem
medidos em detectores de quimiluminescência.
Referencial Teórico 43
Uma etapa importante na degradação das membranas celulares é a reação das
EAO com a dupla camada de ácidos graxos insaturados gerando hidroperóxidos
lipídicos. Na quebra de tais hidroperóxidos, uma grande variedade de aldeídos pode
ser formada
[73]
. O malondialdeído (MDA), um tri-carbono composto pela cisão de
ácidos graxos insaturados peroxidados, principalmente ácido aracdônico, é um dos
principais produtos da peroxidação lipídica (lipoperoxidação)
[74]
.
Desde que o MDA em níveis elevados foi descoberto presente em várias
doenças, também o foi relacionado aos danos por radical livre e usado
extensamente como um índice de lipoperoxidação em ciências biológicas e
médicas
[75]
.
O mais freqüente método usado para determinar essa formação de MDA em
amostras biológicas é a espectrofotometria, após a reação com acido tiobarbitúrico
(TBA)
[76]
. Entretanto, o TBA não reage somente com o MDA, mas com muitos outros
compostos de origem biológica, porém, a derivatização do MDA com 2,4-
dinitrofenilhidrazina (DNPH) está sendo empregada para permitir uma determinação
mais específica deste composto, especialmente se combinado com sua separação,
usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
[77-79]
.
Os efeitos da lipoperoxidação sobre as biomembranas podem ser classificadas
em quatro grupos:
-mudanças no micro ambiente lipídico de enzimas ligadas à membrana e nos
canais iônicos e receptores, ativando ou inibindo a atividade dessas proteínas;
-formação de novos canais de permeabilidade;
-formação de ligações cruzadas entre proteínas e fosfolipídios, inativando-os
irreversivelmente;
-oxidação dos grupos -SH nos sítios ativos de enzimas ligadas à membrana,
ocasionando perda de suas funções.
Halliwell e Gutteridge definem a lipoperoxidação (LPO) como sendo uma
deterioração oxidativa dos lipídios poliinsaturados, ou seja, lipídios que contêm, no
mínimo, dois carbonos unidos por ligações covalentes duplas
[4]
. As membranas das
Referencial Teórico 44
células e das organelas são mais suscetíveis a LPO, pois contêm grande quantidade
de ácidos graxos poli-insaturados. Assim, o processo de lipoperoxidação envolve a
formação e propagação de radicais lipídicos, o consumo de oxigênio e determina um
rearranjo das duplas ligações nos lipídios. A eventual destruição dos lipídios da
membrana, produz uma variedade de produtos de degradação, incluindo álcoois,
cetonas, aldeídos e ésteres (FIGURA 5)
[80]
.
Figura 5. Representação esquemática da reação da LPO (modificado de Halliwell,1999)
[4]
Junto com as alterações de permeabilidade da membrana pode haver um
acúmulo de cálcio intracelular, o que ativaria outras enzimas cálcio-dependentes,
como a fosfolipase, ocasionando um ciclo vicioso. Além de ativar outras enzimas, há
um aumento na síntese de prostaglandinas, leucotrienos e fagocitose, o que pode
gerar aumento na destruição das membranas celulares
[81]
.
Como mecanismo compensador do processo oxidativo, o organismo possui um
sistema antioxidante, constituído por componentes enzimáticos e não enzimáticos,
que atuam conjuntamente na proteção celular. O sistema enzimático é considerado
a linha de defesa primária, uma vez que evita o acúmulo do ânion radical superóxido
e do peróxido de hidrogênio. Existem, também, as defesas secundárias que
Referencial Teórico 45
impedem a propagação da LPO e as terciárias, enzimas responsáveis pelo reparo
de danos já instalados
[4, 82]
.
Quando a substância age neutralizando as EAO, na fase de iniciação ou
propagação da LPO, levando à formação de um composto menos reativo, é
chamada de "scavenger". Ao passo que, se a substância antioxidante tiver a
propriedade de absorver a energia de excitação dos radicais, neutralizando- os, é
denominada de "quencher"
[4, 82, 83]
.
A distribuição das enzimas antioxidantes está intimamente relacionada com as
fontes de EAO, sendo assim, podemos notar a importância da existência das
defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas. Sem elas, o equilíbrio celular
seria alterado e facilitaria o surgimento de várias disfunções que poderiam levar a
sérios processos de doença.
A regulação das enzimas antioxidantes, necessária para manutenção da
homeostase celular em condições adversas ao organismo, depende de vários
fatores, como especificidade do órgão, idade, estágio de desenvolvimento, perfil
hormonal e disponibilidade de cofatores
[84]
.
O sistema enzimático encarregado da detoxificação das EAO é formado por
várias enzimas, das quais se podem destacar: superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx).
A SOD forma um grupo de enzimas, que catalisa a reação de dois ânions
superóxido (O
2
-
), com conseqüente formação de peróxido de hidrogênio, sendo
menos reativo e podendo ser degradado por outras enzimas
[85]
.
A SOD é classificada em três tipos distintos: SOD cobre e zinco (CuZnSOD),
presente no citoplasma das células de eucariontes; SOD manganês (MnSOD),
localizada na matriz mitocondrial e SOD ferro (FeSOD), que ocorre em bactérias
[85]
.
H
2
O
2
+ O
2
O
2
-
+ O
2
-
+ 2H
+
SOD
Reação 1:
Referencial Teórico 46
Outra enzima importante é a CAT. O peróxido de hidrogênio, formado na
dismutação do ânion superóxido, é transformado em água e oxigênio por ação
dessa enzima. Esta, por sua vez, tem uma ação muito específica, já que atua em
reações com peróxidos de hidrogênio, metila e etila
[86]
.
Reação 2:
Entre as peroxidases, que geralmente usam o grupo heme, se sobressai a
atividade da glutationa peroxidase (GP
X
), localizada no citosol e na matriz
mitocondrial. Ela catalisa a redução do peróxido de hidrogênio e do hidroperóxidos
orgânicos, através da oxidação da glutationa reduzida (GSH), que será por sua vez,
regenerada por ação da glutationa redutase com consumo de NADPH. Neste
processo de oxirredução, os grupamentos sulfidrilas doam dois hidrogênios para os
peróxidos, transformando-os em álcool e/ou água, formando glutationa dissulfeto
(GSSG)
[4, 85]
.
Reação 3:
Muitas plantas são citadas quanto aos seus efeitos antioxidativos, ou seja, são
capazes de proteger a célula ou tecidos de danos decorrentes de radicais livres ou
de lipoperoxidação. Entre os grupos de compostos vegetais que apresentam essa
capacidade estão os flavonóides, que são representados pela rutina e quercetina,
entre outras
[12]
. Esses flavonóides atuam em atividades antilipoperoxidativas,
antitumorais, antiinflamatória e antiplaquetária, assim como podem atuar como um
pró-oxidante
[10, 87]
. Existem indícios que a forma como um flavonóide responde ora
como um antioxidante ou como pró-oxidante, está intimamente ligada a
concentração e a fonte do radical livre
[10]
.
Assim como alguns trabalhos experimentais, utilizando quercetina, obtiveram
redução das lesões em tecidos, diminuição da peroxidação lipídica e menor
quantidade de colágeno, amenizando a fibrose
[11]
, outros demonstram atividade pró-
oxidativa quando o metal de transição era avaliado. Esses mesmos autores
questionam: se o comportamento ambíguo ocorreria em outras formas de
antioxidantes, ou seja esse fato é exclusivo para flavonóides. Nos últimos anos,
CAT
O
2
+ 2H
2
O
2H
2
O
2
2GSH + 2NADP
+
GSSG + 2NADPH
GR
R – OH + GSSG + H
2
O
R- OOH + 2GSH
GP
X
Referencial Teórico 47
vários fitoterápicos estão sendo investigados quanto a sua capacidade anti ou pró-
oxidativa, ação protetora ao dano da membrana lipídica celular e a atividade
mutagênica
[88]
.
Essas investigações são necessárias para discutir os mecanismos dos efeitos dos
antioxidantes e sua capacidade de interação com as membranas, esclarecendo
pontos ainda obscuros para a interface clínico-terapêutica.
1.4 Diabetes Mellitus e o Estresse Oxidativo
No Diabetes Mellitus existem consideráveis evidências de que o dano oxidativo
está aumentado, embora seu mecanismo ainda não esteja muito claro
[89]
. Uma das
teorias é a de que o aumento da concentração de açúcares no organismo causaria a
glicosilação de macromoléculas, o qual leva a uma modificação não enzimática
destas, diminuindo sua função biológica. Nesse processo são gerados EAO que
agirão por todo organismo promovendo o dano oxidativo
[90]
.
As principais mudanças metabólicas causadas pela hiperglicemia são os
aumentos no fluxo de glicose na via poliol, que leva a formação crescente de
radicais livres de oxigênio e a formação de produtos finais do processo de glicação
como a carboximetilisina, uma proteína do cristalino
[91]
. Existem também evidências
que a glicação por si só pode induzir a formação de radicais livres derivados de
oxigênio em eritrócitos de indivíduos diabéticos
[92]
.
Verificam-se relatos de aumento do estresse oxidativo no estômago e no fígado
dos animais diabéticos, bem como de alteração no fluxo sangüíneo da artéria
mesentérica superior que é influenciada pelo tempo de instalação da doença e pelo
aumento da glicose sangüínea
[93]
. Foi sugerido que, no DM, o estresse oxidativo é a
chave na patogênese das complicações vasculares, tanto microvascularmente como
macrovascularmente, e um marcador desses danos é uma disfunção endotelial.
Entretanto, a rota do estresse oxidativo é muito questionada por estudos de
intervenção com antioxidantes, que são em muitos casos mal sucedidos
[94]
.
A perda da atividade dos antioxidantes é realçada sensivelmente pelo estresse
oxidativo associado com EAO intracelulares. A hiperglicemia induzida produz um
Referencial Teórico 48
aumento de superóxidos inibindo a glicose-6-fosfatase dehidrogenase, uma enzina
taxa-limitadora da via pentose que é requisito para fornecer reduções equivalentes
para o sistema de defesa antioxidante e é requisito para formação do sistema
glutationa peroxidase – glutationa redutase. Adicionalmente, o sorbitol é
metabolizado em frutose via sorbitol dehidrogenase, aumentando a relação
NADH/NAD+. Este, promove o aumento da síntese de Diaglicerol (DAG) que ativa a
proteína quinase C, responsável por severas complicações patológicas do DM
[94]
.
Sendo assim, a hiperglicemia promove um aumento na formação de EAO,
presumivelmente derivadas da cadeia respiratória mitocondrial. A ação das EAO tem
uma rota central mediada por vários defeitos metabólicos associados com o estado
diabético. Consequentemente, a inibição da produção de EAO e/ou aumento da
varredura das EAO poderia ser uma forma terapêutica benéfica
[95]
.
1.5 Croton cajucara BENTH
Os usuários de plantas medicinais de todo o mundo, mantém em voga a prática
do consumo de fitoterápicos, tornando válidas informações terapêuticas, que foram
sendo acumuladas durante séculos. De maneira indireta, este tipo de cultura
medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos, envolvendo áreas
multidiciplinares, como botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem
os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial
[15]
.
O gênero Croton, pela classificação taxonômica, pertence à ordem Euphorbiales
da subfamília Crotonoideae que é um dos gêneros mais numerosos da família
Euphorbiaceae, possuindo representantes tanto medicinais, quanto tóxicos
[96, 97]
. No
Brasil, há mais de 300 das 700 espécies existentes desse gênero, muitas das quais,
têm suas propriedades químicas e/ou farmacológicas já conhecidas
[15]
.
O Croton cajucara BENTH distribui-se nas regiões Leste e Central da floresta
Amazônica, principalmente no Pará, junto ao estuário do Rio Amazonas, assim como
também no estado do Amapá. Já, no próprio estado do Amazonas, só é encontrado
em plantações cultivadas
[98]
.
Referencial Teórico 49
O CcB, de nome popular Sacaca, é uma planta arbustiva de casca purulenta,
folhas alternas, lanceoladas, olentes. As Euphorbiaceas têm importância na
medicina como fonte de toxinas e medicamentos. Resinas e diterpenos do croton
são usados em estudos experimentais de iniciação de tumores e podem ser úteis na
terapia do câncer. Devido à diversidade bioquímica da família, parece provável que
usos medicinais adicionais podem ser descobertos, uma vez que muitas pessoas na
América, Ásia e África utilizam essas plantas para diversos males. Algumas espécies
de croton são usadas como cicatrizante e antiinflamatório; para doenças do aparelho
digestivo, como antiviral, como antimicrobiano e antitumoral
[99, 100]
.
No estado do Pará, as folhas e cascas do caule dessa planta são utilizados em
forma de chá ou pílulas no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, distúrbios
gastrintestinais, renais, hepáticos e no controle de níveis elevados de colesterol
[14, 15,
101]
.
A Sacaca também é comercializada em farmácias de manipulação e neste caso o
pó das cascas do caule é vendido em cápsulas (concentração aproximada de
250mg). Já, as folhas são comercializadas livremente, para distúrbios do fígado e
auxílio na digestão de alimentos gordurosos. O pó das folhas é vendido também em
farmácias de manipulação, com indicação, além das anteriores, como ação
hepatoprotetora e para dietas de emagrecimento
[15, 102, 103]
.
A Sacaca é considerada uma planta de crescimento secundário, aparecendo em
clareiras recentes e terras abandonadas. Apesar de ser encontrada nas várzeas
alagadas, parece preferir as várzeas altas, mais protegidas de alagamentos
constantes.
É uma árvore resistente a pragas e que não necessita de solos ricos,
adaptando-se bem até aos solos de argila amarela, de fertilidade muito baixa, perto
de Manaus
[15, 103]
.
É uma árvore de 6 a 10 m de altura, de copa estreita e casca aromática e
pulverulenta. As folhas são simples, subcoriáceas, lisas na superfície superior, de 7
a 16 cm de comprimento (FIGURAS 6, 7 e 8)
[104]
.
Sua inflorescência, em racemos terminais com 9 cm de comprimento, apresenta-
se com 7 flores femininas na base e 12 masculinas na porção mediana terminal, de
cor amarelada. Já os frutos são cápsulas globosas de um pouco menos de 1 cm de
Referencial Teórico 50
comprimento, com uma semente preta em cada carpelo. A planta multiplica-se
apenas por sementes
[104]
.
A colheita da sacaca consiste na extração das folhas da árvore, normalmente
realizada a cada 3 meses, já que a planta é sensível demais ao sol forte para
permitir um período maior de desfolhagem. Fazendeiros locais preferem colher as
folhas velhas e mesmo amareladas por acreditarem que possuem melhores
propriedades medicinais (informação não confirmada cientificamente). Uma planta
de 4 anos produz 10 quilos de folhas por ano
[104]
.
Figura 6. Vista geral da planta Croton cajucara BENTH em seu ambiente natural
[105]
.
Referencial Teórico 51
Figura 7. Vista geral das folhas de Croton cajucara BENTH
[104]
.
Referencial Teórico 52
Figura 8. Cascas do caule do Croton cajucara BENTH
[105]
.
Em alguns países de clima tropical como o Brasil, a abundância de plantas
medicinais oferece acesso a diversos produtos utilizados, através da automedicação,
na prevenção e tratamento de doenças. Além disso, a utilização de plantas como
meio curativo, é uma atividade altamente difundida e popular, às vezes, empregada
de maneira equivocada e até mesmo malévola, afinal muitas plantas possuem
princípios tóxicos e o seu uso indiscriminado pode causar sérios problemas
[104]
.
Inúmeros casos de hepatite tóxica foram notificados em hospitais públicos da
região Amazônica devido ao uso prolongado dessa planta
[15]
. A disseminação de
uso tem chegado a lugares distantes no país, como em nosso estado, na cidade de
Caxias do Sul, Rio Grande do Sul, onde também houve relatos de casos de hepatite
fulminante, conforme comunicação pessoal do Dr. Milton Bertelli, médico
Gastroenterologista Hepatologista e professor da Universidade de Caxias do Sul,
que nos motivou neste estudo.
Referencial Teórico 53
Os extratos de plantas, praticamente todas as que contêm bioflavonóides,
apresentam uma significativa ação antioxidante, capaz de diminuir os efeitos nocivos
gerados por radicais livres e, conseqüentemente, o surgimento das doenças
associadas a eles.
Em estudos fitoquímicos, ao investigarem partes distintas da planta Croton
cajucara BENTH como raiz, casca do caule e folhas, verificaram que: a) a casca
apresentou-se rica em clerodanos do tipo diterpenos: trans-dehidrocrotonina (DCTN)
(FIGURA 9), trans-crotonina (CTN) (FIGURA 9), cis-cajucarina B e sacacarina;
b) nas plantas jovens (até 18 meses) o triterpeno ácido acetil aleuritólico (AAA)
(FIGURA 9) se apresenta em maior concentração na casca do caule; c) o diterpeno
CTN não está presente, onde o DCTN se encontra em alta concentração (1,4% em
casca seca), detectado em plantas adultas com idade de 4 a 6 anos, enquanto
plantas com 3 anos de idade tem somente 0,26% de diterpenos
[106]
.
O
H
O
O
O
H
trans-crotonina
O
H
O
O
O
trans-dehidrocrotonina
H
O
O
H
COOH
Ácido acetil aleuritólico
Figura 9. Componentes da raiz, casca e folhas do Croton Cajucara BENTH
[15]
.
A atividade farmacológica do maior componente do extrato da casca (DCTN) tem
sido extensivamente estudada sendo que foram detectados efeitos antinflamatório,
analgésico, antiulcerogênico, hipoglicêmico e hipolipidêmico
[107]
. O chá da casca de
CcB produziu redução na glicose plasmática, com diminuição de peso corporal,
sugerindo uma atividade hipoglicêmica desta espécie
[108]
.
Em estudos realizados com as folhas do CcB foi possível isolar e caracterizar três
esteróides (-sitosterol, estigmasterol e 3,o-glicopiranosil--sitosterol), dois
Referencial Teórico 54
flavonóides (3,7,4-tri-o-metilcanferol e 3,7-di-o-metilcanferol) e um diterpeno do tipo
19-nor-clerodano (cajucarinolida) (FIGURA 10)
[15, 103]
.
OH
H
H
beta-sinosterol
OH
H
H
estigmasterol
O
H
H
O
OH
OH
OH
OH
sitosterol-3-O-beta-glucosideo
O
OH O
OMe
MeO
OH
canferol 3,4',7-dimetil eter
O
OH O
OMe
MeO
OMe
canferol 3,4',7-trimetil eter
O
O
O
O
OH
O
H
H
cajucarinolida
Figura 10. Substâncias isoladas da folha do Croton Cajucara BENTH
[15]
.
Essas substâncias foram submetidas à avaliação de atividade antinflamatória e
antiálgica e, para tanto, diversos testes foram feitos, comprovando que os
compostos t-CTN e AAA agem inibindo diferentes compostos inflamatórios,
demonstrando terem afinidade pelos mecanismos das prostaglandinas e da
histamina
[108]
.
Cavalcante e colaboradores
[109]
, comprovaram a eficácia hipoglicêmica e
hipolipidêmica da sacaca em ratos. Em 1995, Oliveira e cols.
[110]
, confirmaram o
efeito hipolipidêmico em coelhos. Com relação aos estudos fitoquímicos, o óleo
Referencial Teórico 55
essencial das folhas foi avaliado por Araújo e cols. em 1971
[111]
e, mais
recentemente, por Lopes e cols. em 1999
[112]
.
Outras atividades farmacológicas do CcB já foram evidenciadas, das quais pode-
se citar a atividade antinociceptiva dos extratos hexânicos, clorofórmico e metanólico
das folhas
[108]
e o efeito hipolipidêmico, correlacionado com a redução de índices
elevados de colesterol, foi evidenciado no extrato hidroalcoólico das folhas
[113]
.
Também foi verificado que o extrato hidroalcoólico das folhas não produziu
toxicidade em camundongos tratados oralmente com até 5g/kg (toxicidade
aguda)
[113]
.
