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Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
MARISA REZENDE CASTRO
Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica na desinfecção in vitro de canais
radiculares bovinos contaminados com cepa padrão de Enterococcus faecalis
ATCC 10100.
São José dos Campos, SP
2006
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Marisa Rezende Castro
“Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica na desinfecção in vitro de canais
radiculares bovinos contaminados com cepa padrão de Enterococcus faecalis
ATCC 10100.”
“Evaluation of the effect of the photodynamic therapy in the disinfection in vitro of
contaminated bovine root canals by standard strain of Enterococcus faecalis ATCC 10100.”
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Biomédica, como
complementação dos créditos necessários
para obtenção do título de Mestre em
Engenharia Biomédica.
Orientadora: Profª.Drª. Emília Ângela Loschiavo Arisawa
Co-orientadores: Prof. Dr. Egberto Munin
Profª. Msc. Sônia Khouri
São José dos Campos
2006
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Agradecimentos
A Deus,
Agradeço Sua presença constante iluminando o meu caminhar.
Ao meu marido Igor,
Por toda compreensão, afeto, estímulo para que a construção e término deste trabalho se
tornasse possível.
Por ser um pai adorável e suprir com tanto carinho minhas ausências.
Conhecer você mudou totalmente minha vida, descobrindo o verdadeiro sentido da
palavra amor.
Simplesmente Te Amo!
À minha filha Amanda,
Por toda a sua compreensão, paciência e carinho nos meus diversos momentos de angústia e
nervosismo.
Por tantas horas de ausência.
Ter você como minha filha é meu eterno estímulo para vencer.
Te amo!
À minha mãe Célia,
Por ser minha amiga e companheira.
Por sua incansável dedicação comigo e, sobretudo com a Amanda nas minhas infinitas horas de
ausência.
Sem a sua ajuda, com certeza não teria conseguido.
À minha irmã Sílvia e meu irmão César,
Por estarem ao meu lado sempre.
Sem a ajuda de vocês em todos os sentidos não teria conseguido.
Ao meu pai Luiz Fernando e meu irmão Roberto, Luciene e Isabela,
Por todo o estímulo e interesse na confecção deste trabalho.
Ao Magnífico Reitor da UNIVAP, Prof. Dr. Baptista Gargione Filho, ao Diretor do IP&D, Prof.
Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco e ao Diretor da Faculdade de Ciências da Saúde da
UNIVAP, Prof. Dr. Renato Amaro Zângaro, que possibilitaram a realização desta pesquisa.
À orientadora Profª. Drª. Emília Ângela Loschiavo Arisawa,
Por toda a sua dedicação, paciência, entusiasmo e estímulo para que este trabalho fosse realizado.
À Profª. MsC. Sônia Khouri,
Por apresentar-me ao mundo da Microbiologia.
Por todo seu incentivo e incansável dedicação para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Egberto Munin, pelas orientações técnicas.
Ao Prof. Dr. Hélio Plapler, por compor a banca examinadora.
À Profª. Drª. Iris Fróis,
Por seu carinho, estímulo e amizade eterna.
Por sua sabedoria inestimável.
Por ser minha referência profissional e pessoal.
Obrigada por seu incentivo, sempre!
À minha amiga Claudia Brasil,
Compartilhar cada etapa desse trabalho com você foi um grande presente – o verdadeiro
significado do que é ser amigo.
Construímos uma verdadeira amizade diante das inúmeras alegrias, conquistas,
contratempos e decepções vividas por cada uma de nós.
Minha eterna gratidão!
Ao técnico Guilherme Theodoro e às estagiárias Carol, Néia e Juliana – Laboratório de
Microbiologia da Faculdade de Ciências da Saúde,
Agradeço o auxílio de vocês na elaboração do material microbiológico.
A Leandro Procópio Alves – Laboratório de Aplicações de Laseres de alta potência em
Bioengenharia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D,
Agradeço por seu auxílio no sistema de acoplamento da fibra óptica.
Às bibliotecárias Rosângela Regis Cavalcanti Taranger e Rúbia Gravito de Carvalho
Gomes pela atenção e cordialidade no atendimento.
À empresa Kroman®, pela cessão temporária de aparelho laser de Arseneto Gálio Alumínio
(AsGaAl) com acoplamento de fibra óptica acrílica à peça de mão, desenvolvida pelo fabricante,
para utilização em canais radiculares.
“Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica na desinfecção in vitro de canais radiculares
bovinos contaminados com cepa padrão de Enterococcus faecalis ATCC 10100”
Resumo
As bactérias anaeróbias facultativas, como Enterococcus faecalis, compõem parte significativa da
microbiota de lesões endodônticas e são mais resistentes à atividade antimicrobiana, podendo
persistir em canais radiculares e no interior dos túbulos dentinários após terapia endodôntica. O
efeito da terapia fotodinâmica (PDT) vem sendo testado frente a estas espécies resistentes ao
tratamento convencional. Avaliou-se neste estudo a ação da terapia fotodinâmica sobre culturas
de Enterococcus faecalis in vitro. Quarenta dentes bovinos foram contaminados com um inóculo
de Enterococcus faecalis (ATCC 10100) obtido de acordo com a escala 0,5 de Mac Farland
(5x105UFC/mL). As quarenta raízes comprovadamente contaminadas com a suspensão de
Enterococcus faecalis foram então divididas em quatro grupos de 10 raízes cada um: G1:
irrigação com solução de hipoclorito de sódio a 1% por 15 minutos; G2: irradiou-se introduzindo
10mm da fibra óptica no canal radicular, com os parâmetros 685nm, 15mW por 2 minutos.
Removeu-se a fibra e, em seguida, posicionou-se a peça de mão na entrada do canal e nesta
posição acionou-se o laser com os parâmetros 685nm, 40mW por mais 2 minutos. G3: as raízes
receberam o corante azuleno a 25% / endo-PTC, 5 minutos. G4: as raízes receberam o corante
azuleno a 25% associado ao endo-PTC por um período de pré-irradiação de 5 minutos e foram
irradiadas da seguinte forma: introduziu-se a fibra 10mm no interior do canal radicular e
mantendo-a nesta posição acionou-se o laser (685nm, 15mW) por 2 minutos. Removeu-se a fibra
e, em seguida, posicionou-se a peça de mão na entrada do canal e nesta posição acionou-se o
laser (685nm, 40mW) por mais 2 minutos. Todas as amostras foram colhidas com cones de papel
absorvente que foram imediatamente mergulhados em tubos contendo 3 mL de caldo BHI (Difco,
EUA). Alíquotas de 0,2mL desses caldos foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI.
As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC antes da leitura dos resultados. Os resultados
foram avaliados através da análise qualitativa e/ou quantitativa de formação de unidades de
colônias (UFC) após incubação a 37ºC por 24hs. As quarenta placas semeadas para controle
positivo apresentaram um número incontável de colônias (superior a 100.000UFC/mL),
confirmando assim a contaminação de todos os canais. A observação das placas semeadas em G1
revelou a inexistência de colônias (zero UFC/mL), confirmando a ação bactericida dessa
substância. Por sua vez, as placas semeadas em G2 e G3 apresentaram número de colônias
superior a 100.000UFC/mL, semelhantes, portanto, às placas referentes ao grupo controle. Nas
placas correspondentes ao G4, nas quais foi realizada a terapia fotodinâmica, revelou a
inexistência de colônias (zero UFC/mL), confirmando a ação bactericida dessa terapia.
Palavras-chave: terapia fotodinâmica, laser de AlGaAs, Enterococcus faecalis
“Evaluation of the effect of the photodynamic therapy in the disinfection in vitro of
contaminated bovine root canals by standard strain of Enterococcus faecalis ATCC 10100”
Abstract
The facultative anaerobic bacteria, as Enterococcus faecalis, compose significant part of
microbiota of endodontic injuries and are more resistant to the antimicrobial activity, being able
to persist in root canals and inside the dentinal tubules after the endodontic therapy. The effect of
the photodynamic therapy (PDT) has been tested against these species resistant to the
conventional treatment. The action of the photodynamic therapy was evaluated in this study on
cultures of Enterococcus faecalis in vitro. Forty bovine teeth were contaminated by an inoculate
of Enterococcus faecalis (ATCC 10100) obtained according to the 0,5 Mac Farland scale
(5x105UFC/mL). The forty roots proven contaminated by the suspension of Enterococcus
faecalis were then divided in four groups of 10 roots each: G1: irrigation with a solution of 1%
sodium hypochlorite for 15 minutes. G2: radiating introducing 10 mm of the optic fiber in the
root canal and the laser with 685nm and 15mW was set for 2 minutes. Then the fiber was
removed and next the hand piece was placed at the entrance of the canal and the laser with
685nm and 40mW was set for 2 more minutes. G3: the roots received photosensitizer azulene
25% / endo-PTC for 5 minutes. G4: the roots received azulene 25% associated to the endo-PTC
for a period of pre-irradiation of 5 minutes and were radiated as follows: the fiber was introduced
10mm inside the root canal and in this position the laser with 685nm and 15mW was set for 2
minutes. Then the fiber was removed and next the hand piece was placed at the entrance of the
canal and the laser with 685nm and 40mW was set for 2 more minutes. All the samples were
taken by absorbent paper points which were immediately dived in glass tubes containing 3mL of
BHI broth (Difco, EUA). Aliquot of 0,2mL of these broths were plated on plates of Petri
containing BHI agar. The plates were incubated at 37ºC for 24 hours before the reading of the
results. The results were evaluated through qualitative and/or quantitative analysis of the
formation of units of colonies (UFC) after incubation at 37ºC for 24hs. The forty plates plated for
positive control presented a countless number of colonies (over 100.000UFC/mL), thus
confirming the contamination of all the canals. The observation of the G1 plates showed the
inexistence of colonies (zeroUFC/mL), confirming the bactericidal action of this substance. On
the other hand, the plates of groups 2 and 3 were presented with a number of colonies over the
100.000UFC/mL, similar, therefore, to the referring plates of the control group. In the
corresponding plates of G4, in which the photodynamic therapy was applied, showed the
inexistence of colonies (zero UFC/mL), confirming the bactericidal action of this therapy.
Keywords: photodynamic therapy, AlGaAs laser, Enterococcus faecalis
Lista de ilustrações
Figura 1: Microrganismos no interior dos túbulos dentinários – MEV. Fonte:
Cardoso; Gonçalves (2002)
22
Figura 2: Aparelho laser Kroman®
49
Figura 3: Fibra óptica acoplada à peça de mão, desenvolvida pelo fabricante
Kroman®
49
Figura 4: Medidor de potência Melles Griot®
49
Figura 5: Sistema de acoplamento realizado no IP&D
50
Figura 6: Corante azuleno a 25%
51
Figura 7: endo-PTC
51
Figura 8: Fluxo laminar
52
Figura 9: Cepa padrão
53
Figura 10: Escala Mc Farland
53
Figura 11: Inóculo bacteriano
53
Figura 12: Grupo 1 – Hipoclorito de sódio a 1%
54
Figura 13: Grupo 2 – Laser AlGaAs
54
Figura 14: Irradiação do fundo para a abertura do tubo
55
Figura 15: Grupo 3 – Azuleno a 25% + endo-PTC
55
Figura 16: Irradiação contornando as paredes laterais do tubo
56
Figura 17: Preparo do dente
58
Figura 18: Contaminação da raiz com inóculo de Enterococcus faecalis ATCC
10100
59
Figura 19: Coleta de amostra
59
Figura 20: Irradiação com fibra óptica
60
Figura 21: Canal preenchido com azuleno a 25% / endo-PTC
61
Figura 22: Acoplamento da fibra óptica desenvolvido no IP&D
62
Figura 23: Irradiação com a fibra óptica
65
Figura 24: Irradiação com a peça de mão
65
Figura 25: Placa representativa dos grupos controle
67
Figura 26: Placa representativa dos grupos 1 – hipoclorito de sódio
68
Figura 27: A - Placa representativa dos grupos 2 – laser isolado; B - Placa
representativa dos grupos 3 – fotossensitizador isolado e C - Placa
representativa dos grupos 4 – terapia fotodinâmica
68
Figura 28: Ação da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra
óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D – placas 1 a
10
69
Figura 29: Ação da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra
óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D – protocolo
misto – placas 1 a 10
71
Lista de tabelas
Tabela 1: Bactérias comumente isoladas de polpas necróticas infectadas. Fonte:
Cardoso; Gonçalves (2002)
20
Tabela 2: Redução bacteriana expressa em UFC/mL e porcentagem de redução após
utilização da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra
óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D
70
Lista de abreviaturas e siglas
AlGaAs: Arseneto Gálio Alumínio
Azul de O-Toluidina: azul de Orto-toluidina
ATCC: american type colection culture
BHI: brain heart infusion
CFU: colony-forming units
Ca(OH)
2
: hidróxido de cálcio
cm
2
: centímetro quadrado
EDTA: ácido diaminoetil- tetracético
Endo-PTC: endo – peróxido de uréia, tween 80, carbowax
HL: haste longa
He-Ne: Hélio-Neônio
J: Joule
K-file: Kerr-file
Laser: light amplification by stimulated emission of radiation
LED: light emission diode
log
10
: logaritmo de base 10
MEV: microscopia eletrônica de varredura
mL: mililitros
mm: milímetro
mW: miliwatt
NaOCl: hipoclorito de sódio
nm: nanometro
PDT: photodynamic therapy
P. gingivalis: Porphiromona gingivalis
S. sanguis: Streptococcus sanguis
Tipo H: tipo Hedströem
Tipo K: tipo Kerr
TBO: O-toluidine blue
UFC: unidades formadoras de colônia
W: Watt
µg: micrograma
µm: micrometro
Lista de símbolos
®: marca registrada
#: calibre
ºC: grau Celsius
Sumário
1. Introdução
17
1.1Objetivos gerais
19
1.2 Objetivos específicos
19
2. Revisão da literatura
20
2.1 Tratamento endodôntico convencional
20
2.2 Terapia fotodinâmica
41
3. Material e métodos (metodologia)
48
3.1 O equipamento laser
48
3.2 O fotossensitizador
50
3.3 Estudo piloto – manchamento dos dentes
51
3.4 Padronização do protocolo
52
3.4.1 Ação da terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em
tubos de ensaio
53
3.4.2. Ação da terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em
tubos de ensaio - modificação na forma de irradiação
56
3.4.3. Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis
utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento da Kroman®
57
3.4.4. Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis
utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D
62
3.4.5. Experimento principal: Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de
Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento
desenvolvido no IP&D – protocolo misto
64
4. Resultados
67
5. Discussão
72
6. Conclusão 82
Referências
83
Anexo A
87
Anexo B
88
17
1. INTRODUÇÃO
A terapia endodôntica tem como objetivo tratar as afecções pulpares e periapicais, de
forma a favorecer a reparação tecidual, permitindo, assim, o retorno do dente às suas funções
estética e funcional no menor tempo possível, o que se conhece como processo de cura. Uma
correta desinfecção dos canais radiculares aumenta significativamente o sucesso da terapia
endodôntica. Sendo assim, a intervenção visa eliminar os microrganismos, seus produtos e
substrato do sistema de canais radiculares.
