( PDF ) O Efeito de APRIL na Migração de Timócitos

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

Cecilia Rocha de Souza

O Efeito de APRIL na Migração de Timócitos

Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo

Cruz como parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Biologia Celular e Molecular.

Orientador(es): Prof

Carla Eponina de Carvalho Pinto

Prof. Dr. Wilson Savino

RIO DE JANEIRO

2009

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

AUTOR: CECILIA ROCHA DE SOUZA

O EFEITO DE APRIL NA MIGRAÇÃO DE TIMÓCITOS

ORIENTADOR (ES): Prof

. Dr

. Carla Eponina de Carvalho Pinto

Prof. Dr. Wilson Savino

Aprovada em: 21/08/2009

EXAMINADORES:

Prof. Dr. Alexandre Morrot Lima (Suplente)

Prof

. Dr

. Maria Isabel Doria Rossi

Prof

. Dr

. Salete Smaniotto

Prof

. Dr

. Valéria de Mello Coelho (Suplente)

Prof. Dr. Vinicius Cotta de Almeida - Presidente

Rio de Janeiro, 21 de agosto de 2009.

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iii

Dedico este trabalho à minha querida amiga Joana, pois

“life is still worthwhile if you just smile”.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos que estiveram ao meu lado ao longo desta

jornada. Este trabalho me proporcionou uma fuga para os problemas e, em alguns

momentos, a razão deles. Por isso, foi muito importante ter o apoio, carinho,

preocupação e torcida das pessoas que gostam de mim. Obrigada a todos vocês!

Primeiramente, agradeço aos meus pais, meus exemplos, por me permitirem sonhar

com uma carreira tão difícil, por vibrarem com minhas conquistas (mesmo que ainda

sejam poucas) e por participarem ativamente desse sonho. Por me apontarem o

caminho quando, muitas vezes, eu não o via. Por terem me ensinado a suportar e

superar as dificuldades. Sem vocês nada disso seria possível. À minha maneira, eu

os amos muito. Muito obrigada!

Ao meu namorado, João Victor, pelo carinho, apoio e, principalmente, pela

paciência. Pelo seu bom humor, companheirismo e pelo seu amor. Por sempre

aparecer na hora certa com seu lindo sorriso e maravilhosos chocolatinhos! Você foi

abrigo, força e inspiração. Você é meu grande exemplo de superação. Obrigada por

me fazer sorrir para os problemas. Obrigada por tudo e por nada, simplesmente por

você fazer parte da minha vida.

Aos meus avós, pela constante preocupação, e por não reclamarem da minha

ausência. Por serem simples, mas tão nobres. Vocês não fazem a menor idéia, mas

me dão forças para continuar a cada dia...

As minhas tias, sempre preocupadas comigo, pela escandalosa, carinhosa e

calorosa torcida para que os experimentos funcionassem e para que eu, um dia,

descubra algo muito legal.

Aos meus irmãos barulhentos, Rico e Mau, que fizeram com que eu desenvolvesse

uma incrível capacidade de abstração e concentração nestes anos.

Aos meus primos (que são tantos!), pela imensa alegria de estar ao lado de vocês

em qualquer ocasião.

Ao meu afilhado, o menino mais lindo e inteligente desse mundo, que enche a

dindinha de orgulho. Eu sei que nos últimos meses eu fui uma dindinha um

pouquinho ausente, mas aqueles passeios e lanchinhos acumulados acontecerão

logo!

Aos meus queridíssimos Andressa, Vanessa, Tamara, Giselle, Pamela, Marcelo,

Gustavo, Samon, Flávio, Léo e Bahamut. Por me ouvirem, por perdoarem os meus

furos, e por me divertirem sempre! Se existe algo na minha vida de que eu não

possa reclamar, é de ter AMIGOS. Vocês são únicos, verdadeiros, e, por isso,

fundamentais.

Mas eu devo um agradecimento especial para as minhas amigas Joana e Julie que

sempre estiveram ao meu lado, mesmo que virtualmente, independente da hora,

local e humor. Que me conhecem tão bem, e há tantos anos, sabendo exatamente

quando o momento pedia uma piada, um abraço, um cineminha, uma caixinha de bis

(ou trufas!), ou apenas alguns momentos de silêncio... Meninas, eu amo vocês!

Aos meus amigos de faculdade, Clarissa, Camila, Dani, Fefê, Gentil, Rei, Sérgio,

Paula, Tiago, Sheila e Henrique, por manterem o espírito de “turma” vivo mesmo

depois da graduação. Que equipe! Vocês também fazem parte disso.

Aos amigos que fiz no meu primeiro estágio (ainda durante a graduação),

Archimedes, Vinicius, Camila e Alexandre, pelos momentos que passamos juntos

nestes últimos anos. Eles foram poucos, mas me fizeram tão bem... Tenho

saudades de vocês no meu dia-a-dia!

Aos amigos que fiz em Montpellier, Gisa e Fernando, por toda ajuda durante as

minhas temporadas em solo francês, pelos jantares, pela simpatia, e pela torcida

para que o trabalho continue (e as viagens também!).

A família do meu namorado, Márcia, Higino (in memoriam), vovô Rodrigo, Pedro,

Bia, Yuki e Sheeva, por todo mimo e incentivo nestes 5 anos.

A Stephenie Meyer, por ter escrito seus livros.

Aos colegas de laboratório de Pesquisas Sobre o Timo (LPT), Dani, Ednéa,

Eduardo, Pedro(s), Diego(s), Ailin, Luciana, Carol, Emmanuelle, Marina, Ariany e

etc... pelo agradável convívio, troca de protocolos e artigos, almoços e lanchinhos.

A Sid, pela simpatia, e por toda ajuda, especialmente, em imprimir este trabalho.

Ao Luiz (Luiz! Luiz! Luiz!) e a Flávia Madeira (Frávia!), pela amizade e imensa ajuda

no laboratório. Obrigada!

A Bárbara e ao Francisco, que não fazem mais parte do grupo, mas que sempre me

ajudaram muito.

A Leandra, por todos os protocolos e por tirar as minhas dúvidas nos experimentos.

A Eugênia, pela calma que você transmite, pela sua simpatia e por toda ajuda.

A Klaysa, sobretudo, pelo seu imenso bom humor. Por todo incentivo e carinho. Mas

eu preciso agradecer por todos os macaquinhos!

Ao Marco, pelas idas ao FACS até que eu aprendesse a usá-lo sozinha, pelas

sugestões, pelas dicas, pelos artigos, e, principalmente, pela troca de experiências.

E a Marcele, pelas caronas, pela simpatia e pelo carinho. Sentirei saudades de

vocês!

Ao Douglas, Paulo Emílio e Eustáquio pela ajuda na UFF.

Aos queridos Dani, Gabriel, Ju, Teh e Felipe pelas sextas-feiras de seminários mais

animadas que o Laboratório de Migração em Imunopatologia (UFF) já teve.

A Mariana, pela sua simpatia, seu jeitinho calmo e doce. Saudades de você...

A minha querida amiga Ana Flávia, por ter dividido comigo as alegrias e angústias

da dissertação (e do APRIL!). Por ter se tornado uma amiga essencial e muito

especial. Nossa parceria continua! Afinal, “o timo é um órgão linfóide primário

bilobado...”.

A Nina e a Bartira, com quem sempre aprendi tanto. Por serem duas “mãezonas”!

Obrigada pela prazerosa companhia no laboratório (UFF), pelas conversas, pelos

conselhos, pela amizade e por toda ajuda.

A Flavinha, pela amizade e carinho que cultivamos nestes anos. Por sempre me

abrigar no seu cantinho francês, e pela companhia em nossas inesquecíveis

aventuras pela Europa.

Aos pesquisadores do LPT por todas as discussões e sugestões durante os

seminários.

Ao Ernesto e ao João, que também fazem parte do grupo, pela simpatia e incentivo.

A Salete, pelas dicas e por aceitar fazer parte da banca. E aos outros membros da

banca, Alexandre, Isabel, Valéria e Vinícius, por aceitarem o meu convite.

A Juliana, por todas as sugestões e, especialmente, por revisar e discutir comigo

este trabalho.

Ao Désio, por toda força, principalmente, nestes últimos meses. Sua ajuda fez toda

diferença.

A Déa, por ser tão querida e serena. Muito obrigada pela atenção que sempre teve

comigo.

A Letícia, pela simpatia, bom humor, energia e pela imensa ajuda nos experimentos.

Gracias!

Ao Michael, pela oportunidade de trabalhar com APRIL (“a proteína mais importante

do mundo”). Danke schön!

Aos meus orientadores, Carla e Savino, por todas as oportunidades, pela confiança

e liberdade. Gostaria, ainda, de agradecer, em especial, à Carla que me acompanha

desde a graduação. Muito obrigada pela dedicação ao longo destes anos!

vii

“Empty spaces

what are we living for ?

Abandoned places

I guess we know the score

On and on, does anybody know what we are looking for ?

Another hero, another mindless crime

Behind the curtain, in the pantomime

Hold the line, does anybody want to take it anymore ?

The show must go on

Inside my heart is breaking

My make-up may be flaking

But my smile still stays on”

Freddie Mercury

viii

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

O Efeito de APRIL na Migração de Timócitos

RESUMO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Cecilia Rocha de Souza

As proteínas da família do Fator de Necrose Tumoral (TNF) possuem papel

importante na indução de processos biológicos como proliferação, diferenciação,

sobrevivência e morte celular. APRIL (ligante indutor de proliferação) é uma citocina

desta família que promove proliferação e sobrevivência tumoral, modulando,

também, a atividade de linfócitos B, favorecendo a sobrevivência e produção de

anticorpos. Por outro lado, seus efeitos em linfócitos T ainda não pouco conhecidos.

APRIL interage com os receptores BCMA e TACI expressos em linfócitos. Além

destes, APRIL pode ligar-se a proteoglicanas de heparan-sulfato (HSPG) nas

superfícies celulares. Camundongos transgênicos para APRIL que expressam a

proteína em excesso desenvolvem neoplasia associada às células B-1. Em análise

preliminar por imunohistoquímica encontramos um aumento de células B220

timo destes animais comparado aos controles. O timo é o órgão linfóide primário

onde ocorre a maturação de linfócitos T, processo altamente dependente da

migração dos timócitos no microambiente tímico. Para isto, os timócitos interagem

com células epiteliais tímicas (TEC) e com uma rede de matriz extracelular

complexa, que apresenta entre outros componentes, fibronectina e laminina. No

entanto, os efeitos de APRIL no timo ainda não são conhecidos. Neste sentido,

nosso objetivo foi estudar o efeito de APRIL na migração de timócitos de

camundongos normais através de ensaios de migração em câmaras de transwell.

Inicialmente, investigamos o impacto de APRIL na sobrevivência e proliferação de

timócitos, porém, não encontramos alterações após o tratamento in vitro com a

proteína recombinante. Por outro lado, os ensaios de migração ex vivo revelaram

que APRIL possui efeito quimiorrepulsor, provavelmente, em conseqüência da

diminuição da adesão dos timócitos conforme análise do co-cultivo com linhagens de

TEC. A modulação destes eventos não estava relacionada com alteração do perfil

de expressão dos receptores para fibronectina e laminina (VLA-4/VLA-5 e VLA-6)

nas subpopulações de timócitos. Além disso, o efeito quimiorrepulsor de APRIL foi

potencializado por CXCL12 e laminina (mas não por fibronectina). E ainda, os

timócitos, ao contrário das TEC, não expressam receptor TACI. No entanto, o pré-

tratamento com heparina bloqueia parcialmente o efeito de APRIL na migração dos

timócitos, sugerindo que este seja mediado pela interação com HSPG. Assim,

concluímos que APRIL estimule a migração de timócitos, e module negativamente a

adesão celular, através da interação com HSPG.

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

The effect of APRIL on thymocyte migration

ABSTRACT

MASTER THESIS

Cecilia Rocha de Souza

Proteins of the tumor necrosis factor (TNF) family play an important role in many

biological processes like cell proliferation, differentiation, survival and death. APRIL

(A Proliferation-Inducing Ligand) is a member of this cytokine family, promotes tumor

proliferation and survival, and modulates B cells activities, enhancing cell survival

and antibody production. However, whether APRIL exerts any effect on T cells

remains unclear. APRIL acts by interacting with two receptors, BCMA and TACI, both

expressed on lymphocytes. Additionally, APRIL binds to cell surface heparan

sulphate proteoglycans (HSPG). Transgenic mice overexpressing APRIL develop a

B-1 cell neoplasia. In preliminary analysis, we observed by immunohistochemistry, an

increase in B220

cells in the thymus from APRIL Transgenic mice compared to the

controls. The thymus is a central lymphoid organ in which T cell differentiation

occurs. This process is deeply dependent on thymocyte migration throughout organ,

and for that the thymocytes interact with the thymic epithelial cells (TEC) and

extracellular matrix molecules such as fibronectin and laminin. APRIL effects in the

thymus remain unknown. This work aimed to study the effect of APRIL on thymocyte

migration of normal mice. Firstly, we investigated whether APRIL could modulate

thymocyte survival and proliferation. We did not find any alterations in response to in

vitro treatment with APRIL recombinant protein. Even though, the ex vivo migration

assays revealed a chemorrepulsive effect probably owning to a decrease on

thymocyte adhesion as showed by co-culture with TEC. Interestingly, these results

did not correlate with any difference in the membrane expression of fibronectin or

laminin receptors (respectively VLA-4 / VLA-5, and VLA-6) on thymocyte

subpopulations. APRIL chemorrepulsive effect was enhanced by CXCL12 and

laminin (but not by fibronectin). Besides, differing from TEC, thymocytes did not

express APRIL receptors. Nevertheless, pre-treatment with heparin partially blocks

migration, suggesting that the effect of APRIL on thymocyte migration is mediated by

HSPG interaction. In conclusion, APRIL seems to stimulate thymocyte migration, and

downregulates cell adhesion, by interacting with HSPG.

ÍNDICE

Resumo ..................................................................................................................... ix

Abstract ...................................................................................................................... x

1.Introdução ............................................................................................................... 1

1.1.Família do Fator de Necrose Tumoral............................................................................................ 2

1.2.APRIL ............................................................................................................................................. 7

1.2.1.Receptores e sinalização ........................................................................................................ 9

1.2.2.Efeitos de APRIL ................................................................................................................... 10

APRIL e Tumorigênese ........................................................................................................... 10

APRIL e Autoimunidade .......................................................................................................... 11

APRIL e Linfócitos ................................................................................................................... 13

1.2.3.Camundongos transgênicos para APRIL .............................................................................. 14

1.3.Timo .............................................................................................................................................. 17

1.3.1.Microambiente tímico ............................................................................................................ 17

1.3.2.Maturação e migração intratímica dos linfócitos T ................................................................ 23

1.3.3.APRIL e timo ......................................................................................................................... 29

2.Objetivos ............................................................................................................... 30

3.Material e Métodos ............................................................................................... 31

3.1.Reagentes .................................................................................................................................... 31

3.2.Animais ......................................................................................................................................... 32

3.2.1.Obtenção de timócitos .......................................................................................................... 32

3.3.Cultivo celular ............................................................................................................................... 32

3.4.Ensaio de Sobrevivência celular .................................................................................................. 32

3.5.Ensaio de Migração celular .......................................................................................................... 33

3.6.Ensaio de adesão ......................................................................................................................... 34

3.7.Fenotipagem ................................................................................................................................. 34

3.8.Análise Estatística ........................................................................................................................ 35

4.Resultados ............................................................................................................ 36

4.1.Avaliação do efeito de APRIL na sobrevivência de timócitos ...................................................... 36

4.2.Avaliação do efeito de APRIL na migração de timócitos in vitro .................................................. 38

4.2.1. Efeito de APRIL na migração de timócitos .......................................................................... 38

4.2.2. Efeito de APRIL na migração de timócitos frente à fibronectina, laminina e CXCL12 ........ 40

4.2.3. Análise fenotípica dos ensaios de migração ........................................................................ 41

4.3.Interação de APRIL com moléculas de matriz extracelular ......................................................... 44

4.4.Avaliação do efeito de APRIL na interação TEC-timócito ............................................................ 46

4.5.Avaliação do efeito de APRIL na expressão de receptores para matriz extracelular .................. 46

4.6.Determinação da interação APRIL x Timócito ............................................................................. 51

4.6.1. Caracterização da expressão do receptor TACI nos timócitos ............................................ 51

4.2.2.Avaliação da participação de proteoglicanas de heparan-sulfato (HSPG) na migração de

timócitos ......................................................................................................................................... 51

5.Discussão ............................................................................................................. 54

6.Conclusões e Perspectivas ................................................................................. 65

7.Bibliografia ............................................................................................................ 66

8.Anexo: artigo desenvolvido de publicado durante o mestrado ...................... 85

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

1.1.Ligantes e receptores da Família TNF ............................................................... 3

1.2. Sinalização intracelular através dos receptores para APRIL ......................... 4

1.3. Efeitos de APRIL ................................................................................................ 8

1.4. Alterações histológicas dos órgãos linfóides e não-linfóides em

camundongos transgênicos para APRIL .............................................................. 16

1.5. Microambiente tímico ....................................................................................... 19

1.6. Padrão de expressão de moléculas de matriz extracelular (ECM) e

citoqueratinas no timo ............................................................................................ 20

1.7. Maturação e migração intratímica: influência das moléculas de matriz

extracelular (ECM), quimiocinas e seus receptores ............................................. 25

4.1. APRIL não interfere na sobrevivência e proliferação de timócitos ............. 37

4.2. Efeito quimiorrepulsor de APRIL na migração de timócitos ........................ 39

4.3. . Efeito de APRIL na migração de timócitos orientada por fibronectina,

laminina e CXCL12 .................................................................................................. 42

4.4. Análise fenotípica dos ensaios de migração ................................................. 43

4.5. APRIL interage com fibronectina .................................................................... 45

4.6. APRIL modula negativamente a interação TEC-timócito .............................. 47

4.7. Expressão de VLA-4 (CD49d) não é alterada após tratamento com APRIL 48

4.8. Expressão de VLA-5 (CD49e) não é alterada após tratamento com APRIL 49

4.9. Expressão de VLA-6 (CD49f) não é alterada após tratamento com APRIL . 50

4.10. Subpopulações de timócitos não expressam o receptor TACI .................. 52

4.11. APRIL modula migração de timócitos via HSPG ......................................... 53

5.1. Modelo de interação entre APRIL, fibronectina, laminina e HSPG .............. 61

xiii

ÍNDICE DE TABELAS

3.1. Anticorpos monoclonais utilizados na fenotipagem..................................... 31

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS

APC – aloficocianina (allophycocinin)

APRIL – ligante indutor de proliferação (a proferation-inducing ligand)

APRIL-KO – camundongo nocaute para APRIL

APRIL-Tg – camundongo transgênico para APRIL

AR – Artrite Reumatóide

BAFF – fator ativador de linfócito B (B cell activating factor)

BCMA – receptor para APRIL e BAFF, antígeno de maturação de linfócito B (B Cell

maturation antigen)

BLyS – fator estimulador de linfócito B (B lymphocyte stimulator)

CD – marcadores de superfície celular (clusters of differentiation)

CIA – Artrite induzida por colágeno (collagen induced arthritis)

CIVD - coagulação intravascular disseminada

CK – citoqueratina (citokeratin)

CLL – Leucemia Linfocítica Crônica (chronic lymphocytic leukemia)

DC – células dendríticas (dendritic cells)

DN – timócitos duplo-negativos

DP – timócitos duplo-positivos

ECM – matriz extracelular (extracellular matrix)

FN - fibronectina

FITC – isotiocianato de fluoresceína (fluorescein isothiocyanate)

GH – hormônio do crescimento (growth hormone)

HBD – domínio de ligação para heparina (heparin-binding domain)

HE – Hematoxilina e Eosina

HSPG - proteoglincanas de heparan-sulfato (heparan sulfate proteoglycans)

Ig – imunglobulina

IL – interleucina

LES – Lúpus Eritematoso Sistêmico

LN – laminina

LPS - lipopolissacarídeo

MG – Miastenia Gravis

MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Histocompability

Complex)

mLN – linfonodos mesentéricos

MMPs – metaloproteinases

PAMPs - padrões moleculares associados à patógenos (pathogen-associated

molecular patterns)

PBMC – célula mononucleare de sangue periférico (peripheral blood mononuclear

cell)

PE – ficoeritrina (phycoeritrin)

PercP – proteína piridina de clorofila (piridin-chlorophyll-a-protein)

PP – placa de Peyer

PTR – célula fagocítica do retículo tímico (phagocytic cell of thymic reticulum)

RNAm – ácido ribodesoxirribonicléico (ribonucleic acid) mensageiro

SP – timócitos simples-positivos

TACI – receptor para APRIL e BAFF, ativador transmembranar que interage com

CAMIL (Transmembrane activator and CAMIL interactor)

TCR – receptor clonal de células T (T cell receptor)

TEC – células epiteliais tímicas (thymic epithelial cells)

Th – célula T auxiliadora (T helper cell)

TLR- receptores semelhantes a Toll (toll like receptors)

TNC – célula nurse tímica (thymic nurse cell)

TNF – fator de necrose tumoral (turmor necrosis factor)

TNF-R – receptores da família TNF

TRAF - Fator Associado ao TNF-R

SS – Síndrome de Sjörgren

VLA – antígeno de superfície tardio (very late antigen)

VLA-4 –

α4β1 ou CD49d/CD29, receptor de fibronectina

VLA-5 – α5β1 ou CD49e/CD29, receptor de fibronectina

VLA-6 – α6β1 ou CD49f/CD29, receptor de laminina

1. INTRODUÇÃO

Em 1998, Hahne e colaboradores descreveram um novo membro da família

TNF (Fatores de Necrose Tumoral), denominado APRIL (A PRoliferation Inducing

Ligand). Desde então, com a produção do camundongo transgênico para a proteína,

muito se tem estudado sobre seus efeitos no sistema imune.

A proteína APRIL foi descrita como um potente indutor de proliferação e

aumento de sobrevivência de tumores, sendo expressa, predominantemente, em

linhagens celulares e tecidos tumorais (Hahne et al., 1998). A partir destes achados,

investigou-se, também, a participação de APRIL em processos de autoimunidade.