Trabalhos demonstram que a administração oral de trans-desidrocrotonina é
efetiva em reduzir a hiperlipidemia induzida por uma dieta rica em gordura ou por
tiloxapol em camundongos, como também na hipertrigliceremia induzida por etanol e
sugere seu uso benéfico como um agente antiaterogênico
[114, 115]
. Em ratos
diabéticos induzidos pelo uso da estreptozotocina (STZ), a t-DCTN demonstrou
atividade antidiabética oral. O efeito hipoglicemiante da t-DCTN é maior quando
administrada uma hora antes da estreptozotocina (efeito preventivo). Quando a t-
DCTN foi administrada 48 horas após a STZ (efeito curativo), os níveis de glicose
sangüínea caíram em torno de 49 %
[116]
.
Em muitos casos, a pesquisa nasceu da experiência tradicional e sabedoria
popular e, a partir daí, os mecanismos e vias de ação destas plantas, foram sendo
descobertos, confirmando, nos estudos clínicos, a eficácia terapêutica de certas
plantas ou extratos derivados de plantas. Por outro lado, as formulações a base de
plantas medicinais também são importantes fontes de danos hepáticos in vivo, o que
não é surpresa, já que o fígado é predominantemente um local de “clearence”,
biotransformação e excreção de drogas
[117]
.
A busca por substâncias antioxidantes naturais vem aumentando nos últimos
anos, por isso que cada vez mais os grandes centros de pesquisa e indústrias
farmacêuticas têm investido neste tipo de pesquisa
[118]
, porém suas ações
antioxidantes exigem maiores estudos e comprovações com técnicas apuradas e
confiáveis.
Referencial Teórico 56
1.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Muitas metodologias podem determinar a concentração de radicais livres e EAO
em ensaios laboratoriais. Estas são empregadas para avaliação do dano tecidual
provocado pela peroxidação lipídica que está implicada em diversas doenças,
incluindo o Diabetes Mellitus, arterosclerose, câncer, doença de Parkinson, entre
outras
[16]
. A quantificação de malondialdeído (MDA), um dos principais produtos
formados pelo processo oxidativo de hidroperóxidos lipídicos, por HPLC é
recomendada devido a sua alta sensibilidade analítica e sua especificidade,
especialmente em estudos de lipoperoxidação
[16]
.
Também, a testagem farmacológica, chamada de “screening biológico”,
envolvendo a observação dos efeitos induzidos pelos extratos de plantas ou pelos
compostos purificados destes extratos em modelos in vitro, seguida por uma análise
mais detalhada da sua atividade
[119]
emprega a cromatografia líquida de alta
eficiência como uma de suas metodologias.
A cromatografia é definida como um método físico-químico de separação, no qual
os constituintes da amostra a serem separados são divididos entre duas fases, que
estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra
se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária,
os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que
cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando
em migrações diferenciais destes componentes
[120, 121]
.
A cromatografia líquida em coluna se divide em dois grupos: 1) a cromatografia
líquida clássica, feita em colunas de vidro, sob pressão atmosférica, com fluxo da
fase móvel devido à força da gravidade e 2) a cromatografia líquida de alta eficiência
ou em inglês “high performance liquid chromatography” (HPLC), que usa colunas e
uma pressão da fase móvel elevada, obtida com auxílio de uma bomba de alta
pressão que pode empurrar a fase móvel com vazão mais rápida
[122]
.
A técnica de HPLC utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser
totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que emprega
Referencial Teórico 57
pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase
móvel que é eluída sob altas pressões. Ela tem a capacidade de realizar separações
e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em
vários tipos de amostras, em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e
sensibilidade
[17]
.
A cromatografia tem cerca de 100 anos e ela tem se mostrado uma técnica
incrivelmente importante para a análise de materiais com as mais variadas
estruturas e propriedades físicas. Três cientistas ganharam o Prêmio Nobel devido a
seus trabalhos na área de cromatografia (Tiselius em 1948, e Martin e Synge em
1952).
A HPLC é uma técnica que atualmente emprega um conjunto de equipamentos
especiais. Eles se caracterizam por terem os seguintes componentes: 1)
Reservatório e sistemas de bombeamento da fase móvel; 2) Sistema de introdução
de amostra; 3) Sistema analítico (coluna cromatográfica); 4) Sistema de detecção; 5)
Sistema de registro e tratamento de dados. A fase móvel é bombeada por ação de
uma bomba, do seu reservatório para a coluna cromatográfica, passando antes por
uma pré-coluna. A amostra é introduzida no alto da pré-coluna e o eluente é
continuamente observado por um detector, podendo, em seguida, passar para um
coletor de frações. Ao sair da coluna, passa por um sistema de detecção, onde são
detectadas alterações de alguma propriedade física específica. Esta variação é
transformada num sinal elétrico, que é convenientemente registrado e tratado
matematicamente por um processador conveniente
[123]
.
A partir dos anos 70 foram desenvolvidos aparelhos mais sofisticados, que
levaram a uma maior resolução e mais alta separação cromatográfica. Assim tornou-
se possível uma melhor detecção da maioria dos compostos e a análise de traços
em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos, entre outras.
Dificuldades anteriores ou separações de compostos como corantes polares,
isômeros, drogas básicas e seus metabólitos viraram mera rotina
[123]
.
A grande reprodutividade na HPLC eleva ambas as análises (tanto qualitativa,
quanto quantitativa), a um alto nível de exatidão e precisão. As múltiplas vantagens
da HPLC fizeram desta técnica analítica uma das mais procuradas atualmente. As
Referencial Teórico 58
vantagens mais importantes da HPLC são, a sua resolução e a rapidez da
análise
[123]
. A necessidade de experiência no seu manuseio é um fator limitante, pois
para um operador atingir este nível de vivência necessita em geral 6 meses de
treinamento
[17]
.
A fase móvel empregada em HPLC deve ser de alto grau de pureza, normalmente
chamada de “grau HPLC”. Eles devem circular por tubos que conectam o
reservatório do solvente com a bomba, a bomba ao injetor, este com um ou mais
detectores e, eventualmente, com um coletor de frações ou válvulas de distribuição.
Estes tubos devem ser inertes e de acordo com o sistema cromatográfico feito de
aço inoxidável teflon ou outros polímeros, resistindo assim a altas pressões
[123]
.
A HPLC pode ser efetuada mantendo-se a composição da fase móvel constante
durante toda a análise cromatográfica. Nesse caso fala-se em HPLC isocrático. Em
outras oportunidades, por necessidade do sistema que está sendo analisado, é
conveniente alterar durante a análise cromatográfica, a composição da fase móvel.
Neste caso fala-se em HPLC com programação por gradiente
[123]
.
As separações cromatográficas produzem-se por um balanço de afinidades entre
a amostra, a fase móvel e a fase estacionária (coluna cromatográfica). As
propriedades químicas da fase móvel são as que estabelecem o tipo e a força de
interação entre o solvente e a amostra, e em conseqüência, são determinantes na
separação
[120]
.
O resultado de um ensaio cromatográfico é, por um lado, a obtenção de frações
separadas dos componentes da amostra, e por outro lado, a de um gráfico chamado
cromatograma, de cuja interpretação podem extrair-se conclusões qualitativas e
quantitativas. Este registro e a eventual manipulação se obtêm a partir do sinal
proveniente do detector por meio de um sistema de aquisição e processamento de
dados
[121]
.
Inúmeros métodos vêm sendo aplicados para determinação do potencial
antioxidante de compostos em ensaios laboratoriais
[16]
, e a tecnologia que está cada
vez mais incorporada às rotinas científicas, devido à sua apurada sensibilidade e
eficiência, é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
[17]
. Bem como, na
quantificação de malondialdeído (MDA), um dos principais produtos formados pelo
Referencial Teórico 59
processo de estresse oxidativo em hidroperóxidos lipídicos
[124]
, o HPLC é
recomendada devido a sua alta sensibilidade analítica e sua especificidade,
especialmente em estudos de peroxidação lipídica em amostras humanas
[16]
.
Também, na análise quantitativa de espécies reativas de oxigênio e dos
mecanismos antioxidantes, a HPLC vem demonstrando resultados primorosos e
efetivos.
1.7 Levedura Saccharomyces cerevisiae como Modelo de Estudo
Ensaios microbianos in vitro têm se mostrado muito adequados na triagem
rotineira de vários produtos naturais, sendo testes rápidos, sensíveis, econômicos,
reprodutíveis e apresentam resultados confiáveis na identificação da atividade
biológica. São utilizados e recomendados por conceituadas entidades
governamentais e órgãos de pesquisa dos Estados Unidos, Canadá e vários países
da Europa
[125]
.
O fato de a levedura Saccharomyces cerevisiae ser um dos microorganismos
mais estudados do ponto de vista genético e metabólico, levou-a a se tornar um dos
microorganismos mais utilizados em testes biológicos
[126, 127]
. A capacidade que a
levedura apresenta de crescer em condições aeróbicas e anaeróbicas permite,
também, o estudo durante diferentes situações metabólicas. Os dados obtidos nesse
tipo de teste apresentam uma correlação de aproximadamente 70% em relação ao
observado no homem
[125]
.
A levedura Saccharomyces cerevisiae é um fungo unicelular, com ciclo eucarioto
típico e completo, amplamente estudado e notavelmente semelhante às células de
mamíferos no que se referem às macromoléculas, organelas e proteínas com
homologia às proteínas humanas, tornando-a uma ferramenta importante nas
pesquisas sobre mutagênese, reparo de DNA e mecanismos que respondem ao
estresse oxidativo
[126, 128]
.
As leveduras podem crescer tanto em condições anaeróbias quanto aeróbias e,
portanto, são expostas continuamente as EAOs geradas como bioprodutos do
metabolismo. A Saccharomyces cerevisiae pertence ao grupo das leveduras
Referencial Teórico 60
anaeróbias facultativas. Isto significa que fermenta hexoses como a glicose e a
frutose, independente da concentração de oxigênio. A glicose é a principal fonte de
carbono da Saccharomyces cerevisiae, uma preferência que é mediada por um
complexo processo de repressão e ativação de genes e de proteínas, usualmente
conhecido como repressão da glicose ou repressão catabólica
[129, 130]
. Quando a
concentração de glicose cai para menos de 0,2% no meio, há a desrepressão das
enzimas que participam da biossíntese na mitocôndria e de outros genes
necessários para o crescimento respiratório
[129, 130]
.
Este crescimento apresenta fases distintas do ponto de vista metabólico e cinético
(FIGURA 11). Após um breve período de adaptação em meio rico (YPD – 2%
glicose), chamado de fase lag, as células iniciam uma divisão celular a cada hora e
meia (fase exponencial), com energia proveniente da fermentação da glicose. Ao
diminuir a disponibilidade de glicose no meio, ocorre a desrepressão catabólica
(transição diáuxica), na qual há uma parada transiente na divisão celular, enquanto
as células são preparadas para o metabolismo respiratório. Após, ela reassume a
divisão celular em um ritmo mais lento (uma divisão a cada três ou quatro horas),
utilizando o etanol como fonte de carbono produzido durante a fermentação (fase
pós-diáuxica). Quando todas as fontes de carbono forem exauridas, as células
entram na fase estacionária na qual podem sobreviver por muito tempo na ausência
de nutrientes
[131, 132]
.
Referencial Teórico 61
Figura 11. Fases de crescimento de uma levedura selvagem quando iniciada em meio completo
(Adaptado de Fuge e Werner, 1997)
[132]
.
1.7.1 Defesas antioxidantes da levedura Saccharomyces cerevisiae
A Saccharomyces cererevisiae apresenta uma variedade de mecanismos de
defesas antioxidantes. Possui duas enzimas superóxidos dismutases: SodCuZn,
codificada pelo gene SOD1, localizada no citoplasma; e a SodMn, codificada no
núcleo pelo gene SOD2 e que é localizada na mitocôndria
[133, 134]
. Ambas as
enzimas fazem a dismutação do radical superóxido a peróxido de hidrogênio. Duas
catalases foram identificadas, uma citosólica codificada pelo gene CTT1 e outra
perixossomal codificada pelo gene CTA1. As leveduras mutadas para ambas as
catalases são sensíveis a estresse por elevadas concentrações de H
2
O
2
[135]
.
Linhagens isogênicas de Saccharomyces cerevisiae deficientes em defesas
antioxidantes têm sido utilizadas para o estudo do mecanismo de ação de agentes
físicos e químicos que interferem com o estado redox da célula
[136, 137]
. Um método
utilizado para determinação da natureza das lesões induzidas por agentes
oxidantes, consiste em comparar a sensibilidade de mutantes deficientes em
enzimas antioxidantes com uma linhagem selvagem isogênica proficiente naquele
tipo de defesa antioxidante. Pode-se também combinar um oxidante conhecido,
como H
2
O
2
, t-BOOH (peróxido de terc-butil) e paraquat, com uma substância com
potencial antioxidante. O aumento da viabilidade celular ao tratamento estará
Referencial Teórico 62
sugerindo atividade protetora (antioxidante) e a diminuição da viabilidade a um efeito
deletério (pró-oxidante)
[138-140]
.
Tendo em vista as considerações postuladas com esse trabalho, pretendeu-se
avaliar a ação do Croton cajucara BENTH em animais diabéticos e avaliar seu
potencial antioxidante por HPLC e sobre a levedura de Saccharomyces cerevisiae.
OBJETIVOS
2 OBJETIVOS__________________
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo geral avaliar o potencial antioxidante e os efeitos
da administração do extrato aquoso da casca (EAC) do caule da planta amazônica
Croton cajucara BENTH sobre o estresse oxidativo no modelo experimental de
Diabetes Melittus.
2.2 Objetivos Específicos
-Avaliar o potencial antioxidante in vitro do extrato aquoso da casca do caule de
Croton cajucara BENTH com o método a base da enzima Xantina Oxidase,
empregando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
-Determinar a atividade antioxidante in vivo do EAC do caule de Croton cajucara
BENTH, utilizando diferentes linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae
selvagens e isogênicas, deficientes em produtos de genes envolvidos na resposta
ao estresse oxidativo.
-Comparar o peso corporal, os níveis de glicemia, colesterol e triglicerídeos dos
diversos grupos animais com e sem o uso de EAC de CcB em diferentes tempos do
tratamento.
-Verificar as funções de integridade hepáticas através da atividade das
aminotransferases AST (aspartato-aminotransferase), ALT (alanina-
Objetivos
65
aminotransferase) e da FA (Fosfatase Alcalina) no plasma dos animais, indicadores
de dano hepático.
- Desenvolver, adaptando e implantando a metodologia para medir MDA
(malondialdeído), via HPLC, em homogeneizados de fígado dos animais estudados,
avaliando esse marcador de estresse oxidativo.
-Quantificar a atividade da enzima antioxidante Glutationa Peroxidase (GPx) no
fígado dos animais dos diversos grupos do estudo.
MATERAIS E MÉTODOS
3 MATERIAIS E MÉTODOS___________
3.1 Delineamento da Pesquisa
Este estudo de caráter experimental quantitativo, empregou ratos normais e
diabéticos induzidos por estreptozotocina, tratados com extrato aquoso da casca
(EAC) do caule da planta amazônica Croton cajucara BENTH.
3.2 Animais
Para realização deste trabalho foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar,
com peso médio no início dos experimentos de 250 a 300g, provenientes do Biotério
do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul (UFRGS). Os animais foram mantidos durante o experimento na Unidade de
Experimentação Animal do Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, em caixas plásticas individuais, de 47x34x18cm, forradas com maravalha.
Os animais foram tratados diariamente com água e ração Nutripal (Moinhos
Purina, Porto Alegre, RS/Brasil) ad libitum composta por: 15,4% de proteína, 2,9%
de gordura, 60,5% de carboidratos, 3,9% de fibras, 5,3% de minerais e 12% de
água. As caixas foram limpas de acordo com a rotina do Centro de Pesquisa, sendo
mantidos em uma temperatura de 22 ± 4°C, em ciclo de 12 horas claro/escuro (luz
das 7 às 19 horas).
Materiais e Métodos
68
3.3 Considerações Bioéticas
Todos os procedimentos realizados seguiram em consonância com as normas
estabelecidas pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde contidas na Pesquisa
em Saúde e Direito dos Animais, de autoria do grupo de pesquisa e de Pós-
Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[141]
bem como o
preconizado no Principles for Research Involving Animals (NAS).
O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre sob o protocolo número 04-453.
3.4 Delineamento Experimental
O tempo de duração do experimento foi de 60 dias, a partir do dia da indução do
DM experimental, onde foram formados 6 grupos de animais. O número total em
cada grupo no final do estudo foi estabelecido pela sobrevivência dos animais.
1) Grupo controle (CO): estes animais normais receberam 1,5mL de água
destilada intragastricamente, diariamente, durante os últimos 20 dias (n=10).
2) Grupo controle + CcB 5 dias (CO5d): estes animais normais receberam 1,5mL
de extrato aquoso da casca do caule de Croton cajucara BENTH (concentração de
5%, intragastricamente), diariamente, durante os últimos 5 dias (n=10).
3) Grupo controle + CcB 20 dias (CO20d): estes animais normais receberam
1,5mL de extrato aquoso da casca de Croton cajucara BENTH (concentração de 5%,
intragastricamente), diariamente, durante os últimos 20 dias (n=10).
4) Grupo diabético (DM): estes animais diabéticos receberam 1,5mL de água
destilada intragastricamente, diariamente, durante os últimos 20 dias (n=10).
5) Grupo diabético + CcB 5 dias (DM5d): estes animais diabéticos receberam
1,5mL de extrato aquoso da casca do caule de Croton cajucara BENTH
(concentração de 5%, intragastricamente), diariamente, durante os últimos 5 dias
(n=10).
Materiais e Métodos
69
6) Grupo diabético + CcB 20 dias (DM20d): estes animais diabéticos receberam
1,5mL de extrato aquoso da casca do caule de Croton cajucara BENTH
(concentração de 5%, intragastricamente), diariamente, durante os últimos 20 dias
(n=10), que passaremos a denominar somente EAC de CcB.
3.5 Marcação e Pesagem
No início do estudo, os animais foram marcados no lóbulo da orelha e pesados
individualmente. Foi registrado o peso corporal inicial (momento da indução do DM),
bem como no momento da morte dos animais. Foi utilizada uma balança da marca
Sartoris
®
, com peso em gramas para a pesagem dos animais.
3.6 Indução do Diabetes Mellitus
O Diabetes Mellitus foi induzido por uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de
estreptozotocina (STZ) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) na dose de
70 mg/Kg de peso corporal
[142]
.
A estreptozotocina foi dissolvida em tampão citrato de sódio (0,1M, pH 4,5) e
ácido cítrico (0,1M, pH 4,5) e administrada na região abdominal esquerda do animal,
cerca de 10 minutos após a diluição em solução tampão.
Os animais do grupo controle receberam somente NaCl 0,9% i.p. no mesmo
volume utilizado para dissolver a STZ. O período do estudo foi de sessenta dias, a
contar do dia em que os animais diabéticos apresentaram uma glicemia sangüínea
acima de 250mg/dL, sendo considerado diabéticos.
3.7 Preparação do Extrato Aquoso da Casca do caule de Croton cajucara BENTH
A casca do caule de Croton cajucara BENTH utilizada no estudo é procedente da
cidade de Santarén no Estado do Pará - Brasil.
Materiais e Métodos
70
Para a preparação do extrato aquoso (EA) foi necessário triturar a casca do
Croton cajucara BENTH até virar pó. O chá foi preparado com 5g da casca triturada
do caule do CcB em 100mL de água destilada, fervida durante 10 minutos. Foi dado
para cada animal do grupo estudado, 1,5mL do chá intragastricamente (gavagem).
Os animais do grupo CO e DM receberam água destilada no mesmo volume com o
objetivo de também serem estressados com o procedimento de gavagem.
O chá foi administrado, nos 20 dias e nos 05 dias finais do estudo, aos grupos
CO20d, DM20d e CO5d, DM5d, respectivamente. No 60º dia os animais foram
mortos e retirando-se os fígados para posteriores análises.
3.8 Avaliação do Potencial Antioxidante in vitro do Croton cajucara BENTH pelo
sistema enzimático Xantina Oxidase por HPLC
Durante o processo de hidroxilação da Hipoxantina, que é transformada em
xantina e depois em ácido úrico, a enzima Xantina Oxidase produz também o íon
superóxido a partir do oxigênio e, peróxido de hidrogênio, a partir de água. Na
presença de Fe (III) e de EDTA, o íon superoxido reduz o Fe (III) para formar Fe (II),
que gera, numa segunda etapa, o peróxido de hidrogênio para formar os radicais
hidroxila, que são muito reativos (FIGURA 12).