A limpeza e desinfecção do sistema de canais radiculares consiste na remoção da matéria
orgânica viva ou em decomposição, microrganismos e seus produtos tóxicos, bem como todo e
qualquer material contido no canal radicular, que é alcançada por meio do preparo químico-
cirúrgico, caracterizado pelo uso simultâneo de instrumentos e substâncias químicas irrigadoras.
Porém, alguns microorganismos podem permanecer viáveis mesmo quando todos os passos são
realizados criteriosamente.
Teoricamente, todas as bactérias que habitam a cavidade bucal têm possibilidade de
invadir o sistema de canais radiculares, multiplicarem-se e, por fim, alcançarem os tecidos
periapicais. Entretanto, poucas são as espécies que detém essa capacidade.
Nas infecções endodônticas há predomínio de bactérias anaeróbias estritas. Bactérias
anaeróbias facultativas, normalmente, estão em menor número nessas infecções mas, quando
presentes, podem dificultar a terapia endodôntica e, consequentemente, o processo reparacional.
Dentre essas últimas podemos destacar Enterococcus faecalis, que se mostra altamente resistente
à ação dos medicamentos usados no decorrer do tratamento endodôntico. Os enterococos
parecem capazes de sobreviver no canal radicular sem necessitar de interação com outras
18
bactérias. Assim, mesmo em pequena quantidade, é possível que sobrevivam ao tratamento
antimicrobiano e persistam após a obturação do canal radicular.
A tecnologia laser apresenta-se, atualmente, como uma alternativa para o diagnóstico e
tratamento tanto na Medicina como na Odontologia. Para compreender a interação da radiação
laser com o tecido biológico é necessário conhecer as propriedades ópticas do tecido, o
comprimento de onda da radiação de excitação, a densidade de potência (irradiância) e de energia
(fluência) entregues a esse tecido. Com estes parâmetros, todos os possíveis efeitos causados pela
radiação no tecido podem ser previstos através de modelos físicos e matemáticos levando-se em
consideração as principais variáveis biológicas tais como: tipo de célula, perfusão sanguínea,
condução térmica, entre outras. Variando-se os parâmetros acima mencionados, quatro efeitos
podem ocorrer quando a radiação óptica atinge o tecido: o fotoquímico, o fototérmico, o
fotoelétrico e o fotomecânico.
Os lasers de alta potência causam fotodestruição celular pelo efeito fototérmico,
desnaturando o conteúdo protéico celular e vaporizando o conteúdo hídrico da célula. Como os
lasers de baixa potência não apresentam efeito fototérmico, a ação antimicrobiana destes lasers
tem sido estudada em um processo de interação fotoquímica conhecido como terapia
fotodinâmica ou fotossensitização letal. Nessa terapia, a luz emitida por um laser de baixa
potência ativa um fotossensitizador que passa então a exercer um efeito letal sobre as bactérias. O
fotossensitizador absorve a luz na forma de fótons, e transfere sua energia ao oxigênio e outras
moléculas, resultando na liberação de substâncias energéticas, altamente reativas e de meia-vida
curta, que interagem com sistemas biológicos provocando dano aos tecidos. O uso do corante
deve ocorrer de forma que a banda de absorção dos fotoiniciadores esteja em ressonância com o
comprimento de onda emitido pela fonte de luz. A toxicidade dos corantes deve ser observada,
justificando assim seu uso em pequenas concentrações.
19
Em Endodontia, o efeito da terapia fotodinâmica ou fotossensitização letal vem sendo
testado frente a espécies resistentes ao tratamento convencional. A associação do
fotossensitizador azuleno a 25% ao creme de endo PTC é sugerida por Garcez, 2002 porque
facilita sua remoção do interior do canal por irrigação com solução salina, água ou hipoclorito de
sódio o que afasta o risco de manchamento do dente. A banda de absorção desse corante é
ressonante com o comprimento de onda 685nm emitido pelo laser de Arseneto de Gálio e
Alumínio (AlGaAs).
1.1 Objetivo geral
Estudar a ação da terapia fotodinâmica em casos refratários ao tratamento endodôntico
convencional,
como uma técnica alternativa na clínica endodôntica.
1.2 Objetivo específico
Estudar a ação in vitro da terapia fotodinâmica em canais radiculares bovinos
contaminados com suspensão de Enterococcus faecalis.
20
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Tratamento endodôntico convencional
Haapasalo, Ranta e Ranta (1983), avaliaram o papel das bactérias facultativas Gram-
negativas em infecções periapicais persistentes em dois casos clínicos. Ambos não responderam à
terapia endodôntica convencional e à associação com medicação sistêmica, penicilina ou
penicilina e eritromicina. Os canais radiculares encontravam-se abertos e as amostras foram
colhidas com pontas de papel absorvente estéril para a análise bacteriológica. Os resultados
demonstraram que as principais espécies bacterianas encontradas pertenciam ao grupo do
enterococos (Tabela 1).
Gênero Espécies/Grupos comuns
Bactérias anaeróbias estritas
Bastonetes Gram-negativos Porphyromonas
Prevotella
Fusobacterium
Selenomonas
Campylobacter
P. gingivalis, P. endodontalis, P. intermedia, P.
nigrescens
P.oralis, P. oris, P. buccae, P. melaninogenica
F. nucleatum, F. necrophorum
S. sputigena
C. rectus, C. curvus
Bastonetes Gram-positivos Eubacterium
Propionibacterium
Lactobacillus
Actinomyces
E. alactolyticum. E. lentum
P. acnes
L. catenaforme, L. plantarum
A. israelii, A. viscosus
Cocos Gram-positivos Peptostreptococcus
P. anaerobius, P. micros, P. prevotii, P. magnus
Cocos Gram-negativos Veillonella V. parvula
Bactérias anaeróbias facultativas
Cocos Gram-positivos Streptococcus
Enterococcus
S. mitis, S. anginosus, S. constellatus, S.
intermedius, S. oralis, S. sanguis
E. faecalis, E. faecium
Bastonetes Gram-negativos Eikenella
Capnocytophaga
E. corrodens
C. gingivalis
Cocos Gram-negativos Neisseria N. sicca, N. flava
Bastonetes Gram-positivos Corynebacterium
Lactobacillus
Actinomyces
Propionibacterium
C. xerosis
L. acidophilus
A. naeslundii
P. propionicum
Tabela 1: Bactérias comumente isoladas de polpas necróticas infectadas. Fonte: Cardoso; Gonçalves (2002)
21
Byström e Sundqvist (1985), analisaram o efeito antibacteriano do irrigante hipoclorito de
sódio a 0,5% e a 5% em canais radiculares. Sessenta dentes unirradiculares com polpa necrosada,
câmara pulpar intacta e, evidenciando radiograficamente destruição óssea periapical foram
usados, divididos em três grupos com vinte dentes cada. No grupo 1 os canais receberam a
solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, no grupo 2 receberam a solução de hipoclorito de sódio a
5% e no grupo 3 foi usada a associação de hipoclorito de sódio a 5% mais EDTA a 15%. Os
resultados não indicaram diferenças entre o efeito antibacteriano nos grupo 1 e 2. No grupo 3,
onde se utilizou a combinação de EDTA a 15% com hipoclorito de sódio a 5% foi mais eficiente
na descontaminação.
Haapasalo e Örstavik (1987) propuseram um modelo experimental in vitro para
desenvolver infecção em túbulos dentinários, permitindo assim a realização de testes
antimicrobianos relacionados à medicação intracanal. Blocos de dentina radicular bovina foram
infectados com Enterococcus faecalis e as medicações intracanal a base de hidróxido de cálcio e
paramonoclorofenol canforado foram testados. Neste modelo experimental, os autores
observaram que a presença de cemento afetava a capacidade das células de Enterococcus faecalis
infectar a dentina radicular, enquanto que a ausência facilitava tal contaminação. As amostras
colhidas do canal revelaram cultura negativa após exposição às medicações testadas, porém
amostras da dentina radicular desses mesmos espécimes revelaram infecção por Enterococcus
faecalis. Assim sendo, os autores alertaram que culturas negativas provenientes de amostras
colhidas da luz do canal, não significam que o sistema endodôntico esteja isento de
microrganismos, podendo esses estar presentes no interior dos túbulos dentinários (Figura 1).
22
Yoshida et al. (1987), observaram a correlação entre sintomas clínicos e microrganismos
isolados dos canais radiculares de trinta e seis dentes permanentes com lesões periapicais. O
diagnóstico da lesão periapical foi confirmado através de exames clínicos e radiográficos e os
pacientes foram divididos em três grupos de acordo com a combinação dos sintomas clínicos.
Grupo 1: dor espontânea, dor à percussão e exsudação; grupo 2: dor à percussão, porém sem dor
espontânea e grupo 3 (controle): ausência de dor espontânea, dor à percussão e exsudação. Nos
grupos 1 e 2 houve a prevalência de bactérias anaeróbias, enquanto no grupo 3 as bactérias mais
comumente isoladas foram as facultativas.
Fleury e Aun (1990), realizaram revisão da literatura com a finalidade de aclarar e
racionalizar a aplicação microbiológica voltada à terapia endodôntica. Constataram que na prática
Figura 1: Microrganismos no interior dos túbulos dentinários – MEV. Fonte: Cardoso;
Gonçalves (2002)
23
clínica diária existiam situações ligadas ao insucesso da terapia endodôntica sugerindo técnicas
microbiológicas para microorganismos anaeróbios estritos, no intuito de solucionar casos
refratários aos tratamentos convencionais. Os autores relataram que casos refratários estão
freqüentemente ligados a infecções por microflora anaeróbia, normalmente decorrente de
associações de múltiplas espécies que colonizam o canal radicular e a região periapical.
Concluíram que as infecções endodônticas são reproduzíveis e transmissíveis.
Fukushima et al. (1990), localizaram, isolaram e identificaram bactérias presentes nos
ápices dos canais radiculares de vinte e um dentes com lesões periapicais assintomáticas
diagnosticados como classe três (ausência de dor espontânea, dor à percussão e exsudação)
indicados para extração. Os dentes foram examinados bacteriologicamente e a confirmação da
existência de bactérias foi realizada por meio da microscopia eletrônica de varredura. Os grupos
de bactérias identificadas foram Gram-positivas, anaeróbias Gram-positivas, Gram-negativas e
bactérias facultativas que podem apresentar o potencial para tornar lesões periapicais
assintomáticas em sintomáticas agudas.
Nair et al. (1990), estudaram a presença de bactérias e fungos no canal radicular de nove
dentes humanos apicectomizados, resistentes à terapia endodôntica e com lesões assintomáticas.
As peças removidas foram examinadas por microscopia eletrônica e óptica. A maioria das
biópsias revelou a presença de microrganismos no terço apical do canal radicular, contendo uma
ou mais espécies de bactérias e dois exames revelaram a presença de fungos. Os resultados
encontrados neste estudo sugeriram que a maioria dos microrganismos podem resistir ao
tratamento endodôntico convencional e desempenhar um papel significante no fracasso da terapia
endodôntica.
24
Baumgartner e Falkler Jr (1991), estudaram a presença bacteriana nos cinco milímetros
apicais de canais radiculares infectados de dez dentes recentemente extraídos, os quais tinham
exposição pulpar por cárie ou lesão periapical. A presença de dor era comum em todos os
pacientes e era a razão principal para a seleção dos mesmos. Imediatamente após a extração, cada
dente foi colocado juntamente com a lesão periapical num tubo de ensaio esterilizado e realizado
o processamento microbiológico. Foram isoladas e identificadas cinqüenta cepas de bactérias dos
dez canais radiculares. As bactérias encontradas em maior número nos canais radiculares foram:
Actinomyces, Lactobacilos, Bacterióides, Peptoestreptococcus, Veilonella, Enterococcus
faecalis, Fusobacterium nucleatum e Streptococcus mutans. Portanto, os autores demonstraram
neste estudo a presença predominante de bactérias anaeróbias nos cinco milímetros apicais dos
canais radiculares infectados em dentes com lesões cariosas extensas com exposição pulpar e
presença de lesão periapical.
Azevedo, Lage Marques e Pesce (1995), apresentaram um caso clínico reforçando o
grande desafio no combate à gama de microorganismos presentes nas lesões refratárias,
admitindo ser a cirurgia paraendodôntica, após a tentativa via canal já realizada, a forma de
resolver a questão. Paciente de cinqüenta anos de idade, sexo feminino, apresentava fístula extra-
oral, na região do mento do lado esquerdo, com drenagem de coleção purulenta durante onze
meses e freqüentes agudizações. Radiograficamente apresentava tratamento endodôntico
incompleto e extensa rarefação óssea periapical. Após terapia endodôntica convencional (técnica
de Paiva & Antoniazzi), trocas de medicação intracanal por seis meses (iodofórmio em pó
associado à pomada de Rifocort®) e medicação sistêmica sem sucesso, o canal foi obturado na
ausência de exsudato intracanal. A partir daí, a apicectomia foi realizada observando o
fechamento completo da fístula após seis meses e a completa cicatrização após doze meses do
25
tratamento. Após esse período, o exame radiográfico apresentava completa reparação do processo
patológico.