Vários grupos encontraram um aumento da concentração plasmática da proteína em

pacientes com doenças auto-imunes, como Artrite Reumatóide, Lupus Eritematoso

Sistêmico, Miastenia Gravis e Síndrome de Sjörgren (Josson et al., 2005; Seyler et

al., 2005; Thangarajh et al.; 2006 Morel et al., 2009). Conhecemos a importância de

APRIL na biologia dos linfócitos B, promovendo a apresentação antigênica,

produção de anticorpos e sobrevivência celular (Dillon et al., 2006). Estudos com

camundongos transgênicos para APRIL, que produzem a proteína constitutivamente,

revelaram que estes animais desenvolvem uma neoplasia associada às células B-1,

com invasão de células tumorais em órgãos linfóides secundários e órgãos não-

linfóides (Planelles et al., 2004). Porém, ainda não são conhecidos os possíveis

efeitos de APRIL em órgãos linfóides primários, bem como na atividade de linfócitos

Assim, nosso grupo propôs-se a estudar os efeitos da proteína APRIL sobre

alguns aspectos relacionados à fisiologia do timo. Para isto, realizamos ensaios ex

vivo com a proteína recombinante tendo como foco principal a atividade migratória

de timócitos e sua interação com as células epiteliais tímicas.

Para melhor compreensão de nossos resultados, as sessões seguintes deste

capítulo apresentam uma coletânea de informações acerca da temática abordada

nesta dissertação de Mestrado.

1.1. Família do Fator de Necrose Tumoral

As proteínas da Família do Fator de Necrose Tumoral são ligantes e

receptores (TNF-R) que possuem papel importante na indução e regulação de

diversos processos biológicos como proliferação, diferenciação, organogênese dos

órgãos linfóides secundários, inflamação, sobrevivência e morte celular (Aggarwall et

al., 2003; Clark, 2007). Foram descritos cerca de 50 membros: 19 ligantes que

exercem efeitos biológicos através da sinalização a partir de 29 receptores

(Hehlangs & Pfeffer, 2005). Estas moléculas são trímeros e, de maneira geral, ligam-

se a mais de um receptor, sendo expressos preferencialmente por células do

sistema imune. Conforme ilustrado na figura 1.1, a grande maioria destes receptores

apresenta-se na forma membranar, podendo ser encontrados, também, após

processamento, na forma solúvel (Aggarwall et al., 2003).

A sinalização através dos receptores TNF-R recruta proteínas adaptadoras

que ativam diferentes vias intracelulares. Neste sentido, os receptores podem ser

divididos em três grupos de acordo com a estrutura do domínio citoplasmático, e,

portanto, com os eventos estimulados. O primeiro grupo é formado pelos receptores

FAS (CD95), TNFR1, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R4 (DcR2), TRAMP

(DR3) e EDAR. Estas moléculas possuem um domínio de morte na sua porção

citoplasmática, de modo que sua ativação leva ao recrutamento de adaptadores

contendo domínios de morte, como FADD e TRADD (Hehlangs & Pfeffer, 2005), que

ativam as caspases induzindo, assim, a morte celular (Baker & Reddy, 1998). O

segundo grupo compreende os receptores TNFRII, CD27, CD30, CD40, LT

βR,

OX40, 4-IBB, BAFFR, RANK, Fn14, AITR, XEDAR, TROY, BCMA e TACI que

apresentam o domínio de interação (TIM) que recruta o Fator Associado ao TNF-R

(TRAF) que, por sua vez, ativa a transdução de sinais pelas vias do NFkB, JNK, p38,

ERK e PI3K (Figura 1.2). O terceiro grupo inclui os receptores TRAIL-R3 (DcR1),

DcR3 e OPG que não possuem domínios específicos para sinalização, mas

competem com os outros pelos ligantes (Hehlangs & Pfeffer, 2005).

Figura 1.1. Ligantes e receptores da Família TNF. Os receptores estão

representados na esquerda, e os respectivos ligantes na direita. Podemos observar

que a maioria dos membros desta família é liberada da membrana celular após

clivagem realizada por diferentes enzimas proteolíticas. TNF e RANKL são clivados

por metaloproteinases da família ADAM, TRAIL e CD95L pela matrilisina, ao passo

que TWEAK e APRIL por furinas. Os valores à esquerda representam o número de

aminoácidos no domínio citoplasmático de cada receptor. A sinalização através dos

receptores pode ser mediada pela interação da porção citoplasmática com domínios

de morte ou com diferentes fatores de interação que recrutam o Fator Associado ao

TNF-R (TRAF) que ativam diferentes proteínas (Modificado de Aggarwall, 2003).

Figura 1.2. Sinalização intracelular através dos receptores para APRIL. APRIL

pode ligar-se a BCMA, TACI e HSPG nas superfícies celulares, no entanto, ainda

não se sabe se a interação com este último receptor gera algum sinal intracelular. A

sinalização através dos outros receptores é mediada, primeiramente, pelo

recrutamento e interação com diferentes domínios TRAF dependendo do receptor

envolvido. A principal via de sobrevivência celular envolvida com este circuito é do

NFkB, sua ativação modula outros fatores de transcrição, levando ao aumento de

proteínas anti-apoptóticas, e diminuição das pró-apoptóticas. Como resultado,

observamos aumento da sobrevivência, proliferação celular e troca de classe de

imunoglobulinas para IgA (Modificado de Kimberley et al., 2008).

O Fator de Necrose Tumoral (TNF), primeiro membro da família, foi

inicialmente descrito como um potente indutor seletivo de morte em células tumorais.

Demonstrou-se que esta citocina era produzida por macrófagos ativados com

endotoxina bacteriana, lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli, e era, então, responsável

pela destruição necrótica de diversos tipos de tumor em modelo murino in vitro e in

vivo (Carswell et al., 1975). No entanto, estudos posteriores mostraram que a

estimulação crônica com TNF, em baixas doses, favorece o desenvolvimento

tumoral promovendo seu crescimento, invasão e metástase, pois, aumenta a

sobrevivência, angiogênese, mobilidade e produção de metaloproteinases de matriz

(MMPs) (Szlosarek et al., 2006). Sendo assim, o TNF é uma citocina capaz de

estimular efeitos antagônicos, podendo tanto promover, como inibir a atividade

tumoral.

Além de sua participação na resposta imune de tumores, o TNF é uma

importante citocina pró-inflamatória, promovendo a imunidade inata através da

inflamação em resposta à invasão de microorganismos. Estes sinais são

fundamentais para iniciar a resposta adaptativa ao estimular a diferenciação de

linfócitos TCD4

virgens em Th1 que apresentam um perfil de resposta celular capaz

de eliminar as células infectadas. Macrófagos quando ativados por padrões

moleculares associados à patógenos (PAMPs) passam a secretar TNF que ativa o

endotélio vascular, de modo que este passa a expressar um maior número de

moléculas de adesão, facilitando a migração leucocitária do vaso para o tecido alvo

(Murphy et al., 2008).

Por outro lado, o TNF pode desencadear reações extremamente danosas ao

hospedeiro quando é produzido em excesso, estando relacionado com processos

como sepse e caquexia, além de diversas doenças auto-imunes (Hehlgans & Pfeffer,

2005; Clark, 2007). A sepse é uma resposta exacerbada do hospedeiro diante de um

processo infeccioso, constituindo-se de uma resposta sistêmica com alta produção

de citocinas pró e anti-inflamatórias. Dentre as pró-inflamatórias, as principais

citocinas envolvidas são o TNF-α e a IL-1β, ao passo que a IL-10 e o TGFβ são as

citocinas anti-inflamatórias predominantes neste processo. Assim, a liberação de

TNF-α no sangue faz com que o sistema vascular entre em colapso em

conseqüência da coagulação intravascular disseminada (CIVD) ou choque (Murphy

et al, 2008).

As citocinas da Família TNF têm sido ainda relacionadas com a reação

inflamatória presente nos processos de autoimunidade, principalmente, em doenças

como a Artrite Reumatóide (AR), a Doença de Crohn e o Lúpus Eritematoso

Sistêmico (LES) (Hehlgans & Pfeffer, 2005). Nestas, pode ser encontrado aumento

dos níveis séricos, assim como no tecido afetado, de citocinas pró-inflamatórias,

dentre elas, o TNF (Bradley, 2008). Por isso, o uso de drogas anti-TNF, como o

anticorpo monoclonal Infliximab, tem sido empregado na terapia contra estas

doenças. No entanto, os ensaios clínicos realizados com antagonistas de TNF

revelam o aparecimento de efeitos colaterais, como a produção de auto-anticorpos

anti-núcleo e anti-dsDNA (Kollias & Kontoyiannis, 2002).

A AR é uma doença crônica que acomete as articulações sinoviais. Nestas há

grande produção de citocinas como IL-1, IL-6, IL-12 e TNF-

α, e formação de um

tecido inflamatório, chamado de pannus, constituído, principalmente, de neutrófilos,

macrófagos, células dendríticas, linfócitos T e B, que invade e destrói osso e

cartilagem (Firestein, 2003; Robins et al., 2005). Assim, camundongos transgênicos

que superexpressam TNF-α desenvolvem inflamação crônica das articulações. No

entanto, estas alterações são completamente inibidas com a administração de

anticorpo monoclonal anti-TNF-α, revelando que esta citocina é fundamental para o

desenvolvimento da doença (Keffer et al., 1991).

A Doença de Crohn é uma doença inflamatória crônica na qual a mucosa do

trato gastrintestinal é invadida por um infiltrado formado, principalmente, por

linfócitos T e macrófagos, com predominância, assim como na Artrite Reumatóide,

do perfil de resposta Th1 (Elia & Souza, 2001). Camundongos geneticamente

modificados, que expressam a citocina TNF-α constitutivamente, desenvolvem um

quadro histopatológico semelhante à Doença de Crohn, com inflamação crônica e

colabamento das vilosidades intestinais (Kontoyiannis et al., 1999). E, por outro lado,

a terapia com Infliximab induz remissão da doença em pacientes, mostrando a

importante participação do TNF-α na promoção desta patologia (Sands et al., 2004).

O LES é uma doença auto-imune crônica caracterizada, principalmente, pela

produção exacerbada de auto-anticorpos e conseqüente deposição dos complexos

imunes em diversos tecidos. Esta deposição promove a ativação da cascata do

sistema complemento. Pacientes com LES apresentam níveis séricos elevados de

TNF-α que se correlacionam com a atividade da doença, de maneira que o uso de

bloqueadores é eficiente no tratamento da inflamação que acomete os órgãos

atingidos (Aringer & Smolen, 2008).

Além do TNF-

α, outras citocinas desta família estão sendo apontadas como

fatores críticos no desenvolvimento e manutenção de diversas doenças auto-

imunes, e, portanto, são novos alvos em potencial para o tratamento destas

alterações (Dillon et al., 2006; Mackay et al., 2007). As citocinas BLyS (B lymphocyte

stimulator), conhecida também como BAFF (B cell activating factor) e, em especial

para este trabalho, APRIL (A Proliferation-Inducing Ligand), apresentam-se

aumentadas no soro e nos tecidos acometidos de pacientes e de animais em

diversos modelos experimentais para as doenças acima mencionadas, recebendo

atenção no cenário científico nos últimos anos (Mackay et al., 1999; Wang et al.,

2001; Seyler et al., 2005; Morel et al., 2009).

1.2. APRIL

APRIL (A Proliferation-Inducing Ligand), também conhecido como TNSF13A,

Tall-2, TRDL-1 e CD256, é o mais novo ligante da família TNF descrito por Michael

Hanhe e colaboradores em 1998. APRIL foi assim denominada devido à sua

capacidade de estimular a proliferação de diversas linhagens de células tumorais in

vitro. Esta proteína foi identificada após o mapeamento genético, seguido de

alinhamentos múltiplos em bancos de dados para seqüências semelhantes a outros

ligantes da família já conhecidos. Assim, pôde-se obter a estrutura primária de

APRIL que é codificada pela região cromossômica 17p13, e constitui-se de 250

aminoácidos (Hahne et al., 1998).

APRIL é uma proteína solúvel que, assim como ocorre com os demais

membros da família TNF, é sintetizada como uma proteína transmembranar, porém,

o sítio de ancoramento à membrana é clivado por uma furina convertase no aparelho

de Golgi (Lopez-Fraga et al., 2001). Dessa forma, após processamento intracelular,

APRIL é secretada para o meio extracelular na forma biologicamente ativa com um

trímero solúvel de peso molecular de 63-kDa (Wallweber et al., 2004). Ela pode ser

produzida por diversos tipos celulares, pertencentes ou não do sistema imune,

dentre eles estão: neutrófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos

B e T, células estromais da medula óssea, megacariócitos e osteoclastos (Figura

1.3). APRIL é expressa, predominantemente, por células tumorais e células do

microambiente tumoral, ao passo que os tecidos normais produzem níveis muitos

baixos da proteína, porém, dentre estes, os leucócitos do sangue periférico, a

expressam em maior intensidade (Hahne et al., 1998; Dillon et al., 2006).

Figura 1.3. Efeitos de APRIL. APRIL pode ser produzido por diversos tipos

celulares. Seus efeitos estão relacionados com a atividade de células tumorais e

linfócitos. APRIL aumenta a sobrevivência e proliferação celular de diversos tipos

tumorais e linfócitos B, estimula a mudança de classe de imunoglobulinas e aumenta

a apresentação antigênica. Em linfócitos T, APRIL pode co-estimular a proliferação

celular (Modificado de Dillon et al., 2006).

1.2.1. Receptores e sinalização

APRIL pode desencadear seus efeitos através da interação com dois

receptores conhecidos, BCMA (B Cell maturation antigen) e TACI (Transmembrane

activator and CAMIL interactor) (Rennert et al., 2000), conforme mostrado na figura

1.2. Estes receptores ligam-se também a outro membro da família, o BAFF, sendo

que APRIL liga-se com maior afinidade a BCMA, ao passo que BAFF possui maior

afinidade por TACI (Marsters et al., 2000). Ambos os receptores são expressos por

linfócitos: as células B expressam os receptores BCMA e TACI, enquanto que as

células T expressam somente TACI (Mackay et al., 2002). Embora TACI tenha sido

descrito, primeiramente, como receptor de células T ativadas (von Bülow & Bram,

1997), os dados sobre a expressão de TACI em linfócitos T ainda são conflitantes

(Mackay & Leung, 2006) . Resultados recentes mostraram que em camundongos,

linfócitos T CD4

e CD8

de baço, linfonodos mesentéricos e periféricos, assim como

de lavado peritoneal, expressam o receptor TACI constitutivamente, portanto na

ausência de estimulação (Hardenberg et al., 2008).

Acredita-se ainda que APRIL possua um terceiro receptor específico, pois

linhagens de células tumorais de linfoma de células T humano (Jurkat) e de

carcinoma humano de células epiteliais (A549), que não expressam os receptores

BCMA e TACI, respondem ao estímulo in vitro com aumento de proliferação (Hahne

et al., 1998). Este efeito de APRIL não é observado quando estas células são

submetidas previamente ao tratamento com heparina, já que APRIL possui uma

seqüência de aminoácidos próxima da extremidade N-terminal que é necessária

para ligação com proteoglicanas de heparan-sulfato (HSPG) (Hendriks et al., 2005).

Esta ligação é específica, pois a administração de BCMA-Fc não afeta a ligação

entre APRIL com HSPG, sugerindo que a seqüência protéica envolvida nesta

ligação é diferente daquela necessária para a ligação com BCMA e TACI (Ingold et

al., 2005). Sendo assim, APRIL poderia ligar-se, também, a HSPG presente nas

superfícies celulares.

As vias intracelulares utilizadas por estas moléculas ainda não foram

completamente mapeadas, mas, até o momento, já se sabe que TACI e BCMA

ativam a via clássica do fator de transcrição NF-kB (Marsters et al., 2000). Esta

ativação promove, principalmente, a produção de anticorpos e o aumento de

sobrevivência em linfócitos através da interação com os membros da família TRAF

(Kimberley et al., 2008). O efeito de APRIL na inibição de morte já foi descrito como

resultado da modulação de proteínas evolvidas com apoptose, pois estimula o

aumento de fatores anti-apoptóticos e leva à diminuição dos pró-apoptóticos (Stein

et al., 2002, He et al., 2004; Kern et al., 2004; Belnoue et al., 2008). No entanto,

ainda não se sabe se a interação entre HSPG e APRIL é responsável pela ativação

de algum sinal intracelular. Sua interação com APRIL auxiliaria o acúmulo da

proteína na membrana facilitando, assim, a sinalização através dos outros

receptores (Kimberley et al., 2009).

As vias envolvidas com o receptor BCMA associam-se aos fatores TRAF1,

TRAF2 e TRAF3 resultando na ativação de NF-kB, Elk-1, JNK e p38 (Mukhopadhyay

et al., 1999; Hatzoglou et al., 2000; Marsters et al., 2000). Ao passo que o domínio

intracelular do receptor TACI interage com os fatores TRAF2, TRAF5 e TRAF6

ativando, da mesma maneira, NF-kB e JNK (Xia et al., 2000). Há, então, diminuição

dos níveis das proteínas pró-apoptóticas Bim, Bax e p53, e, paralelamente, aumento

da expressão de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, XIAP, dentre outras,

como mostrado anteriormente na Figura 1.2 (He et al., 2004; Kimberley et al., 2008).

1.2.2. Efeitos de APRIL

APRIL e Tumorigênese

APRIL foi descrita com uma molécula capaz de modular a biologia tumoral,

induzindo aumento de proliferação e sobrevivência, tornando-se, assim, um novo

alvo de estudos para terapia contra o câncer. Neste sentido, foi visto que APRIL é

capaz de inibir a apoptose mediada por receptor em algumas linhagens de células

tumorais, como U373MG (astrocitoma humano) e LN-229 (glioma humano), quando

estas foram transfectadas para APRIL. Assim, a expressão de APRIL levou à

redução da morte induzida por CD95L e TRAIL em decorrência do aumento da

expressão da proteína anti-apoptótica XIAP (Roth et al., 2001).

APRIL foi encontrado em diversos tipos de tumores sólidos, como o

melanoma e o carcinoma de célula basal, sendo produzido, principalmente, por

neutrófilos infiltrantes. A interação com HSPG parece promover a formação de

domínios ricos em APRIL ao redor do tumor, privilegiando, assim, seu

desenvolvimento (Mhawech-Fauceglia et al., 2006). Estes arranjos foram

observados, também, em pacientes com Linfoma de células B Não-Hodgkin. Nestes,

os neutrófilos infiltrantes foram identificados como a fonte celular de APRIL que,

similarmente, pôde acumular-se nas células tumorais através da ligação com

proteoglicanas (Schwaller et al., 2007).

APRIL foi ainda relacionado com a promoção da Leucemia Linfocítica Crônica

(CLL). A CLL é uma leucemia de linfócitos maduros da subpopulação B-1, de

fenótipo CD5

CD19

CD23

IgM

. A principal característica desta patologia é a

acumulação gradual de linfócitos em decorrência da falha na regulação dos eventos

relacionados com a morte celular programada. Linfócitos B de pacientes com CLL,

assim como células mononucleares CD14

, que dão suporte às células tumorais

protegendo-as da apoptose, chamadas de nurse-like cells, expressam tanto o

receptor TACI, quanto o ligante APRIL (Kern et., 2004; Nishio et al., 2005). Estudos

com pacientes com CLL mostraram que as amostras de soro apresentaram uma

elevação da concentração de APRIL (Planelles et al., 2004, 2007). A estimulação

com APRIL e BAFF ativa a via clássica do NF-kB de modo a aumentar a

sobrevivência celular de linfócitos B-CLL, ao contrário do que foi observado nas

células B normais que utilizavam a via alternativa (Endo et al., 2007). Porém, o

tratamento com receptores solúveis ou antagonistas para APRIL, aumenta a

susceptibilidade à apoptose das células B leucêmicas (Kern et., 2004), revelando,

assim, que o efeito anti-apoptótico de APRIL na CLL ocorre por mecanismos

moleculares distintos daqueles envolvidos num contexto fisiológico, e, portanto,

representam possíveis alvos para intervenções clínicas.

Camundongos transgênicos para APRIL (APRIL-Tg) apresentam aumento na

incidência da Eritroleucemia, e, em conseqüência, diminuição da sobrevivência, em

decorrência de infecção por vírus MLV (Moloney murine leukemia virus). Esta

leucemia é uma doença aguda caracterizada pela proliferação excessiva de

progenitores da linhagem eritróide, e esplenomegalia combinada com queda no

hematócrito para percentuais menores que 35%. Neste modelo, foi encontrado

aumento em até quatro vezes do peso do baço, sugerindo uma expansão da

população de eritroblastos, pois, os animais APRIL-Tg apresentavam, também,

enriquecimento da população de células Ter-119

no órgão, antígeno de superfície

celular associado à linhagem eritróide presente desde os estágios mais precoces da

diferenciação (Hardenberg et al., 2008).

APRIL e Autoimunidade

Além de sua importância em processos tumorais, alguns trabalhos apontam

para o envolvimento de APRIL no estabelecimento e manutenção de doenças auto-

imunes, pois, foram encontrados níveis elevados desta proteína no soro de

pacientes com Artrite Reumatóide, Esclerose Múltipla, Lupus Eritematoso Sistêmico,

Miastenia Gravis e Síndrome de Sjörgren (Dillon et al., 2006). No entanto, ainda não

se sabe de qual maneira APRIL participa ou influencia a resposta imune nestas

patologias.

Em estudo com pacientes com Artrite Reumatóide, biópsias de tecido sinovial

revelaram aumento da expressão de APRIL em células dendríticas, e de seu

receptor TACI nos linfócitos T (Seyler et al., 2005). Já em modelo murino de Artrite

induzida por colágeno (CIA), o tratamento com TACI-Fc foi capaz de inibir a

progressão da doença, com redução na produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-

colágeno acompanhada da melhora das alterações histológicas (Wang et al., 2001).

Porém, foi demonstrado, recentemente, que os camundongos deficientes para

APRIL quando submetidos ao protocolo de CIA apresentam redução da incidência

da doença, porém sem alterações na severidade, em decorrência da redução dos

níveis de IL-17, assim como de IgG2a (Xiao et al., 2008).

APRIL parece participar também na fisiopatologia do LES. No entanto, os

dados publicados até o momento são controversos. Koyama e colaboradores (2004)

encontraram aumento de APRIL no soro de pacientes, e esta elevação estava

correlacionada com os níveis de anti-dsDNA (Koyama et al., 2004). Porém, em

estudo recente, nosso grupo observou uma relação inversa entre os níveis séricos

de APRIL e o índice de atividade da doença, que inclui como parâmetro a produção

de anticorpos anti-dsDNA, mostrando que APRIL pode atuar de maneira protetora,

regulando a produção de auto-anticorpos (Morel et al., 2009). Estes resultados estão

de acordo com o que Stohl e colaboradores encontraram em estudo semelhante

(Stohl et al., 2004).