A metodologia para determinar a concentração destes radicais hidroxila no teste é
baseada na reação dos radicais hidroxila com o ácido salicílico. Desta maneira, são
formados dois compostos estáveis: 2,3- e 2,5-dihidroxi-ácido-benzóico (2,3-DHBA e
2,5-DHBA) (FIGURAS 12 e 13), mensuráveis via HPLC
[119, 143]
.
Materiais e Métodos
71
N
N
N
N
N
N
N
N
OH
OH
COOH
COOH
COOH
FeIII/EDTA + OH
.
+ OH
-
+ FeII/EDTA
FeII/EDTA
FeIII (50 µM)/EDTA (500µM)
FeII/EDTA
FeIII/EDTA + OH
.
+ OH
-
FeIII/EDTA
+ FeII/EDTA
Hypoxanthine
(300µ M)
Xanthine
XANTHINE OXIDASE (18 mU)
Salycilic acid (2 mM)
2,3-DHBA
2,5-DHBA
Uric acid
N
N
N
N
OH
OH
Figura 12. Esquema do ensaio para medir atividades antioxidantes utilizando o sistema da
Hipoxantina/Xantina Oxidase (Owen et al., 1996)
[143].
A HPLC é uma técnica que atualmente emprega um conjunto de equipamentos
especiais. Eles podem diferir em características e grau de automação, porém, são
absolutamente necessários para uma execução conveniente. O reservatório,
recipiente que contém a fase móvel, pode estar integrado ao equipamento ou estar
externamente porém, deve sempre ser colocado alguns centímetros sobre o nível da
bomba. Pode-se usar como reservatório da fase móvel qualquer frasco de
laboratório de boa qualidade, preferencialmente deve ser de teflon ou outro polímero
conveniente, e com uma tampa adequada para prevenir o ataque de partículas
ambientais do sistema e da evaporação da fase móvel
[121]
.
Segundo Pompeiro
[123]
, as bombas utilizadas em HPLC têm características
totalmente especiais. As principais são de operar a pressões de até 500 atm com a
mesma precisão e exatidão de operações à pressão quase ambiente. As bombas
não devem ser corroídas pelas fases móveis empregadas.
Materiais e Métodos
72
A injeção da amostra é feita com o auxílio de uma válvula especial que permite a
introdução, com grande precisão e exatidão, de quantidades mínimas da ordem de
20 microlítros (µL) ou mais. Esta válvula permite introduzir a amostra na coluna
cromatográfica sem interromper o fluxo de solvente através do sistema. Ele deve ser
de fácil operação, inerte ao ataque químico e capaz de suportar altas pressões. A
amostra a ser analisada é geralmente dissolvida na fase móvel, sendo essa solução
aplicada no fluxo da fase móvel à sua entrada no inicio da coluna. Os volumes de
soluções de amostra estão compreendidos, em geral, entre 0,5 e 20 µL, contendo
uma massa de soluto entre 0,1 e 10 µg
[144]
.
A pré-coluna é uma unidade do equipamento de grande importância na
cromatografia líquida do tipo HPLC. Ela contém um enchimento com a mesma fase
estacionária do que a coluna cromatográfica, e tem a função de “saturador” da fase
móvel nesta mesma fase, impedindo assim o seu arrastamento na coluna analítica
pela fase móvel pura
[123]
.
Segundo Ciola
[120]
, a separação na HPLC é efetuada dentro das colunas
cromatográficas que são geralmente construídas em metais e projetadas para
trabalhar a pressões de até 500 atm. Suas dimensões dependem do processo
escolhido e elas podem ser separadas em colunas analíticas e colunas preparativas.
As colunas analíticas são destinadas à separação de pequenas quantidades de
materiais, não existindo, na maioria dos casos, o objetivo de isolar, para fins de
identificação dos outros, os materiais separados mas, somente a necessidade de
detectá-los para fins quantitativos ou qualitativos. Colunas preparativas são de
dimensões maiores e estão dirigidas aos processos de preparação e isolamento de
compostos para fins de identificação.
A fase móvel, também chamada de solvente tem um papel fundamental, já que
pode por si mesma modificar completamente a seletividade das separações na fase
móvel e é, por sua vez, o verdadeiro “motor” das separações na fase reversa. Assim
se explica que na HPLC é possível obter um número muito grande de diferentes
separações, utilizando a mesma coluna cromatográfica, variando somente a
composição da fase móvel. Nem todos os solventes são adequados para trabalhar
com HPLC; as fases móveis mais utilizadas na cromatografia líquida são misturas de
metanol, acetonitrila e água. Um solvente apropriado deve possuir: 1) alto poder
Materiais e Métodos
73
solubilizante das amostras; 2) baixa reatividade; 3) compatibilidade com o detector
utilizado; 4) adequado ponto de ebulição; 5) baixa viscosidade; 6) seguridade; e 7)
alto grau de pureza
[120]
.
Segundo Quattrocchi et al.
[121]
, o detector é a parte do equipamento
cromatográfico que permite ver ou localizar a posição de cada componente de uma
amostra na saída da coluna cromatográfica. Ele é o olho do sistema cromatográfico,
mede as mudanças de concentração ou a massa dos compostos da amostra
injetada que estão deixando a coluna. Um avanço considerável, aumentando a
sensibilidade, foi o desenvolvimento de novos tipos de detectores como os
eletroquímicos, os a base de fluorescência, e os fotômetros UV, que medem as
variações na absorbância da luz na região de 190 a 350 nm. Com base numa boa
sensibilidade, consegue-se detectar com estes detectores, compostos na ordem de
nanogramas. O detector UV-VIS é o mais usado em HPLC e possibilita medir
variações na absorbância da luz na região de 190 a 700 nm. Pode-se, também, usar
com gradientes de solventes e um detector muito pouco sensível a mudanças de
fluxo e de temperatura, com a única limitação de que estes sejam transparentes no
comprimento de onda de trabalho.
O resultado de um ensaio cromatográfico é, por um lado, a obtenção de frações
separadas dos componentes da amostra, e por outro lado, a de um gráfico chamado
cromatograma, de cuja interpretação podem extrair-se conclusões qualitativas e
quantitativas. Este registro e a eventual manipulação se obtêm a partir do sinal
proveniente do detector por meio de um sistema de aquisição e processamento de
dados, entre os quais pode-se citar: 1) o registrador gráfico, que converte o sinal em
um gráfico do tipo X-Y; 2) o integrador, permite obter o registro gráfico, chamado de
cromatograma e também o tratamento matemático para o cálculo de concentrações;
e 3) um programa de computação muito específico, que substituiu a ação do
integrador. Este software apropriado permite, tanto o registro gráfico do
cromatograma como os cálculos, a manipulação de dados, o armazenamento de
ensaios, a geração de dados, bem como o manejo global de vários cromatógrafos.
Como os computadores possuem sinais digitalizados, faz-se necessário uma
interface analógica-digital que converta o sinal analógico integrado pelo detector
[121]
.
Materiais e Métodos
74
Utilizou-se uma coluna de fase reversa µBondapack C18 (300x3,9 mm – 4 µm) da
empresa Waters e um equipamento de HPLC Alliance (Waters), constituído pelo
módulo de separação 2695 (Waters) com autosampler e um detector UV-VIS 2487
dual (Waters). A detecção do 2,3-DHBA e do 2,5-DHBA foi feita em 325 nm, com
Fase Móvel de gradiente à base dos solventes água/ácido acético (96:4) e metanol,
com fluxo de 1 ml/min durante 30 minutos. Em paralelo foi medido num comprimento
de onda de 278 nm para monitorar e analisar a quantidade de ácido úrico, o que
mostra o funcionamento da enzima.
O ensaio foi feito através da incubação de Hipoxantina, da enzima Xantina
Oxidase, na presença de Fe(III), EDTA e de ácido salicílio, e um banho-maria de
37ºC durante 3 horas, na presença do extrato de CcB. Depois, 30 µL de cada
amostra foi analisada via HPLC. Foram analisadas concentrações de 1%, 2%, 4%,
5% e 10% e nos volumes de 25, 50, 100, 250 e 400 µL de EAC de CcB.
Figura 13. Reação do ácido salicílico com os radicais hidroxila formando
2,3- e 2,5-DHBA (Owen et al., 1996
[143]
).
Materiais e Métodos
75
3.9 Avaliação do Potencial Antioxidante in vivo do Croton cajucara BENTH através
da levedura de Saccharomyces cerevisiae
3.9.1 Meios de cultura e soluções
O crescimento das células foi feito em meio líquido completo (YEL), contendo
0,5% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona e 2% de glicose. Para
determinação do número de células viáveis, ou seja unidades formadoras de
colônias, foram realizadas semeaduras em meio YEPD solidificado com 2% de
bacto-ágar. Para ressuspensão das células e diluições para posterior semeadura,
utilizou-se solução salina (solução de NaCl 0,9%).
3.9.2 Detecção da atividade antioxidante in vivo em Saccharomyces cerevisiae
Para a análise da atividade antioxidante, linhagens de Saccharomyces cerevisiae
proficiente e deficiente no sistema da defesa antioxidante (SOD, sod1Δ, sod2Δ,
sod1Δsod2Δ) foram utilizadas no ensaio de sobrevivência. As células, em fase
estacionária de crescimento, foram submetidas a centrifugação e lavadas duas
vezes com solução salina. A densidade das células foi determinada usando uma
câmara de contagem de Neubauer. Os extratos foram preparados em uma
concentração de 2mg/mL em DMSO. Uma suspensão, contendo 2x107céls/mL, foi
inoculada em solução salina juntamente com doses crescentes do extrato (50 -
500L) e H
2
O
2
4mM por 1 hora em estufa à 30°C, sendo posteriormente semeadas
em placas de meio YEPD. Logo após, as placas foram acondicionadas em estufa à
30°C por 48 ou 72 horas. Após este tempo, foi feita contagem das colônias, sendo
os resultados tabelados e submetidos a tratamento estatístico. O ensaio foi repetido
por 3 vezes.
Materiais e Métodos
76
3.10 Morte dos Animais
Após o período de sessenta dias, os animais foram anestesiados com cloridrato
de Cetamina (Ketalar
®
) e cloridrato de Xilasina (2,6-xilidina) – 5,6 dihidro-4h-1,3
tiazina (Rompum
®
), numa proporção de 100mg/kg de Cetamina para 50mg/kg de
Xilasina. Os anestésicos foram administrados intraperitonealmente na região
abdominal esquerda.
A profundidade da anestesia foi controlada pelos reflexos plantares e
oculopalpebrais quando se realizava algum tipo de pressão nas patas dos animais.
Primeiramente o sangue foi retirado do animal através do plexo retro-orbital
[145]
e
colocado num tubo de ensaio com heparina (Liquemine
®
), para evitar a coagulação.
Os animais foram colocados em decúbito dorsal e permaneceram sob ventilação
espontânea, respirando ar ambiente.
Posteriormente, realizou-se tricotomia e desinfecção da região abdominal,
seguida da intervenção cirúrgica, que iniciou com uma laparotomia ventral média
onde foi retirado o fígado e, em seguida congelado em nitrogênio líquido, para
posteriores análises estabelecidas. Os animais anestesiados foram mortos por
pneumotórax.
3.11 Obtenção do Plasma e Determinação da Glicemia, Colesterol e Triglicerídeos
O sangue foi retirado do animal através do plexo retro-orbital e colocado num tubo
de ensaio com heparina (Liquemine
®
), para evitar a coagulação. Após se realizou a
centrifugação do material a 4.000 rpm pelo tempo de 10 minutos.
O precipitado foi desprezado e o plasma retirado com pipeta (Labsystems 4500,
200-100 µL) para ser congelado em freezer à temperatura de –70º C para posterior
determinação dos índices de glicemia, colesterol e triglicerídeos.
Para determinação da glicemia foi utilizado o teste enzimático colorimétrico (Kit
Glicose PAP, LAB TEST), no qual o reagente foi misturado a 40 µL de amostra do
Materiais e Métodos
77
plasma e lido em espectofotômetro (CARY 3E – UV- Visible Spectrophotometer
Varian) com comprimento de onda de 500nm. Foram considerados diabéticos para
esse estudo os animais que apresentaram a concentração de glicose sangüínea
acima de 250 mg/dL
[146]
.
Para determinação dos níveis de colesterol foi utilizado o teste enzimático
colorimétrico (Kit Colesterol Liquiform, LAB TEST), no qual o reagente foi misturado
a 40 µL de amostra do plasma e lido em espectofotômetro (CARY 3E – UV- Visible
Spectrophotometer Varian) com comprimento de onda de 500nm. Os ésteres de
colesterol são hidrolisados pelas colesterol esterases à colesterol livres e ácidos
graxos. O colesterol livre é oxidado pela colesterol oxidase à colest-4-en-ona e
peróxido de hidrogênio. Na presença de peróxido de hidrogênio, o fenol e a 4-amino-
antipirilquironimina terá absortividade máxima em 500nm
[147]
.
Para determinação dos níveis de triglicerídeos foi utilizado o teste enzimático
colorimétrico (Kit Triglicerideos Liquiform, LAB TEST), no qual o reagente foi
misturado a 40 µL de amostra do plasma e lido em espectofotômetro (CARY 3E –
UV- Visible Spectrophotometer Varian) com comprimento de onda de 410nm. Os
triglicerídeos são hidrolisados enzimaticamente por uma lipase específica,
produzindo glicerol e ácido graxo. O glicerol se oxida com ácido perclórico à
formoladeído, que é quantificado colorimetricamente a 410 nm como 3,5-diacetil-1,4-
diideolutidina
[148]
.
3.12 Atividade das Aminotransferases (AST, ALT e FA) – Provas de Integridade
Hepática
Para a determinação da AST (aspartato-aminotransferase) e da ALT (alanina-
aminotransferase) no plasma foi utilizado o método enzimático comercial (Boehringer
Mannheim, Alemanha). Assim, a atividade enzimática do AST e ALT foi obtida
através da medição cinética a 567 nm.
A AST catalisa a reação do -cetoglutarato e do ácido alanína sulfínico a piruvato
e glutamato. A ALT catalisa a reação do -cetoglutarato e alanina a piruvato e
glutamato. O piruvato se hidrolisa a acetilfosfato, após a ação do piruvato oxidase
Materiais e Métodos
78
(POD), anidrase carbônica e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Em presença de POD, o
H
2
O
2
oxida a forma reduzida incolor do indicador à forma azul.
Para determinação da atividade da FA (Fosfatase Alcalina) no plasma foi
empregado o método enzimático automatizado. Para isto, utilizou-se como substrato
o para-nitrofenilfosfato mais água, que formou para-nitrofenol, composto
intensamente amarelo, com um máximo de absorbância de 400nm.
3.13 Preparo do Homogeneizado
Foram utilizados dois tipos de homogeneizados: o primeiro para realizar a
quantificação de proteínas e a avaliação da atividade de enzima GPx
(Homogeneizado 1) e o segundo para realizar a quantificação de MDA por HPLC
(Homogeneizado 2).
Para homogeneizar o fígado (Homogeneizado 1) dos animais foram colocados
9mL de tampão fosfato (KCL 140 mM, fosfato 20 mM; pH 7,4) por grama de tecido. A
homogeneização foi realizada em um aparelho Ultra-Turrax (IKA-WERK) durante 40
segundos, à temperatura de 0 a 4ºC. Posteriormente, o homogeneizado foi
centrifugado em uma centrífuga refrigerada (SORVALL RC-5B Refrigerated
Superspeed Centrifuge) por 10 min a 3000 rpm (1110 x g)
[80]
. O precipitado foi
desprezado, o sobrenadante retirado e congelado em freezer a uma temperatura de
–70 ºC para posteriores dosagens.
Para o homogeneizado de fígado utilizado na detecção e quantificação de MDA
por HPLC (Homogeneizado 2), forma misturados 0,5g de fígado em 2,5ml (0,25M)
TRIZMA BASE BUFFER (pH 7,4), 0,2 M SUCROSE e 5nM DTT (DL-Dithiotreitol). A
homogeneização foi realizada em um aparelho Ultra-Turrax (IKA-WERK) durante 40
segundos, à temperatura de 0 a 4ºC. Posteriormente, centrifugou-se por 30 min em
4°C em 10.000 x g (SORVALL RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge); coletou-
se o sobrenadante e separando-os em tubos eppendorfs
[149]
.
Materiais e Métodos
79
3.14 Quantificação das Proteínas
A concentração das proteínas do homogeneizado hepático foi determinada
através do método de Lowry e colaboradores
[150]
. Esse método utiliza como padrão
uma solução de 1 mg/mL de albumina bovina (Sigma
), utilizaram-se volumes de 50,
100 e 150 L. Colocou-se uma alíquota do homogeneizado (20 L) em 780 L de
água destilada e 2,0mL de reativo C. Este último foi preparado somente no momento
que seria utilizado e consistiu na mistura de 50mL de NaHCO
3
, somado a 0,5mL do
reativo B1 (CuSO
4
.H
2
O 1%) e 0,5mL do reativo B2 (tartarato de sódio e potássio
2%). Após a adição do reativo C, foram aguardados 10 minutos, colocando-se a
seguir 0,2mL do reativo Folin-Ciocalteau 2N (Laborclin), na concentração de 1:3 em
água destilada. Após 30 minutos, a solução apresentou coloração azulada que pôde
ser medida num espectrofotômetro com comprimento de onda de 625 nm.
3.15 Determinação do Estresse Oxidativo
3.15.1 Mensuração de Malondialdeído (MDA) por HPLC
Foi avaliada a lipoperoxidação através da quantificação de MDA, um biomarcador
de estresse oxidativo, por HPLC descrita por Mateos et al.
[149]
. Realizou-se a
padronização e validação da técnica, seguindo preconização da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (Resolução RE nº 899-29/05/2003). Concentrações pré-
estabelecidas de MDA (0,033; 0,1; 0,33; 1,0; 3,33 e 10µg/mL) foram medidas 3
vezes cada amostra por 3 dias consecutivos, sendo seus resultados avaliados
estatisticamente e sendo considerados padronizados se não houver diferença
significativa estatisticamente.
A técnica adaptada de Mateus et al.
[149]
, padronizada e validada consiste em
coletar 250µL de amostra (Homog. 2) e adicionar 50µL NaOH (Hidróxido de Sódio)
(6M). Incuba-se por 30 min a 60°C em banho-maria, para ocorrer a liberação do
MDA ligado a proteínas. Num segundo momento, realiza-se a precipitação de
proteínas, adicionando à amostra, 125µl de 35% (v/v) de Ácido Perclórico (HClO
4
) e
centrifugar por 10 min a 2800 x g. Coleta-se 250µL do sobrenadante e adiciona-se
25µl de DNPH (2,4-dinitrofenilhidrazina), preparado com 5mM de solução em 2M
Materiais e Métodos
80
Ácido Clorídrico (HCl). Incuba-se por 30 min em temperatura ambiente e protegido
da luz. Injeta-se, então, 50µL da amostra incubada, em HPLC Alliance (Waters),
constituído por uma bomba 2695 (Waters) com autosampler e um detector UV-VIS
2487 dual (Waters).
Para este procedimento, utilizou-se uma coluna de fase reversa µBondapack C18
(300x3,9 mm – 4 µm, Waters) e a análise foi feita utilizando uma Fase Móvel
Isocrática a base de 0,2% (v/v) ácido acético, água deionizada e acetonitrila 8:38
(v/v), com fluxo de 0,6mL/min durante 21 minutos e com detecção num comprimento
de onda de 310 nm. As concentrações de MDA foram expressas em nmol de
MDA/mg de proteína.
3.15.2 Atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)
A determinação da glutationa peroxidase selênio dependente, mediante o método
de Guntzler e Flohé
[151]
, consiste em medir a velocidade de consumo do NADPH em
um sistema que contenha GSH, sendo que a oxidação se registra
espectrofotometricamente em comprimento de onda de 340 nm. Então:
GPx
ROOH (H
2
O
2
) + GSH ------------ ROH (H
2
0) + GSSG + H
2
O
A atividade da GPx pode ser estudada, medindo a velocidade de consumo de
NADPH num sistema que contenha GSH.
GSH + NADPH ---------- GSSG + NADP+ + 2H+
Essa técnica consiste em determinar a atividade da enzima
espectrofotometricamente, medindo a velocidade de oxidação do NADPH em uma
reação.