Yoshida et al. (1995), avaliaram a eficácia da solução de EDTA a 15% como irrigante dos
canais radiculares em eliminar a smear layer. Cento e oitenta e nove dentes unirradiculares
infectados foram utilizados de cento e vinte e seis pacientes. Os dentes foram diagnosticados
como tendo polpa necrosada ou lesão periapical crônica. Após cirurgia de acesso e determinação
do comprimento de trabalho e preparação dos canais até o calibre 25. Os restos de dentinas
impregnados na lima foram depositados imediatamente dentro do meio de cultura para ser a
primeira amostra bacteriológica. Em seguida, os dentes foram alargados até #70 e irrigados com
solução de hipoclorito de sódio a 5% e água oxigenada a 3%. Após completa instrumentação dos
canais os dentes foram divididos em dois grupos. No grupo 1: cento e vinte e nove dentes foram
irrigados por um minuto com a solução de EDTA a 15% e no grupo 2: sessenta dentes foram
irrigados por um minuto com solução salina. A segunda amostra bacteriológica foi colhida com
pontas de papel absorvente, preparadas e incubadas por 48 horas a 37°C em condições de
anaerobiose. A terceira amostra foi colhida após uma semana de uso de medicação intracanal. A
análise dos resultados mostrou cultura positiva em todos os dentes da primeira amostra. Na
análise da segunda amostra do grupo 1, onde se utilizou a irrigação com a solução de EDTA a
15%, houve 81,4% de redução no crescimento bacteriano; enquanto no grupo 2, onde se utilizou
a irrigação com solução salina, a redução foi em 75% dos casos. Na avaliação da terceira
amostra, o grupo 1 teve uma redução de 72,1% no crescimento bacteriano e no grupo 2 teve uma
redução de 35%.
26
Gaetti-Jardim Júnior, Pedrini e D’Antônio (1996), avaliaram a susceptibilidade aos
antimicrobianos de bactérias anaeróbias isoladas de canais radiculares de dentes desvitalizados e
refratários ao tratamento endodôntico convencional. Um total de quarenta e oito cepas
bacterianas de quatorze pacientes que foram submetidos ao tratamento endodôntico, por no
mínimo seis meses, sem qualquer evidência de cura. A coleta dos espécimes foi realizada
introduzindo-se cones de papel absorventes esterilizados no conduto radicular, onde
permaneciam por um minuto. Após a coleta e preparo dos espécimes, as placas preparadas foram
incubadas a 37°C em condições de anaerobiose por dez dias. Os medicamentos usados foram:
ampicilina, cefalotina, cefoxitina, clindamicina, eritromicina, imiperem, licomicina,
metronidazol, penicilina G e tetraciclina. Como controle dos testes de suscetibilidade, os
antimicrobianos foram empregados em cepas de referência Fusobacterium nucleatum,
Bacterioides fragilis e Eubacterium lentum incubadas nas mesmas condições das cepas-testes.
Após 48 horas de incubação foi realizada a leitura dos resultados verificando-se a inibição ou não
do crescimento microbiano nas placas com antimicrobianos quando comparadas com as placas
controle (sem antimicrobianos). Os resultados demonstraram que vinte cepas eram de Prevotella
intermédia, dezoito cepas de Fusobacterium nucleatum e dez cepas de Peptostreptococcus sp.
Todos os microrganismos isolados foram sensíveis à cefoxitina, clindamicina, imipenem,
lincomicina e metronidazol; alguns isolados mostraram-se resistentes à ampicilina, cefalotina,
eritromicina, penicilina G e tetraciclina. A resistência a alguns fármacos pode estar associada a
seu uso, por vezes abusivo.
Sjögren et al. (1997), investigaram o papel da infecção endodôntica no prognóstico de
cinqüenta e cinco dentes unirradiculares, que apresentavam as paredes da cavidade pulpar
intactas, necrose pulpar e evidência radiográfica de lesão óssea periapical. Os dentes foram
27
instrumentados e irrigados com solução de hipoclorito de sódio a 0,5%. Para a análise
microbiológica foi utilizada a técnica bacteriológica anaeróbica e amostras foram colhidas antes e
depois da instrumentação dos canais. Em seguida, os dentes foram obturados na mesma sessão,
sem o auxílio de medicação intracanal. Os resultados permitiram observar que todos os dentes
estavam inicialmente infectados e que após a instrumentação houve uma diminuição das espécies
bacterianas em vinte e dois dos cinqüenta e cinco dentes. Todos os pacientes foram
acompanhados clínica e radiograficamente por um período de cinco anos. A completa formação
óssea ocorreu em 94% dos casos que apresentaram culturas negativas após a instrumentação do
canal. Nos casos onde a cultura foi positiva após a instrumentação do canal, o sucesso do
tratamento ocorreu em 68% dos casos. Baseado na observação dos resultados acima, os autores
enfatizam a importância da completa eliminação bacteriana antes da obturação do canal radicular,
salientando também que este objetivo não pode ser alcançado em tratamentos de sessão única,
sem o suporte da medicação antimicrobiana.
Abou-Rass e Bogen (1998), investigaram, in vivo, os microorganismos presentes em
lesões periapicais fechadas, rigorosamente selecionadas, associadas à terapia endodôntica
refratária e calcificação pulpar. Um total de treze lesões com indicações cirúrgicas foram
selecionadas e amostras foram tomadas durante as cirurgias. O principal critério para a seleção
das lesões era que a lesão deveria apresentar-se isolada do contato com o meio oral. Essas
amostras foram colhidas de três regiões diferentes: janela cirúrgica, interior do corpo da lesão,
ápice radicular. Nos treze casos, as amostras tomadas do ápice revelaram microorganismos,
sendo 63,6% de anaeróbicos obrigatórios e 36,4% de anaeróbicos facultativos. Após análise dos
resultados, os autores alertaram sobre a dificuldade em erradicar todos os microorganismos
28
durante o tratamento endodôntico e possibilidade dessas bactérias colonizarem o ápice radicular e
os tecidos periapicais, dificultando assim o processo de cura.
Sundqvist et al. (1998), realizaram o retratamento endodôntico em cinqüenta e quatro
dentes obturados com lesões periapicais persistentes e os analisaram microbiologicamente. A
proposta deste estudo foi determinar o tipo de flora microbiana que estava presente no canal
radicular antes e depois do retratamento. Cinco amostras para análise microbiológica foram
coletadas, a saber: uma amostra na primeira consulta após a remoção do material obturador, três
amostras na segunda sessão e uma última amostra antes da reobturação do dente. Os resultados
microbiológicos das amostras revelaram que o microrganismo Enterococcus faecalis foi
encontrado com maior freqüência.
D’Arcangelo, Varvara e De Fazio (1999), testaram, in vitro, o efeito da solução de
hipoclorito de sódio em variadas concentrações (5, 3, 1 e 0,5%) e de soluções de clorexidine e
cetramida associadas em culturas de bactérias anaeróbias facultativas, tais como, Enterococcus
faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, cepas de Candida albicans, anaeróbias estritas,
tais como, Actinomyces odontolycus, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis e
Prevotella melaninogenica e bactérias microaeróbias, tais como, Actinobacillus
actinomycetemcomitans. Cada um dos antimicrobianos ficou em contato com os microrganismos
por tempos que variaram de 10, 20 e 30 minutos. Os resultados demonstraram efeito bactericida e
fungicida entre todos os irrigantes testados.
29
Nair et al. (1999), demonstraram neste estudo seis casos que falharam na reparação das
lesões periapicais ósseas após tratamento endodôntico convencional. Após a cirurgia
paraendodôntica, biópsias foram removidas e os tecidos foram analisados por microscopia óptica
e eletrônica de varredura. Das seis biópsias, duas eram de pacientes cujos dentes foram obturados
em sessão única e quatro foram derivadas de dentes que tiveram retratamento após recente
obturação do canal radicular insatisfatório. Todos os dentes foram retratados endodonticamente
da forma convencional e irrigados com solução de hipoclorito de sódio a 0,5%. Os pacientes
foram avaliados anualmente e cirurgias apicais foram realizadas nos casos em que se observou
aumento da área de radiolucência. A caracterização histológica das lesões foi baseada na ausência
ou presença de microrganismos na porção apical do canal e componentes estruturais dos tecidos
periapicais. Os resultados das seis biópsias periapicais investigadas mostrou infecção bacteriana
distinta dentro do canal.
Buck et al. (2001), compararam a efetividade bactericida de três irrigantes endodônticos
em diferentes profundidades dos túbulos dentinários em doze dentes unirradiculares, extraídos de
pacientes com idades entre 30 e 50 anos. As coroas foram removidas com discos diamantados e
os canais foram instrumentados com limas K-file até completa limpeza. A técnica step-back foi
utilizada para alargar o canal no terço médio e coronário até o #25. Em seguida, as raízes foram
autoclavadas. Os canais foram contaminados com a suspensão de Enterococcus faecalis e
incubadas por 12 horas a 36,5°C. O excesso do caldo foi removido com pontas de papel
absorvente estéril para permitir o acesso das substâncias irrigantes, simulando a situação clínica.
As raízes foram divididas em quatro grupos com três raízes cada. O grupo 1 (controle) foi
irrigado com solução salina estéril, no grupo 2 utilizou-se a solução de hipoclorito de sódio a
30
0,525%, no grupo 3 utilizou-se a solução de EDTA a 0,2% (Tubulicid®) e no grupo 4 a solução
de clorexidine a 0,12% (Periodex®). Todas as soluções irrigantes foram deixadas no interior dos
canais radiculares por 1 minuto. Em seguida, amostras foram colhidas com cones de papel
absorvente, plaqueadas e incubadas por 12 horas a 36,5 °C. A contagem de unidades formadoras
de colônia foi realizada. Os resultados permitiram observar que no grupo 1 (controle) houve
crescimento bacteriano. Enquanto no grupo 2, onde se utilizou a solução de hipoclorito de sódio
a 0,525%, a ação na redução bacteriana foi mais efetiva que nos grupos 3 e 4 onde se utilizou,
respectivamente o EDTA a 0,2% e a solução de clorexidine a 0,12%. Tal fato pode ter sido
atribuído a ação antibacteriana destes irrigantes ou a insuficiência de crescimento dentro dos
túbulos dentinários.
Ferrari (2001), detectou a presença de espécies de enterococos, leveduras e
enterobactérias em pacientes portadores de polpa necrótica e lesão periapical, em dentes com
câmara pulpar intacta. Vinte e cinco dentes humanos unirradiculares, com diagnóstico clínico
correspondente a polpa mortificada em fase crônica, e que apresentavam, radiograficamente, área
de rarefação óssea periapical, foram selecionados para esta pesquisa. As amostras foram colhidas
do interior dos canais radiculares com cones de papel absorvente esterilizados. O isolamento
bacteriano foi realizado em meios de cultura adequados ao desenvolvimento dos microrganismos.
Sua identificação foi baseada no perfil bioquímico apresentado pelas amostras, após semeadura
em testes específicos. Os resultados permitiram avaliar a freqüência dos microrganismos
referidos nas infecções endodônticas de caráter primário, consideradas as diversas fases da
terapia endodôntica, verificando-se que os microrganismos superinfectantes mostraram-se pouco
freqüentes nessas situações clínicas e que espécies de enterococos foram mais resistentes ao
preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, em comparação às leveduras e enterobactérias.
31
Lima, Fava e Siqueira Jr (2001), verificaram que as infecções endodônticas com
Enterococcus faecalis usualmente constituem um problema nos casos resistentes ao tratamento
endodôntico convencional. Os autores avaliaram a efetividade de diversas medicações
antimicrobianas na eliminação de biofilmes de Enterococcus faecalis. Para tanto realizaram os
seguintes protocolos: grupo A:
gluconato de clorexidine a 2% associado a natrozole a 2% em
água destilada; grupo B:
gluconato de clorexidine a 2% associado a sulfato lauril-dietileno-glicol-
éter-sódio a 1,25% e natrozole a 2% em água destilada; grupo C: clindamicina a 2% associado a
natrozole a 2% em água destilada; grupo D: clindamicina a 2% associado a sulfato lauril-
dietileno-glicol-éter-sódio a 1,25% e natrozole a 2% em água destilada; grupo E
: gluconato de
clorexidine a 2% associado a óxido de zinco a 15% mais sulfato lauril-dietileno-glicol-éter-sódio
a 1,25% e natrozole a 2% em água destilada; grupo F
: clindamicina a 2% associado a natrozole a
2% mais sulfato lauril-dietileno-glicol-éter-sódio a 1,25% e metronidazol a 10% e o grupo
controle continha natrozole a 2% associado ao sulfato lauril-dietileno-glicol-éter-sódio a 1,25%.
Tais medicações foram usadas a fim de verificar a eliminação de biofilmes de Enterococcus
faecalis de um e três dias induzidos em membranas de filtros de nitrato de celulose. Cada grupo
foi composto por seis membranas coradas com cada medicação teste, inclusive o grupo controle.
Os resultados desse estudo indicaram que medicamentos a base de gluconato de clorexidine a 2%
e associações podem exercer um papel importante na erradicação de infecções endodônticas
refratárias ao tratamento endodôntico convencional.
Love (2001), identificou, in vitro, os possíveis mecanismos que explicam como o
Enterococcus faecalis pode sobreviver e crescer dentro dos túbulos dentinários e reinfectar um
canal radicular obturado. Culturas de Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans ou
Enterococcus faecalis foram colocados em meio de cultura BHI contendo diferentes
32
concentrações de soro humano por 56 dias. Após esses período, todas as três espécies bacterianas
permaneceram viáveis. O soro humano se mostrou capaz de inibir a invasão dentinária pelo
Streptococcus gordonii e Streptococcus mutans, mas somente reduziu esta invasão quando se
tratava do Enterococcus faecalis e se verificou o aumento na capacidade desta bactéria em aderir
ao colágeno na presença de soro humano. Os resultados permitiram observar que os fatores de
virulência do Enterococcus faecalis pode estar relacionados à capacidade desta bactéria em
invadir os túbulos dentinários e aderir ao colágeno na presença de soro humano.