A Síndrome de Sjörgren é uma doença auto-imune que afeta,

predominantemente, tecidos exócrinos como as glândulas salivares e lacrimais.

Estas glândulas são invadidas por um infiltrado inflamatório composto por linfócitos T

e B, células dendríticas e macrófagos, formando centros germinativos ectópicos.

Assim como nas doenças antes mencionadas, os pacientes com SS apresentam

aumento da concentração plasmática de APRIL (Jonsson et al., 2005).

Tomados em conjunto, os dados acima resumidos sugerem que APRIL

participe de maneira importante da resposta imune em processos auto-imunes. No

entanto, os mecanismos envolvidos e o efeito no controle ou promoção da doença

ainda precisam ser desvendados.

APRIL e linfócitos

Paralelamente ao crescente número de trabalhos sobre o envolvimento de

APRIL em processos tumorais e doenças auto-imunes, acumulam-se dados na

literatura acerca de seus efeitos na biologia dos linfócitos, principalmente

relacionados com as células B (Mackay & Tangye, 2004). Vários estudos mostraram

a participação de APRIL na indução da proliferação, diferenciação e sobrevivência

de linfócitos B. Culturas primárias de esplenócitos murinos quando tratadas com

APRIL e anti-IgM apresentam maior incorporação de timidina [

H] (Yu et al., 2000). E

ainda, linfócitos B-1 de camundongos APRIL-Tg, que expressam a proteína em

excesso, acumulam-se a partir da cavidade peritoneal em decorrência do aumento

da sobrevivência celular (Planelles et al., 2004). Além disso, APRIL estimula a

divisão e diferenciação celular de plasmablastos para plasmócitos, pois

camundongos deficientes em APRIL (APRIL-KO) apresentam redução na

sobrevivência destas células, assim como na produção de anticorpos na medula

óssea (Belnoue et al., 2008).

APRIL é capaz, também, de controlar a produção de anticorpos in vitro e in

vivo. O tratamento de leucócitos de sangue periférico (PBMCs) humanos com a

proteína recombinante mostrou-se um potente estímulo para a produção de IgM

(Marsters et al., 2000). O mesmo foi observado com os camundongos APRIL-Tg, os

quais apresentam aumento dos níveis séricos de IgM basal e após estimulação com

antígeno T-dependente (Stein et al, 2002). E ainda, camundongos APRIL-KO

apresentaram diminuição de IgA pré-imune e após imunização intraperitoneal com

antígeno T-independente (Castigli et al., 2004), confirmando, assim, um efeito de

APRIL na modulação da secreção de anticorpos IgM, e na mudança de classe de

imunoglobulinas para IgA.

APRIL pode, ainda, favorecer a apresentação antigênica de linfócitos B (Dillon

et al., 2006). Células B da linhagem A20, transfectadas para BCMA, receptor para

APRIL, ou esplenócitos previamente estimulados com IL-4 e IL-6 (interleucinas

capazes de induzir a expressão do receptor) aumentam a expressão das moléculas

envolvidas na apresentação antigênica como CD40, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e

MHC de classe II após tratamento com APRIL. Estas células quando co-cultivadas

com linfócitos T com TCR transgênico para OVA, DO11.10, na presença do antígeno

específico são capazes de estimular a produção de IL-2 (Yang et al., 2005). Sendo

assim, APRIL é capaz de contribuir na apresentação antigênica de linfócitos B para

linfócitos T.

Como mencionado, poucos dados foram publicados a respeito da participação

de APRIL na biologia dos linfócitos T. No entanto, alguns trabalhos mostram que,

assim como observado nos linfócitos B, existe uma relação com estímulo para a

proliferação celular, pois, o tratamento de células T aumenta a incorporação de

timidina[

H], efeito sinérgico com anti-CD3 administrado em dose sub-ótima,

mostrando que APRIL pode atuar como um co-estímulo para proliferação de

linfócitos T (Yu et al., 2000). APRIL promove ainda aumento da sobrevivência ex

vivo de células CD4

e CD8

de camundongos APRIL-Tg em decorrência do

aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 (Stein et al., 2002).

1.2.3. Camundongos Transgênicos para APRIL

A produção e utilização dos camundongos transgênicos para APRIL foi

fundamental para maior compreensão sobre os efeitos da proteína no sistema

imune, tanto no contexto fisiológico como patológico. Para isto, foi construído um

vetor contendo a região de cDNA humano codificante para APRIL sob controle do

promotor distal para lck (Wildin et al., 1995), de modo que os camundongos

transgênicos possuem células T maduras produtoras de APRIL. Os animais

transgênicos, ao contrário dos controles, possuem níveis detectáveis da proteína no

soro, porém, não apresentam alterações na expressão de seus receptores, TACI e

BCMA, nem do outro ligante, BAFF (Stein et al., 2002).

Apesar de APRIL estar relacionado com a acumulação de linfócitos B

esplênicos (Yu et al., 2000), não foram encontradas diferenças na celularidade, no

peso, nem na análise histopatológica do baço dos animais APRIL-Tg jovens (6-12

semanas de idade). No entanto, a avaliação das populações linfocitárias dos órgãos

linfóides secundários, como baço, placas de Peyer, linfonodos mesentéricos e

periféricos, revelou um aumento de linfócitos TCD4

e TCD8

CD62L

como, também,

no percentual de células B220

, acompanhada de proporcional redução de células

TCD4

e CD8

nos linfonodos periféricos. No entanto, quando linfócitos purificados

foram estimulados com anti-CD3 e anti-CD28, as células dos animais APRIL-Tg

apresentaram maior taxa de proliferação, estando este aumento relacionado com

produção de IL-2 (Stein et al., 2002).

Além de estimular a divisão celular de linfócitos T, a expressão de APRIL em

excesso modula a sobrevivência destas células ex vivo, pois, após três dias de

cultivo, com anti-CD3 e anti-CD28, as células dos APRIL-Tg apresentam redução na

captação de iodeto de propídio (PI), devido ao aumento da expressão da proteína

anti-apoptótica Bcl-2. No entanto, o efeito observado na divisão e na sobrevivência

de linfócitos T não está relacionado, somente, com a população CD62L

, pois as

células CD62L

dos APRIL-Tg, linfócitos virgens, também apresentam as mesmas

alterações, mostrando que APRIL age diretamente nos linfócitos T

independentemente do seu estágio de ativação (Stein et al., 2002).

A respeito da biologia dos linfócitos B, os APRIL-Tg possuem

desenvolvimento normal sem perturbações nos percentuais dos diferentes estágios

de maturação. A produção de anticorpos IgG também é comparável entre

transgênicos e controles, ao passo que a produção de IgM, antes e após desafio

com antígenos T-dependente e T-independente (vírus MVA e NP-Ficoll

respectivamente) é maior nos APRIL-Tg, mostrando que APRIL promove os dois

tipos de resposta humoral. O aumento de IgM pré-imune refletiu em uma alteração

da subpopulação B-1. Porém, não foram encontradas em animais desta idade,

variações no percentual e número absoluto destas células no peritônio (Stein et al.,

2002).

Ao contrário do observado nos APRIL-Tg jovens, camundongos com idade

avançada, 9-15 meses, apresentam alterações no sistema imune. A avaliação

macroscópica, e posterior contagem de células, dos órgãos linfóides secundários

revelou hiperplasia em linfonodos mesentéricos (mLN), placas de Peyer (PP) e baço

(Figura 1.4A). Estes órgãos apresentaram, também, alterações histológicas com

perda da arquitetura tecidual normal e formação de massas tumorais. Não se

distingue as áreas T e B dos mLN, assim como, a polpa branca e vermelha no baço.

Além disso, há invasão de células tumorais na mucosa das PP, na cápsula do baço

e nas áreas subcapsulares dos linfonodos (Figura 1.4B) (Planelles et al., 2004).

A análise fenotípica por citofluorimetria mostrou aumento, em números

absolutos, de linfócitos B e T. Há infiltração e enriquecimento de linfócitos B-1 no

baço e linfonodos mesentéricos, e, também, em alguns órgãos não-linfóides, como

os rins (Figura 1.4C). A avaliação da população de células B-1 da cavidade peritonial

dos APRIL-Tg com hiperplasia revelou acúmulo gradual do número destas células

com o passar da idade. Estas células apresentam aumento da sobrevivência celular,

in vitro e in vivo, sugerindo que a acumulação observada deve-se ao efeito anti-

apoptótico de APRIL (Planelles et al., 2004). Cabe aqui salientar que os estudos

acima relatados se restringiram aos órgãos linfóides secundários e sítios de

infiltração tumoral, sem abranger órgãos linfóides primários, particularmente o timo.

Figura 1.4. Alterações histológicas dos órgãos linfóides e não-linfóides em

camundongos transgênicos para APRIL. A, camundongos transgênicos para

APRIL (APRIL-Tg) apresentam hiperplasia de linfonodo mesentérico (mLN) e placas

de Peyer (PP), fotos da esquerda, acompanhada de perda da arquitetura tecidual

normal com o passar da idade, fotos da direita. B, hiperplasia está associada com

acúmulo de células B220

. C, infiltração de células tumorais com fenótipo B-1

(B220

CD5

), também, em órgão não-linfóide (rim). Aumento de 100x (Modificado de

Planelles et al., 2004).

1.3. Timo

O timo é um órgão linfóide primário situado no mediastino ântero-superior no

qual ocorre a maturação dos linfócitos T. A capacidade de gerar linfócitos maduros

por toda a vida do hospedeiro, mesmo sem possuir células auto-renováveis, é

garantida pela entrada contínua de precursores linfóides gerados na medula óssea

(Takahama, 2006). O timo é constituído de uma rede epitelial que tem origem

embrionária da camada endodérmica derivada da terceira bolsa faríngea, formando

um broto epitelial que é englobado pelo mesênquima originado da crista neural. Ao

longo de seu desenvolvimento, o epitélio tímico diferencia-se num microambiente

complexo e diverso que atrai os precursores linfóides da medula óssea, gerando,

assim, nichos imprescindíveis para o desenvolvimento dos linfócitos T (Petrie &

Zúñiga-Pflucker, 2007; Ciofani & Zúñiga-Pflucker, 2007).

O timo é um órgão bilobado, sendo cada lobo dividido em numerosos lóbulos

parcialmente separados por septos fibrosos. Cada lóbulo consiste de duas regiões

histológicas bem definidas, o córtex e a medula. A região cortical, mais externa, que

abriga os linfócitos T nos estágios mais precoces de maturação, sendo intensamente

corada pelo corante Hematoxilina por possuir uma grande densidade linfocitária. Já

na medula, região mais interna do lóbulo, as células T encontram-se nos estágios

finais da maturação. Porém, estima-se que somente 5% dos linfócitos gerados no

timo completam todo o processo de maturação e são exportados para os órgãos

linfóides periféricos. Tendo um número relativamente menor de linfócitos (quando

comparada ao córtex), esta região é menos corada pela Hematoxilina como

podemos observar na figura 1.5A. (Crivellato et al., 2004).

1.3.1. Microambiente tímico

O microambiente tímico é complexo, compondo-se de diferentes tipos

celulares imersos na trama composta por moléculas de matriz extracelular (ECM)

que concentra, também, diferentes citocinas e quimiocinas. É um tecido densamente

vascularizado e formado, principalmente, por células epiteliais tímicas (TEC)

corticais e medulares, além de macrófagos, células dendríticas e fibroblastos (Figura

1.5B). Este arcabouço celular abriga, estimula e direciona os timócitos,

diferencialmente distribuídos pelas regiões do lóbulo tímico (Savino et al., 2002).

As TEC organizam-se numa rede interconectada de modo a percorrer todo

órgão. No entanto, este epitélio é heterogêneo, pois, as TEC das regiões cortical e

medular apresentam características morfológicas e fenotípicas distintas (Meireles de

Souza et al., 1993). As TEC corticais possuem prolongamentos citoplasmáticos

delgados que envolvem os timócitos, ao passo que as TEC medulares apresentam

corpos celulares mais volumosos. As TEC podem ser classificadas de acordo com a

expressão diferenciada de filamentos intermediários de citoqueratinas K8 e K5, e

dos marcadores MTS44 e MTS10 (Figura 1.6D-E). Em camundongos, o córtex

possui, em maioria, TEC com fenótipo K8

MTS44

, ao passo que na medula

apresentam-se K8

MTS10

, e duplo-positivas, K8

, na junção córtico-medular

(Meireles de Souza et al., 1993; Klug et al., 1998; Blackburn et al., 2002).

Na região cortical, encontramos complexos multicelulares constituídos por

TEC e timócitos chamados de “células nurse tímicas” (Thymic nurse cells- TNC)

(Figura 1.5B). Cada estrutura linfo-epitelial é formada por uma TEC que pode abrigar

até 200 timócitos nos seus espaços intermembranas (Villa-Verde et al., 1995). As

TNC fornecem um microambiente favorável para sobrevivência, proliferação e

diferenciação intratímica dos linfócitos T, pois são capazes de secretar hormônios

tímicos, como a timulina, e moléculas de matriz extracelular, além de expressarem

na superfície celular moléculas que participam da maturação dos timócitos como

MHC de classe I e classe II (Wekerle & Ketelsen, 1980; Villa-Verde et al., 1995).

Na região medular, em humanos, podemos encontrar TEC organizadas em

pequenas estruturas concêntricas chamadas de Corpúsculo de Hassall. A

participação dos corpúsculos na fisiologia tímica ainda é duvidosa. No entanto,

algumas evidências sugerem a participação destas estruturas na remoção de células

mortas e, também, na geração intratímica, em especial, de células T reguladoras ao

influenciarem a atividade das células dendríticas (Watanabe et al., 2005).

As interações entre o epitélio tímico e timócitos são fundamentais para a

diferenciação dos linfócitos T. As TEC influenciam de modo pleiotrópico este

processo através da interação direta com os timócitos mediada por moléculas de

adesão célula-célula e moléculas do MHC de classe I e II. E ainda, através da

secreção de citocinas que, dentre outros efeitos, podem aumentar a sobrevivência e

estimular a proliferação, assim como quimiocinas, moléculas de matriz extracelular e

MMPs de matriz, que direcionam os timócitos para as diferentes regiões do

microambiente de acordo com o estágio de maturação em que se encontram ao

longo das diferentes etapas do processo de diferenciação (Figura 1.5C) (Savino et

al., 2002).

Figura 1.5. Microambiente tímico. A, nesta foto histológica podemos observar as

duas regiões anatômicas do timo: a medula, região mais central, é menos corada

pela Hematoxilina-Eosina, ao passo que o córtex, região mais externa, é mais

intensamente corada. Aumento de 400x (Adaptado de Pearse, 2006). B,

componentes celulares do microambiente tímico. C, os timócitos podem ter sua

atividade modulada ao interagirem de diversas maneiras com as TEC durante o

processo maturação: (1) interação quimiocina-receptor, (2), interação ECM-receptor,

(3) interação quimiocina-receptor, sendo a quimiocina depositada pela ECM e (4)

ação das metaloproteinases de matriz que podem interromper a interação com a

ECM e quimiocinas (Modificado de Savino et al., 2002).

Figura 1.6. Padrão de expressão de moléculas de matriz extracelular (ECM) e

citoqueratinas no timo. Através da marcação para pan-citoqueratina, podemos

observar no painel A a distribuição do epitélio tímico por todo órgão. Os painéis B e

C mostram marcação com anti-fibronectina, e anti-laminina, respectivamente. A

trama de ECM é mais intensa na região medular (M) do que no córtex (C). Aumento

de 400x. As TEC corticais e medulares podem ser identificadas por diferentes

moléculas. Em D, mostramos as TEC corticais K8

(vermelho) na trama de laminina

(verde), escala de 100µm. Ao passo que em E, mostramos as TEC medulares

MST10

(vermelho), e TEC corticais K8

(azul), laminina (verde). Fotos foram

gentilmente cedidas por Flávia Calmon Hamaty (A, B e C) e Marco Augusto

Stimamiglio (D e E).

Como mencionado, as TEC produzem diferentes moléculas de ECM, uma

rede acelular formada de proteínas e polissacarídeos que estão associadas às

superfícies celulares, regulando o desenvolvimento, migração, proliferação,

sobrevivência, forma e atividade celular (Alberts et al., 2004). No timo, as principais

moléculas encontradas são os colágenos do tipo I e IV, fibronectina e laminina

(Berrih et al., 1985; Lannes-Vieira et al, 1991; Meireles de Souza et al, 1993).

A fibronectina é uma proteína heterodimérica que pode ser produzia por

células epiteliais e fibroblastos. A laminina é um trímero que apresenta conformação

cruciforme fundamental para a ligação com outras moléculas (Goodman, 1992).

Estas proteínas desempenham papel na maturação intratímica dos linfócitos, e

dispõem-se de maneira característica nas regiões cortical e medular, sendo

altamente conservadas nos mamíferos (Savino et al., 2004).

A cápsula tímica é formada por tecido conjuntivo rico em fibras de colágeno

tipo I, assim como no interior dos septos interlobulares, onde podemos encontrar,

também, as fibras de fibronectina e laminina, enquanto a membrana basal constitui-

se, basicamente, de colágeno tipo IV (Berrih et al., 1985). Nas junções córtico-

medulares, três tipos de colágenos (I, III e IV) estão presentes, porém, somente o

colágeno do tipo IV é expresso nos espaços perivasculares. Além disso, os

filamentos de fibronectina e laminina formam uma rede que pode ser encontrada em

todo órgão, tornando-se mais densa na região medular (Figura 1.6). Este padrão de

expressão pode, ainda, intensificar-se com o passar da idade (Berrih et al., 1985;

Lannes-Vieira et al., 1991), e em processos infecciosos, como na infecção aguda

pelo Trypanosoma cruzi (Cotta-de-Almeida et al., 2003; Savino et al., 2006).

Grande parte dos receptores para proteínas de ECM pertence à família das

integrinas. Estas moléculas foram assim denominadas por integrarem os

compartimentos intra e extracelular ao se ligarem às moléculas presentes no

microambiente, como as outras células ou a proteínas da ECM, e aos componentes

do citoesqueleto. As integrinas são glicoproteínas transmembranares

heterodiméricas compostas de duas subunidades (

α e β). Até o momento, foram

descritas 18 subunidades α, e 8 subunidades β, formando, assim, 24 diferentes

moléculas (Kinashi, 2007). Os timócitos expressam, principalmente, as integrinas

denominadas VLAs (very late antigens) da família β1, como por exemplo, os

receptores VLA-4 (α4β1 ou CD49d/CD29) e VLA-5 (α5β1 ou CD49e/CD29) para

fibronectina, e o receptor VLA-6 (

α6β1 ou CD49f/CD29) para laminina. No entanto, a

distribuição destas moléculas difere segundo o estágio de diferenciação, refletindo

uma influência diferencial dos ligantes e receptores em cada etapa da maturação

(Figura 1.7) (Savino et al., 2000, 2004).

Células não-epiteliais também podem ser encontradas no microambiente

tímico. Dentre elas, vários tipos de células fagocíticas e apresentadoras de

antígenos distribuem-se pelas regiões do órgão (Figura 1.5B). Os macrófagos

residentes do córtex tímico apresentam núcleos degradados caspase-3

citoplasma, indicando que estas células fagocitem timócitos apoptóticos (Paessens

et al., 2008; Wakimoto et al., 2008).

As células dendríticas (DC) localizam-se na junção córtico-medular e na

região medular, dispondo-se ao longo dos vasos sangüíneos. A população de DCs

tímicas é heterogênea, e encontramos DCs plasmacitóides, grandes produtoras de

IFNα, e DCs convencionais que apresentam uma maior capacidade de apresentar

antígenos para os linfócitos T através das moléculas de MHC de classe I e II

(Proietto et al., 2009). As DCs convencionais estão envolvidas com a deleção de

clones auto-reativos durante a seleção negativa dos timócitos, bem como com a

geração de células T reguladoras (Treg) (Proietto et al., 2009).

Encontramos, também, as PTR (phagocytic cells of thymic reticulum), células

que apresentam fenótipo similar aos macrófagos, expressam MHC de classe I e II,

F4/80 e Mac-1. Estas células podem ser isoladas a partir de culturas primárias de

timo murino. Assim como as TEC, as PTR produzem moléculas de matriz

extracelular como colágeno-IV, fibronectina e laminina, expressam os receptores

correspondentes, VLA-4, VLA-5 e VLA-6, respectivamente, e ainda interagem com

timócitos através de ligantes e receptores de ECM (Ayres-Martins et al., 2004).

O timo possui, além dos tipos celulares já citados, fibroblastos que estão

localizados nas regiões ricas em tecido conjuntivo, como o septo e a cápsula. Estas

células também são capazes de produzir diferentes moléculas de ECM como

fibronectina, laminina, colágenos tipo I e tipo IV (Savino et al., 2000).

Apesar de o timo ter sido caracterizado como o principal sítio de diferenciação

de linfócitos T, ele também sedia maturação de células B a partir de progenitores

vindos da medula óssea (Mori et al., 1997). As células B tímicas estão localizadas,

predominantemente, na junção córtico-medular e representam, aproximadamente,

1% da suspensão celular do timo (Miyama-Inaba et al., 1988). Estas células

apresentam características fenotípicas da subpopulação de linfócitos B-1 e atividade

de células apresentadoras de antígenos participando, assim, da seleção intratímica

(Inaba et al., 1991). Além disso, as células B tímicas podem deixar o órgão,

atingindo os órgãos linfóides periféricos (Akashi et al., 2000).

O acúmulo de linfócitos B no timo está relacionado com o envelhecimento e

algumas patologias auto-imunes, como a Miastenia Gravis (MG). Em cortes

histológicos de adultos e, mais intensamente, em pacientes com MG, podemos

encontrar a expansão desta população, com sua redistribuição para todas as regiões

do órgão (Flores et al., 2001). Além disso, podem ser encontrados arranjos

semelhantes a centros germinativos no timo. Os linfócitos B tímicos na MG

apresentam aumento da sobrevivência celular, e são responsáveis pela secreção de

auto-anticorpos, anti-receptor de Acetilcolina (AChR) que iniciam o processo auto-

imune na junção neuro-muscular (Hill et al., 2008).