Materiais e Métodos
81
Para tal, em uma cubeta de quartzo foram colocados 2,7mL de solução
reguladora de fosfatos de Na+ e K+ (100 mM, pH 7,0) com 50 L de NADPH
(10mM), 150 L de BOOH (10mM) e 50 L de glutationa redutase (12 U/mL). A
mistura foi lida durante 1 minuto, quando se fez uma linha de base e em seguida
foram adicionados 50 L de GSH (100mM) e 50 L do homogeneizado. As amostras
foram incubadas a 25°C durante 5 minutos, e lidas numa absorbância de 340 nm. A
atividade foi expressa em mol/min.g de tecido.
3.16 Análise Estatística
Após a determinação de todos os parâmetros experimentais, os resultados foram
expressos como média ± desvio padrão da média (DP) para cada grupo
experimental.
Para a análise estatística foi utilizado o programa estatístico Statistical Package
for Sciences, versão 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Os dados de peso corporal, níveis de glicemia, colesterol e triglicerídeos foram
testados pela Análise de Variância para Medidas Repetidas e aplicado o Teste “t” de
Student para as amostras pareadas.
Para os dados das leveduras, enzimas hepáticas, níveis de MDA e GPx utilizou-
se a análise de variância simples (ANOVA), a fim de comparar as diferenças
observadas em cada parâmetro estudado. Foi aplicado também o teste
complementar de Tukey-Kramer para comparações múltiplas.
A análise do potencial antioxidante foi avaliada através de Regressão Linear
Múltipla, definindo-se o coeficiente de correlação de Pearson.
Considera-se para afirmar no texto que existe diferença estatisticamente
significativa entre as variáveis estudadas, a utilização do nível mínimo de
significância de cada uma delas de, em pelo menos, 5% (p<0,05).
RESULTADOS
4 RESULTADOS______________
Os resultados apresentados neste estudo, com base nos objetivos propostos,
são referentes a todos os grupos avaliados e têm a seguinte ordem:
1-Potencial Antioxidante in vitro do EAC de CcB por HPLC.
2-Potencial Antioxidante in vivo do EAC de CcB em leveduras.
3-Peso corporal.
4-Níveis sangüíneos de glicose, colesterol e triglicerídeos.
5-Provas de função hepática AST, ALT e FA.
6-Marcador de estresse oxidativo MDA por HPLC.
7-Atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase (GPx).
4.1 Potencial Antioxidante in vitro do Croton cajucara BENTH pelo sistema
enzimático Xantina Oxidase por HPLC
Através das análises cromatográficas (FIGURA 14) pode-se observar a detecção
por HPLC dos compostos estáveis 2,3 e 2,5-DHBA e determinar o potencial
antioxidante do EAC do Croton cajucara BENTH. Na FIGURA 14A, observa-se o
cromatograma padrão da amostra sem enzima e sem o EAC, sendo utilizado para
comprovar a ausência de picos (relativos às moléculas detectadas) na região de
interesse, que interfeririam nas análises dos picos de interesse. Da mesma forma,
pode-se visualizar na FIGURA 14B a ausência de picos na região de interesse no
cromatograma da amostra de EAC sem a enzima Xantina Oxidase.
Resultados
84
Na análise cromatográfica onde se empregou somente o sistema enzimático,
pode-se observar dois picos independentes (FIGURA 14C), em tempos de retenção
diferentes, que foram respectivamente, os compostos 2,5-DHBA (tempo de retenção:
11,422 min) e 2,3-DHBA (tempo de retenção: 13,390 min). Para afirmar que os picos
apresentados são relativos aos compostos DHBAs foram realizadas cromatografias
prévias, utilizando-se os compostos 2,3- e 2,5-DHBA padrão (substância pura -
Merck
®
) e definindo de antemão seus tempos de retenção, que foram praticamente
invariáveis, tendo apenas variação de área de gráfico devido à ação das substâncias
antioxidantes.
Na FIGURA 14D, observa-se a ação do EAC de Sacaca numa concentração de
10% sobre a formação dos compostos estáveis 2,3- e 2,5-DHBA, reduzindo as áreas
de seus picos em 50% e demonstrando o potencial antioxidante do Croton cajucara
BENTH.
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
Fi
gura 14B.
Cromatograma do mix sem enzima e com EAC de CcB (10%) (325 nm)
Figura 14A.
Cromatograma do mix sem enzima, sem EAC de CcB (325 nm)
Resultados
85
Figura 14. Cromatogramas do potencial antioxidante in vitro do CcB.
Analisando todos os resultados das áreas dos picos obtidos a partir dos
cromatogramas dos ensaios enzimáticos da Xantina Oxidase, com EAC de Sacaca
nas concentrações de 1%, 2%, 4%, 5% e 10% e nos volumes de 25, 50, 100, 250 e
400 µL, pode-se verificar que o Croton cajucara BENTH apresenta atividade
antioxidante (redução da formação ou varredura das EAOs) dependente de volume
e concentração, conforme são observados na TABELA 1 e FIGURA 15. Verifica-se
que na concentração de 10% e volume de 400µL houve a maior redução na
formação de espécies reativas de oxigênio, aproximadamente 74,2±0,86%,
comprovando assim, sua ação “scavenger” antioxidante.
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
2,5-DHBA - 11.422
2,3-DHBA - 13.390
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
10.289
2,5-DHBA - 11.262
12.803
2,3-DHBA - 13.217
13.538
2,5
-
DHBA
– Área = 285.734
2,3-DHBA – Área = 173.945
2,5
-
DHBA
– Área = 154.496
2,3-DHBA – Área = 93.643
Figura 14D. Cromatograma do mix com enzima e 100 µl de EAC de CcB (10%) (325 nm)
Figur
a 14C.
Cromatograma
do mix com enzima (sem EAC
de CcB) (325 nm)
Resultados
86
Tabela 1. Pontencial antioxidante in vitro de várias concentrações e volumes de EAC
de CCB.
Concentração de
EAC CcB (%)
Dose de EAC CcB
(µL/mL)
DHBAs (%)
Redução das
EAOs (%)
0 0 100 0
1 50 94,69± 0,87 5,31± 0,87
1 100 71,40± 0,26 28,60± 0,26
1 250 68,70 ± 1,31 31,30± 1,31
1 400 60,43 ± 1,59 39,57± 1,59
2 50 82,83 ± 0,55 17,17± 0,55
2 100 86,33 ± 1,51 13,67± 1,51
2 250 70,30 ± 0,34 29,70± 0,34
2 400 50,20 ± 1,47 49,80± 1,47
4 50 81,43 ± 0,66 18,57± 0,66
4 100 86,33 ± 1,51 13,67± 1,51
4 250 70,30 ± 0,34 29,70± 0,34
4 400 50,20 ± 1,47 49,80± 1,47
5 50 79,70 ± 0,34 20,30± 0,34
5 100 63,33 ± 1,06 36,67± 1,06
5 250 43,43 ± 0,55 56,57± 0,55
5 400 30,33 ± 0,05 69,67± 0,05
10 50 69,80 ± 0,87 30,20± 0,87
10 100 46,83 ± 0,23 53,17± 0,23
10 250 34,96 ± 1,27 65,04± 1,27
10 400 25,80 ±0,86 74,20±0,86
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão da média.
Resultados
87
Figura 15. Pontencial antioxidante in vitro de várias concentrações e volumes de EAC de CCB.
Resultados expressos como média ± desvio padrão.
Sacaca 1%
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
doses (L/mL)
DHBA (%)
Sacaca 2%
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
doses (L/mL)
DBHA (%)
Sacaca 4%
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
doses (L/mL)
DHBA (%)
Sacaca 5%
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
doses (L/mL)
DHBA (%)
Sacaca 10%
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
doses (L/mL)
DHBA (%)
Resultados
88
Através da Equação da Regressão Linear Múltipla [DHBA=99,7-3,5*concentração-
0,10*dose], observou-se a relação de causa-efeito entre a variável dependente
“percentagem de DHBA” e as variáveis independentes “dose” e “concentração” da
EAC de CcB. Conforme a Equação derivada dos dados da TABELA 2, verifica-se
que a cada uma variação percentual de concentração do EAC de CcB o nível de
DHBA varia em -3,5% e que a cada uma variação de µL/mL de dose o nível de
DHBA varia em -0,10%. Segundo o Coeficiente de Determinação (R
2
ajustado)
observa-se que as variações de dose e concentração de Sacaca explicam em 86% o
nível de DHBA.
Tabela 2. Coeficientes das variáveis de Regressão Linear Múltipla para o desfecho
DHBA (%).
Nota: Equação da Regressão [DHBA=99,7-3,5*concentração-0,10*dose].
Pelos dados obtidos através do Coeficiente de Correlação de Pearson constata-
se que há relação estatisticamente significativa inversa entre a DHBA (%) x
Concentração (%) e DHBA (%) x Dose (µL/mL), conforme apresentado na TABELA
3.
Tabela 3. Correlação de Pearson para percentagem de DHBA, dose e concentração
de EAC de CcB.
DHBA (%)
Concentração (%) -0,612*
Dose (µL/mL) -0,759*
*Correlação é significativa para p<0,01.
A varredura de radicais livres de oxigênio com as diferentes concentrações e
volumes de EAC de Sacaca pode ser observada e inter-relacionada nas FIGURAS
16 e 17. Assim:
Variáveis Β Ic β p
Concentração -3,5 -4,6 a -2,4 <0,001
Dose -0,10 -0,1 a -0,07 <0,001
Resultados
89
0 100 200 300 400
0
25
50
75
100
Sacaca 10%
Sacaca 5%
Sacaca 4%
Sacaca 2%
Sacaca 1%
doses (L/mL)
DHBA (%)
Figura 16. Potencial antioxidante in vitro do CcB.
Resultados expressos como média ± desvio padrão.
Figura 17. Dispersão dos Dados do Potencial antioxidante in vitro do CcB correlacionando as
variáveis de DHBA, dose e concentração.
Resultados
90
4.2 Atividade Antioxidante in vivo do Croton cajucara BENTH através da levedura
Saccharomyces cerevisiae
Na FIGURA 18, estão expressos resultados do ensaio de sobrevivência,
utilizando linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae proficientes e deficientes
no sistema de defesa antioxidante da enzima superóxido dismutase (SOD, sod1Δ,
sod2Δ, sod1Δsod2Δ), por meio de um ensaio semi-quantitativo realizado através da
inibição de crescimento (teste de sobrevivência), utilizando, também, o EAC de CcB
em volumes de 0, 50, 100, 250 e 500 µl em uma concentração de 5% . Como pode
ser observado, existe um aumento no percentual de sobrevivência celular em todas
as linhagens, sendo significativo em suas doses mais altas, ao demonstrar um
potencial antioxidante do CcB.
SOD sod1 sod2 sod1sod2
0
25
50
75
100
0
50
100
250
500
linhagens
sobrevivência (%)
**
*
**
**
*
*
*
Figura 18. Potencial antioxidante in vivo do CcB.
Resultados expressos como média ± desvio padrão. Os sinais referem-se as seguintes significâncias:
*Dados significativos em relação ao controle positivo (0) com significância de p<0,05;
**Dados significativos em relação ao controle positivo (0) com significância de p<0,01.
Resultados
91
4.3 Avaliações Basais
Foram coletados e verificados os dados basais (tempo zero dia – t0) para as
variáveis peso corporal, glicemia, colesterol e triglicerídeos nos diferentes grupos
experimentais. Estes dados são importantes para se observar o comportamento
entre os grupos no t0 e verificar se poderão haver interferências nos dados finais.
Através da TABELA 4, percebe-se diferença significativa estatisticamente, para a
glicemia, entre os grupos controle e os grupos diabéticos, conforme o esperado,
demonstrando que os animais dos grupos DM, DM 5d e DM 20d são realmente
diabéticos. O observou-se uma diferença estatística para o peso corporal entre os
grupos, porém sem força para ser detectada pelo teste estatístico post hoc de
Tukey. Esta diferença de pesos corporais basais não tem relevância clínica, pois as
diferenças entre as médias dos grupos apresentam pouca variabilidade.
Tabela 4. Médias Basais dos grupos experimentais.
CO
n=10
CO5d
n=10
CO20d
n=11
DM
n=12
DM5d
n=10
DM20d
n=10
P
Peso
(g)
281,00±33,35 262,40±20,13 282,45±25,59 277,75±29,89 254,10±20,01 253,80±27,99 0,034*
#
Glicemia
(mg/dL)
177,63±19,80 173,56±25,42 187,26±28,66 468,52±80,50
a
392,17±94,40
b
440,66±64,50
c
<0,001*
Colesterol
(mg/dL)
56,98±16,58 53,86±11,77 52,41±14,32 62,97±10,78 58,88±7,47 59,00±13,28 0,572
Triglicerídeos
(mg/dL)
58,50±19,92 66,73±20,88 66,99±32,91 73,83±15,89 65,84±13,77 74,32±19,48 0,412
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão.
*Diferença significativa entre os grupos.
#
Mesmo havendo uma significância estatística com o teste de Análise das Variâncias (ANOVA), não
tivemos poder para detectar o grupo diferente com o teste post hoc de Tukey.
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
b
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
c
Diferença significativa entre o grupo DM 20d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
4.4 Peso Corporal
Durante os 60 dias de duração do estudo, efetuando mensurações dos pesos
corporais dos animais controles e diabéticos, nos diferentes grupos, antes da
indução do Diabetes Mellitus e no dia da morte dos animais, pode-se observar
através da Análise de Variância para Medidas Repetidas e pelo Teste “t” Student
para Amostras Pareadas, como verificadas na TABELA 5, que houve uma alteração
global entre o tempo inicial e o final (Ptempo <0,001). Foi detectada uma diferença
Resultados
92
no comportamento das médias dos grupos entre si (Pgrupo <0,001) e uma mudança
dos deltas - Δ (t60-t0) dos grupos (Pinteração). Na FIGURA 19, observa-se que as
diferenças médias entre o tempo 60 dias (t60) e o tempo zero dia (t0) foram
diferentes de zero estatisticamente nos grupos controle, acusando um aumento de
peso corporal nesses grupos.
Tabela 5. Peso Corporal.
CO (n=10) CO5d (n=10) CO20d (n=11) DM (n=12) DM5d (n=10) DM20d (n=10) Ptempo Pinteração
Pgrupo
t0
281,00±33,35 262,40±20,13 282,46±25,59 277,75±29,89 254,10±20,02 253,80±27,99
t60
336,20±56,86 315,40±23,14 349,19±39,14 262,83±26,24
a
265,20±45,29
b
250,60±45,31
c
<0,001 <0,001 <0,001
Nota: Resultados expressos em gramas como média ± desvio padrão.
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
b
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
c
Diferença significativa entre o grupo DM 20d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
Figura 19. Diferenças médias dos pesos corporais e Intervalo de Confiança 95%.
*Diferentes de zero estatisticamente significante (p<0,05).
*
*
*
Resultados
93
4.5 Níveis de Glicemia, Colesterol e Triglicerídeos
Os níveis glicêmicos, colesterolêmicos e de triglicerídeos foram medidos em dois
momentos, sendo t0 e t60. Observando-se os resultados das diferenças das médias
entre o t60 e t0 para glicemia na FIGURA 20, verifica-se que não foram diferentes de
zero estatisticamente em todos os grupos, excetuando o grupo CO, o qual
apresentou uma variação das diferenças das médias dos níveis glicêmicos
diferentes de zero estatisticamente. Porém, observa-se na TABELA 6, que as
médias dos animais do grupo CO no t60 não apresentaram níveis glicêmicos que os
identifique como diabéticos.
Tabela 6. Níveis glicêmicos.
CO (n=10) CO5d (n=10) CO20d (n=11) DM (n=12) DM5d (n=10) DM20d (n=10)
Ptempo Pinteração Pgrupo
t0
177,62±19,80 173,57±25,42 187,26±28,67 468,52±80,51 392,17±94,41 440,67±64,51
t60
215,97±31,17 211,74±48,36 232,09±77,45 444,88±117,5
a
372,01±84,72
b
440,66±75,41
c
0,303 0,376 <0,001
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão (mg/dL).
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
b
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
c
Diferença significativa entre o grupo DM 20d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
Figura 20. Diferenças médias para os níveis glicêmicos e Intervalo de Confiança 95%.
*Diferente de zero estatisticamente significante (p<0,05).
*
Resultados
94
Através dos resultados das médias entre o t60 e t0 para colesterol, conforme a
TABELA 7 e, das diferenças das médias na FIGURA 21, verifica-se que os grupos
DM e DM5d foram diferentes de zero estatisticamente, comparando-se com os
demais grupos e, que os grupos diabéticos aumentaram seus níveis de colesterol no
T60 (Ptempo<0,01).
Tabela 7. Níveis de colesterol.
CO (n=10) CO5d (n=10) CO20d (n=11) DM (n=12) DM5d (n=10) DM20d (n=10)
Ptempo Pinteração Pgrupo
t0 56,98±16,58 53,87±11,78 52,41±14,32 62,97±10,77 58,88±7,48 59,01±13,28
t60 51,85±17,99 55,49±13,76 58,31±12,73 80,91±16,99
a
74,83±9,57
b
73,42±18,24
c
<0,001 0,012 0,001
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão (mg/dL).
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
b
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
c
Diferença significativa entre o grupo DM 20d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
Figura 21. Diferenças médias para os níveis de colesterol e Intervalo de Confiança 95%.
*Diferentes de zero estatisticamente significante (p<0,05).
*
*
Resultados
95
Comparando-se os resultados das médias entre o t60 e t0 para triglicerídeos na
TABELA 8 e as diferenças das médias da FIGURA 22, observa-se que o grupo DM
foi diferente de zero estatisticamente. Os grupos DM5d e DM20d apresentaram
níveis de triglicerídeos semelhantes aos grupos controles (pgrupo=0,017).
Tabela 8. Níveis de triglicerídeos.
CO (n=10) CO5d (n=10) CO20d (n=11) DM (n=12) DM5d (n=10) DM20d (n=10)
Ptempo Pinteração Pgrupo
t0 58,51±19,92 66,73±20,88 66,99±32,92 73,83±15,90 65,84±13,78 74,32±19,48
t60 91,58±39,24 87,90±24,03 89,66±38,35 195,80±171,69
a
84,86±25,92 97,49±85,85
<0,001 0,050 0,017
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão (mg/dL).
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d, CO 20d, DM 5d e
DM20d.
Figura 22. Diferenças médias para os níveis de triglicerídeos e Intervalo de Confiança 95%.
*Diferente de zero estatisticamente significante (p<0,05).
*
Resultados
96
4.6 Provas de Função Hepática através da atividade das transaminases AST
(aspartato-aminotransferase), ALT (alanina-aminotransferase) e da FA (Fosfatase
Alcalina)
A atividade das transaminases hepáticas foi mensurada no dia da morte dos
animais (t60). Conforme os resultados obtidos através da Análise da Variância
seguida de Tukey e na TABELA 9, cosntata-se diferença significativamente
estatística entre os grupos para as enzimas ALT e FA. Não há diferença significativa
para a enzima AST entre os grupos.
Tabela 9. Atividade das Aminotransferases Hepáticas.
CO
n=10
CO5d
n=10
CO20d
n=11
DM
n=12
DM5d
n=10
DM20d
n=10
p
AST
154,90±37,82 149,40±35,72 131,72±39,84 200,83±131,69 127,30±49,13 143,30±69,41
0,190
ALT
53,20±5,88 66,50±33,62 59,46±16,70 122,92±77,32
a
71,30±27,11 99,80±34,22
0,001*
FA
136,10±31,81 170,20±57,36 137,46±31,51 423,75±135,10
b
248,50±112,39
c,e
391,20±113,35,99
d
<0,001**
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão (u/L).
*Diferença significativa entre os grupos com p<0,005.
** Diferença significativa entre os grupos com p<0,001.
a
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d, CO 20d e DM 5d.
b
Diferença significativa entre o grupo DM comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
c
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
d
Diferença significativa entre o grupo DM 20d comparado aos grupos CO, CO 5d e CO 20d.
e
Diferença significativa entre o grupo DM 5d comparado aos grupos DM e DM 20d.
Resultados
97
Constata-se através dos resultados na FIGURA 23, que não houve diferença
estatisticamente significante detectável entre os grupos para a enzima AST, o que
confirma os dados anteriores.
Figura 23. Médias e desvios padrão das médias para os níveis de aspartato-aminotransferase.