Peciuliene et al. (2001), avaliaram o papel das bactérias Gram-negativas e espécies de
enterococos de quarenta dentes de pacientes com lesões periapicais assintomáticas, bem como a
ação antimicrobiana da solução irrigadora iodeto de potássio. Os quarenta pacientes tiveram os
canais radiculares obturados entre 5 e 10 anos anteriores à pesquisa e as obturações foram
consideradas, pelos autores, insatisfatórias. O retratamento endodôntico foi realizado em
condições de assepsia e somente com uso de instrumentos manuais. Após a coleta da primeira
amostra microbiológica, os canais foram divididos limpos e modelados com o auxílio de limas do
tipo Hedströem e irrigados com 10 mL da solução de hipoclorito de sódio a 2,5% e neutralizado
com a irrigação final com 5 mL da solução de EDTA a 17%. Logo após o completo preparo
químico-mecânico dos canais, novas amostras foram colhidas do interior dos canais radiculares
com o auxílio de pontas de papel absorvente. Os dentes foram divididos em dois grupos com
vinte dentes cada. No grupo A: os vinte canais receberam, antes da obturação definitiva com
cimento endodôntico e cones de guta percha, a medicação intracanal hidróxido de cálcio que
permaneceu dentro do canal entre 10 e 14 dias. No grupo B: os vinte canais foram irrigados
durante 5 minutos com a solução de iodeto de potássio antes da obturação definitiva do canal. A
terceira amostra microbiológica foi colhida antes da obturação final dos quarenta canais. A
33
análise microbiológica da primeira coleta das amostras, revelou a presença de fungos, bactérias
entéricas Gram-negativas facultativas e espécies de enterococos. Na coleta da segunda amostra
bacteriológica, ou seja, após o preparo químico-mecânico dos canais observou-se a presença de
bactérias facultativas e Gram-positivas anaeróbias, enquanto fungos e bactérias Gram-negativas
facultativas não foram encontradas. Após a coleta da terceira amostra, onde foi realizada a
irrigação final com a solução de iodeto de potássio, a análise microbiológica foi negativa. As
bactérias do grupo dos Enterococcus faecalis foram as prevalentes.
Peters et al. (2001), coletaram dois grupos de dentes com periodontite apical em
diferentes localizações geográficas, Holanda - GI e Escócia - GII, para estudar as espécies de
bactérias deixadas nos túbulos dentinários radiculares. Foram realizadas culturas com amostras
de dentina radicular de três regiões entre a polpa e o cemento (A, B e C). Além disso, dentina de
oito dentes foi examinada histologicamente. Usando as culturas microbiológicas, os resultados
permitiram observar que foram encontradas bactérias em 77% das amostras do grupo I e em
87,5% das amostras do grupo II . Na região distante da polpa (camada C) havia bactérias em 62%
das amostras. Nas camadas mais próximas à polpa, foi encontrado maior número de bactérias
anaeróbias e bastonetes Gram-positivos, bem como maior quantidade de espécies bacterianas. Os
autores concluíram que em mais da metade das raízes infectadas, bactérias estavam presentes na
profundidade da dentina, próxima ao cemento.
Souza (2001), revisou trabalhos que abordaram as lesões refratárias em Endodontia.
Alguns destes trabalhos mostraram que o terço apical de canais com lesão periapical está
maciçamente infectado, com predomínio absoluto de bactérias anaeróbias. Pelo fato de alguns
desses microrganismos estarem alojados em locais de difícil acesso, muitas vezes considerado
34
impossível pelas técnicas atuais de preparo do canal, a conduta geral para a resolução desses
casos tem sido a indicação cirúrgica. Baseado nos achado citados, o autor sugeriu uma nova
abordagem clínica para a endodontia não cirúrgica. Dez dentes uni, bi ou polirradiculares foram
utilizados, sendo que o dado comum em todos os dentes foi a presença de lesão periapical. Os
dentes foram preparados utilizando lima tipo K-file que ultrapassava o forame apical em dois a
três milímetros. No final do preparo os dentes foram irrigados com solução de hipoclorito de
sódio a 2%. O autor concluiu que as lesões tidas como refratárias ao tratamento convencional
devem ser tratadas endodonticamente através da limpeza ativa do forame, ou seja, feita com a
utilização de instrumentos trabalhados de dois a três milímetros além do forame apical, raspando
ativamente as suas paredes.
Siqueira Jr (2001), discute sobre a etiologia das falhas de tratamentos endodônticos
realizados dentro dos mais altos padrões de assepsia e biossegurança, mas que mesmo assim são
acometidos por lesões periapicais resistentes. Na maioria dos casos a falha endodôntica resulta da
infecção intra-radicular persistente, por contaminação extra-radicular ou por fatores microbianos
extrínsecos e intrínsecos. As medidas necessárias para o controle e prevenção da infecção do
canal radicular são fundamentais para minimizar a margem de insucesso dos tratamentos
endodônticos, incluindo assepsia estrita de todos os materiais que serão utilizados durante o
tratamento endodôntico, preparação correta do canal usando irrigantes apropriados, medicação
intracanal, obturação correta do canal radicular e o selamento coronário do mesmo. Embora se
sugira que os fatores não microbianos estão sempre associados às falhas do tratamento
endodôntico, as infecções intra-radiculares persistentes ou infecções extra-radiculares podem
também ser as causas mais comuns de insucesso na terapia endodôntica.
35
Siqueira Jr e Lopes (2001), avaliaram a presença de bactérias na região apical dos canais
radiculares de vinte e sete dentes extraídos apresentando lesões cariosas extensas, lesões
radiolúcidas de vários tamanhos e lesões periapicais associadas após a extração. Após a fixação,
as lesões foram removidas e a porção de cinco milímetros apicais de cada raiz foi seccionada. As
pontas destas raízes foram desidratadas e examinadas utilizando a microscopia eletrônica de
varredura para verificar a presença de bactérias na superfície apical da raiz. Os resultados
demonstraram presença maciça de bactérias próxima ao forame apical, restritas à região do canal
radicular.
Sunde et al. (2002), pesquisaram a microbiota periapical de trinta e seis dentes com lesão
apical crônica e refratária ao tratamento endodôntico convencional, bem como ao tratamento a
longo prazo com medicação a base de hidróxido de cálcio [Ca(OH)
2]. O estudo demonstrou que
uma ampla variedade de microorganismos, compreendendo bactérias anaeróbicas estritas e
facultativas, assim como fungos, permaneceram nas lesões refratárias mesmo após longos
períodos de tratamento com Ca(OH)
2. Das bactérias isoladas, 79,5% eram Gram-positivas e 51%
eram anaeróbias. Microrganismos facultativos como Staphylococcus, Enterococcus,
Enterobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Sphingomonas, Bacillus ou Candida estavam
presentes em 75% das lesões.
Chávez De Paz et al. (2003), investigaram o tipo de bactéria que se manteve no canal
radicular após o preparo químico-cirúrgico de dentes com patologia periapical. As amostras
foram colhidas de duzentos dentes que apresentavam evidências clínicas e radiográficas de lesão
periapical. Os achados bacteriológicos foram associados aos parâmetros clínicos e radiográficos
considerando o estado do canal radicular antes do tratamento, a saber: polpa viva, polpa morta ou
36
canal obturado. Um total de duzentos e quarenta e oito amostras foi obtido de cento e sete dentes,
para analisar o crescimento bacteriano. Os resultados permitiram observar que bactérias Gram-
positivas foram predominantemente encontradas, enquanto bactérias Gram-negativas anaeróbias
foram encontradas esporadicamente.
Mickel, Sharma e Chogle (2003), avaliaram a atividade antimicrobiana do fluoreto
estanhoso a 0,3% em água estéril (Stanimax®), hidróxido de cálcio ou da combinação de
hidróxido de cálcio com Stanimax® contra os microrganismos facultativos Gram-positivos
Enterococcus faecalis. Ampicilina foi usada como controle positivo. Quinze placas com ágar
Mueller-Hinton foram usadas para a conduta disco-difusão como teste de susceptibilidade do
microorganismo, sendo divididas em três grupos com cinco placas cada como segue: grupo 1:
fluoreto estanhoso a 0,3% (Stanimax®), grupo 2: hidróxido de cálcio e grupo 3: combinação de
fluoreto estanhoso a 0,3% e hidróxido de cálcio. Os dados obtidos foram analisados
estatisticamente pelos métodos ANOVA e testes t. O grupo com fluoreto estanhoso a 0,3%
(Stanimax®) exibiu uma zona larga de inibição (1,7 mm), seguido do grupo onde se utilizou a
combinação de fluoreto estanhoso a 0,3% (Stanimax®) e hidróxido de cálcio com uma zona
intermediária de inibição (1,1 mm), enquanto que o grupo com hidróxido de cálcio revelou uma
zona mínima de inibição (0,5 mm).
Pinheiro et al. (2003), estudaram e identificaram a microflora presente em canais
radiculares de sessenta dentes com lesão periapical persistente que foram retratados
endodonticamente. O material obturador foi removido com o uso de brocas Gattes-Glidden® e
limas endodônticas, sem o uso de solventes químicos, e irrigados com solução salina para
remover os remanescentes do material obturador. Amostras foram colhidas do interior do canal
37
radicular com o auxílio de pontas de papel absorvente estéril que permaneceram em contato por 1
minuto. Para o isolamento microbiológico das amostras e a determinação das espécies foi
utilizada técnica microbiológica para espécies anaeróbias, enviadas ao laboratório após 15
minutos da coleta. Os resultados permitiram observar que a flora dos canais radiculares com
falhas no tratamento endodôntico compreende um limitado número de espécies microbianas
predominantemente Gram-positivas. Bactérias anaeróbias facultativas, especialmente
Enterococcus faecalis foram os microrganismos mais comumente isolados nos dentes. No
entanto, infecções polimicrobianas e microrganismos anaeróbios obrigatórios foram
freqüentemente encontrados em canais de dentes obturados e com presença de sintomatologia.
Ferreira et al. (2004), detectaram a presença de microrganismos nas superfícies dos ápices
radiculares removidos durante o tratamento endodôntico cirúrgico. O presente caso clínico ilustra
o retratamento endodôntico de um dente pré-molar superior com presença de fístula e rarefação
óssea periapical. O caso havia sido tratado há um ano, durante o qual medicações intracanal
foram trocadas várias vezes. Como a lesão óssea não diminuía e o exsudato era persistente na
fístula, a cirurgia apical foi o tratamento de escolha. Amostras microbiológicas foram coletadas
pela fístula e Propionibacterium acnes e espécies associadas à falha endodôntica foram
detectadas. O terço apical removido foi analisado por microscopia eletrônica de varredura e
revelou presença de espécies bacteriana dos grupos dos cocci e formas fúngicas.
Dametto et al. (2005), avaliaram in vitro a atividade antimicrobiana do gel de clorexidine
a 2% em pré-molares humanos contaminados com culturas de Enterococcus faecalis comparado
com outros irrigantes endodônticos, a saber: solução de clorexidine a 2% e solução de hipoclorito
de sódio a 5,25%. Todos os dentes foram instrumentados endodonticamente, autoclavados e
38
contaminados por sete dias com monoculturas de Enterococcus faecalis. As raízes foram
divididas em cinco grupos de acordo com a substância irrigante utilizada durante a preparação
biomecânica. Para avaliar a ação das substâncias antimicrobianas, três amostras microbianas
foram colhidas. A primeira amostra: antes da preparação biomecânica, a segunda amostra:
imediatamente após a preparação biomecânica e a terceira amostra: sete dias após a preparação
biomecânica. Todas as amostras foram plaqueadas para a posterior contagem das unidades
formadoras de colônia (UFC). Os resultados permitiram observar que tanto o gel de clorexidine a
2% quanto a solução de clorexidine a 2% reduziram significantemente as UFC de Enterococcus
faecalis após a análise da segunda e da terceira amostra. A solução de hipoclorito de sódio a
5,25% também reduziu as UFC de Enterococcus faecalis após a análise da primeira amostra, mas
não foi capaz de manter os canais radiculares livres de bactérias na segunda e terceira amostras.
Os autores concluíram que a tanto a solução quanto o gel de clorexidine a 2% foi mais efetivo
que a solução de hipoclorito de sódio a 5,25% na redução de UFC de Enterococcus faecalis após
sete dias do preparo biomecânico.
Berber et al. (2006), avaliaram a eficácia da solução de hipoclorito de sódio nas
concentrações de 0,5%; 2,5% e 5,25% como irrigante intracanal associado a três técnicas de
instrumentação endodôntica contra Enterococcus faecalis no interior dos canais radiculares e
túbulos dentinários. Para este trabalho foram utilizados cento e vinte dentes pré-molares humanos
unirradiculares preparados, instrumentados e irrigados com soluções de EDTA 17% seguida por
irrigação com de hipoclorito de sódio a 5,25%. Todos os dentes foram autoclavados e incubados
por 48 horas a 37ºC para verificação da eficácia da esterilização. Após contaminação dos cento e
vinte dentes com culturas puras de Enterococcus faecalis, os dentes foram divididos em 12
grupos com 10 dentes cada de acordo com o irrigante intracanal e técnica de instrumentação. G1:
39
solução de hipoclorito de sódio a 5,25% associada à técnica híbrida; G2: solução de hipoclorito
de sódio a 5,25% associada à técnica da UNICAMP; G3: solução de hipoclorito de sódio a 5,25%
associada à técnica rotatória NiTi Hero 642; G4: solução de hipoclorito de sódio a 2,5%
associada à técnica híbrida; G5: solução de hipoclorito de sódio a 2,5% associada à técnica da
UNICAMP; G6: solução de hipoclorito de sódio a 2,5% associada à técnica rotatória NiTi Hero
642; G7: solução de hipoclorito de sódio a 0,5% associada à técnica híbrida; G8: solução de
hipoclorito de sódio a 0,5% associada à técnica da UNICAMP; G9: solução de hipoclorito de
sódio a 0,5% associada à técnica rotatória NiTi Hero 642; G10: solução salina estéril associada à
técnica híbrida; G11: solução salina estéril associada à técnica da UNICAMP; G12: solução
salina estéril associada à técnica rotatória NiTi Hero 642. Os grupos G10, G11 e G12 foram os
grupos controle positivo.
Em continuação, amostras foram colhidas do interior dos canais antes e após a
instrumentação utilizando três pontas de papéis absorventes cada e colocados no interior de tubos
de ensaio contendo 1mL de caldo BHI. Após dez diluições seriais, alíquotas de 0,1mL foram
plaqueadas e incubadas por 48 horas a 37ºC. As unidades formadoras de colônia foram contadas.