Este aumento da população de células B-1 no timo também foi encontrado em

modelo murino de Lupus Eritematoso Sistêmico. Os camundongos (NZBxNZW)F1

(BWF1) desenvolvem, com passar da idade, uma doença auto-imune semelhante ao

LES em humanos (Ishikawa et al, 2001; Ito et al., 2004). Após transferência

intravenosa de uma mistura de células B-1 e B-2 para camundongos BWF1, as

células B-1 migram, preferencialmente, para o timo. O recrutamento observado

deve-se, em parte, ao aumento da expressão da quimiocina CXCL13, um importante

fator quimioatraente para linfócitos B (Ito et al., 2004). Assim, num contexto de

autoimunidade ou senescência do sistema imune, o microambiente gera sinais que

aumentam a sobrevida das células B tímicas, ou, estimulam a migração de linfócitos

B para o timo.

A respeito da influência de APRIL na biologia das células B-1, já se sabe que

esta citocina promove aumento da sobrevivência de células tumorais de pacientes

com CLL (Haiat et al., 2006). E ainda, conforme mencionado anteriormente,

camundongos APRIL-Tg apresentam uma expansão desta subpopulação a partir da

cavidade peritoneal que invade outros órgãos linfóides (Planelles et al., 2004).

Nesse sentido, resultados preliminares de nosso grupo mostram um acúmulo de

células B220

, também, no timo de camundongos APRIL-Tg a partir dos 9 meses de

idade. No entanto, o efeito de APRIL na fisiologia tímica permanece, ainda,

desconhecido.

1.3.2. Maturação e migração intratímica de linfócitos T

No parênquima tímico ocorrem os eventos celulares responsáveis pela

diferenciação dos linfócitos T. Este processo é dinâmico, porém, organizado e

compartimentalizado em diferentes regiões do microambiente que, devido à sua

composição específica, fornece sinais essenciais para o direcionamento dos clones

durante seu desenvolvimento. Os precursores de linfócitos T entram no timo, através

dos vasos sangüíneos presentes na junção córtico-medular, e migram, inicialmente,

para a região cortical e, depois, encaminham-se para a medula, onde completam o

processo de maturação (Figura 1.7) (Petrie & Zúñiga-Pflucker, 2007). Vale ressaltar

que a migração direcionada necessita de substrato para adesão, fornecido pelas

moléculas de ECM, e, também, de sinais polarizantes dados pelas quimiocinas.

Estes sinais são fornecidos pelas células do microambiente, estabelecendo uma

comunicação (crosstalk) com os timócitos através da interação com os receptores

específicos (Savino et al., 2002, 2004). Assim, os timócitos alternam a expressão de

diferentes moléculas de adesão e receptores de quimiocinas durante seu

desenvolvimento, conforme é ilustrado na figura 1.7B.

Os timócitos podem ser identificados de acordo com a expressão de

moléculas de superfície celular que apresentam ao longo das diferentes etapas do

desenvolvimento. As células nos estágios mais imaturos, presentes na junção

córtico-medular e na área cortical, ainda não expressam os co-reptores CD4 e CD8

sendo, assim, denominadas de células duplo-negativas (DN). Esta população pode,

ainda, ser subdividida em quatro sub-etapas de desenvolvimento, DN1, DN2, DN3 e

DN4, baseadas, principalmente, na expressão de duas moléculas de superfície

celular: o CD25 (IL-2R

α), cadeia alfa do receptor para IL-2, e o CD44 (Pgp-1),

receptor para ácido hialurônico e fibronectina (Figura 1.7A). No entanto, outras

moléculas também influenciam a biologia das células nestes estágios, como o

CD117, ou c-kit, receptor para fator de célula tronco (SFC) (Godfrey et al., 1993).

As TEC produzem diferentes citocinas e quimiocinas que direcionam a

migração destas subpopulações. Dentre elas, a IL-7 é fundamental para o

desenvolvimento e sobrevivência dos timócitos. Na sua ausência há diminuição

severa da celularidade no timo com bloqueio na diferenciação de linfócitos e,

conseqüentemente, linfopenia no sangue e nos órgãos linfóides periféricos (von

Freeden-Jeffry et al., 1995). A expressão de IL-7 difere na intensidade e localização

ao longo da ontogenia, a freqüência de células IL-7

diminui com o envelhecimento.

Podemos encontrá-las no primórdio tímico, mas, à medida que o órgão expande,

observamos uma redução da produção desta citocina (Zamisch et al., 2005). No timo

adulto, as TEC produtoras de IL-7 são encontradas na junção córtico-medular, sítio

colonizado por timócitos nos estágios mais precoces do desenvolvimento (Alves et

al., 2009).

Figura 1.7. Maturação e migração intratímica: influência das moléculas de

matriz extracelular (ECM), quimiocinas e seus receptores. O painel A mostra

esquemáticamente a distribuição dos estágios de maturação no timo: os precursores

linfóides (DN) entram no órgão através dos vasos sanguíneos situados na junção

córtico-medular de onde migram para a região cortical mais externa. Os timócitos

passam, então, para o estágio de duplo-positivo (DP), dirigindo-se para a região

medular. Na medula encontramos os linfócitos nos estágios mais avançados de

maturação, com fenótipo simples positivo CD4 ou CD8 (Modificado de Crompton et

al., 2007). O painel B, mostra à esquerda que o processo de diferenciação de

timócitos se dá no contexto da rede do microambiente tímico (retícula cinza) e de

proteínas solúveis, marcadas como estrelas vermelhas. No lado direito deste painel

podemos perfis citofluorimétricos que representam a expressão diferencial dos

receptores de ECM (VLA-4, VLA-5 e VLA-6) e quimiocinas (CXCR4) nos diversos

estágios de diferenciação (Modificado de Savino et al., 2004).

A IL-7 induz expressão das enzimas responsáveis pela recombinação dos

genes V(D)J, RAG1 e RAG2, participando, assim, do rearranjo do TCR (Muegge et

al., 1993).

Os progenitores linfóides DN1 (CD25

CD44

c-kit

) que chegam através dos

vasos da junção córtico-medular no timo, proliferam expandindo o número de

progenitores, e são dirigidos para a região cortical adjacente onde se apresentam

com o fenótipo DN2 (CD25

CD44

c-kit

) (Petrie & Zúñica-Pflucker, 2007). O

recrutamento de precursores para a região cortical é altamente dependente da

sinalização entre a quimiocina CXCL12 e seu receptor CXCR4. Os timócitos duplo-

negativos expressam CXCR4, e seu ligante pode ser produzido pelas TEC corticais.

Em ensaios in vitro, os precursores aumentam a atividade migratória na presença de

CXCL12, ao passo que a ausência de seu receptor impede a entrada dos

precursores no córtex, acumulando-os ainda no estágio DN1 na junção córtico-

medular (Plotkin et al., 2003).

Nestes primeiros estágios de maturação, os precursores linfóides

comprometem-se com a linhagem T. Em linhas gerais, durante o processo de

maturação, os linfócitos T passam a expressar o receptor de antígeno (TCR), assim

como as moléculas acessórias CD4 e CD8. O TCR é formado por duas cadeias, αβ

ou γδ, no entanto, a maioria dos clones gerados no timo apresenta moléculas de

TCRαβ. Estas moléculas são produzidas através do rearranjo dos segmentos

gênicos V, D e J. Diferentes segmentos podem ser direcionados para compor o

receptor, gerando, assim, uma grande variedade de repertório. Os linfócitos T

imaturos que apresentarem rearranjos produtivos, originando TCRs capazes de

interagir com moléculas de MHC apresentadas por células do microambiente,

porém, sem deflagrar uma resposta auto-tóxica estão aptos para deixar o órgão e

colonizar a periferia. Por outro lado, os clones que apresentarem rearranjos

improdutivos, ou que não interagirem com moléculas de MHC próprio com avidez

moderada morrerão por apoptose (Takahama, 2006).

As TEC participam deste processo ao estimularem a sinalização através dos

receptores Notch que são expressos pelos timócitos desde os estágios mais

precoces, ao passo que as TEC expressam os ligantes Jagged1, Jagged2, Delta-

like1 e Delta-like4 (Harman et al., 2003). Sendo assim, quando a interação com

receptor para Notch é bloqueada, ocorrem falhas no desenvolvimento dos linfócitos

T, inviabilizando o início do rearranjo dos segmentos gênicos para produção do

receptor de antígeno, evento que determina total comprometimento com a linhagem

T (Schmitt et al., 2004).

No estágio subseqüente de maturação DN3 (CD25

CD44

c-kit

low

), os linfócitos

já estão comprometidos com a linhagem T e expressam pré-TCR associado à

molécula de CD3. No entanto, aquelas células que apresentam falhas no rearranjo

morrem nesta fase do desenvolvimento (Saint-Ruf et al., 1994). Existe uma última

subetapa de diferenciação no estágio DN, na qual os timócitos duplo-negativos

perdem a expressão do CD25 e passam a apresentar o fenótipo DN4 (CD25

CD44

Estas células encontram-se, ainda, na porção mais externa do córtex, na área sub-

capsular, assim, a migração para a região medular coincide com a transição do

estágio de duplo-negativo para duplo-positivo (DP), seguindo o estímulo dado pelo

acúmulo de moléculas de matriz extracelular e quimiocinas nesta região, conforme

ilustrado na figura 1.7 (Savino et al., 2004).

Os timócitos DP são assim chamados por expressarem os co-receptores CD4

e CD8 simultaneamente. Estas células, que correspondem à cerca de 80% dos

timócitos totais, podem ser encontradas próximas das junções córtico-medulares, e

migram em direção a região medular onde darão origem às células maduras simples

positivas CD4

CD8

(CD4SP) ou CD4

CD8

(CD8SP) (Petrie&Zúñia-Pflucker, 2006).

Desta maneira, o microambiente que sinaliza para a entrada de DN no córtex é o

mesmo que influencia a saída de DP em direção a medula. No entanto, estas duas

subpopulações respondem de maneira diferente aos mesmos estímulos, pois

apresentam expressão diferenciada de receptores específicos para os sinais

liberados pelo microambiente tímico (Figura 1.7B).

A IL-7 é fundamental, também, para a manutenção da subpopulação de

timócitos SP. Esta citocina é produzida pelas TEC medulares, e a expressão de seu

receptor, IL-7R, está aumentada nas células CD4

CD8

e CD4

CD8

, estimulando a

expansão dos clones selecionados (Hare et al., 2000; Zamisch et al., 2005). Além

desta molécula, as quimiocinas CCL19 e CCL21 participam da transição para as

etapas finais de diferenciação, guiando os clones selecionados positivamente,

CD4SP ou CD8SP, para a medula. A ausência destes ligantes ou do receptor CCR7,

leva ao bloqueio da entrada de timócitos na medula, acumulando-os na região

cortical, o quê explica o defeito na exportação de linfócitos T encontrado nos animais

deficientes em CCR7 (Ueno et al., 2004).

Para completar o processo de maturação, os timócitos devem passar pelos

eventos de seleção intratímica. Na seleção positiva, ainda no córtex, os TCR

formados são testados quanto à restrição ao MHC próprio. De maneira geral, as

células que reconhecem antígenos apresentados por MHC de classe I tornam-se

CD8SP, ao passo que aquelas que interagem com MHC de classe II diferenciam-se

em CD4SP. Em ambos os casos, a avidez da interação TCR/MHC-peptídeo é

moderada. Na seleção negativa, os linfócitos devem ser capazes de interagir com

complexo MHC:peptídeo, porém, com avidez maior, sem deflagrar um sinal de

morte, que ocorre freqüentemente quando há uma resposta aos auto-antígenos

apresentados. Esta distinção entre próprio e não-próprio envolve a atividade das

TEC, principalmente as medulares, que expressam uma diversidade de antígenos

específicos de tecidos (tissue-specific antigens, TSA) sob controle do fator de

transcrição AIRE (auto-imune regulator) (Kyewski & Derbinski, 2004). Trabalho com

camundongos AIRE

-/-

mostraram que estes animais desenvolvem autoimunidade

órgão-específica em diversos tecidos cujos antígenos perdem sua representação

tímica. Assim, o timo sedia os eventos responsáveis pela indução de tolerância

central, prevenindo a saída de células auto-reativas para a periferia, e,

conseqüentemente, o aparecimento de doenças auto-imunes (DeVoss et al., 2006).

As células T que passam por todos estes estágios estão aptas a deixar o

timo. Ainda não são conhecidos todos os mecanismos envolvidos na saída dos

clones para a periferia, no entanto, foi observado que os linfócitos maduros prestes a

emigrar apresentam algumas mudanças no fenótipo que proporcionam esta

migração. Além da modulação da expressão de CCR7 como mencionado

anteriormente, há, também, aumento da expressão do receptor de esfingosina-1-

fosfato, S1P

, um lipídio abundante no sangue, e da molécula de adesão CD62L

(McCaughtry et al., 2007). Assim, os linfócitos maduros são atraídos para os vasos,

podendo, então, ser exportados para os órgãos linfóides periféricos.

É importante ressaltar que todos os estímulos citados, atuam conjuntamente

na migração dos timócitos, ou seja, trata-se de um processo multivetorial resultante

da atuação de diversas interações (vetores), tais como as interações mediadas por

moléculas de matriz extracelular, quimiocinas e citocinas (Savino, 2007; Mendes-da-

Cruz et al, 2008). Neste sentido, APRIL poderia ser mais um fator capaz de modular

os eventos relacionados à migração de timócitos.

1.3.3. APRIL e timo

Trabalhos recentes mostraram que, dentre os órgãos linfóides e não-linfóides

de diferentes espécies animais analisadas (cão, coelho e porco), o timo apresenta

níveis de RNAm para APRIL bastante altos quando comparados a vários outros

órgãos (Guan et al., 2007; Shui et al., 2008; Wang et al., 2009). Ainda através da

análise de RNAm, foi identificada a expressão do receptor TACI em amostras de

timo humano (von Bülow & Bram, 1997). Deste modo, seria possível que a

sinalização através da ligação com APRIL influenciasse a fisiologia tímica.

No entanto, não existem relatos da expressão da proteína em tecido tímico

humano e murino, sobretudo dentro de um contexto fisiológico. Até o momento, um

único trabalho detectou a proteína APRIL em macrófagos no timo de pacientes com

MG (Hahne et al., 1998; Thangarajh et al., 2006). Sendo assim, ainda não se

conhecem os efeitos de APRIL neste órgão. Então, dando continuidade à

investigação da participação de APRIL na atividade dos linfócitos (Stein et al., 2002;

Planelles et al., 2004), nosso grupo propôs-se a estudar o efeito de APRIL na

atividade de timócitos em diferenciação, em especial nos eventos de migração

celular.

2. OBJETIVOS

Sabemos que o timo é um órgão linfóide central, responsável pela geração e

seleção de linfócitos T e, portanto, importante sítio para indução de tolerância.

Tendo em vista, que o aumento da expressão de APRIL está relacionado com

diversas doenças auto-imunes, torna-se necessário investigar possíveis alterações

da fisiologia tímica frente à proteína APRIL no que tange seus efeitos na migração

de timócitos, processo fundamental para a diferenciação dos linfócitos T.

Nesse contexto, nosso objetivo geral foi avaliar o efeito de APRIL na migração

dos timócitos. E, de forma mais específica:

• Analisar o efeito de APRIL na sobrevivência e proliferação de timócitos;

• Verificar o efeito de APRIL na adesão de timócitos às células epiteliais

tímicas;

• Avaliar o efeito de APRIL na migração de timócitos.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Reagentes

Utilizamos os seguintes reagentes: soro bovino fetal (Cultilab, Campinas,

BRA); formaldeído (VETEC, Campinas,); APRIL e CXCL12 recombinantes

(Peprotech, Princeton, EUA); APRIL-flag e BAFF-flag humanos (Invitrogen,

California, EUA); fibronectina e laminina (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Os demais

reagentes: salina tamponada com fosfato (PBS), meio RPMI 1640, piruvato de sódio,

albumina sérica bovina (BSA), heparina, Hematoxilina, Eosina-Fuxina, e anti-flag

Flag BioM2 foram obtidos juntos à Sigma-Aldrich. Já a estreptavidina conjugada à

peroxidase foi comprada da Becton Dickinson (Franklin Lakes, EUA).

Quanto aos anticorpos monoclonais (mAb) utilizados na fenotipagem,

obtivemos: anti-B220 (clone RA3-B2) PercP, anti-CD4 PercP (clone RM4-5), anti-

CD8 APC (clone 53-6.7), anti-CD5 FITC (557487), anti-CD19 FITC (553785), anti-

CD49d PE (clone R1-2), anti-CD49e PE (557447), anti-CD49f PE (clone 33775X),

todos da Becton Dickinson (Franklin Lakes, EUA); anti-TACI PE (clone 166010) da

R&D Systems (Minneapolis, EUA). Todos os anticorpos estão listados na tabela 3.1.

Tabela 3.1. Anticorpos monoclonais utilizados na fenotipagem.

Anticorpos monoclonais utilizados na fenotipagem

Marcador

Anticorpo

Molécula alvo

Fluoro

cromo

Linfócitos B

Anti-CD45R

Tirosina fosfatase (B220) PercP

Anti-CD5 Regulador negativo do BCR FITC

Anti-CD19 Co-receptor do BCR FITC

Sub-

populações de

linfócitos T

Anti-CD4

Co-receptor do TCR para ligação

ao MHC de classe II

PercP

Anti-CD8

Co-receptor do TCR para ligação

ao MHC de classe I

APC

Molécula de

ativação

Anti-CD25 Cadeia alfa do receptor para IL-2 FITC

Molécula de

adesão

Anti-CD49d

Subunidade α da integrina α4β1

(VLA-4)

Anti-CD49e

Subunidade α da integrina α5β1

(VLA-5)

Anti-CD49f

Subunidade α da integrina α6β1

(VLA-6)

Receptor para

APRIL

Anti-TACI Receptor para APRIL PE

3.2. Animais

Foram utilizados camundongos machos das linhagens BALB/c e C57BL/6

com 5-6 semanas de idade, obtidos no biotério central da Fundação Oswaldo - RJ

(CECAL) e mantidos no biotério experimental do Pavilhão Leônidas Deane em

condições SPF. A manipulação dos animais obedeceu às normas de biossegurança

estabelecidas pela Comissão de Ética no Uso de Animais do IOC (CEUA P0145).

3.2.1. Obtenção de timócitos

Os timos foram macerados em homogeneizador de tecidos, “potter”, contendo

1mL de RPMI-SBF 10%. Após centrifugação por 5 minutos a 400g a 4ºC, as células

foram ressuspendidas em 1mL de RPMI-SBF 10% para contagem com Azul de

Tripan em câmara de Neuebauer e posterior utilização nos ensaios de RT-PCR,

sobrevivência, migração e adesão celular. Parte das células foi utilizada para os

ensaios de citofluorimetria, sendo a fluorescência adquirida e posteriormente

analisada em citômetro FACSCalibur ou FacsAria (Becton-Dickinson).

3.3. Cultivo celular

Nos ensaios de adesão celular, utilizamos as linhagens de células epiteliais

tímicas (TEC), IT-76M1 e 2BH4, obtidas após cultivo contínuo de estroma tímico de

camundongos BALB/c e C57BL/6, respectivamente (Itoh et al., 2001; Amarante-

Mendes et al., 1995). Para o plaqueamento e manutenção dos cultivos celulares,

utilizamos meio RPMI 1640, suplementado com 10% de SBF acrescido de 100U/mL

de penicilina, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio e albumina sérica bovina

(BSA). As células foram mantidas a 37°C em estufa c om 5% de CO

3.4. Ensaio de Sobrevivência Celular

Para verificar a influência de APRIL na sobrevivência dos timócitos in vitro,

tratamos 10

células com 50ng/mL da proteína APRIL por 16 horas a 37ºC em estufa

com 5% de CO

. Após este período, verificamos a celularidade de cada amostra

através da contagem em câmaras de Neubauer por exclusão de Azul de Tripan, e

utilizamos o kit ApoScreen™ Annexin V Apoptosis (Southern, EUA) para detectar o

percentual de células apoptóticas através da análise citofluorimétrica. Esta molécula

pode conjugar-se à fosfatidilserina presente na face externa da membrana da

maioria das células em processo em fase inicial de morte celular programada. Por

isso, pode ser utilizada como ferramenta para avaliação da apoptose. Como controle

positivo para morte celular, foram utilizados timócitos tratados com 100nM de

hidrocortisona.

3.5. Ensaio de Migração celular

Para analisar o efeito da proteína APRIL na migração de timócitos, realizamos

ensaios de migração em placas de transwell (Corning Inc., New York, EUA) dotadas

de membranas com poros de 5

µm de diâmetro. Os insertos tiveram suas

membranas previamente tratadas com moléculas de matriz extracelular, fibronectina

e laminina (Sigma-Aldrich) na concentração de 10µg/mL, por 45 minutos a 37°C em

estufa com 5% de CO

, ou BSA na mesma concentração (usada neste experimento

como controle negativo para migração celular). Posteriormente, as membranas

foram bloqueadas com PBS-BSA 0,5% por 1 hora a 37°C em estufa com 5% de

. Foram utilizados 2,5x10

timócitos para os ensaios de migração, obtidos de

acordo com a sessão 3.2.2. Nos ensaios de quimiorrepulsão, conforme

esquematizado na sessão dos resultados, os timócitos foram depositados sobre a

membrana de transwell em meio à solução de RPMI-BSA 1% contendo diferentes

doses da proteína APRIL recombinante. Em alguns experimentos, os timócitos

receberam pré-tratamento com solução de 50µg/mL de heparina por 1h a 37

C em

estufa contendo 5% de CO

Nos ensaios de quimiotaxia, as câmaras inferiores

receberam solução de 200ng/mL de CXCL12. Após 3 horas de migração a 37°C em

estufa com 5% de CO

, as células migrantes foram retiradas, lavou-se a face inferior

da membrana com 200µL de PBS-SFB 10% e as células depositadas na câmara

inferior foram coletadas. As células foram centrifugadas e a contagem realizada em

câmara de Neubauer pelo método de exclusão do corante Azul de Tripan.

Para identificação das subpopulações linfocitárias das células migrantes,

submetemos os timócitos à análise citofluorimétrica.