Resultados
98
Já na FIGURA 24, constata-se através dos resultados obtidos, que houve
diferença significativa estatisticamente (p<0,005) entre o grupo DM e os grupos CO,
CO5d e CO20d para a enzima ALT. Os animais diabéticos tratados por 5 e 20 dias
demonstraram uma tendência de redução dos níveis de ALT comparados ao grupo
DM, porém este dado não apresentou significância estatística.
Figura 24. Diferenças médias e desvios padrão das médias para os níveis de alanina-
aminotransferase.
* Diferença significativa entre o grupo DM e os grupos CO, CO5d e CO20d (p<0,005).
Resultados
99
Houve diferença estatisticamente significante entre os grupos DM e DM20d para
os grupos controles, e entre DM5d e os grupos DM e DM20d para a FA, conforme
pode-se constatar nos resultados da FIGURA 25.
Figura 25. Diferenças médias e desvios padrão das médias para os níveis de Fosfatase Alcalina.
*Diferença significativa dos grupos DM e DM20d para os grupos controles (p<0,001).
**Diferença significativa entre o grupo DM5d e os grupos DM e DM20d (p<0,001).
*
*
**
Resultados
100
4.7 Determinação do Estresse Oxidativo
4.7.1 Mensuração de MDA (malondialdeído) via HPLC
As análises para implementação da metodologia por cromatografia líquida de alta
eficiência para mensurar MDA do fígado de animais, partiram de publicações
científicas que detalhavam a técnica, conforme Mateos, et al.
[149]
Inicialmente, realizou-se a padronização e validação da técnica, analisando
diferentes concentrações de malondialdeído (Merck
®
), 0,033; 0,1; 0,33; 1; 3,33 e 10
µg/mL MDA, em 3 dias consecutivos, medindo 3 vezes cada amostra por dia e
observando sua estabilidade. Assim, com este procedimento, validou-se a
metodologia, conforme preconizado pela ANVISA, que descreve: “A validação deve
garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das
aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados” (Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução RE nº 899, de 29/05/2003.)
Na FIGURA 26, observam-se cromatogramas referente à validação da
metodologia de mensuração de MDA por HPLC descrita por Mateos, et al.
[149]
.
Os picos de MDA encontram-se sempre em um tempo de retenção próximo de 14
minutos, apresentando áreas dos picos crescentes conforme o aumento da
concentração de MDA, estável e reprodutível durante todos os dias da validação.
Resultados
101
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
AU
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
13.600
AU
0.0000
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
MDA DNPH - 14.501
15.806
AU
0.0000
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
MDA DNPH - 14.369
15.642
A
B
C
D
Resultados
102
Figura 26. Cromatogramas de MDA
A)Água MilliQ + 25µL 2M HCl; B)Água MilliQ + 25µL 5mM DNPH + 2M HCl; C)0,033µg/mL MDA
(0,11 nmol/mL); D) 0,10 µg/mL MDA (0,32 nmol/mL); E)0,33 µg/mL MDA(1,06nmol/mL); F) 1 µg/mL
MDA (3,19 nmol/mL); G)3,33 µg/mL MDA (10,65 nmol/mL); H) 10 µg/mL MDA (31,95 nmol/mL);
todas as amostras acrescidas de 25µL 5mM DNPH + 2M HCl.
AU
0.0002
0.0003
0.0004
0.0005
0.0006
0.0007
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
MDA DNPH - 15.008
AU
-0.0002
0.0000
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
MDA DNPH - 15.063
AU
0.000
0.002
0.004
0.006
0.008
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
MDA DNPH - 14.474
15.750
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
Minutes
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00
MDA DNPH - 14.966
E
F
G
H
Resultados
103
Foram calculadas as médias das 3 áreas de concentração nos 3 dias e feitas
comparações entre elas (Área 1 vs Área 2 / Área 1 vs Área 3 / Área 2 vs Área 3) pelo
Teste “t” de Student para amostras pareadas. Foi realizado um ajuste dos valores P
pelo fato de se estar realizando comparações múltiplas (Ajuste de Bonferroni).
Conforme verifica-se na FIGURA 27, não houve diferença estatisticamente
significante entre as médias das áreas, com exceção do grupo 10µg/mL de MDA,
que apresentou diferença entre a Área 3 comparativamente com as ocorrências nas
Áreas 1 e 2.
Figura 27. Diferenças médias e desvios padrão das médias para as áreas cromatográficas de
concentração de MDA, tendo sido realizadas 3 mensurações por dia em 3 dias distintos para avaliar o
método.
*Diferença significativa da área 3 para as áreas 1 e 2 da concentração de MDA de 10g/mL.
*
MDA
Resultados
104
Os fígados dos animais de todos os grupos, após homogeneização (Homog. 2)
foram analisados por HPLC, seguindo a metodologia anteriormente validada, para
detecção de MDA. Conforme os resultados contidos na FIGURA 28, verifica-se uma
diferença estatisticamente significante entre o grupo DM em relação aos grupos
controles; o grupo DM em relação ao grupo DM tratado por 5 dias; e o grupo DM20d
em relação ao CO.
Figura 28. Médias ± desvios padrão das médias para os níveis de Malondialdeído
(nmol/mg proteína), para os grupos com n=6.
*Diferença significativa do grupo DM e CO, CO5d e CO20d (p<0,001).
**Diferença significativa do grupo DM e DM 5d (p<0,001).
***Diferença significativa do grupo DM20d e CO (p<0,001).
*
**
***
Resultados
105
4.7.2 Glutationa Peroxidase (GPx)
A atividade da enzima glutationa peroxidase foi mensurada no dia da morte dos
animais (t60). Apurou-se através dos resultados encontrados na FIGURA 29, que
não houve diferença estatisticamente significante para a GPx.
Tabela 10. Atividade da enzima Glutationa Peroxidase (GPx).
CO CO5d CO20d DM DM5d DM20d P
GPx
102,84±32,40 117,38±16,47 121,27±31,13 128,85±17,39 125,14±22,86 108,98±30,64
0,354
Nota: Resultados expressos como média ± desvio padrão (nmol/mg prot.min).
Figura 29. Médias ± desvios padrão das médias para os níveis de Glutationa Peroxidase, para os
grupos com n=8.
DISCUSSÃO
5 DISCUSSÃO______________
O Diabetes Mellitus configura-se hoje como uma epidemia mundial, traduzindo-se
em grande desafio para os sistemas de saúde de todo o mundo
[25]
. Nas estimativas
da OMS, o número de portadores da doença no Brasil é cerca de 6 milhões e deve
alcançar 10 milhões de pessoas em 2010
[25]
. Segundo a International Diabetes
Federation, a cada 2 minutos e 18 segundos, um novo caso de diabetes surge no
Brasil
[152]
.
As conseqüências humanas, sociais e econômicas são devastadoras: são mais
de 4 milhões de mortes por ano relativas ao diabetes e suas complicações (com
muitas ocorrências prematuras), o que representa 9% da mortalidade mundial
total
[25, 153]
.
O maior custo, entretanto recai sobre os portadores, suas famílias, seus amigos e
comunidade, com o impacto da redução de expectativa de vida considerável. A
expectativa de vida é reduzida em média em 15 anos para o diabetes tipo I e em 5 a
7 anos na do tipo II; os adultos com diabetes têm risco 2 a 4 vezes maior de doenças
cardiovasculares e acidentes vasculares cerebrais. É a causa mais comum de
amputações de membros inferiores não traumática, cegueira irreversível e doença
renal crônica terminal. Em mulheres, é responsável por maior número de partos
prematuros e mortalidade materna, segundo dados do Ministério da Saúde do
Brasil
[25]
.
A classificação do DM, desde o Consenso Brasileiro sobre diabetes, em 2002, se
dá de acordo com sua etiologia e não mais por “insulino dependente” e “não insulino
dependente”
[154]
. Sendo nomeado DM tipo I, o caracterizado pela deficiência das
Discussão
108
células β pancreáticas na produção ou secreção de insulina, com intensa
participação de fatores genéticos e ambientais. Geralmente detectado em pessoas
jovens e, se fazendo necessário, uso de insulina. O DM tipo II é caracterizado por
uma resistência à captação da glicose no músculo esquelético e no tecido adiposo.
Isso contribui para a hiperglicemia, manifestando-se predominantemente após os 40
anos e na grande maioria sem a necessidade de utilização de insulina exógena
[36]
.
As dificuldades no tratamento do diabetes (como por exemplo, a necessidade de
várias injeções diárias de insulina para o controle glicêmico), a ocorrência de
complicações crônicas da doença e o risco de hipoglicemias severas em pacientes
com DM tipo I, já justificam, por si só, a pesquisa por estratégias terapêuticas
alternativas à aplicação de insulina exógena. Além dos vários tipos de pesquisas
que buscam soluções alternativas para o tratamento desta doença, atualmente é
dada ênfase aos estudos que aprofundam o entendimento da patogenia desta
doença
[47]
. Os modelos animais têm-se mostrado bastante úteis para este fim
[155]
.
A utilização de modelos experimentais com processo patogênico semelhante ao
humano, pode auxiliar no aprofundamento da compreensão do desenvolvimento do
DM tipo I, assim como permitir o teste de novas modalidades terapêuticas
[31]
. A
estreptozotocina (STZ) é provavelmente a substância de escolha para estudar o
Diabetes Mellitus tipo I em animais. Ela foi descrita em 1956 como um antibiótico de
amplo espectro de ação
[156]
e em 1960 sua atividade antitumoral foi relatada,
principalmente para o tratamento de leucemia
[157]
. Estudos de tumores com modelos
animais (ratos) acabaram por descobrir que a STZ levava a hiperglicemia, e estudos
em cachorros e macacos rhesus evidenciaram o seu potencial diabetogênico
[158]
.
Desde então, esta droga tem sido usada para induzir diabetes em modelos
experimentais.
Muitos estudos realizados em animais puderam demonstrar os variados efeitos
que a STZ pode ocasionar. Em estudos feitos por Dall’ago et al.
[159]
, foram
observadas alterações na freqüência cardíaca e pressão arterial, bem como na
sensibilidade dos baro- e quimioreceptores quando comparados animais diabéticos
com animais do grupo controle. No presente estudo, aplicou-se 70mg/kg de STZ
intraperitonealmente nos animais e a doença se desenvolveu em três dias. Eles
Discussão
109
desenvolveram as principais características do DM como poliúria, polidipsia,
hiperglicemia e perda de peso, semelhante aos achados de Ganong
[37]
e Leiter
[160]
.
Pacientes diabéticos podem apresentar alterações hepáticas, como a esteatose, a
esteatohepatite não-alcoólica e a cirrose
[161]
. As complicações vasculares
representam a principal causa de morbidade e mortalidade em pacientes diabéticos
e ocorrem na micro e na macrovasculatura. A hiperglicemia pode aumentar a
geração das espécies ativas de oxigênio através da auto-oxidação da glicose, pela
ativação da proteína quinase C ou pelo aumento do metabolismo na via dos
polióis
[162]
. Em estudo experimental realizado por Melo
[53]
, utilizando estreptozotocina
(STZ), ficou demonstrado que 18 horas após a indução do DM ocorreu dano nas
células beta pancreáticas, provavelmente causado pelo desequilíbrio nos sistemas
pró e antioxidantes. E, distúrbios na produção de oxidante e antioxidante, em favor
do oxidante levam a danos celulares, os quais são denominados danos oxidativos
ou estresse oxidativo
[163]
.
Os processos oxidativos podem ser evitados através da modificação das
condições ambientais ou pela utilização de substâncias antioxidantes com a
propriedade de impedir ou diminuir o desencadeamento e/ou a propagação das
reações oxidativas
[164]
.
Sendo assim, antioxidantes são substâncias capazes de prevenir os efeitos
deletérios da oxidação, inibindo o início da lipoperoxidação, seqüestrando radicais
livres e/ou quelando íons metálicos. Eles protegem organismos aeróbicos do
estresse oxidativo
[165]
. E, a busca por substâncias antioxidantes naturais vem
aumentando nos últimos anos, por isso que cada vez mais os grandes centros de
pesquisa e indústrias farmacêuticas têm investido neste tipo de pesquisa
[118]
. As
plantas assim como os animais possuem sistemas antioxidantes. Dentre estes,
destacam-se as substâncias como os terpenos oxidados, taninos, fenóis, alcalóides,
lignanas, cafeína e aminas
[166, 167]
.
A sacaca (Croton cajucara BENTH) é uma planta medicinal e aromática,
produtora de linalol ,fixador de perfume em indústrias dos EUA, Inglaterra, França e
Itália
[168]
. Ao efetuar triagem em plantas de rápido crescimento e resistentes a
pragas, Araújo et al.
[169]
encontraram na sacaca 66,4% de linalol, e 25% de
Discussão
110
sesquiterpenos, estes últimos com efeitos diversos, desde os anti-tumorais,
bacteriostáticos, fungistáticos, bioinseticidas e na profilaxia da esquistossomose
(impedindo a penetração das cercárias da Biomphalaria glabrata na pele humana).
Foram isolados terpenóides, ácido aleuritórico, triterpenóide e flavonóides
[170]
.
No presente estudo, avaliou-se o potencial antioxidante da casca do caule do
Croton cajucara BENTH, onde se observou, através de análises cromatográficas por
HPLC, utilizando o teste enzimático da Xantina Oxidase (FIGURA 14), a presença de
atividade varredora ou redutora da formação de EAOs da planta, sendo dependente
de volume e concentração do extrato aquoso utilizado (TABELA 1, FIGURAS 15, 16
e 17). Isso também é comprovado pelo coeficiente de correlação de Pearson que
demonstra estatisitcamente uma relação inversa entre a formação de dihidroxi-ácido-
benzóico (DHBA) e a dose ou a concentração de EAC de CcB (TABELA 3) descrita
através da Equação de Regressão Linear Múltipla com desfecho em DHBA (%) onde
se pode observar que a cada uma variação percentual de concentração do EAC de
CcB o nível de DHBA irá variar em -3,5% e que a cada uma variação de µL/mL de
dose o nível de DHBA irá variar em -0,10% (TABELA 2). Estes resultados são
semelhantes aos encontrados por Larson, que demonstrando o potencial
antioxidante de algumas espécies de crotons
[166]
. Maciel isolou o flavonóide 3,7-di-
O-metilcanferol presente no CcB, demonstrando também, a atividade antioxidante
desse extrato
[15]
.
Os ensaios com células eucarióticas permitem a avaliação da atividade
antioxidante de inúmeros compostos de forma rápida, econômica e reprodutível e os
resultados obtidos podem ser facilmente extrapolados para o homem. Desta forma,
testes em células eucarióticas da levedura Saccharomyces cerevisiae, assumem um
importante papel na verificação da capacidade oxidante e antioxidante e na
determinação do possível mecanismo de ação dos produtos testados
[138, 171]
. Como
demonstrado na FIGURA 18, os tratamentos realizados com diferentes volumes do
extrato aquoso da planta Croton cajuca BENTH protegeram as linhagens de
Saccharomyces cerevisiae contra os danos oxidativos provocados pelo H
2
O
2
, sendo
observada uma forte ação antioxidante, principalmente para o extrato da planta em
maiores volumes. Este efeito protetor é evidenciado por um aumento na
sobrevivência celular da maioria das linhagens, independente de defesa antioxidante
Discussão
111
em falta. A partir disso, a atividade encontrada nestes extratos pode ser atribuída à
presença de compostos, flavonóides, terpenóides
[87, 103, 107, 172]
já descritos na
literatura, que apresentam comprovada capacidade de seqüestrar radicais livres com
grande eficiência.
Na presença de íons ferro, o H
2
O
2
pode originar um dos intermediários mais
reativos do oxigênio, o radical OH
através da reação de Fenton
[59]
. Em condições
aeróbicas de crescimento os mutantes sod1 e sod2 apresentam níveis maiores de
ferro (até 5 vezes), assim como a duplo mutante sod1sod2 (até 9 vezes), detectado
por Ressonância Paramagnética de Elétron (EPR), em relação aos níveis basais da
linhagem selvagem isogênica
[173]
. Ensaios com as folhas do CcB também
mostraram um aumento da taxa de sobrevivência de Saccharomyces cerevisiae
após a agressão com paraquat, bem como o tratamento realizado com outros
antioxidantes naturais e sintéticos tais com a vitamina C ou o BTH
[171, 174]
. Portanto,
com base nos resultados obtidos nestes mutantes, pode-se sugerir uma possível
ação dos compostos CcB sobre o radical OH
.
A definição de um antioxidante apresenta inúmeros conceitos que vem sendo
atualizados com o passar dos tempos. Em 1974, o Dorland’s Medical Dictionary
[175]
apresenta “um antioxidante como uma de muitas substâncias sintéticas ou naturais
que adicionadas a um produto para prevenir ou retardar a deteriorização pela ação
do oxigênio do ar. Outra definição, segundo Parker e colaboradores em 1996, afirma
que são substâncias as quais protegem tecidos biológicos do dano causado por
radicais livres, os quais estão aptos para serem reciclados ou regenerados por
redutores biológicos
[176]
. Halliwell e Gutteridge, em sua última publicação (2007),
reafirmam a proposta de uma nova e mais abrangente definição sendo “o
antioxidante qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações
comparadas com aquelas do substrato oxidável, decai significativamente ou previne
a oxidação deste substrato”
[59]
.
Ao analisar-se os resultados desta investigação, verifica-se que na concentração
de 10% nos maiores volumes tem-se uma redução na formação das EAOs de até
74,20±0,86% e na de 5% chega-se a quedas de até 69,67±0,05% (TABELA 1).
Sendo assim, e seguindo a definição mais atual de antioxidantes e também pelas
Discussão
112
referências do uso popular
[15, 103]
, definiu-se a concentração de 5% como a de
escolha para o tratamento dos animais neste estudo.
Os animais estudados tiveram seus dados basais avaliados para a observação do
comportamento entre os grupos e a existência de alguma interferência que pudesse
se interpor aos dados finais. Conforme se verifica nos dados registrados na TABELA
4, houve diferença estatisticamente significante entre os grupos de animais controles
e os grupos diabéticos para os níveis glicêmicos. Segundo os estudos com ratos
diabéticos experimentais, os índices de glicemia destes ratos devem se apresentar
acima de 250 mg/dL
[142]
, sendo que os animais diabéticos aqui investigados
apresentaram média mínima no t0 de 392,17±94,40 mg/dL de glicemia. O peso
corporal dos animais neste período apresentou uma diferença estatística com a
Análise de Variâncias (p=0,34), porém, devido a pequena variação de pesos, não
houve poder estatístico para detectar qual o grupo apresentava tal diferença. Esta,
não apresenta relevância clínica, pois os pesos corporais variaram entre a média
mínima de 253,80±27,99 (DM) e 282,45±25,59 (CO20d) no t0.
Estudos histoquímicos em animais experimentais, como os desses grupos
diabéticos investigados, sugerem que deva existir algum mecanismo de apoptose
celular, pois as células beta pancreáticas são destruídas após a administração de
estreptozotocina. Isso se deve, provavelmente, à diminuição da concentração da
proteína tioredoxina, responsável pela neutralização dos radicais livres, ocorrendo,
assim, a superprodução de EAO, que pode determinar a morte das células
pancreáticas
[58]
.
A partir da indução do DM, uma quantidade de variáveis podem ser avaliadas no
modelo experimental. Da mesma forma, Leiter
[160]
afirma que quando os animais
apresentam a glicosúria e hiperglicemia progressiva, ocorre polidipsia e poliúria,
além de perda de peso corporal.
Após 60 dias de duração do presente estudo, o peso corporal dos animais dos
grupos DM, DM5d e DM20d apresentaram redução em comparação aos grupos
controles (TABELA 5). A perda de peso é um fator que pode ser indicativo da
redução da saúde dos animais, decorrente do procedimento experimental
[48]
.
Observou-se uma diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre as
Discussão
113
diferenças das médias dos t60 e t0 para os pesos corporais dos grupos CO, CO5d e
CO20d (FIGURA 19). Estes animais obtiveram aumento na variação de seus pesos,
sendo o grupo CO20d aquele que apresentou maior ganho. Esse comportamento
também foi verificado nos estudos de Dias
[19]
que demonstrou diminuição do peso
corporal dos ratos diabéticos comparados com os controles e isso pode ocorrer em
animais que permanecem por período prolongado em jejum, pois o glicogênio
hepático está diminuído, e o glicerol é convertido em glicose. Como esse mecanismo
é muito limitado, o substrato para a formação da glicose sangüínea é composto
pelas proteínas, justificando, assim, a diferença encontrada.