Além disso, cada dente foi seccionado em três terços e fatias de dentina dos canais foram
removidas com o auxílio de brocas para alta rotação. As amostras obtidas de cada broca e de cada
terço dos dentes foram imediatamente colocadas dentro de tubos de ensaio, plaqueadas e
incubadas. Os resultados demonstraram que a solução de hipoclorito de sódio a 5,25% teve uma
grande atividade antibacteriana dentro dos túbulos dentinários infectados com Enterococcus
faecalis quando comparado com a mesma solução em outras concentrações testadas,
independentemente da técnica endodôntica utilizada.
40
Öztan et al. (2006), determinaram, in vitro, a suscetibilidade de Enterococcus faecalis e
espécies prevalentes de Candida como microrganismos resistentes à terapia endodôntica
utilizando cones de guta-percha contendo medicações intracanal. Para este estudo, os autores
utilizaram cones de guta-percha contendo hidróxido de cálcio, diacetato de clorexidina ou a
combinação hidróxido de cálcio-clorexidina. Alíquotas de 100µL de diversos microrganismos
suspensos em soro humano diluído foram transferidas para tubos de Eppendorf contendo dois
pedaços de uma das variedades de cones de guta percha. Os tubos foram então incubadas por até
duas semanas e um tubo foi removido da estufa no 1°, 2°, 3°, 4°, 7° e 14° dias, tendo sua
suspensão diluída, plaqueada e incubada para posterior contagem de UFC/mL. Os cones
contendo hidróxido de cálcio ou clorexidina não exibiram atividade antimicrobiana suficiente
contra as diversas espécies testadas. O efeito bactericida ou fungicida foi alcançado com a
utilização de cones contendo a combinação hidróxido de cálcio/clorexidina, exceto para os
microrganismos do grupo dos Enterococcus faecalis e Candida parapsilosis.
Vianna et al. (2006), avaliaram, in vivo, a redução microbiana após preparação químico-
mecânica de canais radiculares humanos contendo polpa necrótica, utilizando a solução de
hipoclorito de sódio a 2,5% ou o gel de clorexidine a 2% como irrigantes endodônticos. Trinta e
seis dentes portadores de polpa necrosada foram divididos em dois grupos de dezesseis dentes
cada um. O grupo 1 foi irrigado com solução de hipoclorito de sódio a 2,5% e o grupo 2
preenchido com gel de clorexidine a 2%. Os autores utilizaram dois tipos de técnicas para
culturas bacterianas e concluíram que a resistência bacteriana foi reduzida substancialmente em
ambos os grupos. Porém, quando utilizaram a técnica de contagem das unidades formadoras de
colônia (UFC) comparada à técnica da reação em cadeia em tempo real da polimerase
41
quantitativa (RTQ-PCR) concluíram que o grupo que utilizou a solução de hipoclorito de sódio a
5,25% obteve maior redução bacteriana.
2.2 Terapia fotodinâmica
Wilson e Pratten (1994), estudaram a ação do fotossensitizador azul de O-toluidina
associada à luz laser de He-Ne na redução de Stapylococcus aureus. Cepas bacterianas foram
preparadas e divididas em grupos como segue: 1) L
+
S
+
: corante azul de O-toluidina associada à
luz laser de He-Ne (grupo controle), 2) L
-
S
+
: somente o corante azul de O-toluidina, 3) L
+
S
–
:
somente a luz laser de He-Ne e 4) L
-
S
-
: sem luz laser de He-Ne e sem corante azul de O-
toluidina. As concentrações de corante foram variadas em cada grupo, bem como o tempo de
exposição ao laser. Em cada experimento, o número de bactérias viáveis remanescentes foi
analisado estatisticamente usando o teste T-student. Os resultados permitiram observar, com
relação a viabilidade dos Stapylococcus aureus, que no grupo 1 houve uma diminuição
estatisticamente significante na contagem viável das bactérias – efeito bacteriostático, enquanto
que nos grupo 2 e 3, onde se utilizou respectivamente somente à luz laser de He-Ne e presença
isolada do fotossensitizador azul de O-toluidina resultou em diminuição na contagem bacteriana,
mas estatisticamente insignificante. No grupo 4 onde não se utilizou nem laser e nem o corante
houve crescimento bacteriano.
Bhatti et al. (2000), realizaram um estudo para determinar os possíveis mecanismos
envolvidos na fotossensitização letal de bactérias com a utilização da conjugação do corante azul
de O-Toluidina com anticorpo. Quando uma mistura de Porphiromona gingivalis e Streptococcus
42
sanguis foi exposta ao TBO e irradiada com laser He-Ne, houve redução na contagem de
microorganismos viáveis, respectivamente. Já quando o TBO foi conjugado com anticorpo de
Porphiromona gingivalis, as reduções nas contagens de viáveis de P. gingivalis e S. sanguis
elevaram-se respectivamente. A conjugação TBO-anticorpo foi também mais efetiva na redução
de P. gingivalis, na presença de fibroblastos gengivais humanos, que TBO puro.
Gutknecht et al. (2000), avaliaram o efeito antibacteriano do laser diodo em profundidade
no canal dentinário radicular. Sabendo que a colonização microbiana do canal radicular pode
levar ao fracasso no tratamento endodôntico convencional os autores utilizaram fatias de dentina
bovina de 100, 300 e 500 µm obtidas por secção longitudinal. Estas amostras foram esterilizadas
e inoculadas em um lado com uma suspensão de Enterococcus faecalis. A radiação laser foi
efetuada no lado oposto com o laser diodo de comprimento de onda de 810nm com potência de
3W no modo contínuo. A radiação foi realizada usando uma fibra de ponta cônica de 400µm,
num ângulo de aproximadamente 5° com a superfície, por um período de 30 segundos. As
bactérias foram então retiradas através de vibração e cultivadas em placas com ágar sangue. A
contagem de colônias refletiu o efeito antibacteriano da radiação laser em função da espessura
das camadas. Os resultados obtidos permitiram observar que a radiação do laser diodo reduziu o
número de bactérias em camadas profundas de paredes dentinárias de canais radiculares
infectados.
König et al. (2000), descreveram um novo método para inativação bacteriana, baseado na
excitação óptica de porfirinas fotossensitizadoras endógenas, por luz vermelha. Espectroscopia
autofluorescente revelou que bactérias Gram-positivas sintetizam naturalmente o
43
fotossensitizador protoporfirina IX. Colônias destas bactérias foram expostas à luz vermelha de
comprimento de onda 632,8nm, 100mW/cm
2
de intensidade de luz e densidade de energia de 360
J/cm
2
de um laser de He-Ne. Houve destruição significativa em todas as espécies testadas, mesmo
após um único fototratamento. Os resultados sugerem que o tratamento com luz vermelha pode
ser potencialmente empregado como método terapêutico para inativação de espécies patogênicas
de bactérias produtoras de porfirina sem o uso de fotossensitizadores externos.
Ackroyd et al. (2001), realizaram uma revisão de literatura sobre a origem e
desenvolvimento da fotodetecção e da terapia fotodinâmica desde a antiguidade até o presente
momento. A produção de porfirinas e a subseqüente descoberta das suas propriedades de
localização de tumores e efeitos fototóxicos sobre tecidos tumorais levaram ao desenvolvimento
da moderna terapia fotodinâmica. Atualmente, esta terapia está sendo empregada no tratamento
de tumores desempenhando papel curativo em cânceres iniciais e paliativo nos avançados.
Garcez (2002), avaliou a redução bacteriana intracanal em trinta dentes contaminados
com Enterococcus faecalis. Os trinta dentes foram divididos em três grupos com dez raízes cada
um. No grupo 1 as raízes receberam a substância química hipoclorito de sódio a 0,5% por 30
minutos, no grupo 2 as raízes receberam uma pasta a base do corante azuleno por 5 minutos e
irradiação com laser de diodo, com os parâmetros: comprimento de onda de 685nm e 10mW de
potência, no grupo 3 as raízes não receberam nenhum tratamento. O autor concluiu que, o grupo
2, onde se utilizou a terapia fotodinâmica, a redução bacteriana foi mais efetiva quando
comparada ao tratamento realizado no grupo 1, no qual se utilizou a solução de hipoclorito de
sódio a 0,5%.
44
Nussbaum, Lilge e Mazzulli (2002), examinaram o efeito da terapia com laser de baixa
potência no crescimento bacteriano in vitro. Culturas de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli e Staphylococcus aureus foram plaqueadas em ágar e depois irradiadas com comprimentos
de onda de 630, 660, 810 e 905nm (0,015W/cm
2
) e densidades de energia de 1-50 J/cm
2
. Após 20
horas de incubação a 35°C foi realizada a contagem de colônias. Os quatro comprimentos de
onda afetaram o crescimento das espécies de bactérias: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli e Staphylococcus aureus. O crescimento foi estimulado ou inibido dependendo da
combinação entre espécie bacteriana, comprimento de onda, radiação e dose. O comprimento de
onda de 630nm mostrou estar mais comumente associado à inibição bacteriana.
Seal et al. (2002), compararam in vitro a eficácia bactericida da fotossensitização letal
utilizando o corante azul de O-toluidina e irrigação com solução de hipoclorito de sódio a 3% em
culturas de Streptococcus intermedius de biofilmes de canais radiculares. O laser utilizado foi o
He-Ne com comprimento de onda de 632,80nm e potência de saída de 35 mW. As concentrações
do fotossensitizador utilizadas neste estudo foram: 0; 12,5; 25; 50 e 100µgmL
-1
. Trinta e cinco
dentes humanos unirradiculares, extraídos recentemente foram preparados endodonticamente e
inoculados com Streptococcus intermedius e incubados por 48 horas para permitir a formação do
biofilme. Quatro dentes receberam solução de hipoclorito de sódio a 3%. Quatro dentes foram
utilizados para cada combinação do fotossensitizador azul de O-toluidina nas diversas
concentrações (12,5; 25; 50 e 100µgmL
-1
) com variados tempos (60, 90, 120, 300 e 600
segundos) equivalentes a doses de energia de 2,1 a 21J. Para os grupos que receberam somente
laser ou somente o fotossensitizador também foram utilizados quatro dentes. Dezessete dentes
não receberam nenhum tipo de tratamento. Amostras foram colhidas utilizando pontas de papel
absorvente. Os resultados mostraram que, com a combinação de 100µgmL
-1
de TBO em 600
45
segundos e dose de energia de 21J, houve efeito bacteriostático. Nos dentes que receberam a
solução de hipoclorito de sódio a 3% o efeito foi bactericida. Entretanto, nos dentes que
receberam somente o laser ou somente o corante também houve um discreto efeito
bacteriostático. Os autores concluíram que a ação da terapia fotodinâmica, utilizando a
combinação do fotossensitizador O-toluidina e laser de baixa potência aplicado diretamente na
entrada dos canais radiculares, foi bacteriostática e que o efeito bactericida foi conseguido com a
utilização de irrigação com solução de hipoclorito de sódio a 3%.
Garcez et al. (2003), apresentaram as principais indicações da terapia fotodinâmica na
odontologia, assim como os principais corantes e fontes de luz encontrados. A ação
antimicrobiana da terapia fotodinâmica e a constante busca por novos corantes tende a ampliar
sua eficiência e aplicações clínicas. Para os autores, a terapia fotodinâmica não deverá ser
encarada como substituta dos antibióticos, dos agentes antimicrobianos ou de qualquer
tratamento convencional, mas como uma modalidade de tratamento de infecções localizadas, bem
como uma terapia complementar e eficiente no tratamento de lesões e infecções bucais. Os
autores concluíram através da revisão da literatura que o uso da terapia fotodinâmica é um
eficiente método de redução bacteriana. Seu uso em odontologia tem sido bastante indicado,
ressaltando que se mostra mais eficiente em infecções localizadas, de pouca profundidade e de
microflora conhecida. Os trabalhos encontrados na literatura mostram a viabilidade do uso dessa
terapia como auxiliar no tratamento de infecções na cavidade oral, por ser uma terapia de baixo
custo e, principalmente por apresentar efeitos colaterais mínimos, não apresentar efeitos
sistêmicos, além de não haver risco de se provocar resistência bacteriana.
46
Shibli et al. (2003), avaliaram a viabilidade de microrganismos após a fotossensitização
letal usada no tratamento de periimplantite induzida em cães. Fez-se o debridamento dos tecidos,
lavagem das superfícies dos implantes com solução salina e coleta da primeira amostra
microbiológica. Em seguida, foi injetado azul de O-toluidina próximo à margem óssea com uma
agulha fina; o corante foi deixado no local por um minuto e depois foi cuidadosamente removido.
A área corada foi irradiada utilizando o laser diodo AlGaAs com os seguintes parâmetros: potência
de saída de 50mW, comprimento de onda de 685nm, por 80 segundos e dose de energia de 4J. As
superfícies mesial, distal, vestibular e lingual foram irradiadas por 20 segundos cada, totalizando
80 segundos. A segunda amostra microbiológica foi então obtida. Os autores concluíram que o
tratamento microbiológico da periimplantite pela fotossensitização letal reduziu ou eliminou, em
algumas amostras, os microrganismos periodontais envolvidos nesta condição patológica.
Zanin et al. (2003), realizaram um estudo com o objetivo de informar o leitor sobre o uso
da terapia fotodinâmica na redução de bactérias bucais e novas perspectivas para o uso dessa
terapia na odontologia. Os autores relataram que muitos trabalhos afirmaram a eficácia da terapia
fotodinâmica como bactericida em lesões de cárie e na doença periodontal em humanos. Que as
vantagens do uso dessa técnica em relação ao uso dos agentes antimicrobianos tradicionais, é que
a morte celular bacteriana pode ser rápida, não sendo necessária a manutenção do agente químico
em altas concentrações sobre as lesões por longos períodos de tempo, como ocorre com o uso dos
antibióticos. O uso dos fotossensibilizadores ou da luz laser sozinha não apresenta ação
significativa sobre a viabilidade bacteriana, devendo preferencialmente ser utilizados em
associação. Os autores salientaram que esses dados são promissores, mas que outros estudos
deveriam ser desenvolvidos a fim de tornar a utilização da terapia fotodinâmica aplicáveis na
47
clínica odontológica, visto que a ausência de parâmetros definidos para a eliminação bacteriana
ser uma das limitações dessa técnica.