Para análise comparativa da atividade migratória de cada subpopulação,

calculamos o percentual de input (% de input) para cada subpopulação de timócito

de acordo com a seguinte fórmula:

Número absoluto de células depois da migração

% de Input = ________________________________________ x 100

Número absoluto de células antes da migração

3.6. Ensaio de Adesão

Para avaliar o efeito da proteína APRIL na adesão de timócitos às TEC,

realizamos ensaios de adesão de acordo com protocolo estabelecido pelo nosso

grupo (Ribeiro-Carvalho et al., 2002). Para isto, as TEC foram plaqueadas em

frascos de 25cm

(Nunc S/A, Dinamarca) na concentração de 7,5x10

células por

frasco, que foram mantidos em cultura por 48 horas em meio RMPI como descrito na

sessão 3.3. As TEC foram lavadas com PBS e co-cultivadas com timócitos frescos,

tratados ou não previamente com 50ng/mL de APRIL por 1 hora a 37°C em estufa

com 5% de CO

. A cultura de 2BH4 recebeu timócitos da linhagem C57BL/6, ao

passo que a IT-76M1 recebeu timócitos de BALB/c. A proporção para o co-cultivo foi

de 50 timócitos/TEC. Nos primeiros 30 minutos, as co-culturas foram incubadas a

37°C em estufa com 5% de CO

, e, nos 30 minutos restantes, as células foram

mantidas sob agitação leve (60 rpm) à temperatura ambiente. A seguir, os frascos

foram deixados na posição vertical por 5 minutos para que os timócitos não-

aderentes fossem depositados e desprezados do sistema. Os co-cultivos foram

fixados com metanol (Vetec) por 8 minutos, coradas com Giemsa (Merk) 10% por 20

minutos, e lavadas com PBS, para visualização e contagem. As imagens foram

obtidas em microscópio óptico (Zeiss – modelo Axiolab, Alemanha). Para análise da

interação entre timócitos e TEC, utilizamos o índice de adesão (IA) determinado pela

seguinte fórmula:

Número de TEC com timócitos x número de timócitos aderidos nas TEC

IA= __________________________________________________________x 100

Número total de TEC

3.7. Fenotipagem

A fenotipagem das subpopulações linfocitárias foi feita por citofluorimetria. Os

timócitos foram obtidos conforme descrito na sessão 3.2.1, e as TEC foram retiradas

dos frascos de cultura com auxílio de 1,5mL de EDTA 10mM por 20 minutos. As células

foram colocadas em placas de fundo "V" de 96 poços, centrifugadas a 400g por 5

minutos a 4ºC, e ressupendidas em 5µL de soro normal de camundongo para bloqueio

por 20 minutos a 4

C. Adicionamos 15µL da solução contendo os anticorpos

específicos para a detecção das proteínas estudadas (Tabela 3.1). Após incubação por

30 minutos a 4

C no escuro, as suspensões celulares foram lavadas com 100µL de

tampão de PBS-SBF 1% e centrifugadas. Desprezou-se o sobrenadante, e as células

foram ressuspendidas em 200µL de tampão de fixação (PBS-PFA 1%), transferidas

para tubos apropriados, e estocadas a 4

C protegidos da luz até a aquisição em

citômetro de fluxo. Os dados adquiridos foram analisados no programa Summit 4.3 2,

Dako®.

3.8. ELISA

Para verificar se APRIL é capaz de interagir com moléculas de matriz

extracelular, realizamos a técnica de ELISA. Placas de 96 poços foram cobertas com

10µg/mL de fibronectina, 10µg/mL de laminina ou 100ng de BCMA-Fc (utilizado

como controle positivo) por poço. As placas foram incubadas por 16-18 horas a 4°C.

No dia seguinte, foram lavadas três vezes com PBS-Tween 0,005% e cobertas com

200µL/poço de PBS-BSA 1% durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas

foram incubadas por 1 hora com soluções contendo diferentes concentrações de

APRIL-flag. Terminado o período de incubação, cada poço foi lavado 5 vezes com

PBS-Tween 0,005% e, em seguida, foi adicionado 100µL/poço de anti-flag

biotinilado. Após uma hora de incubação, à temperatura ambiente, as placas foram

novamente lavadas cinco vezes com PBS-Tween 0,005%. Acrescentou-se então

solução de estreptavidina HRP para revelar o Flag-biotinilado. As placas foram

mantidas no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Após cinco lavagens,

foram colocados 100µL/poço de solução substrato (OPD-3mg, H

5mL, 2,5mL de

tampão citrato e 2,5mL de Na

HPO

). A reação foi interrompida após cinco minutos

com solução 2N de HCl. A medida da densidade óptica foi realizada em um leitor de

ELISA (Dynex), utilizando um comprimento de onda de 492nm.

3.9. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas através do Teste ANOVA com

auxílio do software GraphPad Prim 4. As diferenças entre os grupos analisados

foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor de p < 0,05.

4. RESULTADOS

4.1. Avaliação do efeito de APRIL na sobrevivência de timócitos

Sabendo-se que APRIL foi descrito primeiramente como um importante fator

indutor de proliferação de células tumorais in vitro (Hahne et al., 1998) e,

posteriormente, como uma citocina promotora de sobrevivência de linfócitos T e B

em diferentes modelos (Stein et al., 2002; Planelles et al., 2004; Belnoue et al.,

2008), buscamos, inicialmente, verificar o efeito de APRIL na sobrevivência e

proliferação de timócitos in vitro.

Timócitos frescos de camundongos C57BL/6 foram incubados em solução

contendo 5ng/mL ou 50ng/mL de APRIL em estufa a 37°C contendo 5% de CO

Após 16 horas de tratamento, as culturas foram avaliadas quanto à morte celular

através da contagem e análise da viabilidade celular em câmaras de Neubauer por

exclusão com Azul de Tripan. Além disto, avaliamos o perfil de ligação de Anexina V

nas subpopulações de timócitos.

Não foram encontradas diferenças na celularidade entre os dois grupos

experimentais, controle e tratado (Figura 4.1A). E ainda, a análise da marcação com

Anexina V revelou que APRIL parece não alterar o número de células em apoptose

neste modelo, pois, os percentuais e a média de intensidade de fluorescência (MFI)

permaneceram iguais nos dois grupos em todas as subpopulações de timócitos

analisadas (Figura 4.1B).

Estes resultados sugerem que APRIL não é capaz de causar morte dos

timócitos ou protegê-los da apoptose em ensaios in vitro. Podemos sugerir, ainda,

que APRIL não estimule proliferação, pois não encontramos diferenças na

celularidade entre os dois grupos.

Figura 4.1. APRIL não interfere na sobrevivência e proliferação de timócitos.

Os timócitos de camundongos C57BL/6 foram incubados com 50ng/mL de APRIL

por 16h a 37°C em estufa contento 5% de CO

. Em A, mostramos que não há

diferenças na celularidade das subpopulações de timócitos após o tratamento in

vitro. Em B, observamos que não há alteração da população em apoptose nos dois

grupos através da marcação com Anexina V. A hidrocortisona é utilizada como

controle positivo para indução de morte celular. Os gráficos e histogramas

representam resultado representativo de três experimentos independentes (n=3).

“*”p<0,05.

4.2. Avaliação do efeito de APRIL na migração de timócitos in vitro

4.2.1 Efeito de APRIL na migração de timócitos

A migração celular é um evento crucial na diferenciação intratímica dos

linfócitos T. Ao longo do processo de maturação, os timócitos em diferentes estágios

migram através do microambiente tímico, onde recebem sinais essenciais para sua

diferenciação, até completarem o seu desenvolvimento (Petrie & Zúñiga-Pflucker,

2007). Nosso grupo tem utilizado o modelo de migração celular ex vivo para avaliar

a participação de diferentes moléculas neste processo (Savino et al., 2002, 2003,

2004).

Desta forma, para avaliar o efeito de APRIL na atividade migratória de

timócitos provenientes de camundongos normais, e, assim, analisar sua influência

na diferenciação dos linfócitos T, realizamos ensaios ex vivo de migração em

câmaras de transwell. Primeiramente, diferentes concentrações de APRIL foram

utilizadas para investigar se esta molécula seria capaz de modular a atividade

migratória dos timócitos atuando como um fator quimioatraente ou repulsor. Assim,

para os ensaios de quimiotaxia, soluções contendo APRIL (0,5ng/mL, 5ng/mL,

50ng/mL e 100ng/mL) foram depositadas na câmara inferior das placas de transwell.

Nos ensaios de quimiorrepulsão, os timócitos foram depositados na câmara superior

em meio a uma solução contendo, igualmente, diferentes doses de APRIL, conforme

esquematizado na figura 4.2.

Não encontramos alterações numéricas na migração dos timócitos em

resposta a nenhuma das doses de APRIL utilizadas no ensaio de quimiotaxia (Figura

4.2A). Por outro lado, nos ensaios de quimiorrepulsão, observamos um aumento

dose-dependente na taxa de migração de timócitos, sendo que após tratamento com

50ng/mL de APRIL, o número de células migrantes coletado na câmara inferior foi 2-

3 vezes maior do que o das células do grupo controle, sugerindo, desta maneira,

que APRIL possa atuar como um fator quimiorrepulsor (Figura 4.2B).

Figura 4.2. Efeito quimiorrepulsor de APRIL na migração de timócitos. Os

timócitos de camundongos C57BL/6 jovens não-tratados (quimiotaxia) e tratados

(quimiorrepulsão) com APRIL (0,5ng/mL, 5ng/mL, 50ng/mL e 100ng/mL) foram

depositados sobre membranas de transwell com poros de 5µm, tratadas

previamente com BSA (esquemas à esquerda). Após três horas de migração, as

células que migraram para a câmara inferior foram recolhidas e contadas em

microscópio óptico. Em A, mostramos os ensaios de quimiotaxia nos quais

diferentes doses de APRIL foram depositadas na câmara inferior. Em B, mostramos

os ensaios de quimiorrepulsão nos quais os timócitos foram tratados com diferentes

doses de APRIL. Observamos aumento da migração quanto os timócitos foram

tratados com 50ng/mL de APRIL. Dados apresentados como média ± erro padrão de

três experimentos independentes (n=3), “*” p<0,05 em relação ao controle.

4.2.2 Efeito de APRIL na migração frente à fibronectina, laminina e CXCL12

Os eventos relacionados com a migração intratímica dos linfócitos T são

parcialmente direcionados e controlados por proteínas de ECM e quimiocinas,

dentre elas fibronectina e laminina e CXCL12, respectivamente (Savino et al., 2002;

2003; 2004).

Sendo assim, com o intuito de verificar a influência de APRIL na migração de

timócitos orientada por moléculas de ECM, realizamos ensaios de migração nos

quais as membranas dos insertos foram tratadas previamente com fibronectina ou

laminina conforme ilustrado nos esquemas da figura 4.3A e B. Diante dos resultados

encontrados nos ensaios de quimiorrepulsão (Figura 4.2B), foi utilizada a dose de

50ng/mL para tratamento dos timócitos nestes ensaios de migração.

Confirmando dados anteriores de nosso grupo (Savino et al., 2004), a migração

sobre fibronectina e laminina foi maior do que na ausência destes dois estímulos

haptotáticos. Foi observado um aumento no número de células migrantes quando as

membranas dos insertos foram previamente tratadas com estas moléculas de ECM

(Figura 4.3A e B). No entanto, os timócitos tratados com APRIL que receberam,

também, o estímulo da molécula de fibronectina, não apresentaram alterações na

reposta migratória em comparação com o controle não-tratado e com as células

tratadas com APRIL que migram na ausência de fibronectina (Figura 4.3A). A

incubação com APRIL foi suficiente para obter o efeito migratório similar,

numericamente, à migração em fibronectina de timócitos não-tratados. Não houve,

portanto, potencialização dos efeitos de cada fator, APRIL e fibronectina, quando os

estímulos são dados no mesmo sistema (Figura 4.3A).

Diferindo dos resultados obtidos na migração sobre fibronectina, observamos

um aumento no número de células migrantes quando timócitos tratados com APRIL

receberam, também, estímulo de laminina (Figura 4.3B). No entanto este aumento

nunca chegou a valores que correspondessem à soma dos dois estímulos utilizados

isoladamente. Estes resultados nos levaram a pensar que a proteína APRIL interaja,

de alguma maneira, com moléculas de ECM, particularmente laminina.

Buscamos ainda avaliar a influência do tratamento com APRIL na migração de

timócitos direcionada por CXCL12. Para isto, foram realizados ensaios de migração

nos quais as câmaras inferiores do sistema continham solução com a quimiocina

CXCL12 de acordo com o esquema da figura 4.3C.

Conforme descrito anteriormente, a atividade migratória dos timócitos é

aumentada na presença de CXCL12. A resposta frente à CXCL12 é cerca de duas

vezes maior que aquela observada após estímulo por APRIL, mostrando que o

estímulo da quimiocina é mais potente na atividade dos timócitos. Além disso, os

timócitos que receberam os dois estímulos, APRIL e CXCL12, apresentaram

aumento da migração em comparação com o grupo que não é exposto a quimiocina.

No entanto, de novo o número de timócitos migrantes na presença dos dois

estímulos foi inferior à soma dos valores encontrados quando cada estímulo foi

usado isoladamente (Figura 4.3C).

4.2.3 Análise fenotípica dos ensaios de migração

Dando continuidade à análise do efeito de APRIL na migração orientada por

fibronectina, laminina e CXCL12, verificamos o fenótipo dos timócitos após ensaios

de migração para analisar a atividade migratória de cada subpopulação. Para isto,

realizamos análise citofluorimétrica com marcação para as moléculas de superfície

celular CD4 e CD8. Tendo como parâmetro o número de células migrantes, foi

comparado o perfil das diferentes subpopulações em relação aos percentuais

observados antes da migração, representado pelo percentual de input (% de input),

descrito na sessão 3.5 do Material e Métodos.

A migração em BSA revelou aumento da migração de todas as subpopulações

de timócitos, porém, só encontramos diferença significativa no percentual de

timócitos duplo-positivos após tratamento com APRIL (Figura 4.4A). Por outro lado, a

migração em fibronectina não revelou diferenças significativas no percentual das

subpopulações de células migrantes, ou seja, não houve recrutamento preferencial

neste contexto (Figura 4.4B). No entanto, quando os timócitos migravam em

membranas revestidas com laminina houve aumento da atividade migratória das

subpopulações de células CD4SP no grupo tratado com APRIL (Figura 4.4C). E

ainda, a análise fenotípica após migração direcionada por CXCL12 não mostrou

diferenças entre os dois grupos (Figura 4.4D). Assim, estes resultados apontam para

um efeito diferencial de APRIL na migração de timócitos que está especificamente

relacionado com a molécula de laminina.

Figura 4.3. Efeito de APRIL na migração de timócitos orientada por

fibronectina, laminina e CXCL12. Os timócitos de camundongos C57BL/6 jovens

tratados e não-tratados (Ø) com solução de 50ng/mL de APRIL são depositados

sobre membranas de transwell com poros de 5µm, tratada previamente com BSA,

fibronectina (A) ou laminina (B). Câmara inferior recebeu solução de CXCL12 (C).

Após três horas de migração, as células foram recolhidas e contadas em

microscópio óptico. Dados apresentados como média ± erro padrão de três (A e B) e

dois (C) experimentos em triplicata, “*” p<0,05 e “**”p<0,005.

Figura 4.4. Análise fenotípica dos ensaios de migração. Timócitos não-tratados

(controles – barras brancas) e tratados com solução de 50ng/mL de APRIL (barras

negras) são depositados sobre a membrana de transwell com poros de 5µm tratadas

previamente tratadas com BSA (A), fibronectina (B) ou laminina (C). Solução

CXCL12 foi depositada na câmara inferior (D). Após três horas de migração, as

células foram recolhidas, contadas em microscópio óptico e fenotipadas por

citofluorimetria. As barras mostram o número relativo (% de input) das

subpopulações de timócitos. Valores representam média ± erro padrão, sendo

“**”p<0,005.

4.3. Interação de APRIL com molécula de matriz extracelular

Diante dos diferentes efeitos sobre a migração dos timócitos tratados com

APRIL frente à fibronectina e à laminina (Figura 4.4A e B), verificamos se APRIL

seria capaz de ligar-se a proteínas de matriz extracelular. Para isto, realizamos

ensaios imunoenzimáticos (ELISA) nos quais as proteínas de ECM foram adsorvidas

em suportes plásticos, recebendo, em seguida, APRIL-flag ou BAFF-flag, utilizado

como controle. Após as lavagens, foi adicionado anti-flag ao sistema para detecção

da interação entre APRIL e as moléculas de matriz através da leitura da densidade

óptica em espectrofotômetro.

Conforme esperado, os valores máximos de leitura foram encontrados nos

poços que receberam o coating do receptor BCMA, mostrando assim, que os

ligantes APRIL e BAFF interagem com esta molécula. Neste sentido, pôde-se

observar que os valores encontrados quando as placas foram revestidas com

fibronectina e laminina são inferiores em comparação ao controle (BCMA) para os

dois ligantes. No entanto, os valores encontrados nos sistemas que receberam

fibronectina e APRIL são maiores do que na presença de laminina, o quê não foi

observado para BAFF (Figura 4.5). Assim, estes resultados sugerem que APRIL

possa se ligar à fibronectina, e não a laminina. Isso poderia explicar porque não

ocorre nenhum efeito aditivo em termos de resposta migratória, quando timócitos

são pré-incubados com APRIL e posteriormente deixados migrar através de

fibronectina.

Figura 4.5. APRIL interage com fibronectina. Moléculas de matriz extracelular

(fibronectina e laminina) foram depositadas em placas de poliestireno e incubadas

com APRIL-flag e BAFF-flag. Após 2h, a interação foi revelada através de reação

imunoenzimática com auxílio de anti-flag. Valores representativos de dois

experimentos independentes, expressos em densidade óptica (O.D.), em relação ao

controle BCMA-Fc (BCMA).

4.4. Avaliação do efeito de APRIL na interação TEC-timócitos

Conforme descrito por nosso grupo, ao longo do processo de maturação, os

timócitos migram pelo microambiente tímico, para isso, interagem com as células do

microambiente, principalmente, as TEC. Assim, a adesão célula-célula é um evento

fundamental para o processo de migração intratímica dos linfócitos T (Savino et al.,

2002, 2003, 2004). Neste contexto, buscamos avaliar o efeito de APRIL na adesão

de timócitos às TEC.

Neste sentido, foram realizados ensaios de adesão com timócitos previamente

tratados com solução contendo 50ng/mL de APRIL conforme ilustrado no esquema

da figura 4.6. Os timócitos foram co-cultivados com as TEC, e após uma hora de

adesão, a interação foi quantificada através da contagem ao microscópio óptico e

cálculo do índice de adesão (IA), seguindo o protocolo descrito na sessão 3.6 do

Material e Métodos.

O tratamento dos timócitos com APRIL mostrou-se capaz de diminuir, em cerca

de 50%, a interação entre TEC e timócitos (Figura 4.6). Diante da similaridade dos

resultados encontrados com as duas linhagens de TEC (2BH4 e IT-76M1),

representamos na figura 4.6 somente os resultados dos experimentos com a

linhagem IT-76M1. Este efeito de-adesivo corrobora o papel de quimiorrepulsor,

evidenciado nos experimentos de migração celular ex vivo.

4.5. Avaliação do efeito de APRIL na expressão de receptores para matriz

extracelular

A participação das integrinas VLA-4, VLA-5, receptores de fibronectina, e VLA-

6, receptor de laminina foi caracterizada por nosso grupo como moléculas

fundamentais para a atividade migratória dos timócitos (Savino et al., 2000; Savino

et al., 2004). Sendo assim, tendo em vista os achados acerca do efeito de APRIL na

migração e adesão de timócitos (Figuras 4.2, 4.3 e 4.6), foi avaliada a expressão dos

receptores VLA-4, VLA-5 e VLA-6 nos timócitos em resposta ao tratamento in vitro

com a proteína.

Nestes ensaios, as células foram incubadas por 6h e 3h com solução

contendo 5ng/mL ou 50ng/mL de APRIL. Nossos resultados revelaram que o perfil

de expressão dos receptores VLA-4, VLA-5 e VLA-6 nas subpopulações de timócitos

dos grupos tratado e controle, não sofreu alterações após os tratamentos com

5ng/mL (dados não mostrados) ou 50ng/mL de APRIL nos dois períodos de

incubação utilizados (Figura 4.7, 4.8 e 4.9). Diante da similaridade dos resultados

encontrados, representamos nas figuras 4.7, 4.8 e 4.9 somente os resultados do

tratamento de 50ng/mL por 3h. Assim, não foi possível estabelecer uma relação

entre o aumento da resposta migratória, assim como a redução da adesão dos

timócitos, e os níveis de expressão destas integrinas.

Figura 4.6. APRIL modula negativamente a interação TEC-timócito. Este painel

corresponde a um ensaio de adesão com co-cultivos de células epiteliais tímicas

(TEC) e timócitos. Timócitos, controle, não tratados, (Ø) e pré-tratados com 50ng/mL

de APRIL por 1h, foram co-cultivados com TEC (IT-76M1) por 30 minutos a 37°C em

estufa com 5% de CO

, e mais 30 minutos sob agitação leve (60rpm) à temperatura

ambiente. O gráfico à direita mostra os resultados expressos em “IA” (Índice de

Adesão) referente à interação entre timócitos e TEC, e que foram normalizados para

100% dos valores de co-cultivos com timócitos controle. Valores representam média

± erro padrão de três experimentos, sendo “*”p<0,05.

Figura 4.7. Expressão de VLA-4 (CD49d) não é alterada após tratamento com

APRIL. Timócitos de camundongos C57BL/6 controle (linha tracejada) e tratados

com 50ng/mL de APRIL (linha cheia) foram incubados por 3h e 6h a 37°C em estufa

contendo 5% de CO

. Controle de isotipo (IgG2a) está representado em cinza.

Análise citofluorimétrica do perfil de expressão da cadeia α4 integrina (CD49d) do

receptor de fibronectina VLA-4, nas subpopulações de timócitos após tratamento.

Histogramas expressam resultados representativos de três experimentos

independentes com 3h de tratamento.

Figura 4.8. Expressão de VLA-5 (CD49e) não é alterada após tratamento com

APRIL. Timócitos de camundongos C57BL/6 controle (linha tracejada) e tratados

com 50ng/mL de APRIL (linha cheia) foram incubados por 3h e 6h a 37°C em estufa

contendo 5% de CO

. Controle de isotipo (IgG2a) está representado em cinza.

Análise citofluorimétrica do perfil de expressão da cadeia α5 integrina (CD49e) do

receptor de fibronectina VLA-5 nas subpopulações de timócitos após tratamento.

Histogramas ilustram resultados representativos de três experimentos

independentes com 3h de tratamento.

Figura 4.9. Expressão de VLA-6 (CD49f) não é alterada após tratamento com

APRIL. Timócitos de camundongos C57BL/6 controle (linha tracejada) e tratados

com 50ng/mL de APRIL (linha cheia) foram incubados por 3h e 6h a 37°C em estufa

contendo 5% de CO

. Controle de isotipo (IgG1) está representado em cinza.

Análise citofluorimétrica do perfil de expressão da cadeia α6 integrina (CD49f) do

receptor de laminina VLA-6 nas subpopulações de timócitos após tratamento.