Estudos suportam a idéia de que há aumento na formação da uréia, quando
instalado o DM, bem como diminuição da incorporação do aminoácido leucina no
plasma e no fígado desses animais. O grau de incorporação pode estar reduzido em
torno de 50% quando comparados a animais sem a doença
[161]
. No estudo de
McNurlan e Garlick
[177]
, a hipótese de que a síntese das proteínas pode estar
diminuída foi confirmada, em aproximadamente, 50% nos animais diabéticos, além
de constatar diminuição nos níveis da síntese protéica por unidade de RNA. A
provável causa da diminuição nos níveis da síntese protéica pode estar relacionada
com a degradação do retículo endoplasmático
[161]
.
Sendo a hiperglicemia uma das características encontradas em portadores do
DM, verificaram-se os índices quando a doença foi instalada (após a indução) e após
os 60 dias do estudo. Segundo os dados referentes à TABELA 6 e FIGURA 20, não
foi observada alteração significativa entre o tempo zero e o tempo 60 dias dentre os
grupos (Ptempo=0,303). Mesmo nos animais diabéticos tratados, esta constante se
manteve, demonstrando apenas uma tendência na redução da glicemia. Pode-se
observar somente uma diferença de zero estatisticamente significante no grupo CO
entre a diferença das médias do T60 e T0 (Delta ou Δ). Estes dados vão contra aos
relatos dos benefícios do Croton cajucara BENTH, em sua grande maioria derivados
do empirismo e não estudos biofitoquímicos
[15, 100]
. Rosa
[178]
, em seus estudos com
CcB e animais diabéticos, também encontrou resultados semelhantes, sendo os
grupos diabéticos e diabéticos tratados com CcB somente diferentes
estatisticamente do grupo controle.
Discussão
114
A hiperglicemia e hipercolesterolemia diabética constituem um processo
responsável pela elevada morbidade e mortalidade de pacientes diabéticos
[179]
.
Pelos resultados analisados na TABELA 7 e FIGURA 21, que dizem respeito a
colesterolemia, verificou-se que houve uma variação entre as diferenças das médias
do tempo final comparado com o inicial, mostrando um aumento do delta (Δ) para
todos os grupos diabéticos, sendo significativo para os grupos DM e DM5d.
Analisando as médias dos níveis colesterolêmicos, pôde-se ver que mesmo com o
tratamento com CcB, não houve redução destes níveis no decorrer do tempo do
estudo. Os relatos do estudo de SOARES
[180]
, sobre os níveis de colesterol
plasmático em ratos diabéticos tratados por infusão de duas plantas usadas na
medicina popular, Syzygium jambolanum e Bauhinia candicans, demonstrou
aumento moderado, não sendo observado efeitos no tratamento com as plantas.
A relação entre o diabetes e o colesterol se dá pelas lipoproteínas, que são
compostos hidrossolúveis formados por fosfolipídeos, colesterol e triglicerídeos,
associados a proteínas, as chamadas apolipoproteínas. Quanto maior o componente
protéico das lipoproteínas, maior é a sua densidade. As lipoproteínas são
transportadoras de gordura pelo sangue. Elas são classificadas em quilomícrons,
lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), lipoproteína de densidade
intermediária (IDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de alta
densidade (HDL). A LDL contém a maior densidade do colesterol que é transportado
aos tecidos periféricos, podendo depositar o excedente de colesterol nas artérias. Já
a HDL, conhecida como fator protetor contra o excesso de colesterol, capta o
colesterol livre periférico, impedindo, assim, o aumento do colesterol total e
exercendo efeito protetor contra doenças cardiovasculares
[181]
.
Sabe-se que a LDL ao estar elevada em diabéticos, há maiores riscos de
desenvolvimento de doença cardiovascular. O diabetes está comumente
acompanhado de LDL aumentada
[181, 182]
. O aumento da LDL pode estar associado à
resistência insulínica
[183]
.
Refere-se também, que níveis elevados de triglicerídeos são observados em
pacientes com Diabetes Mellitus
[184]
. Segundo os resultados da TABELA 8, todos os
grupos iniciaram com médias de triglicerídeos semelhantes, porém ao final do
estudo, o grupo DM apresentou um grande aumento (Ptempo<0,001). Este mesmo
Discussão
115
grupo apresentou uma diferença entre as suas médias (Δ) estatisticamente diferente
de zero (FIGURA 22). Os estudos de Nogueira Junior
[184]
também demonstram que
os níveis séricos de triglicerídeos em ratos induzidos por STZ apresentaram um
aumento significativo para o grupo diabético em relação aos demais grupos. Os
grupos DM5d e DM20d apresentaram uma tendência de redução quando
comparados ao grupo DM (t60), mesmo não sendo estatisiticamente significante, e
se aproximando dos valores dos grupos controles. Dados de Gao et al. também
demonstraram redução nos níveis de triglicerídeos em ratos diabéticos tratados com
Córtex Lycii Radici, uma planta utilizada tradicionalmente pela medicina oriental
[185]
.
Considerando que o Diabetes Mellitus resulta no aumento da lipólise no tecido
adiposo, aumentando os níveis de ácidos graxos sanguíneos haverá uma maior
produção de corpos cetônicos pelo fígado. Entretanto, o ácido graxo em excesso
captado pelo fígado não será totalmente oxidado a corpos cetônicos pela
cetogênese. Assim este excesso de ácido graxo será direcionado para a síntese de
triglicerideos que serão transformados em VLDL. Então, as VLDLs em excesso não
serão depuradas pela lipase lipoprotéica, havendo a instalação de uma
hipertrigliceridemia. Além disso, a quantidade desta enzima é dependente do nível
de insulina no sangue, o que reforça o quadro de hipertrigliceridemia em condição
de Diabetes Mellitus
[186]
.
Outras importantes alterações são detectadas em indivíduos portadores de DM. É
o casos das enzimas de integridade hepática (aminotransferases), como: AST
(aspartato-aminotransferase), ALT (alanina-aminotransferase) e da FA (Fosfatase
Alcalina)
[187]
.
As aminotransferases são enzimas que catalisam especificamente a reação de
transaminação (transferência de um grupo amina de um aminoácido para um ácido
α-cetônico, para formar um novo aminoácido e um novo ácido α-cetônico). Exemplos
como a aspartato-aminotransferase (AST, anteriormente designada TGO -
transaminase glutâmica oxalacética) e alanina-aminotransferase (ALT ou TGP -
transaminase glutâmica pirúvica) estão amplamente distribuídas nas células,
especialmente no fígado e no miocárdio, além de estarem presentes nos rins e
músculo esquelético, mas sua taxa sanguínea é baixa. Esta taxa se eleva
consideravelmente em caso de lesões celulares
[188]
.
Discussão
116
A ALT é uma enzima presente nos hepatócitos. Quando uma célula é danificada,
ela libera esta enzima no sangue, onde é medida. A ALT aumenta drasticamente em
lesões hepáticas agudas, como na hepatite viral ou overdose de paracetamol ou
outras drogas. As elevações são geralmente medidas em múltiplos do limite máximo
do normal (ULN). A AST é similar à ALT de modo que é outra enzima associada às
células parenquimais do fígado. Apresenta-se aumentada em número na lesão
hepática aguda, mas também está presente nas hemácias e músculos esqueléticos
e cardíacos, não sendo então uma enzima específica do fígado. A proporção entre a
AST e a ALT é às vezes útil para diferenciar as causas da lesão hepática
[188]
.
Fosfatase Alcalina é uma hidrolase, isto é, é uma enzima capaz de remover
grupos fosfatos de um grande número de moléculas diferentes, incluindo
nucleotídeos, proteínas e alcalóides; como o próprio nome sugere, essa enzima é
mais ativa em soluções alcalinas. O processo de remoção desses grupos fosfatos é
conhecido como defosforilação. A fosfatase alcalina é produzida por diversos órgãos
e tecidos, como por exemplo: ossos, fígado e placenta. É uma enzima presente nas
células que delineiam os ductos biliares do fígado. Os níveis de FA no plasma irão
aumentar com grandes obstruções do ducto biliar, colestase intra-hepática ou
doenças infiltrativas do fígado
[188]
.
Na presente investigação se verifica uma diferença estatisticamente significante
entre os grupos, no tempo 60 dias, para as aminotransferases ALT (p=0,001) e FA
(p<0,001), conforme a TABELA 9. O grupo de animais diabéticos (DM) apresentou
diferença estatística comparado aos grupos controles e ao grupo DM5d,
apresentando este, uma redução nos valores de ALT porém, não retornando aos
níveis de controle. Tal fato também ocorre com os níveis de FA, onde os grupos
diabéticos apresentaram-se diferentes estatisticamente dos grupos controles e o
grupo DM5d apresentou uma diferença estatisticamente significante em relação aos
grupos DM e DM20d, porém não se aproxima aos valores dos grupos controles. Não
se observou diferença estatística para médias dos níveis de AST entre os grupos,
somente uma tendência de aumento no grupo DM (FIGURA 23). Foi percebida uma
diferença estatística significante para as médias de ALT entre o grupo DM
comparado com os grupos controles como mostra a FIGURA 24 (p<0,005). Os
grupos diabéticos tratados com CcB apresentaram uma tendencia de queda nos
Discussão
117
seus níveis, principalmente no grupo DM5d comparado ao DM. E, as médias dos
níveis de FA (FIGURA 25), apresentaram uma diferença significativa
estatisticamente dos grupos DM e DM20d para com os grupos controles (p<0,001) e
entre o DM5d com os grupos DM e DM20d, apresentando-se aquele reduzido em
comparação a estes (p<0,001). Em todas as análises das aminotransferases, não
foram observadas alterações nos grupos controles.
Estes dados se assemelham aos encontrados por Egesie
[189]
em seus estudos
com a administração do extrato aquoso da folha Ocimum gratissimum, planta
tradicional da medicina nigeriana, causando uma redução estatística significativa no
nível de glicose do plasma em ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina e,
evidenciando níveis altos de AST e ALT no plasma dos ratos diabéticos, com
redução após o tratamento.
Os aumentos das médias das enzimas ALT e FA, detectados no grupo diabético
da presente investigação, podem estar relacionados ao acúmulo de gordura no
fígado destes animais e devido à presença de vacúolos de gordura no citoplasma
das células hepáticas. Trata-se da esteatose hepática não alcoólica, uma doença
reconhecida cada vez mais como uma das causas principais da doença de fígado
crônica
[190]
. Estes testes bioquímicos são usados para exames complementares para
o diagnóstico da doença
[191]
. O risco da doença crônica de fígado é mais elevado
nos diabéticos, e o nível alanina-aminotranferase no plasma é um indicador sensível
de mortalidade da doença de fígado
[192]
. Hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia,
hipotireoidismo e Diabetes Mellitus também se associam a níveis aumentados de
ALT
[193]
.
Apesar dos relatos de hepatite tóxica notificados devido ao uso do CcB
[15]
, nos
grupos controle tratados com a Sacaca, não se observou aumento significativo nos
índices das transaminase, sugerindo através deste teste bioquímico, integridade
hepática. O fator de instalação da hepatite tóxica por CcB, ocorridos em muitos
casos no Brasil e mencionado na introdução deste trabalho, pode ser devido ao uso
prolongado e em dosagens muito concentradas deste chá pela população.
Observou-se também uma diminuição estatisticamente significativa no grupo DM
tratado por 5 dias com CcB comparado ao grupo DM para a enzima FA e uma
Discussão
118
tendência de diminuição para as enzimas AST e ALT. Isso pode ser explicado pela
ação antioxidante do EAC Croton cajucara BENTH, conforme os dados das
TABELAS 1, 2 e 3 e das FIGURAS 15, 16 e 17. Hiruma-Lima
[14]
, através de seus
estudos, demonstrou que o CcB possui um efeito protetor em diferentes modelos de
úlcera experimental em ratos, sendo esta atividade desencadeada pela estimulação
na síntese de prostaglandinas causada por antioxidantes
[14, 118, 194]
.
Os radicais livres, mediando a citotoxicidade e a peroxidação lipídica, são
associados com o envelhecimento das células e as doenças crônicas tais como o
câncer, Diabetes Mellitus, aterosclerose ou inflamação
[149]
. Um importante passo na
degradação das membranas celulares é a reação das Espécies Ativas de Oxigênio
com as ligações duplas dos ácidos graxos poli-insaturados, gerando hidroperóxidos
lipídicos. No dano de tais hidroperóxidos, uma variedade de grandes aldeídos pode
ser formada
[73]
. O malondialdeído (MDA), um composto formado pela cisão de
ácidos graxos poli-insaturados peroxidados, é um dos principais produtos da
peroxidação lipídica
[74]
. O MDA é reativo para os grupos amino das proteínas e
ácidos nucléicos, ao qual foi inferido ter efeitos mutagênicos e citotóxicos, e
possivelmente participar na geração de aterosclerose
[75]
. Desde que o MDA foi
encontrado em níveis elevados nas doenças relacionadas aos danos dos radicais
livres, ele foi utilizado extensamente como um índice de lipoperoxidação nas
ciências biológicas e médicas
[75]
.
O estudo dos mecanismos envolvidos nos danos celulares mediados por
compostos oxidantes é importante, assim como a avaliação dos biomarcadores do
estresse celular em tais circunstâncias, pois contribui e pode ajudar extremamente a
impedir o surgimento e o desenvolvimento de doenças relacionadas ao estresse
oxidativo
[195]
.
Neste trabalho, foi projetado e implementado uma metodologia, viável ao nosso
laboratório, para mensurar MDA derivatizado com DNPH por HPLC (FIGURA 26),
com base e referência descrita inicialmente por Mateos
[149]
. Foram realizadas a
padronização e a validação da técnica, avaliando concentrações conhecidas de
MDA. Conforme se observa na FIGURA 27, não houve diferença estatisticamente
significante entre as médias das áreas dos picos cromatográficos, referentes às
concentrações de MDA medidas em triplicatas, um vez por dia, durante três dias.
Discussão
119
Houve uma diferença apenas entre a média da Área 3 e as duas outras áreas da
concentração de MDA de 10µg/mL. Esta variação pode ser explicada por um erro
não intencional de pipetagem em uma das amostras que compôs a média da
concentração do 3º dia, resultando no desvio da média. Entretanto, esta variação
não interfere na validação do método, pois todas as outras médias de concentração
nos três dias apresentaram um comportamento constante e esperado.
O homogeneizado de fígado dos animais estudados foi avaliado por esta
medotodologia e, conforme a FIGURA 28, foi verificada uma diferença
estatisticamente significante para o grupo diabético (DM), em comparação aos
grupos controles (CO, CO5d e CO20d). O aumento da glicemia está diretamente
associado ao aumento de EAO em outros tecidos. Esse excesso de glicose pode
causar a glicação (processo que consiste na adição de glicose na porção N-terminal
da cadeia protéica e dos aminoácidos dentro da cadeia
[196]
) de proteínas, processo
este conhecido como “Reação de Maillard”
[197]
. Nesse processo, a molécula de
glicose pode sofrer uma oxidação por EAOs, formando os produtos avançados da
glicação, chamados também de AGEs (Advanced glycation end-products)
[59]
. A
glicação de proteínas pode levar à inativação de enzimas, incluindo as enzimas do
sistema antioxidante do organismo
[90]
.
Outra conseqüência do excesso de glicose no sangue é de a molécula sofrer uma
auto-oxidação, através da enolização, gerando um radical enediol. Este radical
transfere elétron não pareado a uma molécula de O
2
, gerando um ânion superóxido
e uma dicarbonila que ligará duas cadeias protéicas, formando uma ligação cruzada
e inativando-as
[43, 59]
. A enolização da molécula de glicose tem como conseqüência
o aumento na geração de EAOs, que pode levar a uma peroxidação lipídica
conduzindo à formação de malondialdeído
[59]
. Esta pode ser a justificativa plausível
que levou ao aumento dos níveis de MDA no grupo DM neste trabalho investigativo.
Mateos
[149]
, em seus estudos, também encontrou níveis semelhantes de MDA em
ratos diabéticos. Yokozowa
[198]
registrou níveis entre 3 e 8 nmol/mL de MDA no
plasma de ratos, conforme os níveis também encontrados nas análises da presente
investigação.
Discussão
120
Segundo ele, a utilização de antioxidantes é considerada benéfica devido ao seu
potencial protetor contra o desenvolvimento de múltiplas doenças associadas ao
estresse oxidativo. Um exemplo são os flavonóides, presentes nas plantas, que
exibem uma forte atividade biológica varredora de radicais livres. Eles podem inibir a
lipoperoxidação e a atividade enzimática de sistemas como o da lipoxigenase e
cicloxigenase, processos associados à doença cardiovascular
[149]
.
Os resultados da FIGURA 28 também demonstram uma queda dos níveis de
MDA nos grupos diabéticos tratados, demonstrando a provável ação antioxidante do
Croton cajucara BENTH, que foi anteriormente demonstrada in vitro. Rosa
[178]
observa aumento das substâncias ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) nos grupos
diabético e tratado por um período de 20 dias com o CcB, sugerindo uma ação pró-
oxidante da planta. Nos resultados encontrados neste presente estudo, verifica-se
um aumento do grupo DM20d em relação ao grupo CO, porém registrando-se com
valores inferiores ao grupo DM. Os grupos controles tratados por 5 e 20 dias
apresentaram somente uma tendência de aumento das médias de MDA, porém não
estatisticamente significativa.
Como o estresse oxidativo é o resultado do desequilíbrio entre a geração das
espécies ativas de oxigênio (e/ou nitrogênio) e a capacidade de defesa corporal,
tanto endógena quanto exógena, e sendo o sistema de defesa antioxidante
enzimático um dos componentes mais ativos deste complexo, foram avaliados os
níveis da enzima glutationa peroxidase (GPx) nos fígados dos ratos deste estudo em
apreço.
As peroxidase são enzimas que utilizam uma variedade de redutores celulares
para inativar peróxidos
[199]
. Em mamíferos, as principais peroxidases são as
glutationas dependentes, como por exemplo a GPx, sendo a principal defesa contra
o H
2
O
2
na mitocrôndria, já que esta organela, de maneira geral, não apresenta a
enzima catalase. Há um consenso sobre as mudanças nas atividades das enzimas
antioxidantes de diferentes órgãos em ratos diabéticos
[200]
. Embora alguns estudos
mostrem que a atividade das enzimas SOD, catalase e glutationa peroxidase no
Diabetes Mellitus seja reduzida
[200-202]
, outros autores apontam para o aumento da
atividade em ratos diabéticos induzidos por STZ
[203, 204]
. Essa aparente contradição
Discussão
121
pode ser devida à especificidade do tecido, variações na severidade ou duração da
doença, ou outras condições experimentais
[205]
.
No presente estudo, conforme se observa na TABELA 10 e na FIGURA 29, não
se verifica diferença estatisticamente significante para a atividade da enzima GPx.
As enzimas SOD e catalase, para estes mesmos grupos de animais, já foram
avaliadas pelo nosso grupo de pesquisa, por Rosa
[178]
, demonstrando um aumento
da atividade da superóxido dismutase no grupo DM comparado ao CO,
provavelmente em decorrência da dismutação do íon superóxido que está elevado
quando do estresse oxidativo
[206]
. Houve uma redução da atividade nos diabéticos
após administração de CcB nos grupos de 5 e 20 dias, sugerindo uma atividade
antioxidante da planta. Já na enzima catalase, não houve diferença estatisticamente
significativa, devido, provavelmente, a uma menor formação de peróxido de
hidrogênio pela ação da SOD aumentada
[178]
.
A atividade da catalase apresenta-se com um maior espectro do que a da
glutationa peroxidase para o H
2
O
2
, implicando na detoxificação, quando em
concentração elevada, enquanto a GPx atua em baixas concentrações deste
peróxido. Em órgãos que possuem atividade elevada de catalase, como é o caso do
fígado, a concentração de peróxido de hidrogênio é menor
[7]
. Esta, pode servir como
explicação para a falta de diferença estatística dos níveis de GPx nos nossos grupos
estudados, quando se detecta a existência predominante de outras vias na
depuração das EAOs, sendo provável a ação da superóxido dismutase.