Giusti (2005),
avaliou a efetividade da terapia fotodinâmica na descontaminação de
dentina bovina cariada artificialmente, utilizando o Photogem® e TBO como agentes
fotossensibilizadores e, um diodo emissor de luz (LED) como fonte ativadora. Para este fim,
foram obtidos, a partir de incisivos bovinos, espécimes em dentina que foram imersos em um
meio de cultura estéril, acrescidos de Lactobacillus acidophilus e Streptococcus mutans. Em
seguida, os espécimes foram submetidos a diferentes concentrações do fotossensibilizador e
diferentes doses de luz. A análise estatística dos resultados constituídos pelo número das UFC por
miligrama de dentina cariada, evidenciou que o uso do LED associado aos fotossensibilizadores
Photogem® e TBO foi efetivo na redução bacteriana em dentina bovina cariada artificialmente.
48
3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do
Paraíba – UNIVAP sob Protocolo L151/2006, aprovado em 12 de dezembro de 2004 (ANEXO
A). Está de acordo com a Lei 11977/2005 (SP), os Princípios Éticos na Experimentação Animal
(COBEA/1991) e as Normas para a Prática Didático-Científica da Vivissecção de Animais (Lei
6638/1979).
O experimento foi desenvolvido na Faculdade de Ciências da Saúde, nos Laboratórios de
Microbiologia e de Endodontia do Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Paraíba –
UNIVAP.
Foram utilizados incisivos bovinos extraídos de animais abatidos para comercialização da
carne, conforme laudo veterinário (ANEXO B).
3.1 O equipamento laser
Foi utilizado o equipamento laser de Arseneto de Gálio e Alumínio, modelo KO-650,
Kroman®, São Paulo, Brasil (Figura 2), comprimento de onda 685nm, potência de 50mW
(informação do fabricante).
A potência de saída do equipamento foi de 40mW e com o uso do sistema de fibra óptica
acrílica fornecido pelo fabricante (Figura 3) foi reduzida para 5mW. Essa aferição foi realizada
com um medidor de potência Melles Griot® modelo 13PEM001 devidamente calibrado (Figura
4).
49
Figura 2: Aparelho laser Kroman®.
Figura 3: Fibra óptica acoplada à peça de mão,
desenvolvida pelo fabricante Kroman®.
Figura 4: Medidor de potência. Melles Griot®.
50
Utilizando o mesmo aparelho laser, foi desenvolvido um sistema de acoplamento de fibra
óptica no Laboratório de Aplicações de Laseres de Alta Potência em Bioengenharia do Instituto
de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D (Figura 5) que apresentou potência de saída de 15mW
aferida pelo medidor supracitado.
3.2 O fotossensitizador
Dos corantes pesquisados por Garcez (2002), a solução aquosa de azuleno a 25% (Figura
6) foi o que apresentou a banda de absorção mais próxima ao comprimento de onda do laser
AlGaAs e também o mais eficiente na redução bacteriana de suspensão de Enterococcus faecalis.
O corante azuleno é um corante natural, extraído da camomila utilizado em xampus e loções de
cosmética. O azuleno, na concentração de 25%, provoca manchamento da dentina sendo de
difícil remoção. Para evitar tais inconvenientes o autor sugeriu a associação do corante à pasta
endo-PTC (F&A Laboratório Farmacêutico Ltda – Figura 7). Este creme foi desenvolvido por
Figura 5: Sistema de acoplamento realizado no IP&D.
51
Paiva e Antoniazzi e apresenta a seguinte composição: Peróxido de uréia (10%), Tween 80 (15%)
e o veículo Carbowax (75%).
3.3 Estudo piloto - manchamento dos dentes
Tendo em vista que o uso intracanal do corante utilizado neste experimento provocava
manchamento da dentina, sendo difícil a remoção do mesmo após o tempo de pré-irradiação, este
estudo piloto objetivou confirmar se o referido corante quando em associação com o creme de
endo-PTC tinha sua remoção facilitada.
Cirurgias de acesso tradicionais foram realizadas em doze dentes unirradiculares bovinos,
previamente imersos por 48 horas em hipoclorito de sódio a 0,5%. As cirurgias de acesso foram
realizadas com brocas esféricas diamantadas (HL 1016 KG-Sorensen®). Em seguida, os dentes
foram esvaziados com limas Hedströem #50 (Dentsply®), irrigados com 2mL de líquido de
Dakin e secos com cones de papel absorvente #50 (Dentsply®). Os canais e as câmaras pulpares
de seis dentes foram completamente preenchidos com azuleno a 25% associado ao creme de
endo-PTC e os outros seis dentes receberam apenas o azuleno a 25%, assim permanecendo por 5
Figura 6: Corante azuleno
a 25%.
Figura 7: endo-PTC.
52
minutos, denominado de período de pré-irradiação. Em seguida, todos os dentes foram irrigados
com 5mL de líquido de Dakin, no intuito de promover a remoção mecânica e química, por
efervescência do corante. Verificou-se, por análise visual, que a remoção da associação
corante/endo-PTC foi efetiva, embora nos dentes que receberam apenas corante observou-se o
manchamento das coroas.
3.4 Padronização do protocolo
Todos os experimentos descritos a seguir foram realizados em fluxo laminar (Figura 8).
Figura 8: Fluxo laminar.
53
3.4.1 Ação da terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em tubos de
ensaio.
A cepa padrão de Enterococcus faecalis (ATCC 10100 – Figura 9) foi inoculada em 48
mL de caldo BHI, de acordo com a escala 0,5 de Mac Farland (5x10
5
UFC/mL – Figura 10) e
alíquotas de 1,2mL foram pipetadas e transferidas para quarenta tubos de ensaio. Em seguida, de
cada tubo retirou-se 0,2mL de caldo contaminado e plaqueou-se em ágar BHI para confirmação
da viabilidade das bactérias (Grupo controle – Figura 11).
Os quarenta tubos de ensaio, comprovadamente contaminados com a suspensão de
Enterococcus faecalis, foram então divididos em quatro grupos com 10 tubos cada um:
Grupo 1: os dez tubos receberam 1mL, por tubo, de solução de hipoclorito de sódio a 1%
por 15 minutos e amostras de 0,2mL foram colhidas e plaqueadas para verificação da ação dessa
substância sobre as bactérias (Figura 12).
Figura 9: Cepa padrão. Figura 10: Escala Mc Farland.
Figura 11: Inóculo
bacteriano.
54
Grupo 2: os dez tubos (Figura 13) foram irradiados com o laser diodo de AlGaAs com os
seguintes parâmetros, 685nm de comprimento de onda, 40mW de potência de saída, 3minutos de
irradiação e 7,2J de dose final do fundo para a abertura do tubo (Figura 14) e amostras de 0,2mL
foram colhidas e plaqueadas para observação da ação isolada do laser sobre os microrganismos.
Figura 12:
Grupo 1 – Hipoclorito de
sódio a 1%.
Figura 13: Grupo 2 – Laser AlGaAs.
55
Grupo 3: os dez tubos receberam 1mL, por tubo, da pasta azuleno a 25% / endo-PTC
(Figura 15). Realizou-se a mistura no vortex e, após 5 minutos amostras de 0,2mL foram colhidas
e plaqueadas, com o intuito de se observar a ação isolada do fotossensitizador.
Figura 15:
Grupo 3 – Azuleno a 25% +
endo-PTC.
Figura 14: Irradiação do fundo para a abertura do tubo.
56
Grupo 4: os dez tubos receberam 1mL, por tubo, da pasta azuleno a 25% / endo-PTC.
Realizou-se a mistura no vortex e após 5 minutos, período de pré-irradiação, os dez tubos foram
irradiados com o laser AlGaAs com os mesmos parâmetros utilizados no grupo 2, do fundo para a
abertura do tubo (Figura 14). Em seguida, os tubos foram novamente colocados no vortex e
amostras de 0,2mL foram colhidas, plaqueadas e incubadas para avaliação da ação da terapia
fotodinâmica sobre as bactérias.
3.4.2 Ação da terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em tubos de
ensaio – modificação na forma de irradiação.
Como no experimento anterior não foram obtidos os resultados esperados, repetiu-se o
experimento modificando-se apenas a forma de irradiação nos grupos 2 e 4. Os tubos foram
irradiados com o laser diodo de AlGaAs com os mesmos parâmetros. A irradiação foi feita por
um minuto no fundo do tubo e trinta segundos em quatro pontos contornando as paredes laterais
do mesmo (Figura 16).
Figura 16: Irradiação contornando as paredes laterais do tubo.
57
3.4.3 Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis
utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento da Kroman®.
O equipamento utilizado foi o laser de Arseneto de Gálio Alumínio (AlGaAs) com
acoplamento de fibra óptica acrílica à peça de mão, desenvolvida pelo fabricante Kroman® para
utilização em canais radiculares. Em relação ao fotossensitizador utilizado, manteve-se o mesmo
corante, nas mesmas condições supracitadas no item 3.1.
Segundo informação do fabricante, a potência do equipamento utilizado nesta pesquisa é
de 50mW, apresentando pequena diminuição da mesma após o acoplamento da fibra. Entretanto,
utilizando-se o medidor de potência Melles Griot® para aferição da potência do aparelho
verificaram-se valores de 40mW antes e 5mW após o acoplamento. Utilizou-se a técnica sugerida
por Gutknecht (1996) de irradiação helicoidal, para os laseres de alta potência, na tentativa de
irradiar todas as paredes do canal.
Vinte dentes bovinos, previamente imersos por 48 horas em hipoclorito de sódio a
0,5%, tiveram suas coroas cortadas com disco de carborundum, de forma que as raízes ficassem
com 20mm de comprimento. O tecido pulpar foi removido com limas Hedströem (Dentsply®)
#35. As entradas dos canais foram preparadas com brocas Gattes-Glidenn número 4 e Batt
número 14 e os canais radiculares foram instrumentados e alargados em toda a sua extensão com
limas tipo K-file (Dentsply®) no mínimo até o calibre 45, seguindo a técnica de Paiva e
Antoniazzi. Os ápices radiculares foram selados com resina composta fotoativada Z100 (3M®)
cor A3. As superfícies externas das raízes foram impermeabilizadas com duas camadas de
esmalte para unhas na cor preta. A opção de impermeabilização das raízes com o esmalte na cor
preta, foi necessária para minimizar o espalhamento da luz nos grupos que receberam a
irradiação.
58
No terço cervical de cada raiz foi feita uma amarria com fio 0,25mm para que o
dente pudesse ser introduzido e retirado do tubo de ensaio sem haver contato manual (Figura 17A
e B). As raízes foram esterilizadas em autoclave a 121°C por 20 minutos no interior de tubos de
ensaio com tampas de rosca.
As vinte raízes foram contaminadas com um inóculo de Enterococcus faecalis ATCC
10100 (Figura 18) obtido de acordo com a escala 0,5 de Mac Farland (5x10
5
UFC/mL). Após este
período, amostras foram colhidas (Figura 19) para confirmar a contaminação dos canais (controle
positivo).
Figura 17: Preparo do dente.
A B
59
As vinte raízes comprovadamente contaminadas com a suspensão de Enterococcus
faecalis foram então divididas em quatro grupos de 5 raízes cada um:
Figura 18: Contaminação da raiz com inóculo de Enterococcus faecalis
ATCC 10100.
Fi
g
ura 19: Coleta de amostra.
60
Grupo 1: as raízes receberam solução de hipoclorito de sódio a 1% por 15 minutos.
Amostras foram colhidas imediatamente após para avaliação da possível redução bacteriana.
Grupo 2: as raízes foram irradiadas com a fibra óptica com os seguintes
parâmetros: 685nm, 5mW, 3 minutos e dose de energia de 0,9J em movimentos helicoidais
(Figura 20). Amostras foram colhidas para verificação da ação isolada do laser.
Grupo 3: as raízes receberam o corante azuleno a 25% / endo-PTC por um período
de 5 minutos (Figura 21). Em seguida, amostras foram colhidas para verificação da possível ação
tóxica do corante sobre as bactérias.
Figura 20: Irradiação com fibra óptica.
61
Grupo 4: as raízes receberam o corante azuleno a 25% associado ao endo-PTC por um
período de pré-irradiação de 5 minutos e foram irradiadas com a fibra óptica com parâmetros
semelhantes aos do grupo 2, em movimentos helicoidais. Amostras foram colhidas após estes
procedimentos para avaliação da ação da terapia fotodinâmica sobre as bactérias.
A mistura do corante azuleno a 25% com o creme endo-PTC na proporção de duas
gotas de corante para dois gramas de creme foi realizada dentro da câmara escura de revelação de
radiografia, evitando-se a ação da luz natural e artificial sobre o corante.
Todas as amostras foram colhidas com cones de papel absorvente que foram
mergulhados, imediatamente depois, em tubos contendo 3mL de caldo BHI. Alíquotas de 0,2mL
desses caldos foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI. As placas foram incubadas
por 24 horas a 37ºC antes da leitura dos resultados.
Fi
g
ura 21: Canal
p
reenchido com azuleno a 25% / endo-PTC.
62
3.4.4 Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando
a fibra óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D.
O equipamento utilizado foi o mesmo laser de Arseneto de Gálio Alumínio (AlGaAs)
com acoplamento da radiação emitida em uma fibra óptica de sílica com diâmetro de núcleo de
600µm desenvolvida no Laboratório de Aplicações de Laseres de Alta Potência em
Bioengenharia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D para utilização em canais
radiculares (Figura 22). O fotossenstizador permaneceu inalterado.
Após o acoplamento da fibra utilizou-se o medidor de potência Melles Griot® para
aferição da potência de saída da ponta da fibra verificando-se o valor de 15mW.
Utilizou-se a mesma técnica de irradiação helicoidal sugerida por Gutknecht
(1996) e os quarenta dentes bovinos foram preparados da mesma maneira, conforme descrito no
experimento anterior.
Fi
g
ura 22: Aco
p
lamento da fibra ó
p
tica desenvolvido no IP&D.
63
As quarenta raízes foram contaminadas com um inóculo de Enterococcus faecalis
(ATCC 10100) obtido de acordo com a escala 0,5 de Mac Farland (5x10
5
UFC/mL). Após este
período, amostras foram colhidas para confirmar a contaminação dos canais (controle positivo).
As quarenta raízes comprovadamente contaminadas com a suspensão de Enterococcus faecalis
foram então divididas em quatro grupos de 10 raízes cada um:
Grupo 1: as raízes receberam solução de hipoclorito de sódio a 1% por 15 minutos.