Histogramas ilustram resultados representativos de três experimentos

independentes com 3h de tratamento.

4.6. Determinação da interação APRIL x Timócito

4.6.1 Caracterização da expressão de receptor TACI nos timócitos

A expressão de receptores para APRIL na população de linfócitos T, TACI, no

timo ainda não está relatada. Avaliamos então, a expressão desta molécula nas

diferentes subpopulações de timócitos através da técnica de citometria de fluxo. Os

linfócitos B (CD19

) provenientes da cavidade peritoneal foram utilizados como

controle positivo para expressão do receptor TACI (Hardenberg et al., 2008).

Conforme representado nos gráficos da figura 4.10A, nenhuma das

subpopulações de timócitos, definidas pelos marcadores CD4 e CD8, apresentaram

expressão membranar do receptor TACI. No entanto, as linhagens de TEC e os

linfócitos B (CD19

) tímicos foram positivos para o receptor (Figura 4.10B e C).

Assim, podemos pensar que o efeito de APRIL na atividade dos timócitos talvez seja

mediado pela interação com outro receptor, ou ainda, que APRIL poderia modular a

atividade das TEC, e dos linfócitos B, que, então, influenciariam a atividade dos

timócitos.

4.6.2 Avaliação da participação de proteoglicanas de heparan-sulfato (HSPG)

na migração de timócitos

As moléculas de HSPG também foram descritas como capazes de se ligar a

APRIL. Estudo com células T Jurkat, que não possuem os receptores TACI e BCMA,

revelou que a interação com o ligante via HSPG é capaz de modular a atividade

celular (Hendriks et al., 2005). Entretanto, ainda não são conhecidas as possíveis

vias intracelulares envolvidas nesta ligação. Diante destes dados, e dos resultados

relativos à não-detecção do receptor TACI nos timócitos (Figura 4.8), buscamos

avaliar a importância de HSPG na resposta migratória de timócitos frente à APRIL.

Foram realizados ensaios de migração com timócitos previamente tratados com

heparina, pois, esta molécula pode se ligar a HSPG impedindo, assim, a sua

interação com APRIL (Hendriks et al., 2005; Ingold et al., 2005).

Vimos que o pré-tratamento com heparina bloqueou o efeito de APRIL na

migração dos timócitos, pois os valores encontrados nos ensaios onde as células

recebem somente a proteína APRIL retornaram aos do grupo controle quando as

células foram previamente incubadas com heparina (Figura 4.11). Sendo assim,

podemos inferir que APRIL estimule a migração dos timócitos via interação com

HSPG.

Figura 4.10. Subpopulações de timócitos não expressam o receptor TACI. A,

análise de citometria de fluxo em histogramas mostrando a ausência de marcação

específica para receptor para APRIL, TACI, nas subpopulações de timócitos

definidas pela expressão dos co-receptores CD4 e CD8. B, marcação para TACI nas

linhagens de TEC (IT-76M1 e 2BH4). C, linfócitos B (CD19

) tímicos. D, linfócitos B

(CD19

) da cavidade peritoneal são utilizados como controle positivo. Controle de

isotipo (IgG2a) está representado em cinza. Este resultado é representativo de três

experimentos com camundongos das linhagens C57BL/6 e BALB/c.

Figura 4.11. APRIL modula migração de timócitos via HSPG. Timócitos de

camundongos C57BL/6 tratados com 50ng/mL de APRIL foram depositados sobre a

membrana de transwell com poros de 5µm, tratada previamente com BSA. Em

alguns casos, as células receberam pré-tratamento com heparina (50µg/mL) por 1h

a 37

C. Após três horas de migração, as células que migraram para a câmara

inferior foram recolhidas e contadas em microscópio óptico. Dados apresentados

como média ± erro padrão de três experimentos independentes em duplicata, sendo

“**”p<0,005.

5. DISCUSSÃO

Os estudos com a proteína APRIL têm demonstrado seu envolvimento no

sistema imune, em particular, em processos patológicos como tumores e doenças

autoimunes (Dillon et al., 2006), sugerindo ainda que esta citocina possa vir a ser

alvo terapêutico para estas doenças. APRIL participa da promoção da sobrevivência

de células tumorais e da atividade de linfócitos B. Os estudos realizados com estas

células mostraram que APRIL influencia os mecanismos envolvidos com a

apresentação antigênica, produção e mudança de classe de imunoglobulinas e,

também, proliferação e sobrevivência (Dillon et al., 2006).

No entanto, desde sua descoberta por Hahne e colaboradores, em 1998, os

efeitos desta citocina na fisiologia dos linfócitos T, ainda são pouco consistentes

(Hahne et al., 1998). Nosso grupo, em colaboração com a equipe do Dr. Hahne, vem

estudando a participação de APRIL na biologia do sistema imune, em linfomas de

células B-1, e em processos de autoimunidade (Stein et al., 2002; Planelles et al.,

2004; Morel et al., 2009), sendo a presente dissertação, o primeiro estudo sobre

uma possível participação de APRIL na fisiologia tímica enfocando a migração dos

timócitos.

A diferenciação dos linfócitos T é um processo dependente da migração

celular. Para completar seu desenvolvimento, os precursores oriundos da medula

óssea devem, primeiramente, direcionar-se para o timo. No interior do órgão, os

timócitos movimentam-se pelas diferentes regiões ao longo do processo de

maturação. As células recém chegadas no timo pela junção córtico-medular, mais

imaturas, migram em direção à região cortical. Completadas algumas etapas do

desenvolvimento, os timócitos localizados na região cortical encaminham-se para a

medula tímica onde aquelas células positivamente selecionadas estão aptas para

sair do timo e colonizar os órgãos linfóides periféricos (Takahama, 2006).

O processo de diferenciação intratímica dos linfócitos T é resultante, também,

dos eventos celulares como adesão, de-adesão, migração, quimioatração e

repulsão. Com o intuito de melhor compreender os mecanismos envolvidos com o

desenvolvimento de células T e, mais especificamente, na migração de linfócitos T,

nosso grupo vem estudando a participação e o efeito de vários fatores neste

processo, em condições fisiológicas e patológicas. Os trabalhos mostraram que o

timo é um órgão alvo para doenças infecciosas (Savino et al., 2006), bem como uma

diversidade de moléculas, hormônios e neuropeptídeos que são capazes de modular

a adesão, migração e, portanto, a diferenciação dos timócitos (Savino et al., 2000;

Villa-Verde et al., 2002; Savino et al., 2004; Smaniotto et al., 2005; Lepelletier et al.,

2007; Ribeiro-Carvalho et al., 2007; Terra-Granado et al., 2007; Dardenne et al.,

2009; Mendes-da-Cruz et al., 2009).Tendo em vista o modelo já bem estabelecido

em nosso laboratório, e a complexidade do envolvimento de diferentes moléculas

nos mecanismos que influenciam a atividade migratória dos linfócitos T em

diferenciação, buscamos avaliar o efeito de APRIL na migração de timócitos

normais.

Inicialmente, investigamos a expressão de RNAm para APRIL no timo de

camundongos C57BL/6 e BALB/c, assim como em linhagens de TEC murinas.

Porém, por questões técnicas, ainda não pudemos concluir estas análises, as quais

serão, sem dúvida, importantes para definir uma possível participação da citocina na

fisiologia do órgão. Vale ressaltar, no entanto, que dados publicados recentemente

revelaram que o timo de algumas espécies animais, como cães, coelhos e porcos, é

um dos órgãos com a maior expressão de RNAm para APRIL (Guan et al., 2007;

Shui et al., 2008; Wang et al., 2009). Por outro lado, até o presente, somente um

trabalho mostrou a detecção da proteína em timo humano. A análise de amostras de

timo de pacientes com Miastenia Gravis através da técnica de imunohistoquímica

revelou uma expressão pontual e citoplasmática em células com características de

macrófagos (Thangarajh et al., 2006). Por outro lado, análise de tecido humano

normal não apresentou o mesmo resultado (Hahne et al., 1998; Thangarajh et al.,

2006). Portanto, pretendemos determinar quais células expressam APRIL no timo de

camundongos. Para isto, investigaremos, através de PCR em Tempo Real, se as

subpopulações de timócitos, bem como outros componentes não-linfóides residentes

do microambiente tímico, podem contribuir para o entendimento do resultado

observado em timo de animais normais (Guan et al., 2007; Shui et al., 2008; Wang

et al., 2009) como, também, em modelos de doenças autoimunes e infecciosas.

Tendo em vista a descrição inicial de APRIL como um fator indutor de

sobrevivência e proliferação de linfócitos e de células tumorais (Hahne et al., 1998;

Stein et al., 2002; Planelles et al., 2004; Kimberley et al., 2009), avaliamos o efeito

do tratamento in vitro sobre a sobrevivência de timócitos murinos. Em estudo com

camundongos APRIL-Tg, linfócitos TCD4

e CD8

esplênicos apresentaram aumento

da sobrevivência celular ex vivo em decorrência do aumento da expressão da

proteína anti-apoptótica Bcl-2 (Stein et al., 2002). Nossos resultados, ao contrário,

revelaram que APRIL não modula a sobrevivência das diferentes subpopulações de

timócitos. Além disso, de acordo com nossos achados, podemos supor que o

tratamento com APRIL não influencie, também, a proliferação dos timócitos. Neste

sentido, resultados preliminares com camundongos APRIL-Tg, que superexpressam

a proteína, revelaram que estes animais apresentam a histologia do timo,

celularidade e distribuição das subpopulações de timócitos normais (dados não-

publicados). O mesmo foi observado em animais nocautes para APRIL (Varfolomeev

et al., 2004). Assim, é possível que a modulação da proliferação e sobrevivência de

linfócitos T por APRIL seja um evento observado somente em células maduras na

periferia.

Para investigar o efeito de APRIL na migração dos timócitos, analisamos o

impacto do tratamento ex vivo com a proteína recombinante na migração destas

células. Nestes ensaios, o tratamento de timócitos com 50ng/mL de APRIL foi capaz

de aumentar, em cerca de 50%, a migração celular, indicando que APRIL poderia

exercer um efeito quimiorrepulsor. Porém, não observamos efeito quimiotático

quando a proteína era depositada no compartimento inferior da câmara de transwell.

E ainda, a análise fenotípica das células migrantes revelou que este efeito reflete,

principalmente, um recrutamento preferencial da subpopulação de linfócitos DP, que

constituem cerca de 80% dos timócitos.

Diante do aumento encontrado na migração de timócitos após tratamento com

a proteína APRIL, e da importância das moléculas de ECM no direcionamento

destas células ao longo da maturação (Savino et al., 2004), avaliamos a influência

de APRIL na migração orientada por fibronectina e laminina. Observamos que

APRIL pode aumentar a atividade migratória em laminina, em especial para os

timócitos CD4SP, mas que os valores de migração finais eram inferiores à soma dos

valores obtidos quando os dois estímulos eram utilizados isoladamente. Trabalhos

anteriores de nosso grupo haviam relatado uma maior resposta migratória desta

subpopulação em resposta à laminina (Smaniotto et al., 2005; Mendes-da-Cruz et

al., 2008). No entanto, com relação à fibronectina, não detectamos diferenças, em

números de células migrantes, entre o grupo tratado com APRIL e controle. Apesar

de não termos ainda uma explicação em nível molecular, é surpreendente que os

valores da resposta migratória à fibronectina em presença ou ausência de APRIL

sejam semelhantes; como se o efeito quimiorrepulsor de APRIL desaparecesse em

presença de fibronectina.

Em estudo com TNF-

α, foi descrito que o tratamento de linfócitos T humanos

com a citocina não altera a migração celular. Demonstrou-se, porém, que a

associação entre TNF-

α e fibronectina nas membranas dos insertos induz um efeito

supressor. Esta interação fornece “sinais de parada” que promovem a inibição da

migração dos linfócitos independente da alteração do perfil de expressão de

integrinas

β1 (Franzita et al., 2000). Assim, pretendemos realizar experimentos nos

quais a proteína APRIL, assim como foi feito com TNF-α, seja depositada sobre a

camada de fibronectina. Com isso, poderemos investigar uma possível interferência

na migração de timócitos em virtude de sua associação com fibronectina.

Analisamos, também, a expressão dos receptores para fibronectina, VLA-4 e

VLA-5, e laminina, VLA-6, nos timócitos após tratamento in vitro com APRIL, mas,

assim como no trabalho acima citado de Franzita e colaboradores, 2000, não

detectamos diferenças.

A interação heterotípica entre células epiteliais tímicas e timócitos é um

evento necessário à migração celular, e, da mesma maneira, é modulado por

moléculas de ECM e seus receptores (Savino et al., 2002). Deste modo, na tentativa

de compreender nossos achados nos ensaios de migração, analisamos a

participação de APRIL na adesão de timócitos a células epiteliais tímicas. Para isto,

utilizamos o método de co-cultivos de timócitos e TEC. Após 1h de tratamento dos

timócitos, verificamos que APRIL regula negativamente a adesão dos timócitos às

TEC, porém, sem alterar o perfil de expressão de receptores de ECM, VLA-4, VLA-5

e VLA-6.

Em concordância com os nossos resultados, outros trabalhos mostraram que

o tratamento de timócitos com diferentes moléculas, neuropeptídeos e hormônios,

foram capazes de reduzir a adesão de timócitos à TEC, promovendo a migração

celular no mesmo modelo utilizado neste trabalho. Galectina-3, lectina ligadora de β-

galactose, e que influencia atividade e morte de timócitos, modula a interação entre

TEC e timócitos diminuindo adesão e, também, estimula a migração, principalmente

da subpopulação de timócitos DP, após tratamento in vitro (Villa-Verde, et al. 2002;

Silva-Monteiro et al., 2007). Da mesma maneira, foi observado que semaforina-3A,

glicoproteína envolvida com o crescimento axonal no sistema nervoso apresenta

efeito quimiorrepulsor sobre timócitos humanos (Lepelletier et al., 2007). Assim,

levando-se em conta as interações celulares durante o processo de maturação

intratímica dos linfócitos T, uma modulação da migração celular pode ser resultado

da diminuição da adesão aos constituintes, celulares e acelulares, do

microambiente. Nesse contexto, é possível que o aumento da migração celular, ou

seja, a atividade quimiorrepulsora de APRIL, represente uma conseqüência da

diminuição da adesão dos timócitos às TEC.

Diante dos efeitos de APRIL na migração e adesão de timócitos, buscamos

identificar qual receptor estaria mediando estes eventos. Os dados a respeito da

expressão e atividade do receptor para APRIL em linfócitos T, TACI, entretanto,

ainda são controversos (Mackay&Schneider, 2008). Alguns trabalhos mostraram a

expressão deste receptor em linfócitos T humanos de sangue periférico (von Bülow

& Bram, 1997) e de tecido articular de pacientes com Artrite Reumatóide (Seyler et

al., 2005). Em camundongos, células TCD4

, CD8

de baço, linfonodos

mesentéricos, periféricos e de lavado peritoneal expressam TACI (Hardenberg et al.,

2008). Porém, um único trabalho acerca da presença de TACI no timo humano

mostrou somente a presença de RNAm para esta molécula (von Bulow & Bram,

1997). Através da análise por citometria de fluxo pudemos constatar que as

subpopulações de timócitos de camundongos normais não apresentavam expressão

membranar do receptor TACI, ao passo que as TEC e os linfócitos B foram positivas.

Este resultado nos levou a pensar que o efeito encontrado após tratamento de

timócitos com APRIL seria mediado por outra molécula de superfície celular.

As moléculas de HSPG foram descritas como ligantes para APRIL. Foi

observado que linhagens de células tumorais (T Jurkat, NIH-3T3 e A549) apesar de

não expressarem os receptores TACI e BCMA respondem ao tratamento com

APRIL. Estas células aumentaram a taxa de proliferação quando foram estimuladas

com a citocina in vitro. Este efeito foi abolido com o tratamento por heparina, que

compete pelos sítios de ligação com HSPG, mostrando que a colaboração entre

APRIL e HSPG pode modular a atividade celular (Henrdriks et al., 2005; Ingold et al.,

2005). Tendo em vista que os timócitos usados em nossos ensaios não expressam o

receptor TACI, e que estas células, assim como as TEC, produzem

glicosaminoglicanos, incluindo heparan-sulfatos (Britz & Hart, 1982; Werneck et al.,

1999, 2000), anteriormente descritos como receptores para APRIL, realizamos

ensaios de migração nos quais os timócitos recebiam um pré-tratamento com

heparina, e, sem seguida recebiam a solução contendo APRIL. Quando os timócitos

foram incubados previamente com heparina, observamos que a reposta migratória

retornava aos valores basais, independentemente do tratamento com APRIL. Este

resultado sugere que APRIL module a migração de timócitos via HSPG.

Contudo, ainda não foi descrito se a interação entre APRIL e HSPG é

responsável por gerar sinais intracelulares. Alguns trabalhos mostraram que esta

ligação pode auxiliar no acúmulo de APRIL na membrana plasmática, formando um

domínio rico em APRIL que auxilia na interação e ativação do receptor TACI

(Kimberley et al., 2009). Esta cooperação é importante para a atividade de linfócitos

B, em particular, para produção de anticorpos IgA (Sakurai et al., 2007). Além disso,

a interação APRIL x HSPG participa do controle da progressão do ciclo celular,

estimulando a proliferação e, ao contrário, induzindo senescência em células

tumorais quando a produção de APRIL é suprimida (Henrdriks et al., 2005; Ding et

al., 2009; Moreaux et al., 2009). Assim, apesar de não conhecermos os mecanismos

de sinalização intracelular envolvidos, os dados publicados até o momento,

juntamente com nossos resultados, indicam que APRIL possa modular a atividade

dos timócitos através da ligação com HSPG.

As sindecans são proteínas transmembranares ligadas covalentemente às

cadeias de heparan-sulfato associadas à superfície celular e à ECM (Bernfield et al.,

1999). As moléculas de sindecam-1 são expressas por células epiteliais e

plasmócitos; sindecam-2 em fibroblastos, células endoteliais, neurônios e células

musculares lisas; sindecam-3 em células do sistema nervoso e condrócitos; ao

passo que a sindecam-4 possui uma distribuição ubíqua, sendo expressa, também,

por linfócitos (

Lambaerts

et al., 2009). Estas HSPG atuam como receptores celulares

regulando a proliferação, diferenciação, adesão e migração celular. Para isto, estas

moléculas podem servir de co-receptores para fatores de crescimento e constituintes

da ECM. Podem controlar, também, a expressão de moléculas na membrana celular,

a organização do citoesqueleto e a transdução de sinais após sua ligação com

domínios de interação para heparina (heparin-binding domain, HBD) presentes nas

moléculas de ECM (Morgan et al., 2007;

Lambaerts

et al., 2009). APRIL pode ligar-se

a sindecam-1, sindecam-2 e sindecam-4 (Ingold et al., 2005), assim, é possível que

o aumento na atividade migratória dos timócitos em resposta ao tratamento com

APRIL seja mediado pela interação com estas moléculas de HSPG (Figura 5.1A).

A atividade acessória (co-receptor) das sindecans pode ser mediada pela

interação com integrinas (Bernfield et al., 1999). Foi visto que a atividade sinérgica

entre estas moléculas participa do controle da adesividade e atividade celular em

resposta às diferentes condições físico-químicas do microambiente no qual estão

inseridas (Woods & Couchman, 1999; Morgan et al., 2007). No entanto, os

mecanismos intracelulares envolvidos nesta cooperação ainda não foram

completamente identificados (Lopes et al., 2006). Foi observado, porém, que a co-

localização de sindecans e as intregrinas β-1 nos sítios membranares em

associação com ECM, como a fibronectina, é necessária para formação da “adesão

focal”, sítios de ancoragem célula-ECM ricos em receptores que participam desta

interação (Morgan et al., 2007). Neste contexto, destacam-se a sindecam-1 e

sindecam-4 que estão envolvidas com adesão e migração através da ativação de

moléculas sinalizadoras, PKC e PIP

, e proteínas do citoesqueleto, como a actina

(Simons & Horowirtz, 2001; Morgan et al., 2007;

Lambaerts

et al., 2009).

A sinalização celular através de HSPG em colaboração com integrinas nos

eventos de migração celular está envolvida com alterações no citoesqueleto. Foi

demonstrado que o aumento da expressão de sindecam-1 sustenta a adesão

mediada pela integrina α2β1 através da reorganização dos microfilamentos de actina

em células de ovário de hamster (Vuoriluoto et al., 2008). E ainda, células epiteliais

intestinais de rato transfectadas para sindecam-2 exibiram uma maior atividade

migratória in vitro em decorrência do aumento da fosforilação da proteína FAK,

evento inicial da adesão celular ao substrato, que potencializou a expressão e da

atividade da integrina α2β1(Choi et al., 2009), mostrando que HSPG e integrinas

atuam conjuntamente na adesão e migração celular, ativando proteínas

intracelulares diretamente envolvidas nestes processos. Assim, é importante

investigar se estas vias são alvo da sinalização a partir da ligação com APRIL.

A interação de timócitos com fibronectina é mediada, dentre outros

receptores, pela integrina α5β1 (VLA-5) que reconhece domínios RGD (arginina-

glicina-aspartato) na estrutura da ECM (Ruoslahti, 1996). No entanto, demonstrou-

se, que para promoção da adesão em fibronectina, é necessária além da ligação da

integrina com os domínios RGD, que ocorra a interação da sindecam com domínios

HBD da fibronectina (atividade acessória das moléculas sindecans) conforme

esquematizado na figura 5.1B. E ainda, foi visto que o tratamento com heparina

bloqueia a adesão e a migração celular, em cultura de fibroblastos humanos, frente

à fibronectina (Woods et al., 1993), mostrando, assim, que a ligação dos HSPG

presentes nas superfícies celulares aos domínios HBD da molécula de fibronectina é

necessária para adesão e migração.

Figura 5.1. Modelo de interação entre APRIL, fibronectina, laminina e HSPG. A,

APRIL pode estimular a migração de timócitos através da ligação com HSPG. Porém

os mecanismos intracelulares envolvidos, assim como na participação de HSPG

nestes eventos, são desconhecidos. B, a interação de timócitos com fibronectina é

mediada pela integrina VLA-5 (α5β1) que reconhece domínios RGD na estrutura da

molécula de ECM, em cooperação com a ligação de HSPG aos domínios HBD

durante os eventos de adesão e migração celular. APRIL pode interagir, também,

com os domínios HBD ocupando o sítio de ancoramento para moléculas de HSPG.