Pelos resultados expostos e discutidos neste trabalho, tendo em vista os objetivos
do estudo dos efeitos do extrato aquoso da casca do caule de Croton cajucara
BENTH em ratos diabéticos e seu provável potencial antioxidante, podem-se inferir
as conclusões que seguem.
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO______________
Mediante o que foi estudado bibliográfica e experimentalmente, tendo como
elementos os objetivos propostos, mais uma vez orientados para a conclusão deste
trabalho, registra-se que:
- O extrato aquoso da casca do Croton cajucara BENTH, a partir do ensaio
enzimático da Xantina Oxidase por HPLC apresentou capacidade antioxidante
dependente de volume e concentração.
- Na avaliação in vivo, utilizando a linhagem de leveduras de Saccharomyces
cerevisiae proeficiente e deficiente no sistema de defesa antioxidante da enzima
superóxido dismutase tratadas com EAC de CcB, existiu um aumento na
sobrevivência celular, sendo significante em doses alta do extrato da planta,
demonstrando seu potencial antioxidante.
- Os pesos corporais dos animais diabéticos apresentaram-se reduzidos em
comparação aos controles e o EAC de CcB não apresentou nenhum efeito quanto a
este parâmetro.
- Os níveis glicêmicos, colesterolêmicos e triglicéricos dos ratos diabéticos
tratados mostraram apenas uma tendência de redução, sendo que o grupo DM
tratado por 5 dias apresentou maior redução, apontando para um efeito antioxidante
do CcB no uso agudo.
- As provas de integridade hepática para os grupos controles tratados
apresentaram-se inalteradas, mas às dos grupos diabéticos tratados apresentaram
redução nos níves de alanina-aminotransferase e fosfatase alcalina, tendo, esta
Conclusão
124
última, uma redução significativa no grupo DM 5d em relação ao diabético,
demonstrando a ação antioxidante do CcB em um tratamento de 5 dias.
- A metodologia para medir o marcador de lipoperoxidação, malondialdeído, por
cromatografia líquida de alta eficiência foi implantada, padronizada e validada,
demonstrando uma queda dos níveis de MDA nos grupos diabéticos tratados,
acreditando-se que o CcB esteja agindo com antioxidante e revertendo o quadro
lipoperoxidativo.
- A enzima glutationa peroxidase não apresentou alterações significativas entre os
grupos estudados.
Tendo em vista os resultados obtidos, neste presente estudo, podemos concluir
que o extrato aquoso da casca do caule de Croton cajucara BENTH possui ação
antioxidante nos modelos propostos, tanto in vitro, quanto in vivo, em ratos
diabéticos experimentais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS__________________
1. Nathan, D., J. Meigs, and D. Singer, The epidemiology of cardiovascular
disease in type 2 diabetes mellitus: how sweet it is, or is it? Lancet, 1997.
350(1): p. 14-19.
2. SAÚDE., M.D. (1996) Ministério da Saúde: Diabetes mellitus: guia básico
para diagnóstico e tratamento. Volume,
3. Asbun, J. and F.J. Villarreal, The Pathogenesis of Myocardial Fibrosis in
the Setting of Diabetic Cardiomyopathy. Journal of the American College
of Cardiology, 2006. 47(4).
4. Halliwell, B., Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the
end (of the beginning). Free Radic Res, 1999. 31(4): p. 261-72.
5. Mehta, J.L., et al., Oxidative stress in diabetes: A mechanistic overview
of its effects on atherogenesis and myocardial dysfunction. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2006. in press.
6. Atli, T., et al., Oxidative stress and antioxidant status in elderly diabetes
mellitus and glucose intolerance patients. Archives of Gerontology &
Geriatrics, 2004. 39(3): p. 269-275.
7. Salvador, M. and J.A. Henriques, Radicais livres e a resposta celular ao
estresse oxidativo. 2004, Canoas: Ed. da Ulbra.
8. Halliwell, B., Free radicals and metal ions in health and disease. Proc
Nutr Soc, 1987. 46(1): p. 13-26.
9. van Acker, S.A., et al., Structural aspects of antioxidant activity of
flavonoids. Free Radic Biol Med, 1996. 20(3): p. 331-42.
10. Cao, G., E. Sofic, and R.L. Prior, Antioxidant and prooxidant behavior of
flavonoids: structure-activity relationships. Free Radic Biol Med, 1997.
22(5): p. 749-60.
11. Peres, W., et al., The flavonoid quercetin ameliorates liver damage in rats
with biliary obstruction. J Hepatol, 2000. 33(5): p. 742-50.
12. Day, A., et al., Human metabolism of dietary flavonoids: identification of
plasm metabolites of quercetin. Free Radicals Research, 2001. 35: p. 941-
952.
13. Costa, M., et al., Screening in mice of some medicinal plants used for
analgesic purposes in the state of Sao Paulo. Part II. J Ethnopharmacol,
1989. 27(1-2): p. 25-33.
14. Hiruma-Lima, C.A., et al., Gastroprotective effect of essential oil from
Croton cajucara BENTH. (Euphorbiaceae). J Ethnopharmacol, 2000.
69(3): p. 229-34.
15. Maciel, M.A.M., et al., Plantas Medicinais: a necessidade de estudos
multidisciplinares. Quim. Nova, 2002. 25(3): p. 429-438.
16. Karatas, F., M. Karatepe, and A. Baysar, Determination of free
malondialdehyde in human serum by high-performance liquid
chromatography. Anal Biochem., 2002. 311(1): p. 76-9.
Referências Bibliográficas 127
17. Collins, C.H., G.L. Braga, and P.S. Bonato, Introdução a Métodos
Cromatográficos. 1993, Campinas: Unicamp.
18. Mannervik, B., Methods in Enzymology: Glutathione peroxidase.
Academic Press. Vol. 113. 1985, New York.
19. Dias, A.S., O Antioxidante Quercetina diminui o Estresse Oxidativo
hepático em ratos diabéticos., in PPg em Ciências Biológicas: Fisiologia.
2005, Universidade Federal do Rio Grande do Sul: Porto Alegre. p. 111.
20. Cingolani, H. and A. Houssay, Fisiologia Humana de Houssay. 7 ed.
2004, Porto Alegre: Artmed.
21. Galbo, H., Exercise and diabetes. Scand J Sports Sci, 1988. 10(3): p. 89-
95.
22. Oliveira, R.F., Diabetes Dia-a-Dia: guia para o diabético, seus familiares,
amigos e menbros das equipes de saúde. , ed. 2. 2002, Rio de Janeiro:
Revinter.
23. SILVERTHORN, D.V., Fisiologia Humana: uma abordagem integrada. 2
ed. 2003, São Paulo: Manole.
24. Harris, M. and G. Cahill, Members od NIH diabetes data group workshop:
a draft classification of diabetes mellitus and other categories of glucose
tolerance. Diabetes, 1978. 27: p. 1112-1125.
25. Ministério da Saúde, B., Diabetes Mellitus. . Caderno de Atenção Básica.
Secretaria de Atenção à Saúde, 2006. n. 16: p. 64.
26. DIABETOLOGIA., S.P.D. (2006) Definição, diagnóstico e classificação da
DM. Volume,
27. Thompson, K.H. and D.V. Godin, Micronutrients and antioxidants in the
progression of diabetes. Nutrition Research, 1995. 15: p. 1377-1410.
28. Bauer, A.C., Avaliação do estresse oxidativo e do efeito citoprotetor de
tocoferóis sobre a viabilidade de ilhotas pancreáticas submetidas ao
processo de isolamento., in Clinica Médica e Ciências da Saúde da
Faculdade de Medicina. 2005, Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul: Porto Alegre. p. 130.
29. Wild, S.H., et al., Global prevalence of diabetes: estimates for the year
2000 and projections for 2030: response to Rathman and Giani. Diabetes
Care, 2004. 27: p. 2568-2569.
30. Gruber, W., et al., The economics of diabetes and diabetes care. World
Health Organisation. 1998, Brussels: International Diabetes Federation.
136.
31. Kirsten, V.R., Caracterização do modelo experimental NOD (nonobese
diabetic) em ambiente convencional., in Medicina e Ciências da Saúde:
Nefrologia. 2006, Pontifícia UniversidadeCatólica do Rio Grande do Sul:
Porto Alegre. p. 103.
32. Ferreira, S.R.G., et al., Population-based incidence of lDDM in the state of
São Paulo, Brazil. Diabetes Care, 2000. 16: p. 701-704.
33. Campos, J.J.B., et al., Incidência de Diabetes mellitus insulino-
dependente (Tipo1) na cidade de Londrina, PR, Brasil. Arquivos
Brasileiros de Endocrinologia e Metabolismo, 1998. 42: p. 36-44.
34. Keen, H., The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT). Health
Trends, 1994. 26: p. 41-43.
35. Nathan, D.M., Long-term complications of Diabetes mellitus. Journal of
Medicine, 1993. 328: p. 1676-1685.
Referências Bibliográficas 128
36. Milech, A. and J.E.P. Oliveira, Diabetes mellitus – clinica, diagnóstico,
tratamento multidisciplinar. 2004, São Paulo: Atheneu.
37. Ganong, W.F., Review of Medical Physiology ed. t. ed. 1995: McGraw-Hill
Professional. 928.
38. Dias, A.S., Avaliação da Lipoperoxidação e do fluxo sangüíneo na artéria
mesentérica de ratos diabéticos por indução de estreptozotocina., in
PPG Ciências Biológicas: Fisiologia. 2000, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul: Porto Alegre. p. 69.
39. Boundy, J.O., Enfermagem médico-cirúrgica. 2004, Rio de Janeiro:
Reichmann & Affonso Editores.
40. Low, P.A., K.K. Nickander, and H.J. Tritschler, The roles of oxidative
stress and antioxidant treatment in experimental diabetic neuropathy. .
Diabetes, 1997. 46: p. 385-425.
41. Baynes, W., Chemical modification of protein by lipids in diabetes. .
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2003. 41: p. 1159-1165.
42. Wolff, S.P. and R.T. Dean, Glucose autoxidation and protein
modification. The potential role of autoxidative glycosylation in diabetes.
Biochemistry Journal, 1987. 245: p. 243-250.
43. Wolff, S.P., Z.Y. Jiang, and J.V. Hunt, Protein glycation and oxidative
stress in Diabetes mellitus and ageing. Free Radical Biology and
Medicine, 1991. 10: p. 339-352.
44. Cameron, N.E., et al., Effects of alpha-lipoic acid on neuro-vascular
function in diabetic rats: interaction with essencial fatty acids.
Diabetologia, 1998. 41: p. 390-399.
45. van Dan, P.S., Oxidative stress and diabetic neuropathy:
pathophysiological mechanisms and treatament perspectives.
Diabetes/metabolism Research and Reviews, 2002. 18: p. 176-184.
46. Balda, C.A. and A. Pacheco-Silva, Aspectos imunológicos do diabetes
mellitus tipo 1. Revista da Associação Médica Brasileira, 1999. 45: p.
175-80.
47. Parslow, T.G., et al., Imunologia Médica. 2000, Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan. 702.
48. Andersen, M.L., et al., Princípios Éticos e Práticos do uso de animais de
experimentação. 2004, São Paulo: Universidade Federal de São Paulo.
179.
49. Andrade, A., S.C. Pinto, and R.S. Oliveira, Animais de Laboratório:
Criação e Experimentação. 2002, Rio de Janeiro: Editora Fiocruz.
50. Mezadri, T.J., V.A. Tomáz, and V.L.L. Amaral, Animais de
laboratório:cuidados na iniciação experimental. 2004, Florianópolis:
Editora UFSC.
51. Pickup, J.C. and C. Williams, Textbook of diabetes, ed. 2nd. 1997,
London: Blackwell Scientific Publications.
52. Hounsom, L. and D.R. Tomlison, Does neuropathy develop in animal
models? Clinical Neuroscience, 1997. 4: p. 380-389.
53. Melo, D.A.S., Comparação e análise da expressão do fator de ativação
núcleo Kappa B (NFKB) e da eletrogastrografia em ratos normais e
diabéticos. , in PPG Ciências Biológicas: Fisiologia. 2001, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul: Porto Alegre. p. 98.
Referências Bibliográficas 129
54. Yamamato, H., Y. Uchigata, and H. Okamoto, Streptozotocin and alloxan
induce DNA strand breaks and poly (ADP - ribose) synthetase in
pancreatic islets. Nature, 1981. 294: p. 284-286.
55. Uchigata, Y., et al., Effect of poly (ADPribose) synthetase inhibitor
administration to rats before and after injection of alloxan and
streptozotocin on islet proinsulin synthesis. Diabetes, 1983. 32: p. 316-
318.
56. Robbins, M.J., et al., Protection against streptozotocin-induced diabetes
by superoxide dismutase. Diabetologia, 1980. 18: p. 55-80.
57. Like, A.A. and A.A. Rossini, Streptozotocin-induced pancreatic insulitis:
a new model of Diabetes mellitus. Science, 1976. 193: p. 415-417.
58. Hotta, M., E. Yamato, and J. Miyazaki, Antioxidants in diabetes
management. Oxidative stress and pancreatic B-cell descruction in
insulin dependent diabetes mellitus. 2000, New York: Marcel Dekker Ed.
59. Halliwell, B. and J. Gutteridge, Free Radicals in Biology and Medicine. 4
ed. Biosciences. 2007, Oxford, New York: Oxford University Press. 851.
60. Campbell, M., Bioquímica. 2000, Porto Alegre: Artmed. 753.
61. Augusto, O., Radicais Livres: bons, maus e naturais. 2006, São Paulo:
Oficina de Textos. 115.
62. Barreiros, A.L.B.S., J.M. David, and J.P. David, ESTRESSE OXIDATIVO:
RELAÇÃO ENTRE GERAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS E DEFESA DO
ORGANISMO. Quim. Nova, 2006. 29(1): p. 113-123.
63. Husain, S.R., J. Cillard, and P. Cillard, Phytochemistry, 1987. 26: p. 24-89.
64. Boveris, A., et al., Mitochondrial metabolic states regulate nitric oxide
and hydrogen peroxide diffusion to the cytosol. Biochim Biophys Acta,
2006. 1757(5-6): p. 535-42.
65. Maxwell, S.R., Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs,
1995. 49(3): p. 345-61.
66. Meneghini, R.A., Toxicidade do Oxigênio. Ciência Hoje. 5: p. 28.
67. Cohen, M., Free radicals in ischemic and reperfusion myocardial injury:
is this time for clinical trials? Ann Intern Med, 1989. 111: p. 918-31.
68. Halliwell, B., J.M.C. Gutteridge, and C.E. Cross, J. Lab. Clin. Med., 1992.
119: p. 598.
69. Yokozawa, T., et al., Magnesium lithospermate B suppresses the
increase of active oxygen in rats after subtotal nephrectomy. Nephron,
1997. 75(1): p. 88-93.
70. Kozlov, A.B., E.A. Ostrachovitch, and I.B. Afanas'ev, Mechanism of
inhibitory effects of chelating drugs on lipid peroxidation in rat brain
homogenates. Biochem Pharmacol, 1994. 47(5): p. 795-9.
71. Southorn, P.A. and G. Powis, Free radicals in medicine. I. Chemical
nature and biologic reactions. Mayo Clin Proc, 1988. 63(4): p. 381-9.
72. Southorn, P.A. and G. Powis, Free radicals in medicine. II. Involvement in
human disease. Mayo Clin Proc, 1988. 63(4): p. 390-408.
73. Pilz, J., I. Meineke, and C.H. Gleiter, Measurement of free and bound
malondialdehyde in plasma by high-performance liquid chromatography
as the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative. J. Chromatogr. B, 2000.
742(2): p. 315-25.
74. Suttnar, J., J. Cermak, and E. Dyr, Solid-phase extraction in
malondialdehyde analysis. Anal. Biochem., 1997. 249(1): p. 20-23.
Referências Bibliográficas 130
75. Suttnar, J., L. Másová, and J. Dyr, Influence of citrate and EDTA
anticoagulants on plasma malondialdehyde concentrations estimated by
high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci
Appl, 2001. 751(1): p. 193-7.
76. Bird, R.P. and H.H. Draper, Comparative studies on different methods of
malonaldehyde determination. Methods Enzymol., 1984. 105: p. 299-305.
77. Esterbauer, H., et al., Separation and characterization of the aldehydic
products of lipid peroxidation stimulated by ADP-Fe2+ in rat liver
microsomes. Biochem. J., 1982. 208: p. 129-140.
78. Ekstrom, T., et al., Recovery of malondialdehyde in urine as a 2,4-
dinitrophenylhydrazine derivative analyzed with high-performance liquid
chromatography. Chem. Biol Interact., 1988. 66: p. 177-187.
79. Cordis, G.A., et al., Estimation of the extent of lipid peroxidation in the
ischemic and reperfused heart by monitoring lipid metabolic products
with the aid of high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr.,
1993. 632: p. 97-103.
80. Buege, J.A. and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods
Enzymol, 1978. 52: p. 302-10.
81. Meerson, F.Z., et al., [Role of lipid peroxidation in the pathogenesis of
ischemic injury and the antioxidant protection of the heart]. Kardiologiia,
1982. 22(2): p. 81-93.
82. Halliwell, B., Reactive species and antioxidants. Redox biology is a
fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol, 2006. 141(2): p. 312-22.
83. Sies, H. and M.E. Murphy, Role of tocopherols in the protection of
biological systems against oxidative damage. J Photochem Photobiol B,
1991. 8(2): p. 211-8.
84. Harris, E.D., Regulation of antioxidant enzymes. Faseb J, 1992. 6(9): p.
2675-83.
85. Mayevsky, A. and B. Chance, Oxidation-reduction states of NADH in
vivo: From animals to clinical use. Mitochondrion, 2007. 7(5): p. 330-9.
86. Chance, B., H. Sies, and A. Boveris, Hydroperoxide metabolism in
mammalian organs. Physiol Rev, 1979. 59(3): p. 527-605.
87. Acker, S.B.E., et al., Structural aspects of antioxidant activity of
flavonoids. Free Fadica Biology & Medicine, 1996. 20(3): p. 331-342.
88. Saija, A., et al., Flavonoids as antioxidants agents: importance of their
interaction with biomembrances. Free Radial Biology e Medicine, 1995.
19(4): p. 481-486.
89. West, I., Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet. Med., 2000.
17(3): p. 171-80.
90. Rellier, N. and e. al., In vitro and in vivo alterations of enzymatic
glycosylation in diabetes. Life Sci, 1999. 64(17): p. 1571-83.
91. Cameron, N.E. and M.A. Cotter, Metabolic anda vascular factors in the
pathogenesis of diabetic nephropathy. Diabetes, 1997. 46(2): p. 31-37.
92. Gupta, B., M. Nehal, and N. Baquer, Effects of experimental diabetes on
the activities of hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and
catecholamines in rat erythrocytes of different ages. Indian J. Exp. Biol.,
1997. 35: p. 792-5.
93. Dias, A.S., et al., Alterações Gastrointestinais no Diabetes Mellitus:
estresse oxidativo e fluxo sanguíneo da artéria mesentérica - estudo
experimental. Arq Gastroenterol, 2004. 41(2).
Referências Bibliográficas 131
94. Ceriello, A., New Insights on oxidative Stress and Diabetic Complications
May Lead to a "Causal" Antioxidant Therapy. Diabetes Care, 2003. 26(5):
p. 1589-96.
95. Rolo, A. and C.M. Palmeira, Diabetes and mitocondrial function: role of
hyperglicemia and oxidative stress. Toxology and Applied
Pharmacology, 2006. 212: p. 167-178.
96. Oksuz, S., et al., Biologically active compounds from the Euphorbiaceae;
Part 1. Triterpenoids of Euphorbia nicaeensis subsp. glareosa. Planta
Med, 1993. 59(5): p. 472-3.
97. Pezzuto, J.M., et al., DNA as an affinity probe useful in the detection and
isolation of biologically active natural products. J Nat Prod, 1991. 54(6):
p. 1522-30.
98. Simões, J.C., et al., Dehidrocrotonina, um norditerpeno de Croton
cajucara BENTH (Euphorbiaceae) Ciência e Cultura, 1979. 31: p. 1140.
99. Alviano, W.S., et al., Antimicrobial activity of Croton cajucara BENTH
linalool-rich essential oil on artificial biofilms and planktonic
microorganisms. Oral Microbiol Immunol, 2005. 20(2): p. 101-5.