Amostras foram colhidas imediatamente após para avaliação da possível redução bacteriana.
Grupo 2: as raízes foram irradiadas com a fibra óptica com os seguintes
parâmetros: 685nm, 15mW, 3 minutos e dose final de energia de 2,7J com movimentos
helicoidais. Amostras foram colhidas para verificação da ação isolada do laser.
Grupo 3: as raízes receberam o corante azuleno a 25% / endo-PTC por um
período de 5 minutos. Em seguida, amostras foram colhidas para verificação da possível ação
tóxica do corante sobre as bactérias.
Grupo 4: as raízes receberam o corante azuleno a 25% associado ao endo-PTC
por um período de pré-irradiação de 5 minutos e foram irradiadas com a fibra óptica com os
mesmos parâmetros utilizados no grupo 2. Amostras foram colhidas após estes procedimentos
para avaliação da ação da terapia fotodinâmica sobre as bactérias.
A mistura do corante azuleno a 25% com o creme endo-PTC na proporção de duas
gotas de corante para dois gramas de creme foi realizada dentro da câmara escura de revelação de
radiografia para se evitar a ação da luz natural e artificial sobre o corante.
Todas as amostras foram colhidas com cones de papel absorvente que foram
mergulhados, imediatamente depois, em tubos contendo 3mL de caldo BHI. Alíquotas de 0,2mL
desses caldos foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI. As placas foram incubadas
por 24 horas a 37ºC, antes da leitura dos resultados.
64
3.4.5 Experimento principal: Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de
Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no
IP&D – protocolo misto.
Buscando otimizar os resultados obtidos, repetiu-se o experimento realizando-se um
protocolo misto com a seguinte forma de irradiação: introduziu-se a fibra 10mm no interior do
canal radicular e mantendo-a nesta posição acionou-se o laser com 685nm de comprimento de
onda, 15mW de potência de saída, irradiação por 2 minutos e dose de energia de 1,8J. Removeu-
se a fibra e, em seguida, posicionou-se a peça de mão na entrada do canal e nesta posição
acionou-se o laser com 685nm de comprimento de onda, 40mW de potência de saída, irradiação
por 2 minutos e dose de energia de 4,8J. Este protocolo foi realizado visando a irradiação de toda
a área do canal radicular, evitando-se que algumas regiões do conduto não fossem atingidas pelo
raio laser, o que poderia ter ocorrido na técnica de irradiação helicoidal.
Os dentes foram preprados de maneira semelhante ao descrito nos experimentos
anteriores.
As quarenta raízes foram contaminadas com um inóculo de Enterococcus faecalis
(ATCC 10100) obtido de acordo com a escala 0,5 de Mac Farland (5x10
5
UFC/mL). Amostras
foram colhidas para confirmar a contaminação dos canais (controle positivo). As quarenta raízes
comprovadamente contaminadas com a suspensão de Enterococcus faecalis foram então
divididas em quatro grupos de 10 raízes cada um:
Grupo 1: as raízes receberam solução de hipoclorito de sódio a 1% por 15 minutos.
Amostras foram colhidas imediatamente após para avaliação da possível redução bacteriana.
Grupo 2: as raízes foram irradiadas da seguinte forma: introduziu-se a fibra
10mm no interior do canal radicular e mantendo-a nesta posição acionou-se o laser (685nm,
65
15mW, dose de energia de 1,8J) por 2 minutos (Figura 23). Removeu-se a fibra e, em seguida,
posicionou-se a peça de mão na entrada do canal (Figura 24) e nesta posição acionou-se o laser
(685nm, 40mW, dose de energia de 4,8J) por mais 2 minutos. A dose final que cada raiz recebeu
foi de 6,6J. Amostras foram colhidas para verificação da ação isolada do laser.
Fi
g
ura 23: Irradia
ç
ão com a fibra ó
p
tica.
Fi
g
ura 24: Irradia
ç
ão com a
p
e
ç
a de mão.
66
Grupo 3: as raízes receberam a associação do corante azuleno a 25% / endo-PTC
por um período de 5 minutos. Em seguida, amostras foram colhidas para verificação da possível
ação tóxica do corante sobre as bactérias.
Grupo 4: as raízes receberam o corante azuleno a 25% associado ao endo-PTC por um
período de pré-irradiação de 5 minutos e foram irradiadas da mesma maneira que no grupo 2.
Amostras foram colhidas após estes procedimentos para avaliação da ação da terapia
fotodinâmica sobre as bactérias.
A mistura do corante azuleno a 25% com o creme endo-PTC na proporção de duas
gotas de corante para dois gramas de creme foi realizada dentro da câmara escura de revelação de
radiografia para se evitar a ação da luz natural e artificial sobre o corante.
Todas as amostras foram colhidas com cones de papel absorvente que foram
mergulhados, imediatamente depois, em tubos contendo 3mL de caldo BHI. Alíquotas de 0,2mL
desses caldos foram semeadas em placas de Petri contendo ágar BHI. As placas foram incubadas
por 24 horas a 37ºC antes da leitura dos resultados.
67
4. RESULTADOS
Os resultados obtidos nos itens 3.4.1. (Ação da terapia fotodinâmica em culturas de
Enterococcus faecalis em tubos de ensaio), 3.4.2. (Ação da terapia fotodinâmica em culturas de
Enterococcus faecalis em tubos de ensaio – modificação na forma de irradiação) e 3.4.3. (Ação
da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com
sistema de acoplamento da Kroman®) permitiram observar que todas as placas semeadas para
controle positivo apresentaram um número incontável de colônias (superior a 100.000UFC/mL),
confirmando assim presença de contaminação (Figura 25).
A observação das placas semeadas no Grupo 1, após adição da solução de hipoclorito de
sódio a 1% por 15 minutos (Figura 26), revelou a inexistência de colônias (zero UFC/mL),
confirmando a ação bactericida desse agente químico.
Figura 25: Placa representativa dos grupos
controle.
68
Por sua vez, as placas semeadas nos Grupos 2, 3 e 4, nos quais se utilizou,
respectivamente, somente aplicação de laser (Figura 27A), apenas fotossensitizador (Figura 27B)
e terapia fotodinâmica (Figura 27C), apresentaram-se com número de colônias superior a
100.000UFC/mL, semelhantes, portanto, às placas referentes ao grupo controle.
Figura 26: Placa representativa dos grupos
1 – hipoclorito de sódio.
Figura 27: A - Placa representativa dos grupos 2 – laser isolado.
B - Placa representativa dos grupos 3 – fotossensitizador isolado.
C - Placa representativa dos grupos 4 – terapia fotodinâmica.
A B C
69
As quarenta placas semeadas para controle positivo no experimento 3.4.4. (Ação da
terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com
sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D) apresentaram um número incontável de colônias
(superior a 100.000UFC/mL), confirmando assim a contaminação de todos os canais. A
observação das placas semeadas no Grupo 1, após aplicação da solução de hipoclorito de sódio a
1% por 15 minutos, revelou a inexistência de colônias (zero UFC/mL), confirmando a ação
bactericida dessa substância. Por sua vez, as placas semeadas nos Grupos 2 e 3, nos quais se
utilizou, respectivamente, somente aplicação de laser e apenas fotossensitizador apresentaram-se
com número de colônias superior a 100.000UFC/mL, semelhantes, portanto, às placas referentes
ao grupo controle. Nas placas correspondentes ao Grupo 4, nas quais foi realizada a terapia
fotodinâmica, houve diminuição no número de colônias, efeito bacteriostático (Figura 28 e
Tabela 2).
A
Figura 28 – Ação da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica
com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D – placas 1 a 10.
1 2 3
6
7
1
8 9 10
4 5
70
Tabela 2 – Redução bacteriana expressa em UFC/mL e porcentagem de redução após
utilização da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com
sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D.
Amostras Grupo Controle Grupo PDT % de Redução
Placa 1
100.000UFC/mL
25UFC/mL 99,97
Placa 2
100.000UFC/mL
30UFC/mL 99,97
Placa 3
100.000UFC/mL
145UFC/mL 99,85
Placa 4
100.000UFC/mL
190UFC/mL 99,81
Placa 5
100.000UFC/mL
70UFC/mL 99,93
Placa 6
100.000UFC/mL
75UFC/ml 99,92
Placa 7
100.000UFC/mL
80UFC/mL 99,92
Placa 8
100.000UFC/mL
360UFC/mL 99,64
Placa 9
100.000UFC/mL
155UFC/mL 99,84
Placa 10
100.000UFC/mL
125UFC/mL 99,87
No experimento principal 3.4.5. (Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de
Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no
IP&D – protocolo misto) as quarenta placas semeadas para controle positivo apresentaram um
número incontável de colônias (superior a 100.000UFC/mL), confirmando assim a contaminação
de todos os canais. A observação das placas semeadas no Grupo 1, após aplicação da solução de
hipoclorito de sódio a 1% por 15 minutos, revelou a inexistência de colônias (zero UFC/mL),
confirmando a ação bactericida dessa substância. Por sua vez, as placas semeadas nos Grupos 2 e
3, nos quais se utilizou, respectivamente, somente aplicação de laser e apenas fotossensitizador
apresentaram-se com número de colônias superior a 100.000UFC/mL, semelhantes, portanto, às
placas referentes ao grupo controle. Nas placas correspondentes ao Grupo 4, nas quais foi
realizada a terapia fotodinâmica, revelou a inexistência de colônias (zero UFC/mL), confirmando
a ação bactericida da terapia fotodinâmica (Figura 29).
71
Figura 29 – Ação da PDT em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica
com sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D – protocolo misto – placas 1 a 10.
1
2
3
4
6
7
8
9
1
0
5
72
5. DISCUSSÃO
Toda terapia endodôntica está direcionada a facilitar o estabelecimento do processo
reparacional do dente no menor tempo possível. O conhecimento da Microbiologia Oral,
especialmente a de aplicação endodôntica, é de suma importância para a obtenção do sucesso nos
tratamentos endodônticos. Vários trabalhos expostos na revisão da literatura deixam claro o
estreito relacionamento entre a presença de microrganismos e o estabelecimento das alterações
periapicais (HAAPASALO; RANTA; RANTA, 1983; YOSHIDA et al., 1987; FLEURY; AUN,
1990; BAUMGARTNER; FALKLER JR, 1991; AZEVEDO; LAGE MARQUES; PESCE, 1995;
NAIR et al., 1999; FERRARI, 2001; SOUZA, 2001; SIQUEIRA JR, 2001; FERREIRA et al.,
2004).
A endodontia atual vem concentrando esforços no sentido de promover a sanificação do
sistema de canais radiculares e de prevenir a reinfecção de todo sistema endodôntico. Para isso,
os profissionais utilizam instrumentos endodônticos manuais ou rotatórios, substâncias químicas
auxiliares, medicação intracanal de caráter antimicrobiano, obturação homogênea e adequado
selamento coronário (HAAPASALO;RANTA;RANTA,1983; BYSTRÖM;SUNDQVIST, 1985;
HAAPASALO;ÖRSTAVIK, 1987; AZEVEDO;LAGE MARQUES;PESCE, 1995; GAETTI-
JARDIM JÚNIOR; PEDRINI; D’ANTÔNIO, 1996; SJÖGREN et al., 1997; MICKEL;
SHARMA; CHOGLE, 2003).
Nos casos de polpa necrosada, os microrganismos predominantes no interior dos canais
radiculares são as bactérias anaeróbias estritas Gram-negativas, que são mais facilmente
eliminadas quando se institui tratamento endodôntico convencional
(HAAPASALO;RANTA;RANTA, 1983; YOSHIDA et al., 1987; PECIULIENE et al., 2001).
73
As bactérias anaeróbias facultativas Gram-positivas estão presentes, normalmente, na
minoria dos casos de infecção endodôntica de caráter primário. Porém, permanecem sempre
presentes nos casos refratários à terapia endodôntica convencional. Isso, provavelmente, ocorre
por serem esses microrganismos mais resistentes a manobras endodônticas, sendo então
categorizados como superinfectantes ou oportunistas, dentre os quais se podem destacar o grupo
de enterococos, em particular a espécie Enterococcus faecalis (FUKUSHIMA et al., 1990; NAIR
et al., 1990; BAUMGARTNER;FALKLER JR, 1991; SJÖGREN et al., 1997; FERRARI, 2001;
LIMA;FAVA;SIQUEIRA JR, 2001; LOVE, 2001; SUNDE et al., 2002; CHÁVEZ DE PAZ et
al., 2003; PINHEIRO et al., 2003; ÖZTAN et al., 2006).
As espécies Enterococcus faecalis têm mostrado capacidade de sobreviver no interior
dos canais radiculares como microrganismo único e em ambiente pobre de nutrientes. Tem sido
demonstrada a permanência desses microrganismos oportunistas no interior dos túbulos
dentinários, no cemento e até mesmo fora da intimidade do canal radicular
(HAAPASALO;ÖRSTAVIK, 1987; FUKUSHIMA et al., 1990; PECIULIENE et al., 2001;
PETERS et al., 2001; SIQUEIRA JR;LOPES, 2001), justificando a escolha deste microrganismo
no presente estudo.
A verificação do efeito bactericida, sobre culturas de Enterococcus faecalis, foi
confirmada neste estudo, em todas as fases de padronização do protocolo e do experimento
principal, quando se utilizou a solução de hipoclorito de sódio na concentração de 1% após 15
minutos de contato, coincidindo com os resultados obtidos por diversos autores que utilizaram
metodologias diferentes. Tais como, Byström e Sundqvist (1985) verificaram o efeito
antibacteriano da solução de hipoclorito de sódio nas concentrações de 0,5 a 5% associada ao
EDTA 15%, coincidindo com o trabalho de Yoshida et al. (1995) que avaliaram a eficácia da
solução de EDTA a 15% como irrigante dos canais radiculares em eliminar a smear layer.