C, isto não é observado na migração frente à laminina, pois o sítio de ligação para o

receptor VLA-6 (α6β1) encontra-se em região distinta e independe da interação com

HBD. Desta forma, o vetor resultante (



) dos estímulos gerados pela ligação com

fibronectina e APRIL gera uma reposta menor, na atividade migratória, do que o

resultante na presença de laminina ou da quimiocina CXCL12 (D).

Neste sentido, nossos ensaios de migração nos quais os timócitos tratados

com APRIL receberam, também, o estímulo das moléculas de fibronectina ou

laminina apresentaram resultados distintos. Não foi observado um sinergismo, ou

soma dos estímulos, quando as células migravam em presença de APRIL e

fibronectina, ao passo que a resposta migratória à laminina era potencializada após

o tratamento com APRIL. Isto nos levou a pensar em uma possível interação entre

APRIL e moléculas de ECM. Utilizando a técnica de ELISA, observamos que APRIL

pode interagir com fibronectina. Estes achados sugerem que APRIL seja capaz de

ligar-se, também, à fibronectina, e assim, seria possível que a interação desta

citocina com os domínios HBD presentes na molécula de ECM ocupasse este sítio

de ancoramento da célula interferindo na migração e a adesão celular dos timócitos

(Figura 5.1B).

É importante ressaltar que os timócitos apresentam mais de um receptor para

fibronectina, dentre eles, as integrinas VLA-5 (

α5β1) e VLA-4 (α4β1) (Savino et al.,

2000). Estas duas moléculas podem ligar domínios distintos da proteína. A integrina

VLA-5, como mencionado, liga domínios RGD, ao passo que VLA-4 liga seqüências

CS-1 (Guan & Hynes, 1990; Ruoslahti 1996). Além disso, a colaboração, ou

importância, destes dois receptores na diferenciação intratímica, parece não ser

equivalente, pois os timócitos expressam e utilizam estas integrinas diferentemente

ao longo do processo de maturação (Savino et al., 2000). As células mais imaturas

expressam os receptores VLA-4 e VLA-5 em maior intensidade, utilizando,

preferencialmente, VLA-4 na migração frente à fibronectina, ao passo que as células

mais maduras utilizam o receptor VLA-4, porém, em colaboração com o VLA-5

(Crisa et al., 1996). Por exemplo, a administração de anticorpos anti-α4 inibiu em

60% a adesão de timócitos à TEC, enquanto que o tratamento com anti-α5

apresentou 21% de redução (Dalmau et al., 1999).

No entanto, mais recentemente, trabalhos de nosso grupo têm demonstrado

que, em camundongos NOD, a deficiência na expressão de VLA-5 em timócitos é

responsável por uma drástica redução da migração em resposta à fibronectina, com

acúmulo de timócitos nos espaços perivasculares. As subpopulações afetadas pela

deficiência de VLA-5 representam aproximadamente 95% da população de

timócitos. Dessa forma, a diminuição da atividade migratória de timócitos DP,

CD4SP e CD8SP, também em animais normais que receberam anti-VLA-5, reduz

em mais de 50% o número de células migrantes (Cotta-de-Almeida et al., 2004;

Mendes-da-Cruz et al., 2008). Sendo assim, a atividade do receptor VLA-4 parece

não ser suficiente para sustentar o direcionamento dos timócitos nos estágios mais

maduros de diferenciação, mostrando uma ligação e sinalização preferencial via

VLA-5 na migração destas células em resposta à fibronectina. E ainda, levando-se

em conta a cooperação entre HSPG e VLA-5 para adesão e migração celular, a

ocupação dos sítios HBD da fibronectina por APRIL pode ser capaz de interferir na

resposta migratória dos timócitos, conforme esquematizado na figura 5.1B. É

possível, então, que o efeito de APRIL observado em nossos ensaios de migração e

adesão com os timócitos seja conseqüência da interferência da interação com

fibronectina dependente de VLA-5 e HSPG, que não é resgatada pela atividade do

receptor VLA-4.

A interação entre integrinas e a molécula de laminina, ao contrário da

fibronectina que possui pequenos domínios para ligação, é dependente do arranjo

de suas cadeias. O receptor VLA-6 (

α6β1) liga o fragmento E8 do domínio globular,

o domínio ativo da proteína responsável por estimular a adesão e migração celular

(Sonnenberg et al., 1990; Goodman, 1992). O tratamento de fibroblastos humanos

com heparina não foi capaz de inibir a adesão à laminina (Hozumi et al., 2006), pois,

o domínio de ligação com heparina encontra-se em outra região, no fragmento E3,

igualmente responsável por estimular a atividade celular, porém de maneira

independente (

Yurchenco

et al., 1990; Sung et al., 1993). Desta forma, a interação via

E3 não interfere nos eventos mediados pela ligação do fragmento E8 ao receptor

VLA-6. Este dado reforça a hipótese de que o aumento da migração celular

orientada por laminina observada em timócitos tratados com APRIL seja resultado

da resposta dos dois estímulos, APRIL e laminina, pois APRIL não compete pelo

sítio de ligação à heparina desta molécula de ECM (Figura 5.1C). Não entanto, ainda

não sabemos porque a resposta aos dois estímulos simultâneos apresenta valores

inferiores à soma das respostas obtidas com cada estímulos individualmente.

A respeito da resposta migratória de timócitos tratados frente ao estímulo

quimioatraente da molécula CXCL12, é possível que o efeito quimiorrepulsor de

APRIL seja sobrepujado diante da potência desta quimiocina (Figura 5.1D). As

quimiocinas podem ativar diferentes vias de transdução de sinais intracelulares que

podem controlar a afinidade e atividade das integrinas e, também, regular mudanças

no citoesqueleto, modulando a polaridade celular e, conseqüentemente, a atividade

migratória (Kinashi, 2007). A migração de timócitos ao longo do processo de

diferenciação é conduzida por diferentes quimiocinas que são expressas no timo.

Através dos ensaios de migração ex vivo foi possível observar que as quimiocinas

CXCL12 e CCL19, por exemplo, são capazes de aumentar a migração direcionada

por moléculas de ECM (Savino et al., 2003; Savino et al., 2004).

Um único estudo acerca deste tema revelou, por outro lado, que APRIL não é

capaz de estimular a migração de linfócitos B maduros, nem de modular a resposta

quimiotática frente às quimiocinas CCL21, CXCL12 e CXCL13. BAFF, outro membro

da família TNF, ao contrário, aumenta a atividade migratória destas células nestas

condições (Badr et al., 2008). E ainda, amostras de timo de pacientes com MG que,

conforme mencionado anteriormente, são positivas para expressão das citocinas

APRIL e BAFF (Thangarajh et al., 2006), apresentam, também, aumento da

produção de CXCL13 (Meraouna et al., 2006). Com isso, o acúmulo das citocinas

CXCL13 e BAFF, e não de APRIL, pode contribuir para o recrutamento e criação de

um nicho intratímico favorável para a atividade de linfócitos B produtores de auto-

anticorpos.

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Este trabalho teve como objetivo avaliar o impacto do tratamento com a

proteína APRIL na migração de timócitos murinos in vitro. Nossos resultados

sugerem que APRIL não module a sobrevivência, nem proliferação, de timócitos,

mas seja capaz de estimular a atividade migratória destas células apresentando

efeito quimiorrepulsor, possivelmente, em conseqüência da diminuição da adesão

celular através da interação com HSPG, um ligante recentemente descrito para

APRIL e que está envolvido com adesão e migração celular.

Para maior compreensão dos resultados aqui alcançados, e, buscando

avançar nos estudos do efeito de APRIL no microambiente tímico e na atividade dos

timócitos, pretendemos inicialmente definir em camundongos normais que células no

timo produzem APRIL constitutivamente. Além disso, é nossa intenção saber quais

efeitos APRIL pode exercer sobre células epiteliais tímicas, as quais expressam

constitutivamente o receptor TACI.

Por outro lado pretendemos repetir uma série de experimentos mencionados

no corpo desta dissertação, mas agora sobre timócitos e células epiteliais tímicas de

camundongos transgênicos para APRIL, já disponíveis em nossa Instituição.

7. BIBLIOGRAFIA

Aggarwal B B. Signalling Pathways of TNF Superfamily: a doubled-edged sword.

(2003). Nat Rev Immunol, 3, 745-756.

Akashi K, Richie LI, Miyamoto T, Carr WH & Weissman IL. B Lymphopoiesis in the

thymus. (2000). J Immunol, 164, 5221-6.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Roberts K &Walter P. Biologia Molecular da Célula. 4

edição (Artmed), 2004.

Alves NL, Goff OR, Huntington ND, Sousa AP, Ribeiro VS, Bordack A, Vives FL,

Peduto L, Chidgey A, Cumano A, Boyd R, Eberl G & Di Santo JP.

Characterization of the thymic IL-7 niche in vivo. (2009). Proc Natl Acad Sci

USA, 106,1512-7.

Amarantes-Mendes JGP, Chammas R, Abrahamsohn P, Patel PC, Potworowski EF

& Macedo MS. Cloning of a thymic stromal cell capable of protecting

thymocytes from apoptosis. (1995). Cell Immunol, 161, 173-80.

Aringer M & Smolen J. The role of tumor necrosis factor-alpha in systemic lupus

erythematosus. (2008). Arthritis Research & Therapy, 10, 202-10.

Ayres-Martins S, Lannes-Vieira J, Farias-de-Oliveira DA, Brito JM, Villa-Verde DMS

& Savino W. Phagocytic cells of the thymic reticulum interact with thymocytes

via extracellular matrix ligands and receptors. (2004). Cell Immunol, 229, 21–

30.

Badr G, Borhis G, Lefevre EA, Chaoul N, Deshayes F, Dessirier V, Lapree G, Tsapis

A & Richard Y. BAFF enhances chemotaxis of primary human B cells: a

particular synergy between BAFF and CXCL13 on memory B cells. (2008).

Blood, 111, 2744-54.

Baker SJ & Reddy EP. Modulation of life and death by TNF receptor superpfamily.

(1998). Oncogene, 17, 3261-70.

Belnoue E, Pihlgren M, McGaha TL, Tougne C, Rochat. AF, Bossen C, Schneider P,

Huard B, Lambert PB & Siegrist CA. APRIL is critical for plasmablast survival

in the bone marrow and poorly expressed by early life bone marrow stromal

cells. (2008). Blood, 111, 2755-64.

Bernfield M, Götte M, Park PW, Reizes O, Fitzgerald ML, Lincecum J & Zako M.

Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycan sulfate proteoglycans.

(1999). Annu. Rev. Biochem, 68, 729-77.

Berrih S, Savino W & and Cohen S. Extracellular matrix of the human cultured

epithelial cells. (1985). J Histochem Cytochem, 7, 655-664.

Blackburn CC, Manley NR, Palmer DB, Boyd RL, Anderson G & Ritter MA. One for

all and all for one: thymic epithelial stem cells and regeneration. (2002).

Trends Immunol, 8, 391-5.

Bradley JR. TNF-mediated inflammatory disease. (2008). J Pathol, 214, 149-60.

Britz JS & Hart GW. Biosynthesis of glycosaminoglycans by epithelial and

lymphocytic components of murine thymus. (1982). J Immunol, 130, 1848-

55.

Castigli E, Scott S, Dedeoglu F, Bryce P, Jabara H, Bhan AK, Mizoguchi E & Geha

RS. Impaired IgA class switching in APRIL-deficient mice. (2004). Proc Natl

Acad Sci USA, 101, 3903-8.

Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, Green S, Fiori N & Williamsom B. An endotoxin-

induced serum factor that causes necrosis tumors. (1975). Proc Natl Acad

Sc. USA, 72, 3666-70.

Choi S, Kim Y, Park H, Han IO, Chung E, Lee SY, Kim YB, Lee JW, Oh ES & Yi JY.

Syndecan-2 overexpression regulates adhesion and migration through

cooperation with integrin α2. (2009). Biochem Biophys Res Commun, 384,

321-5.

Ciofani M & Zuniga-Pflucker JC. The thymus as an inductive site for T lymphopoiesis.

(2007). Annu Rev Cell Dev Biol, 23,463–93.

Clark IA. How TNF was recognized as a key mechanism of disease. (2007). Cytokine

Growth Factor Rev, 18, 335-43.

Cotta-de-Almeida V, Bonomo A, Mendes-da-Cruz D, Riederer I, de Meis J, Lima-

Quaresma KRF, Vieira-de-Abreu A, Villa-Verde DMS & Savino S.

Trypanossoma cruzi infection modulates intrathymic contents of extracellular

matrix ligands and receptors and alters thymocyte migration. (2003). Eur J

Immunol, 33, 2439-48.

Cotta-de-Almeida V, Villa-Verde DM, Lepault F, Pléau JM, Dardenne M & Savino W.

Impaired migration of NOD mouse thymocytes: a fibronectin receptor-related

defect. (2004). Eur J immunol, 34, 1578-87.

Crisa L, Cirulli V, Ellisman M, Ishii JK, Elices MJ & Salomon DR. Cell adhesion and

migration are regulated at distinct stages of thymic T cell development: the

roles of fibronectina, VLA4 and VLA5. (1996). J Exp Med, 184, 215-28.

Crivellato E, Vacca A & Ribatti D. Settings the stage: na anatomist´s view of the

immune system. (2004). Trends Immunol, 25, 210-7.

Crompton T, Outram SV, Hager-Theodorides AL. Sonic hedgehog signalling in T-cell

development and activation. (2007). Nat Rev Immunol, 9, 726-35.

Dalmau SR, Freitas CS & Savino W. Upregulated expression of fibronectin receptors

underlines the adhesive capability of thymocytes to thymic epithelial cells

during the early stages of differentiation: lessons from sublethally irradiated

mice. (1999). Blood, 93, 974-90.

Dardenne M, Smaniotto S, Mello-Coelho V, Villa-Verde DMS & Savino W. Growth

hormone modulates migration of developing T cells (2009).

Neuroimmunomodulation, 1153, 1-5.

DeVoss J, Hou Y, Johannes K, Lu W, Liou GI, Rinn J, Chang H, Caspi R, Fong L &

Anderson MS. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of

a single self-antigen. (2006). J Exp Med, 12, 2727–35.

Dillon SR, Gross JA, Ansell SM & Novak AJ. An APRIL to remember: novel TNF

ligands as therapeutic targets. (2006). Nat Rev Drug Discov, 5, 235-46.

Ding W, Ju S, Jiang S, Zhu L, Wang Y & Wang H. Reduced APRIL expression

induces cellular senescence via HSPG-dependent pathway. (2009). Pathol

Oncol Res. [Epub ahead of print]

Elia CCS & Souza HSP. Imunologia da Mucosa Intestinal da Bancada ao Leito

(Editora Atheneu), 2001.

Endo T, Nishio M, Enzler T, Cottam HB, Fukuda T, James DF, Karin M & Kipps TJ.

BAFF and APRIL support chronic lymphocytic leukemia B-cell survival

through activation of the canonical NF-kappaB pathway. (2007). Blood, 109,

703-&10.

Firestein FG. Envolving concepts of rheumatoid arthritis. (2003). Nature, 15, 356-61.

Flores KG, Li J & Hale LP. B Cells in epithelial and perivascular compartmens of

human adult thymus. (2001). Hum Pathol, 32, 926-34.

Franzita S, Hershkoviz R, Kam N, Lichtenstein N, Vaday GG, Alon R & Lider O. TNF-

α associated with extracellular matrix fibronectin provides a stop sinal for

chemotactically migrating T cells. (2000). J Immunol, 165, 2738-47.

Godfrey DI, Kennedy J, Suda T & Zlotnik A. Developmental pathway involving four

phenotypically and functionally distinct subsets of CD3-CD4-CD8- triple-

negative adult mouse thymocytes defined by CD44 and CD25 expression.

(1993). J Immunol, 150, 4244-52.

Goodman SL.

α6β1 Integrin and laminin E8: An increasingly complex simple story.

(1992). Kidney International, 41, 650-6.

Guan JL & Hynes RO. Lymphoid cells recognize an alternatively spliced segment of

fibronectin via the integrin receptor α4β1. (1990). Cell, 60, 53-61.

Guan ZB, Shui Y & Zhang SQ. Two related ligands of the TNF family, BAFF and

APRIL, in rabbit: molecular cloning, 3D modeling, and tissue distribution.

(2007). Cytokine, 39, 192–200.

Hahne M, Kataoka T, Schröter M, Hofman K, Irmler M, Bodmer Jean-Luc, Schneider

P, Bornand T, Holler N, French EL, Sordat B, Rimoldi D & Tschopp J. APRIL,

a new ligand of the tumor necrosis family, stimulates tumor cell growth.

(1998). J Exp Med, 188, 1185-1190.

Haiat S, Billard C, Quiney C, Ajchenbaum-Cymbalista F & Kolb JP. Role of BAFF and

APRIL in human B-cell chronic lymphocytic leukaemia. (2006). Immunology,

118, 281-92.

Hardenberg G, Fernandez L, Hendriks J, Chebil K, Jacquet C, Sitbon M, Hahne M &

Medema JP. APRIL facilitates viral-induced erythroleukemia but is

dispensable for T cell immunity and lymphomagenesis. (2008). J Leukoc Biol,

84, 1-9.

Harman BC, Jenkinson EJ & Anderson G. Entry into the thymic microenvironment

triggers notch activation in the earliest migrant T cell progenitors. (2003). J

Immunol, 170, 1299–1303.

Hare KJ, Jenkinson EJ & Anderson G. An Essential Role for the IL-7 receptor during

intrathymic expansion of the positively selected neonatal T cell repertoire.

(2000). J Immunol, 165, 2410–4.

Hatzoglou A, Roussel J, Bourgeade MF, Rogier E, Madry C, Inoue J, Devergne O &

Tsapis A. TNF receptor family member BCMA (B cell maturation) associates

with TNF receptor-associated factor (TRAF) 1, TRAF2, and TRAF3 and

activates NF-kappa B, elk-1, c-Jun N-terminal kinase, and p38 mitogen-

activated protein kinase. (2000). J Immunol, 165,1322-30

He B, Chandburn A, Jou E, Schattner EJ, Knowles DM & Cerutti A. Lymphoma B

cells evade apoptosis through the TNF family members BAFF/BLyS and

APRIL. (2004). J Immunol, 172, 3268-79.

Hehlgans T & Pfeffer K. The intriguing biology of the tumor necrosis factor/tumor

necrosis factor receptor superfamily: palyers, rules and the games. (2005).

Immunology, 115, 1-20.

Hendriks J, Planelles L, Jong-Odding J, Hardenberg G, Pals ST, Hahne M,

Spaargaren M & Medema JP. Heparan sulfate proteoglycan binding

promotes APRIL-induced tumor cell proliferation. (2005). Cell Death Differ,

12, 637-48.

Hill ME, Shiono H, Newsom-Davis J &Willcox N. The myasthenia gravis thymus: a

rare source of human autoantibody-secreting plasma cells for testing

potential therapeutics. (2008). J Neuroimmunol, 15, 50-56.

Hozumi K, Suzuki N, Nilsen PK, Nomizu M & Yamada Y. Laminin

α1 chain LG4

module promotes cell attachment through syndecans and cell spreading

through integrin α2β1. (2006). J Biol Chem, 281, 32929-40.

Inaba M, Inaba K, Hosono M, Ishida T, Muramatsu S, Masuda T & Ikehara S.

Distintic mechanisms of neonatal tolerance induced by dendritic cells and

thymic B cells. (1991). J Exp Med, 173, 549-59.

Ingold K, Zumsteg A, Tardivel A, Huard B, Steiner QG, Cachero TG, Qiang F, Gorelik

L, Kalled SL, Acha-Orbea H, Rennert PD, Tschopp T & Schneider P.

Identification of proteoglycans as the APRIL-specific binding partners. (2005).

J Exp Med, 201, 1375-83.

Ishikawa S, Sato T, Abe M, Nagai S, Onai N, Yoneyama H, Zhang YY, Suzuki T &

Hashimoto Shin-ichi. Aberrant high expression of B lymphocyte chemokine

(BLC/CXCL13) by C11b-CD11c dendritic cells in murine lupus and

preferential chemotaxis of B1 cells yowards BLC. (2001). J Exp Med,

193,1393–1402.

Ito T, Ishikawa S, Sato T, Akadegawa K, Yurino H, Kitabatake M, Hontsu S, Ezaki T,

Kimura H & Matsushima K. Defective B1 cell homing to the peritoneal cavity

and preferential recruitment of B1 cells in the target organs in a murine model

for Systemic Lupus Erythematosus.(2004). J Immunol, 172, 3628–34.

Itoh T, Nakamura M, Yagi H, Soga H, Doi H, Koja S, Nanno M, Suzuki R, Satomi S,

Kasahara S. Establishment of a mouse thymic epithelial cell line, IT-76MHC

and a brief review on cultured thymic epithelial cells. (2001). Cell Mol Biol,

47,1-18.

Josson MV, Szodoray P, Jellestad T, Josson R & Skarstein K. Association between

circulating levels of the novel TNF family members APRIL and BAFF and

lymphoid organization in primary Sjogren’s Syndrome. (2005). J Clin

Immunol, 25, 189-201.

Keffer J, Probert L, Cazlaris H, Georgopoulos S, Kaslaris E, Kioussis M & Kollias G.

Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor: a predictive

genetic model of arthritis. (1991). EMBO J, 10, 4025-31.

Kern C, Cornuel JF, Bilard C, Tang R, Rouillard D, Stenou V, Defrance T,

Ajchenbaum-Cymbalista F, Simonin PY, Feldblum S & Kolb JP. Involvement

of BAFF and APRIL in the resistence to apoptosis of B-CLL through an

autocrine pathway. (2004). Blood, 103, 679-88.

Kimberley F, Hahne M & Medema JP. “APRIL Hath Put a Spring of Youth in

Everything”: Relevance of APRIL for survival. (2008). J Cell Physiol, 218, 1–

Kimberley F, van Bostelen L, Cameron K, Hardenberg G, Marquart JA, Hahne M &

Medema JP. The proteoglycan (heparan sulphate proteoglycan) binding

domain of APRIL serves as a platform for lingand multimerization and cross-

linking. (2009). FASEB J, 23, 1584-95.

Kinashi T. Integrin regulation of lymphocyte trafficking: lessons from structural and

signaling studies. (2007). Adv Immunol, 93, 185-227.

Klug DB, Carter C, Crouch E, Roop D, Conti CJ & Richie ER. Interdependence of

cortical thymic epithelial cell differentiation an T-lineag commitment. (1998).

Proc Natl Acad Sci USA, 97, 11822-7.

Kollias G & Kontoyiannis D. Role of TNF/TNFR in autoimmunity: specific TNF

receptor blockade may be advantageous to anti-TNF treatments. (2002).