100. Hiruma-Lima, C.A., et al., Effect of essential oil obtained from Croton
cajucara BENTH. on gastric ulcer healing and protective factors of the
gastric mucosa. Phytomedicine, 2002. 9(6): p. 523-9.
101. Luna Costa, A.M., et al., Antioestrogenic effect of trans-dehydrocrotonin,
a nor-clerodane diterpene from Croton cajucara BENTH. in rats.
Phytother Res, 1999. 13(8): p. 689-91.
102. Silva, R.M., et al., Cardiovascular effects of trans-dehydrocrotonin, a
diterpene from Croton cajucara in rats. Vascul Pharmacol, 2005. 43(1): p.
11-8.
103. Maciel, M.A.M., et al., Terpenoids form Croton Cajucara. Phytochemistry,
1998. 49: p. 823-28.
104. Lorenzi, H. and F.J. Matos, PLANTAS MEDICINAIS NO BRASIL: nativas e
exóticas. 2002, São Paulo: Pantarum. 544.
105. Miotto, A.M., Perfil lipídico e sensibilidade adrenérgica em átrio direito
de ratos normo e hipercolesterolêmicos tratados ou não com infuso das
cascas de Croton cajucara BENTH. 2001, Universidade Estadual de
Campinas: Campinas. p. 73.
106. Maciel, M.A., et al., Ethnopharmacology, phytochemistry and
pharmacology: a successful combination in the study of Croton
cajucara. J Ethnopharmacol, 2000. 70(1): p. 41-55.
107. Agner, A.R., et al., Antigenotoxicity of trans-dehydrocrotonin, a
clerodane diterpene from Croton cajucara. Planta Med, 2001. 67(9): p.
815-9.
108. Campos, A., et al., Investigations on the antinociceptive activity of crude
extracts from Croton cajucara leaves in mice. Fitoterapia, 2002. 73(2): p.
116-120.
109. Cavalcante, F.L.M., Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental (FESBE). 1988, Anais: Caxambu, Brasil.
110. Oliveira, M.C., et al. Reunião Anual da Federação de Sociedades de
Biologia Experimental (FESBE). 1995. Serra Negra, Brasil.
111. Araujo, V.C., et al., Acta Amazônica. 1971. 1: p. 45.
112. Lopes, D., et al. in 30th International Symposium on Essential Oils. 1999.
Leipzig.
Referências Bibliográficas 132
113. Farias, R.A.F., et al., Effects of Croton cajucara Extract on serum lipids of
rats fed a high fat diet. Phytother. Res., 1996. 10: p. 697-699.
114. SILVA, R.M., et al., Blood glucose- and triglyceride- lowering effect of
trans-dehydrocrotonin, a diterpene from Croton cajucara BENTH in rats.
Diabetes, Obesity and Metabolism, 2001a. 3: p. 452 - 456.
115. Silva, R.M., et al., Effect of trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane
diterpene from Croton cajucara on experimental hypertriglyceridaemia
and hypercholesterolaemia induced by Triton WR 1339 (tyloxapol) in
mice. Planta Med, 2001. 67(8): p. 763-5.
116. Silva, R.M., et al., The lipid-lowering effect of trans-dehydrocrotonin, a
clerodane diterpene from Croton cajucara BENTH in mice fed on high-fat
diet. J Pharm Pharmacol., 2001c. 53(4): p. 535-9.
117. Luper, S., A review of plants used in the treatment of liver disease: part
two. Altern Med Rev, 1999. 4(3): p. 178-88.
118. Gordon, M.H., Dietary antioxidants in disease prevention. Natural
Products Report, 1996. 4: p. 265-72.
119. Owen, R.W., B. Spiegelhalder, and H. Bartsch, Generation of reactive
oxygen species by the faecal matrix. Gut, 2000. 46: p. 225-232.
120. Ciola, R., Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho
- HPLC. 1998, São Paulo: Edgard Blücher.
121. Quattrocchi, O.A. and S.A. Andrizzi, Introducción a la HPLC: Aplicación
Y Práctica. 1992, Buenos Aires: Farro.
122. Blucher, E., Fundamentos da Cromatografia Líquida de Alto
Desempenho: HPLC. 1998, São Paulo: Químico.
123. Pompeiro, A.J.L.O., Técnicas e Operações Unitárias em Química
Laboratorial. 1983, Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian.
124. St Angelo, A., Lipid oxidation on foods. Crit. Rev. Food Sci Nutr., 1996.
36(3): p. 175-224.
125. Rabello-Gay, M.A.R. Rodrigues, and R. Monteleone-Neto, Mutagênese,
teratogênese e carcinogênese: métodos e critérios de avaliação. 1991,
Ribeirão Preto: Soc. Bras. Genet.
126. Maris, A.F., et al., Diauxic shift-induced stress resistance against
hydroperoxides in Saccharomyces cerevisiae is not an adaptive stress
response and does not depend on functional mitochondria. Curr Genet,
2001. 39(3): p. 137-49.
127. Tieppo, J., et al., Evaluation of the protective effects of quercetin in the
hepatopulmonary syndrome. Food Chem Toxicol, 2007. 45(7): p. 1140-6.
128. Boeira, J.M., et al., Genotoxic and recombinogenic activities of the two
beta-carboline alkaloids harman and harmine in Saccharomyces
cerevisiae. Mutat Res, 2002. 500(1-2): p. 39-48.
129. De Winde, J.H., T. J.M., and J. Winderick, Adaptation to nutrient
depletion in yeast. In: MAGER, W.H. (ED) Yeast stress responses.
Springer-Verlag, Heidelberg,, 1997: p. 7-52.
130. Gancedo, J.M., Yeast carbon catabolite repression. . Microbiology and
Molecular Biology Reviews., 1998. 62: p. 334-361.
131. Pringle, J.R. and L.H. Hartwell, The Saccharomyces cerevisiae cell cycle.
The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae, life cycle
and inheritance., ed. J.N. Strathern, E.W. Jones, and J.R. Broach. 1982,
New York: Cold Spring Hargbor.
Referências Bibliográficas 133
132. Fuge, E.K. and M. Werner, Stationary phase in the yeast Saccharomyces
cerevisiae. . Yeast Stress Response, 1997: p. 57-94.
133. Gralla, E.B. and D.J. Kosman, Molecular genetics os superoxide
dismutase in yeast and related fungi. Advances in Genetics, 1992. 30: p.
251-319.
134. Longo, V.D., E.B. Gralla, and J.S. Valentine, Superoxide dismutase
activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces
cerevisiae. The Journal Biological Chemistry, 1999. 271(21): p. 12275-
12280.
135. Izawa, S., Inque, Y. and A. Kimura, Oxidative stress response in yeast:
effect of glutathione on adaptation to hydrogen peroxide stress in
Saccharomyces cerevisiae. Federation of European Biochemical
Societies., 1995: p. 73-76.
136. Brennan, R.J. and R.H. Schiestl, Free radicals generated in yeast by the
Salmonella test negative carcinogens benzenes, urethane, thiourea and
auramine O. Mutation Research, 1998. 403: p. 65-73.
137. Lee, J.H., et al., Protective role of superoxide dismutases against
ionizing radiation in yeast. Biochemica et Biophysica Acta, 2001. 1526: p.
191-198.
138. Henriques, J.A.P., et al., Espécies reativas de oxigênio e avaliação de
antioxidantes em sistemas biológicos. In: Serafini, L. A., Barros, N.,
Azevedo, J.L. Biotecnologia na agricultura e na agroindústria. 2001,
Guaíba: Editora Agropecuária.
139. Maris, A.F., et al., Diauxic shift-induced stress resistance against
hydroperoxides in Saccharomyces cerevisiae is not an adaptative stress
response and does not depend on functional mitochondria. Current
Genetics, 2000. 39: p. 137-149.
140. Picada, J.N., et al., Differential mutagenic, antimutagenic and cytotoxic
responses induced by apomorphine and its oxidation product, 8-oxo-
apomorphine-semiquinone, in bacteria and yeast. Mutation Research,
2003. 539: p. 29-41.
141. Goldim, J.R. and M.M. Raymundo, Pesquisa em saúde e direitos dos
animais. 2 ed. 1997, Porto Alegre: HCPA. 28.
142. Takeuchi, K., et al., Induction of gastric lesions and hypoglycemic
response by food deprivation in streptozotocin-diabetic rats. Digestive
Diseases and Sciences, 1994. 39: p. 626-634.
143. Owen, R.W., T. Wimonwatwatee, and B. Spiegelhalder, A high
performance liquid chromatography system for quantification of
hydroxyl radical formation by determination of dihydroxy benzoic acids.
European Journal of Cancer Prevention, 1996. 5: p. 233-240.
144. Yost, R.W., et al., Practical Liquid Chromatography - An Introduction.
1980, Norwalk: Perkin Elmer.
145. Bernard, N. and A. Pecard, A Technique de prélivement d’chantilation de
sang chez lês petits animaux de laboratorie por ponction du plexus
ophthalmique. Journal de la Société de Biologie, 1951. 145: p. 1465.
146. Parcker, L. and J. Fuchs, Antioxidants in diabetes management. 2000,
New York: Ed. Marcel Dekker.
147. Bergmeyer, H., Methods of Enzymatic Analysis. Verlag Chemie, 1984. 8:
p. 141-8.
Referências Bibliográficas 134
148. Bucolo, G. and H. DAvid, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,
1973. 19: p. 476.
149. Mateos, R., et al., Determination of malondialdehyde (MDA) by high-
performance liquid chromatography in serum and liver as a biomarker
for oxidative stress. Application to a rat model for hypercholesterolemia
and evaluation of the effects of diets rich in phenolic antioxidants from
fruits. Journal of Chromatography B, 2005. 827: p. 76-82.
150. Lowry, O.H., et al., Protein measurement with the foline reagent. J Biol
Chem, 1951. 193: p. 265-275.
151. Guntzler, W.A. and L. Flohe, Glutathione peroxidase. Handbook of
Methods for Oxygen Radical Research. 1985, Florida: CRC Press.
152. Federation, I.D., Diabetes Atlas. 2007, IDF.
153. McLellan, K., et al., Custo do atendimento ambulatorial e gasto
hospitalar do Diabetes Mellitus tipo 2. Saúde em Revista., 2006. 8(20): p.
37-45.
154. Diabetes, S.B.d., Consenso Brasileiro sobre diabetes 2002: diagnóstico e
classificação do Diabetes Mellitus tipo 2. 2003, Rio de Janeiro:
Sociedade Brasileira de Diabetes. 51.
155. Hernandorena, B.H.G., J.C.R.; and J.C.R. Garcia, Animales de
laboratório en la endocrinología: biomodelos de la Diabetes mellitus
tipo1. Revista Cubana de Endocrinología, 2001. 13: p. 168-177.
156. Lewis, C. and A.R. Barbiers, Streptozotocin, a new antibiotic. In vitro and
in vivo evaluation. Antibiotics annual, 1959. 7: p. 247-254.
157. White, F.R., Streptozotocin. Cancer Chemotherapy Reports. Vol. 30.
1963. 53.
158. Carter, S.K., L. Broder, and M. Friedman, Streptozotocin and metastatic
insulinoma. Annals of Internal Medicine, 1971. 74: p. 445-446.
159. Dall'ago, P., et al., Baroreflex and chemoreflex dysfunctionin
streptozotocin-diabectic rats. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, 1997. 30: p. 119-124.
160. Leiter, E.H., The NOD mouse: a model for insulin-dependent Diabetes
Mellitus. Current Protocols in Immunology, 1997. 24: p. 1-23.
161. Gitlin, N., The liver and systemic disease. 1997, New York: Churchill
Livingstone.
162. Williamson, J., et al., Hyperglicaemic pseudohypoxia and diabetics
complications. Diabetes, 1993(42): p. 801-8.
163. Aitken, R.J., Free radicals, lipid peroxidation and sperm function.
Reproduction, Fertility and Development, s.L, 1995. 7: p. 659-668.
164. Allen, J.C. and R.J. Hamilton, Rancidity in foods. 1983, London: Applied
Science. 199.
165. Therond, P., et al., Biomarkers of oxidative stress: an analytical
approach. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2000. 3: p. 373-84.
166. Larson, R.A., The antioxidants of higher plants. Phytochemistry, 1988.
27(4): p. 969-78.
167. Cotelle, A.C., Antioxidant proprieties of hydroxy-flavones. Free Radical
Biology and Medicine, 1996. 21(91): p. 35-43.
168. Kalil Filho, A., G. Kalil, and A. Luz, CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA
DE PLANTAS AROMÁTICAS E MEDICINAIS DA AMAZÔNIA BRASILEIRA
PARA USO HUMANO. EMBRAPA - Ministério da Agricultura e do
Abastecimento do Brasil, 2000. 50: p. 1-4.
Referências Bibliográficas 135
169. Araújo, V.d., et al. Óleos Essenciais da Amazônia contendo linalol. in
SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS. 1972. São Paulo:
Academia Brasileira de Ciências.
170. Perazzo, F., et al., Anti-inflamatory and antinociceptive activities of.
terpenoids from Croton cajucara BENTH. JORNADA PAULISTA DE
PLANTAS MEDICINAIS. Vol. 3. 1997, Campinas. 114-115.
171. Soares, D., A. Andreazza, and M. Salvador, Sequestering ability of
butylated hydroxytoluene, propyl gallate, resveratrol, and vitamins C and
E against ABTS, DPPH, and hydroxyl free radicals in chemical and
biological systems. Journal of Agric. Food Chem., 2003. 51: p. 1077-1080.
172. Kitts, D., Bioactive substance in food: identification and potencial use.
Canadia Journal of the Physiology and Pharmacology, 1994. 72: p. 423-
434.
173. Srinivasan, C., et al., Yeast lacking superoxide dismutase(s) show
elevated levels of “free iron” as measured by whole cell electron
paramagnetic resonance. J. Biol. Chem, 2000. 275: p. 29187-29192.
174. Tieppo, M., et al., Croton cajucara BENTH. leaf extract scavenges the
stable free radical DPPH and protects against oxidative stress induced
by paraquat. Biol Pharm Bull, 2006. 29(1): p. 161-5.
175. Dorland's, Dorland's Ilustrated Medical Dictionary. 25 ed. 1974, Filadéfia:
W. B. Saunders. 111.
176. Parcker, L. and H.J. Tritschler, Alpha-lipoic acid - the metabolic
antioxidant. Free Radical Biology & Medicine, 1996. 20: p. 625-6.
177. McNurlan, M. and P. Garlick, Protein synthesis in liver and small
intestine in protein deprivation and diabetes. Am J Physiol, 1981. 241: p.
238-45.
178. Rosa, F.S., Avaliação do Estresse Oxidativo e da Atividade Genotóxica
do Croton cajucara BENTH em Ratos Diabéticos, in PPG Diagnóstico
Genético e Molecular. 2007, Universidade Luterana do Brasil: Canoas. p.
89.
179. Sebbag, L., R. Forrat, and E. Canet, Effect of experimental non-insulin
requiring diabetes on miocardial microcirculation ischaemia in dogs.
European J Clin Invest, 1994. 24: p. 686-690.
180. Soares, J., S. Costa, and M. Cecim, GLUCOSE AND CHOLESTEROL
PLASMA LEVELS IN RATS WITH ALLOXAN-INDUCED Diabetes mellitus
TREATED WITH INFUSION OF Bauhinia candicans OR Syzygium
jambolanum. Ciência Rural, 2000. 30( 1): p. 113-118.
181. Waitzberg, D., Nutrição Oral, Enteral e Parenteral na Prática Clínica. 3 ed.
2001, São Paulo: Atheneu. 55-78.
182. Lee, W., W. Min, and S. Chun, Low-density lipoprotein subclass and its
correlating factors in diabetics. Clin Biochem., 2003. 36(8): p. 657-61.
183. Stewart, M., et al., Lipoprotein compositional abnormalities and insulin
resistance in type II diabetic patients with mild hyperlipidemia.
Arterioscler Thromb, 1993. 13(7): p. 1046-52.
184. Nogueira Jr, F., et al., Efeito do tamoxifeno no perfil lipídico de ratos
diabéticos por estreptozotocina. Acta Cir. Bras., 2005. 20(1): p. 69-75.
185. Gao, D., et al., Hypoglicemic effects and mechanisms of action of Cortex
Lycii Radicis on alloxan-induced diabetic mice. Yakugaku Zasshi, 2007.
127(10): p. 1715-21.
Referências Bibliográficas 136
186. Contreras, F., et al., Diabetes e Hipertensión Aspectos Clínicos y
Terapêuticos. Arch Vzlanos Farmacol Terap, 2000. 19: p. 9-24.
187. Martin, G. and J. Rand, Current understanding of feline diabetes: part 2,
treatment. Journal of Feline Medicine and Surgery, 2000. 2: p. 3-17.
188. Berg, J., J. Tymoczko, and L. Stryer, Biochemistry. 6 ed. 2006: WH
Freeman & Co.
189. Egesie UG, et al., Safety and hypoglycaemic properties of aqueous leaf
extract of Ocimum gratissimum in streptozotocin induced diabetic rats.
Niger J Physiol Sci., 2006. 21(1-2): p. 31-6.
190. Flegal, K., et al., Overweight and obesity in the United States: prevalence
and trends, 1960-1994. Int J Obes Relat Metab Disord. , 1998. 22: p. 39-47.
191. Salgado Jr, W., et al., Nonalcoholic fatty liver disease and obesity. Acta
Cir. Bras., 2006. 21(1): p. 72-78.
192. West, J., et al., Elevated serum alanine transaminase in patients with
type 1 or type 2 diabetes mellitus. Quarterly journal of medicine, 2006.
99(12): p. 871-876.
193. Gonçales Jr., F., et al., ELEVATED ALANINE AMINOTRANSFERASE
(ALT) IN BLOOD DONORS: AN ASSESSMENT OF THE MAIN
ASSOCIATED CONDITIONS AND ITS RELATIONSHIP TO THE
DEVELOPMENT OF HEPATITIS C. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 1998.
40(4): p. 219-224.
194. Lloris, J.M., et al., Gastric juice and analysis of basal and stimulated
secretion following treatment with rice-bran oil. Res. Commun. Chem.
Pathol. Pharmacol., 1991. 74: p. 245-248.
195. Mateos, R., L. Goya, and L. Bravo, Determination of malondialdehyde by
liquid chromatography as the 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative. A
marker for oxidative stress in cell cultures of human hepatoma HepG2.
Journal of Chromatography B, 2004. 805: p. 33-39.
196. Devlin, P., Manual de bioquímica com correlações químicas. 1999:
Correlação Clínica. 447
197. Baynes, W. and S. Thorpe, Role of oxidative stress in diabetic
complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes, 1999.
48(1): p. 1-9.
198. Yokozawa, T., K. Nakagawa, and J. Kitani, Agric. Food Chem., 2002. 50:
p. 35-49.
199. Frodovich, I., oxygen toxicity: a radical explanation. J. Exp. Biol., 1998.
201: p. 1203-09.
200. Dias, A.S., et al., Quercetin Decrease. Oxidative Stress, NF-kB activation,
and iNOS overexpression in liver of Streptozotocin-induced diabetic rats,
2005. 135: p. 2299-2304.
201. Coskum, O., et al., Quercetin, a flavonoid antioxidant, prevents anda
protects STZ-induced oxidative stress and B-cell damage in rat
pancreas. Pharmacol Res., 2005. 51: p. 117-23.
202. Ozkaya, Y., et al., The effect of exercise on brain antioxidant status of
diabetic rats. Diabetes Metab., 2002. 28: p. 344-84.
203. Yilmaz, H., et al., Protective effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE)
on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in daibetic rat liver.
Biochem. Mol. Toxol, 2004. 18: p. 234-8.
Referências Bibliográficas 137
204. Aliciguzel, Y., et al., Activities of xantine oxidoreductase and antioxidant
enzymes in different tissues of diabetic rats. J. Lab. Clin. Med., 2003.
142: p. 172-7.
205. Essani, N., G. McGuire, and A. Manning, Endotoxin-induced activation of
the nuclear transcription factor NF-kB in hepatocytes, Kupffer cells and
endothelial cells in vivo. J. Immunol., 1996. 156: p. 2956-63.
206. McCord, G., A. Michelson, and F. I., Superoxide and Superoxide
dismutase 1977, New york: Academic.
ANEXOS
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