74
Sjögren et al. (1997) utilizaram a substância química hipoclorito de sódio a 0,5%, confirmando os
resultados obtidos por D’Arcangelo et al. (1999) que testaram o efeito desta substância em
diferentes concentrações sobre cepas de Enterococcus faecalis em diferentes tempos de contato,
obtendo efeito bactericida. O mesmo foi conseguido nos trabalhos de Buck et al. (2001) que
obtiveram efetiva redução bacteriana com a solução de hipoclorito de sódio na concentração de
0,525% como irrigante intracanal, de Berber et al. (2006) que demonstraram uma grande
atividade antibacteriana desta substância na concentração 5,25% dentro dos túbulos dentinários
infectados com Enterococcus faecalis, e de Vianna et al. (2006) que utilizaram a solução de
hipoclorito de sódio a 5,25%. Porém, Dametto et al. (2006) observaram que tanto o gel de
clorexidine a 2% quanto a solução de clorexidine a 2% reduziram significantemente as UFC de
Enterococcus faecalis quando comparado com a solução de hipoclorito de sódio a 5,25% que não
foi capaz de manter os canais radiculares livre de bactérias após preparo biomecânico.
Refletindo
sobre o exposto acima, com base em artigos científicos e experiências
clínicas, assim como o conhecimento da microflora e anatomia do sistema de canais radiculares e
do efeito bactericida da solução do hipoclorito de sódio em diversas concentrações, por que os
endodontistas se deparam com alguns casos refratários ao protocolo de tratamento endodôntico
instituído, não conseguindo assim a sanificação do sistema de canais radiculares? Com base nessa
pergunta, pesquisou-se qual seria a ação da terapia fotodinâmica em canais radiculares
contaminados com Enterococcus faecalis, que comprovadamente estão presentes nesses casos.
A técnica da terapia fotodinâmica utiliza a propriedade de seletividade da luz laser e
emprega uma droga fotossensitizadora. Esta substância fotossensitizadora é excitada quando
iluminada por uma luz de cor específica e uma vez neste estado energético, provoca uma reação
química com o oxigênio molecular, produzindo uma espécie de oxigênio atômico, ou seja, o
75
oxigênio no estado singleto, que é altamente reativo para os constituintes celulares e, portanto,
bastante citotóxico (KESSEL, 2004; GIUSTI, 2005).
Atualmente, o laser é a fonte de luz mais empregada para ativar os fotossensitizadores,
devido às propriedades que o mesmo apresenta, tais como concentração elevada de energia,
pouca dispersão de energia à medida que a luz se propaga, coerência e monocromaticidade.
Estudos da década de 1990, mostravam que um grande número de bactérias bucais,
incluindo as endodônticas, periodontais e as cariogênicas, era susceptível a essa terapia. Assim
sendo, adaptou-se a utilização dessa técnica empregada em pacientes oncológicos para combater
bactérias orais. Surgiu, então, o interesse em desenvolver um método de descontaminação dos
canais radiculares e da dentina cariada, assim como a eliminação de biofilmes periodontais
baseado na terapia fotodinâmica (ACKROYD et al., 2001; GARCEZ et al., 2003; ZANIN et al.,
2003).
A técnica da PDT pode oferecer diversas vantagens em relação aos agentes
antimicrobianos tradicionais. Primeiramente, a morte bacteriana é rápida, diminuindo a
necessidade da manutenção de altas concentrações de substâncias químicas por longos períodos
de tempo, como no caso do uso de antibióticos e anti-sépticos. Em segundo lugar, como a morte
das bactérias não está ligada à mediação de radicais químicos, o desenvolvimento de resistência
seria improvável. Como nem o fotossensitizador nem a luz empregada são bactericidas quando
utilizados isoladamente, a morte das bactérias pode ser controlada restringindo-se a região
irradiada e evitando-se a destruição da microbiota em outros locais (WILSON; PRATTEN,
1994).
Por essa razão, a PDT pode ser uma alternativa interessante a esses fármacos, utilizada
como coadjuvante de métodos químicos e mecânicos de descontaminação bacteriana de canais
radiculares (GIUSTI, 2005).
76
Neste estudo avaliou-se, in vitro, a ação da terapia fotodinâmica em incisivos bovinos
recém extraídos, simulando uma situação próxima a encontrada na rotina clínica do endodontista,
ou seja, canal radicular com comprimento padronizado semelhante ao dos dentes humanos e
contaminados com Enterococcus faecalis.
É importante salientar que os resultados obtidos na presente pesquisa demonstraram
que, a ausência do fotossensitizador ou a aplicação isolada do laser não afetou a viabilidade das
bactérias, resultados estes, coincidentes com os de Wilson e Pratten (1994) que utilizaram o
fotossensitizador azul de O-toluidina em culturas de Staphylococcus aureus, porém divergentes
dos obtidos por Gutknecht et al. (2000), quando o laser de diodo foi utilizado com comprimento
de onda de 810nm e potência de 0,6W, por 30 segundos, em culturas de Enterococcus faecalis,
onde houve a redução do número de bactérias em camadas profundas de paredes dentinárias de
canais radiculares bovinos infectados. König et al. (2000) conseguiram a inativação bacteriana
baseada na excitação óptica de porfirinas fotossensitizadoras endógenas de bactérias Gram-
positivas utilizando laser He-Ne, diferindo da técnica utilizada no presente estudo.
A aplicação isolada do fotossensitizador azuleno a 25% associada ao creme de endo
PTC nas condições deste estudo, também não afetou a viabilidade da cepa de Enterococcus
faecalis, resultado coincidente ao da pesquisa de Garcez (2002) sobre as mesmas bactérias e de
Wilson e Pratten (1994) em Staphylococcus aureus.
Para a execução do experimento pretendido no objetivo específico deste trabalho,
realizou-se um primeiro estudo piloto, visando a padronização do protocolo descrito na
metodologia como “Ação da terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em tubos
de ensaio”. Tinha por finalidade confirmar a ação isolada da substância hipoclorito de sódio a
1%, do laser e do fotossensitizador, bem como, a ação da terapia fotodinâmica em tubos de
77
ensaio contendo suspensão de Enterococcus faecalis antes de executar nos dentes bovinos
propriamente ditos.
Após a realização de todo o experimento, utilizando o protocolo de irradiação do fundo
para a abertura do tubo, os resultados, bacteriostático ou bactericida, não foram coincidentes com
os verificados por Wilson e Pratten (1994), Bhatti et al. (2000), Gutknetch et al. (2000), Garcez
(2002), Seal et al. (2002), Shibli (2003), Giusti (2005) que avaliaram o efeito da terapia
fotodinãmica utilizando metodologias diferentes.
Diversas justificativas podem ser levantadas, tais como a forma empírica de irradiação
do tubo, o fato do diâmetro do tubo de ensaio apresentar grande calibre, o que,
consequentemente, determinou um volume aumentado da suspensão de Enterococcus faecalis em
caldo BHI, dificultando a penetração da luz laser em todo o conteúdo. Outras, ainda, como a
concentração do corante ou o fato de que algumas áreas do tubo de ensaio poderiam não ter sido
atingidas pela luz, permitindo a existência de células viáveis.
Baseado no ocorrido acima, optou-se por repetir o experimento, descrito como “Ação da
terapia fotodinâmica em culturas de Enterococcus faecalis em tubos de ensaio – modificação na
forma de irradiação.” Neste, utilizou-se também a dose total de 7,2J, divida em cinco aplicações,
sendo uma aplicação no fundo e quatro contornando o tubo de ensaio, com o objetivo principal de
padronizar o protocolo e verificar se ocorreria o efeito bacteriostático ou bactericida após a PDT.
Esta modificação na forma de irradiação foi baseada no trabalho de Shibli et al., 2003. No
entanto, os resultados obtidos também não foram coincidentes com os verificados na literatura.
Visto que os resultados obtidos nos experimentos acima não foram conclusivos, por
causa da metodologia empregada, optou-se por utilizar o mesmo equipamento laser acoplado ao
sistema de fibra óptica fornecido pelo fabricante Kroman® para canais radiculares.
78
O experimento intitulado “Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus
faecalis utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento da Kroman®”, foi realizado
utilizando-se dentes bovinos com padronização do comprimento médio de 20mm e diâmetro dos
canais radiculares # mínimo 45, permitindo que o volume da suspensão de Enterococcus faecalis
dentro das raízes, simulasse uma situação clínica em dentes humanos. Utilizou-se a técnica
sugerida por Gutknecht (1996) de irradiação helicoidal, para os laseres de alta potência, na
tentativa de irradiar todas as paredes do canal.
É importante ressaltar que o fabricante informa a potência de saída do aparelho como
50mW e que após a adaptação do sistema de acoplamento, esta apresentaria uma perda de
aproximadamente 10%, no entanto, a aferição detectou uma perda de quase 90%, resultando em
uma potência de saída de aproximadamente 5mW. Este fato poderia justificar a ausência de efeito
bacteriostático ou bactericida da terapia fotodinâmica.
Portanto, no presente estudo, a dose final recebida passou a ser de 0,9J na raiz, ao invés
de 7,2J no tubo de ensaio. Os resultados divergem dos relatados por Garcez (2002) que obteve
redução bacteriana dos mesmos microrganismos, em tubos de ensaio e em dentes humanos e com
potência de saída de 10mW.
A confirmação da redução da potência de saída do sistema de acoplamento da fibra
óptica e a não efetividade da PDT observada, incentivou ao desenvolvimento de um sistema de
acoplamento com menor perda da potência de saída após o acoplamento. Com o auxílio da
equipe de pesquisadores do Laboratório de Aplicações de Laseres de Alta Potência em
Bioengenharia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento – IP&D foi desenvolvido este sistema
de acoplamento, que passou a fornecer uma potência de saída de 15mW. Com isto a dose final
que cada raiz recebeu através da terapia fotodinâmica foi triplicada, ou seja, 2,7J.
79
Realizou-se, então, o experimento “Ação da terapia fotodinâmica em suspensão de
Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com sistema de acoplamento desenvolvido no
IP&D” utilizando os mesmos parâmetros que o experimento anterior, só que alterando a dose
final recebida em cada raiz, que passou de 0,9J para 2,7J. Os resultados obtidos permitiram
observar a sobrevivência de alguns microrganismos no interior desses canais, coincidindo com os
trabalhos de Wilson e Pratten (1994) que conseguiram a redução na contagem viável de
Staphylococcus aureus em sua pesquisa, utilizando o fotossensitizador O-toluidina associada ao
laser de He-Ne. Assim como, Bhatti et al., (2000); Gutknecht et al., (2000) e Giusti (2005) que
conseguiram o mesmo efeito utilizando metodologias diferentes. Seal et al. (2002) também
conseguiram o efeito bacteriostático da PDT utilizando a combinação do fotossensitizador O-
toluidina e laser He-Ne com os seguintes parâmetros: comprimento de onda de 632,8nm e
potência de saída de 35mW aplicado diretamente na entrada de canais radiculares contaminados
com suspensão de Streptococcus intermedius. Justificando o ocorrido, pode-se sugerir que isto
tenha ocorrido porque algumas áreas das raízes possam não ter sido atingidas pela luz.
O desconhecimento de parâmetros adequados ou mesmo de um protocolo definido para
a ação bactericida da terapia fotodinâmica em canais radiculares, induziu na busca pela obtenção
de um resultado satisfatório.
Deve-se ressaltar que a finalidade do presente estudo, envolvendo a PDT, era definir
parâmetros que resultassem numa ação bactericida, pois a ação bacteriostática não resolveria os
casos refratários em Endodontia.
Utilizando a mesma metodologia acima, com o sistema de acoplamento da fibra óptica
desenvolvido pelo IP&D, e protocolo misto de irradiação aumentou-se o tempo de irradiação para
quatro minutos, sendo que durante dois minutos a irradiação era realizada com a fibra óptica com
15mW de potência, posicionada no interior do canal radicular, resultando em 1,8J de energia. Em
80
seguida, a peça de mão com 40mW de potência, foi acionada por mais dois minutos na entrada do
canal, ou seja, aplicou-se 4,8J de energia, totalizando a dose final em cada raiz de 6,6J. Essas
modificações permitiram obter os resultados relatados como experimento principal, “Ação da
terapia fotodinâmica em suspensão de Enterococcus faecalis utilizando a fibra óptica com
sistema de acoplamento desenvolvido no IP&D – protocolo misto”, que coincidiram com os
verificados por Garcez (2002), relatando o efeito bactericida da PDT em suspensão de
Enterococcus faecalis. O mesmo efeito foi também alcançado por Nussbaum, Lilgle e Mazzuli
(2002) quando testaram diversos parâmetros para PDT, sugerindo que o crescimento bacteriano
pode ser estimulado ou inibido dependendo da combinação entre espécie bacteriana,
comprimento de onda, radiação e dose.
Cabe ressaltar que a dificuldade de padronização de um protocolo utilizando a PDT com
aplicabilidade clínica em Endodontia, ultrapassa o ajuste dos parâmetros supracitados. Isso porque
outros fatores influenciam esse sistema biológico, tais como, a complexidade do sistema de canais
radiculares, a diversidade dos dentes humanos, que apresentam elementos de diversos grupos
(incisivos, caninos, pré-molares e molares), com localização anatômica superior ou inferior,
possuindo um ou mais canais radiculares, sendo que estes podem apresentar diâmetros variados,
dependo diretamente da idade do paciente e de fatores secundários que podem causar o
atresiamento desses canais.
Outro ponto importante a ser lembrado, é que o sistema de canais radiculares é composto
por uma microflora bacteriana diversificada, com espécies bacterianas que apresentam diferentes
fatores de virulência, além de espécies fúngicas oportunistas. Ainda, é importante saber que a
localização desses microrganismos dentro dos canais radiculares não se restringe somente à luz do
canal principal, podendo localizar-se no interior dos túbulos dentinários ou mesmo em canais
secundários, acessórios, colaterais, recorrentes, intercondutos ou laterais e até mesmo fora do
81
sistema de canais radiculares. Por esses motivos, casos refratários ao tratamento endodôntico
convencional muitas vezes dificultam a padronização de um protocolo.
Com base na revisão da literatura e nos resultados obtidos nos parâmetros utilizados no
experimento principal, sugere-se a continuidade de pesquisas nesta área visando esclarecer os
questionamentos apresentados sobre a verdadeira efetividade da PDT na eliminação de
microrganismos resistentes em canais radiculares, bem como o seu papel em casos de reinfecção
ou recontaminação.
82
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos, com os parâmetros utilizados na presente pesquisa, permitem
sugerir que:
- A terapia fotodinâmica apresentou ação bactericida em canais radiculares bovinos
contaminados por Enterococcus faecalis.
83
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Anexo A
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Anexo B
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