Cytokine Growth Factor Rev, 13, 315-21.

Kontoyiannis D, Pasparakis M, Pizarro TT, Cominelli F & Kollias G. Impaired On/Off

regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-Rich elements:

implications for joint and gut-associated immunopathologies. (1999).

Immunity, 10, 387–98.

Koyama T, Tsukamoto H, Masumoto K, Himeji D, Hayashi K, Harada M & Horiuchi T.

A novel polymorphism of the human APRIL gene is associated with systemic

lupus erythematosus. (2004). Rheumatology, 42, 980-5.

Kyewski B & Derbinski J. Self representation in the thymus: an extended view.

(2004). Nat Rev Immunol, 4, 688-98.

Lambaerts K, Wilcox-Aldeman SA & Zimmermann P. The signaling mechanisms of

syndecan heparan sulphate proteoglycans. (2009). Cur Opin Cell Biol, 21, 1-

Lannes-Vieira J, Dardenne M & Savino W. Extracellular matrix components of the

mouse thymus microenvironment: ontogenetic studies and modulation by

glucocorticoid hormones. (1991). J Histochem Cytochem, 11, 1539-46.

Lepelletier Y, Smaniotto S, Hadj-Slimane R, Villa-Verde DMS. Nogueira AC,

Dardenne M, Hermine O & Savino W. Control of human thymocyte migration

by Neuropilin-1/Semaphorin-3A-mediated interactions. (2007). Proc Nat Acad

Sci USA, 104, 5545–50.

Lopes CC, Dietrich CP & Nader HB. Specific structural features of syndecans and

heparan sulfate chains are needed for cell signaling. (2006). Braz J Med Biol

Res, 39, 157-67.

Lopez-Fraga M, Fernández R, Albar JP & Hahne M. Biologically active APRIL is

secreted following intracellular processing in the Golgi apparatus by furin

convertase. (2001). EMBO J, 2, 945-54.

Mackay F, Woodcock SA, Lawton P, Ambrose C, Baetscher M, Schneider P,

Tschopp J & Browning JL. Mice transgenic for BAFF develop lymphocytic

disorders along with autoimmune manifestations. (1999). J Exp Med, 190,

1697-710.

Mackay F, Schneider P, Rennert P & Browning JL. BAFF and APRIL: A tutorial in B

cell survival. (2002). Annu Rev Immunol, 21, 231-64.

Mackay F and Tangye SG. The role of the BAFF/APRIL system in B cell homeostasis

and lymphoid cancers. (2004). Curr Opin Pharmacol, 4, 347–54.

Mackay F & Leung H. The role of the BAFF/APRIL system on T cell function. (2006).

Semin Immunol, 18, 284–9.

Mackay F, Silveira PA & Brink R. B cells and BAFF/APRIL axis: fast-foward on

autoimmunity and signaling. (2007). Curr Opin Immunol, 19, 327-36.

Mackay F & Schneider P. TACI, an enigmatic BAFF/APRIL receptor, with new

unappreciated biochemical and biological properties. (2008). Cytokines

Growth Factor Rev, 19, 263-76.

Marsters SA, Yan M, Pitti RM, Haas PE, Dixit VM & Ashkenazi A. Interaction of the

TNF homologues BLyS and APRIL with the TNF receptor homologues BCMA

and TACI. (2000). Curr Biol, 10, 785-8.

McCaughtry TM, Wilken MS & Hogquist KA. Thymic emigration revisited. (2007). The

J Exp Med, 204, 2513-20.

Meireles de Souza LR, Trajano V & Savino W. Is There an interspecific diversity of

the thymic microenvironment? (1993). Dev Immunol, 3, 123-35.

Mendes-da-Cruz DA, Smaniotto S, Keller AC, Dardenne M & Savino W.

Multivectorial abnormal cell migration in the NOD mouse thymus. (2008). J

Immunol, 180, 4639–47.

Mendes-da-Cruz DA, Lepelletier Y, Brignier AC, Smaniotto S, Renand A, Milpied P,

Dardenne M, Hermine O & Savino W. Neuropilins, Semaphorins, and their

role in thymocyte development. (2009). Neuroimmunomodulation, 1153, 20-

Meraouna A, Cizeron-Clairac G, Le Panse R, Bismuth J, Truffault F, Tallaksen C &

Berrih-Aknin S. The chemokine CXCL13 is a key molecule in autoimmune

myasthenia gravis. (2006). Blood, 108, 432-40.

Mhawech-Fauceglia P, Kaya G, Sauter G, Mckee T, Donze O, Schwaller J & Huard

B. The source of APRIL up-regulation in human solid tumor lesions. (2006). J

Leukoc Biol, 80, 697-704.

Miyama-Inaba M, Kuma S., Inaba K, Ogata H, Iwai H, Yasumizu R, Muramatsu S,

Steinman RM & Ikehara S. Unusual phenotype of B cells in the thymus of

normal mice. (1988). J Exp Med, 168, 811-6.

Moreaux J, Sprinsky AC, Dillon SR, Mahtouk K, Jourdan M, Ythier A, Moine P,

Robbert N, Jourdan E, Rossi JF & Klein B. APRIL and TACI interact with

syndecan-1 on the surface of multiple myeloma cells to form an essencial

survival loop. (2009). Eur J Haematol, 83, 119-29.

Morel J, Roubille C, Planelles L, Rocha C, Fernandez L, Lukas C, Hahne M & Combe

B. Serum levels of tumour necrosis factor family members a proliferation-

inducing ligand (APRIL) and B lymphocyte stimulator (BLyS) are inversely

correlated in systemic lupus erythematosus. (2009). Ann Rheum Dis, 68,

997-1002.

Morgan MR, Humphries MJ & Bass MD. Synergistic control of cell adhesion by

integrinas and syndecans. (2007). Nat Rev Immunol, 8, 957-69.

Mori SI, Inaba M, Sugihara A, Taketani S, Doi H, Fukuba Y, Yamamoto Y, Adachi Y,

Inaba K, Fukuhara S & Ikehara S. Presence of B cell progenitors in the

thymus. (1997). J Immunol, 158, 4193-9.

Muegge K, Vila MP & Durum SK. Interleukin-7: A cofactor for V(D)J rearrangement of

the T cell receptor P gene. (1993). Science, 261, 93-5.

Mukhopadhyay A, Ni J, Zhai Y, Yu GL & Aggarwal BB. Identification and

characterization of a novel cytokine, THANK, a TNF homologue that

activates apoptosis, nuclear factor-kappaB, and c-Jun NH2-terminal kinase.

(1999). J Biol Cel

, 274, 15978-81.

Murphy K, Travers P & Walport M. Immunobiology. 7

edição (Garland Science),

2008.

Nishio M, Endo T, Tsukada N, Ohata J, Kitada S, Reed JC, Zvaifler NJ & Kipps TJ.

Nurselike cells express BAFF and APRIL, which can promote survival of

chronic lymphocytic leukemia cells via a paracrine pathway distinct from that

of SDF-1

α. (2005). Blood, 106, 1012-20.

Paessens LC, Fluitsma DM & van Kooyk Y. Haematopoietic antigen-presenting cells

in the human thymic cortex: evidence for a role in selection and removal of

apoptotic thymocytes. (2008). J Pathol, 214, 96-103.

Pearse G. Normal structure, function and histology of the thymus. (2006). Toxicol

Pathol, 34, 504-14.

Petrie TH & Zúñia-Pflucker JC. Zoned Out: Functional Mapping of Stromal Signaling

Microenviroments in the Thymus. (2007). Annu Rev Immunol, 25, 649-79.

Planelles L, Carvalho-Pinto CE, Hardenberg G, Smaniotto S, Savino W, Gómez-Caro

R, Alvarez-Mon M, Jong J, Eldering E, Martínez-A C, Medema JP & Hanhe

M. APRIL promotes B-1 cell-associated neoplasm. (2004). Cancer cell, 6,

399-408.

Planelles L, Castillo-Gutiérrez S, Medema JP, Morales-Luque A, Merle-Béral H &

Hahne M. APRIL but not BLyS serum levels are increased in chronic

lymphocytic leukemia: prognostic relevance of APRIL for survival. (2007).

Haematologica, 92, 1284-5.

Plotkin J, Prockop SE, Lepique A & Petrie HT. Critical Role for CXCR4 Signaling in

progenitor localization and T cell differentiation in the postnatal thymus.

(2003). J Immunol, 171, 4521–7.

Proietto AI, van Dommelen S & Wu L.The impact of circulating dendritic cells on the

development and differentiation of thymocytes. (2009). Immunol Cell Biol, 87,

39–45.

Rennert P, Schneider P, Cachero TG, Thompson J, Trabach L, Hertig S, Holler N,

Qian F, Mullen C, Strauch K, Browning JL, Ambrose C & Tschopp J. A

soluble form of B cell maturation antigen, a receptor for the tumor necrosis

factor family member APRIL, inhibits tumor cell growth. (2000). J Exp Med,

192, 1677-84.

Ribeiro-Carvalho MM, Farias-de-Oliveira DA, Villa-Verde DMS & Savino W.

Triiodothyronine modulates extracellular matrix-mediated interactions

between thymocytes and thymic microenvironmental cells. (2002)

Neuroimmunomodulation, 10, 142-54.

Ribeiro-Carvalho MM, Lima-Quaresma KRF, Mouço T, Carvalho VF, Mello-Coelho V,

& Savino W. Triiodothyronine modulates thymocyte migration. (2007). Scand

J Immunol, 66, 17–25.

Robbins SL, Cotran RS, Kumar V, Abbas AK & Fausto N. Patologia: Bases

Patológicas das Doenças. 7

edição (Elsevier), 2005.

Roth W, Wagenknecht B, Klumpp A, Naumann M, Hahne M, Tschopp J & Weller M.

APRIL, a new member of tumor necrosis factor family, modulates death

ligand-induced apoptosis. (2001). Cell Death Differ, 8, 403-10.

Ruoslahti E. RGD and other recognition sequences for integrins. (1996). Annu Rev

Cell Dev Biol, 12, 697–71.

Saint-Ruf C, Ungewiss K, Groettrup M, Bruno L, Hans Fehling J & von Boehmer H.

Analysis and expression of a cloned pre-T cell receptor gene. (1994).

Science, 266, 1208-12.

Sakurai D, Hase H, Kanno Y, Kojima H, Okumura K & Kobata T. TACI regulates IgA

production by APRIL in collaboration with HSPG. Blood, 109, 2961-7.

Sands BE, Anderson FH, Bernstein CN, Chey WY, Feagan BG, Fedorak RN, Kamm

MA, Korzenik JR, Lashner BA, Onken JE, Rachmilewitz D, Rutgeerts P, Wild

G, Wolf DC, Marsters PA, Travers SB, Blank MA & van Deventer SJ.

Infliximab maintenance therapy for fistulizing Crohn’s Disease. (2004). N

Engl J Med, 350, 876-85.

Savino W. & Dardenne M. Neuroendocrine control of thymus physiology.(2000).

Endocrine Rev, 21, 412-44.

Savino W, Dalmau SR & Cotta-de-Almeida V. Role of extracellular matrix-mediated

interactions in thymocyte migration. (2000). Develop Immunol,7, 279-91.

Savino W, Mendes-Da-Cruz DA, Silva JS, Dardenne M & Cotta-De-Almeida V.

Intrathymic T-cell migration: a combinatorial interplay of extracellular matrix

and chemokines? (2002). Trends Immunol, 26, 305-13.

Savino W., Ayres Martins M, Neves-dos-Santos S, Smaniotto S, Ocampo JSP,

Mendes-da-Cruz DA, Terra-Granado E, Kusmenok O & Villa-Verde DMS.

Thymocyte migration: na affair of multiple cellular interaction? (2003). Braz J

Med Biol Res, 36, 1015-25.

Savino W, Mendes-da-Cruz DA, Smaniotto S, Silva-Monteiro E, Villa-Verde DMS.

Molecular mechanisms governing thymocytes migration: combined role of

chemokines and extracellular matrix. (2004). J Leukoc Biol, 75, 951-61.

Savino W. The thymus is a common target organ in infectious diseases. (2006).

PLoS Pathog, 2, 472-83.

Savino W. Neuroendocrine control of Tcell development in mammals: role of growth

hormone in modulating thymocyte migration. (2007). Exp Physiol, 92, 813-7.

Schmitt TM, Ciofani M, Petrie HT & Zúñiga-Pflücker JC. Maintenance of T cell

specification and differentiation requires recurrent Notch Receptor–Ligand

Interactions. (2004). J Exp Med, 16, 469–79.

Schwaller J, Schneider P, Mhawech-Fauceglia P, McKee T, Myit S, Matthes T,

Tschopp J, Donze O, Le Gal FA & Huard B. Neutrophil-derived APRIL

concentrated in tumor lesions by proteoglycans correlates with human B-cell

lymphoma aggressiveness. (2007). Blood, 109, 331-8.

Seyler TM, Park YW, Takemura S, Bram RJ, Kurtin PJ, Goronzy JJ & Weyand CM.

BLyS and APRIL in rheumatoid arthritis. (2005). J Clin Invest, 115, 3083–92.

Shui Y, Guan ZB, Zhang JX & Zhang XQ. cDNA cloning, genomic structure,

expression analysis and biological activity of porcine A Proliferation-Inducing

Ligand (APRIL). (2008). Vet Immunol Immunopathol, 125,190–7.

Silva-Monteiro E, Lorenzato LR, Nihei OK, Junqueira M, Rabinovich G, Hsu DK, Liu

FT, Savino W, Chammas R & Villa-Verde DMS. Altered expression of

galectin-3 induces cortical thymocyte depletion and premature exit of

immature thymocytes during Trypanossoma cruzi infection. (2007). Am J

Pathol, 170, 546-556.

Simons M & Horowitz A. Syndecan-4-mediated signaling. (2001). Cell Signal, 13,

855– 62.

Smaniotto S, de Mello-Coelho V, Villa-Verde DM, Pléau JM, Postel-Vinay MC,

Dardenne M & Savino W. Growth hormone modulates thymocyte

development in vivo through a combined action of laminin and CXC

chemokine ligand 12. (2005). Endocrinology, 146, 3005-17.

Sonnenberg A, Linders CJ, Modderman PW, Damsky CM, Aumailley M & Timpl R.

Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8)

and evidence that

α6β1 but not α6β4 functions as a major receptor for

fragment E8. (1990). J Cell Biol, 110, 2145-55.

Stein JV, López-Fraga M, Elustondo FA, Carvalho-Pinto CE, Rodrígues D, Gómez-

Caro R, Jong J, Martínez-A C, Medema JP & Hanhe M. APRIL modulates B

and T cell immunity. (2002). J Clin Invest, 109, 1587-98.

Stohl W, Metyas S, Tan SM, Cheema GS, Oamar B, Roschke V, Wu Y, Baker KP &

Hilbert DM. levels and serological and clinical disease activity in Inverse

association between circulating APRIL patients with systemic lupus

erythematosus. (2004). Ann Rheum Dis, 63;1096-103.

Sung U, O'Rear JJ & Yurchenco PD. Cell and heparin binding in the distal long arm

of laminin: identification of active and cryptic sites with recombinant and

hybrid glycoprotein. (1993). J Cell Biol, 123, 1255-68.

Szlosarek P, Charles KA & Balkwill FR. Tumour necrosis factor-a as a tumour

promoter. (2006). Eur J Cancer, 42, 745 –50.

Takahama Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development

and selection. (2006). Nat Rev Immunol, 6, 127-35.

Terra-Granado E, Berbert LR, de Meis J, Nomizo R, Martins VR, Savino W & Silva-

Barbosa SD. Is there a role for cellular príon protein in intrathymic T cell

differentiation and migration ? (2007). Neuroimmunomodulation, 14, 213-9.

Thangarajh M, Masterman T, Helgeland L, Rot U, Jonsson MV, Eide GE, Pirskanen

R, Hillert J & Jonsson R. The thymus is a source of B-cell-survival factors–

APRIL and BAFF–in myasthenia gravis. (2006). J Neuroimmunol, 178, 161–

Ueno T, Saito F, Gray DHD, Kuse S, Hieshima K, Nakano H, Kakiuchi T, Lipp M,

Boyd RL & Takahama Y. CCR7 Signals are essential for cortex–medulla

migration of developing thymocytes. (2007). J Exp Med, 16, 493–505.

Varfolomeev E, Kischkel F, Martin F, Seshasayee D, Wang H, Lawrence DA, Olsson

C, Tom L, Erickson S, Frech D, Schow P, Iqbal SG & Ashkenazi A. APRIL-

defficient mice have normal immune system. (2004). Mol Cell Biol, 24, 997-

1006.

Villa-Verde DMS, Mello-Coelho V, Lagrota-Candido JM, Chammas R & Savino W.

The thymic nurse cell complex: an in vitro model for extracellular matrix-

mediated intrathymic T cell migration. (1995). Braz J Med Biol Res, 28, 907-

912.

Villa-Verde DM, Silva-Monteiro E, Jasiulionis MG, Farias-De-Oliveira DA, Brentani

RR, Savino W & Chammas R. Galectin-3 modulates carbohydrate-dependent

thymocyte interactions with the thymic microenvironment. (2002). Eur J

Immunol, 32, 1432-44.

von Bülow GU & Bram RJ. NF-AT activation induced by CAML-Interacting member of

the tumor necrosis factor receptor superfamily. (1997). Science, 278, 138-

141.

von Freeden-Jeffry U, Vieira P, Lucian LA, McNeil T, Burdach SE & Murray R.

Lymphopenia in interleukin (IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as a

nonredundant cytokine. (1995). J Exp Med, 181, 1519-26.

Vuoriluoto K, Jokinenc J, Kallioa K, Salmivirtab M, Heinoc J & Ivaska J. Syndecan-1

supports integrin

α2β1-mediated adhesion to collagen. (2008). Exp Cell

Res,314, 3369-81.

Wakimoto T, Tomisaka R, Nishikawa Y, Sato H, Yoshino T & Takahashi K.

Identification and characterization of human thymic cortical dendritic

macrophages that may act as professional scavengers of apoptotic

thymocytes. (2008). Immunobiology,213, 837–47.

Wallweber HJA, Compaan DM, Starovasnik MA & Hymowitz SG. The crystal

structure of A proliferation-inducing ligand, APRIL. (2004). J Mol Biol, 343,

283–90.

Wang H, Marsters SA, Baker T, Chan B, Lee WP, Fu L, Tumas D, Yan M, Dixit VM,

Ashkenazi A & Grewal IS. TACI-ligand interactions are required for T cell

activation and collageninduced arthritis in mice. (2001). Nat Immunol, 2, 632-

Wang SL, Cai YF, Lin QP, Sheng XL, Shui Y & Zhang SQ. Molecular cloning, in vitro

expression and bioactivity of dog A proliferation-inducing ligand (APRIL).

(2009). Vet Immunol Immunopathol, 128, 407–12.

Watanabe N, Wang YH, Lee HK, Ito H, Wang YH, Cao W & Liu YJ. Hassall’s

corpuscles instruct dendritic cells to induce CD41CD251 regulatory T cells in

human thymus. (2005). Nature, 436, 1181-5.

Wekerle H & Ketelsen UP. Thymic nurse cells Ia-bearing epithelium involved in T-

lymphocyte differentiation? (1980). Nature, 283, 402-4.

Werneck CC, Oliveira-Dos-Santos AJ, Silva LC, Villa-Verde DM, Savino W & Mourão

PA. Thymic epithelial cells synthesize a heparan sulfate with a highly sulfated

region. (1999). J Cell Physiol, 78, 51-62.

Werneck CC, Cruz MS, Silva LC, Villa-Verde DM, Savino W & Mourão PA. Is there a

glycosaminoglycan-related heterogeneity of the thymic epithelium? (2000). J

Cell Physiol,185, 68-79.

Wildin RS, Wang HU, Forbush KA & Perlmutter RM. Functional dissection of the

murine lck distal promoter. (1995). J Immunol, 155, 1286-95.

Woods A, McCarthy JB, Furcht LT & Couchman JR. A Synthetic peptide from the

COOH-terminal heparin-binding domain of fibronectin promotes focal

adhesion formation. (1993). Mol Biol Cell, 4, 605-13.

Woods A & Couchman JR. Syndecans: synergistic activators of cell adhesion.

(1999). Trends Cell Biol, 8, 189-92.

Xia XZ, Treanor J, Senaldi G, Khare SD, Boone T, Kelley M, Theill LE, Colombero A,

Solovyev I, Lee F, McCabe S, Elliott R, Miner K, Hawkins N, Guo J, Stolina

M, Yu G, Wang J, Delaney J, Meng SY, Boyle WJ & Hsu H. TACI is a TRAF-

interacting receptor for TALL-1, a tumor necrosis factor family member

involved in B cell regulation. (2000). J Exp Med, 192, 137-43.

Xiao Y, Motomura S & Podack ER. APRIL (TNFSF13) regulates collagen-induced

arthritis, IL-17 production and Th2 responses. (2008). Eur J immunol, 38, 1-9.

Yang M, Hase H, Legarda-Addison D, Varughese L, Seed B & Ting AT. B cell

maturation antigen, the receptor for a proliferation-inducing ligand and B cell-

activating factor of the TNF family, induces antigen presentation in B cells.

(2005). J Immunol, 7, 2814-24.

Yu G, Boone T, Delaney J, Hawkins N, Kelley M, Ramakrishnan M, McCabe S, Qiu

W, Kornuc M, Xia XZ, Guo J, Stolina M, Boyle WJ, Sarosi I, Hsu H, Senaldi

G &Theill LE. APRIL and TALL-1 and receptors BCMA and TACI: system for

regulating humoral immunity. (2000). Nat Immunol, 1, 252 – 6.

Yurchenco PD, Cheng YS & Schittny JC. Heparin modulation of laminina

polymerization. (1990). J Biol Chem, 265, 3981-91.

Zamisch M, Moore-Scott B, Su D, Lucas PJ, Manley N & Richie ER. Ontogeny and

regulation of IL-7-expressing thymic epithelial cells. (2005). J Immunol, 174,

60–7.

8. ANEXO: Artigo desenvolvido e publicado durante o mestrado.

Manuscrito Publicado:

Morel J, Roubille C, Planelles L, Rocha C, Fernandez L, Lukas C, Hahne M & Combe

B. Serum levels of tumour necrosis factor family members a proliferation-inducing

ligand (APRIL) and B lymphocyte stimulator (BLyS) are inversely correlated in

systemic lupus erythematosus. (2009). Ann Rheum Dis, 68, 997-1002.

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