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Introdução à microbiologia clínica
e ao
tratamento das doenças infecciosas
Eurico de Aguiar
2009
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Dedicatória
Aos meus pais, Jefferson e Iracema, que foram fundamentais para que
pudesse me tornar o cidadão que sou.
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Currículo resumido
Eurico de Aguiar é médico e especialista em Patologia Clínica pelo Conselho
Federal de Medicina.
Ex-estagiário da Seção de Vírus do Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará.
Especialista em Perícia Médica pela Fundação Unimed/Universidade Gama Filho.
Pós-graduado em Microbiologia Clínica e Sanitária pela Universidade de Sevilha,
Espanha.
Responsável pelo Setor de Bacteriologia do Laboratório de Patologia Clínica do
Hospital Regional da Asa Sul, Brasília, Distrito Federal (1988-2007).
Ex-coordenador de Patologia Clínica e ex-coordenador de Controle de Infecção
Hospitalar da Secretaria de Saúde do Distrito Federal.
Ex-presidente da Comissão Central de Controle de Infecção Hospitalar do Distrito
Federal.
Docente fundador do Curso de Medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde
do Governo do Distrito Federal.
Diretor da Coordenação de Laboratório de Análises Clínicas do Departamento
Médico da Cãmara dos Deputados (2002-2008).
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ÍNDICE
Prefácio.................................................................................................................5
Coleta, transporte e semeadura de material ....................................................6
Exames diretos ..................................................................................................17
Meios de cultura ................................................................................................20
Identificação preliminar de culturas bacterianas e de fungos.......................22
Taxonomia microbiana .....................................................................................24
Identificação e teste de sensibilidade por equipamento automatizado ........26
Identificação manual dos microrganismos mais isolados ..............................32
Teste de sensibilidade manual ..........................................................................52
Resultados que merecem reavaliação .............................................................55
Avaliação da qualidade do ar interno ..............................................................56
Resistência bacteriana .......................................................................................60
Principais grupos de antimicrobianos ..............................................................63
Considerações importantes sobre alguns antimicrobianos ........................... 73
Princípios gerais de uso de antimicrobianos ...................................................76
Septicemia............................................................................................................82
Agentes antimicrobianos como início de terapia empírica .............................89
Dosagens de alguns antimicrobianos de maior uso .........................................90
Bibliografia recomendada ..................................................................................92
Alguns links de maior interesse .........................................................................96
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Prefácio
Durante vários anos procurei adotar uma metodologia que viesse facilitar o
desenvolvimento dos trabalhos microbiológicos em um laboratório clínico. A bibliografia
sobre o assunto é extensa, complexa e aplica, muitas vezes, procedimentos não acessíveis à
maioria dos laboratórios do nosso país.
Preocupado com essa questão, procurei utilizar práticas que pudessem ser adotadas
por diferentes tipos de condições de trabalho.
Reconheço que, ao menos em Brasília, as condições que dispomos nos laboratórios
da rede pública são bastante razoáveis, se comparadas com outras cidades e regiões do país.
Trabalhamos com sistemas automatizados de realização de hemoculturas, além de
sistemas automatizados de identificação e testes de sensibilidade bacteriana por
microdiluição em caldo, com determinação de concentração inibitória mínima.
Isso, no entanto, não impede que laboratórios com condições mais simples não
possam também desenvolver um trabalho de qualidade.
De 1988 até 2007 trabalhei no Hospital Regional da Asa Sul, hospital público de
nível terciário dotado de 360 leitos e de clientela constituída principalmente por gestantes e
crianças.
Além de responsável pelo setor de microbiologia do laboratório de patologia clínica,
participei ainda como membro efetivo da comissão de controle de infecção hospitalar.
É possível constatar que temos considerável aproximação com outras áreas e
especialidades, como as atividades desenvolvidas pelos infectologistas, assim como pelos
clínicos e cirurgiões que lidam com doenças infecciosas.
Em conseqüência, surgiu a idéia de desenvolver um texto que também abordasse um
pouco de um setor de tanta relevância na prática clínica e cirúrgica e que tem interface com
o nosso trabalho diário, apesar de que, por muito tempo, os livros de texto separaram
indevidamente as informações relativas à microbiologia das relativas às doenças
infecciosas.
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Coleta, transporte e semeadura de material
Como em todo exame de laboratório, as três etapas do processo (pré, per e pós-
analítico) são importantes para que o produto, ou seja o resultado do exame seja adequado e
compatível com as expectativas dos nossos clientes, médicos e pacientes.
Para que a primeira etapa seja realizada de forma correta temos primeiramente de
abordar a coleta, o transporte e a semeadura das amostras.
Passos principais a serem seguidos para uma adequada coleta de amostras para
exame microbiológico:
1. O material deve ser representativo do local da infecção, devendo-se evitar a
contaminação com outras amostras de sítios adjacentes.
2. Seguir os tempos ótimos estabelecidos para obter a maior chance de recuperação dos
microrganismos envolvidos, especialmente em relação às hemoculturas e outros
materiais de maior importância clínica e diagnóstica.
3. Entregar a amostra ao laboratório no menor tempo possível. O ideal é um intervalo de,
no máximo, 30 minutos entre a coleta e a semeadura da amostra.
4. Obter uma quantidade suficiente da amostra para poder realizar os testes solicitados
pelo médico assistente.
5. Utilizar sempre o material mais adequado para a coleta e semeadura de cada tipo de
amostra.
6. Quando necessário, utilizar o meio de transporte mais indicado para as espécies mais
prováveis de serem isoladas.
7. Obter as amostras, preferencialmente, antes do uso de antimicrobianos.
8. Exames diretos devem ser realizados juntamente com as culturas, para melhor
interpretação dos resultados.
9. Cada amostra deve ser sempre bem identificada.
10. O pessoal técnico deve ser imeditamente informado da entrega da amostra.
Desenvolvimento:
Sempre que possível devemos evitar a contaminação da amostra com a microbiota
normal do organismo, de forma a assegurar que seja representativa da infecção.
Amostra colhida de um local com flora normal abundante (pele, membranas
mucosas, fezes, etc.) pode interferir com a interpretação dos resultados de cultura e
dificultar o encontro do agente responsável pelo quadro clínico.
Devemos ainda colher a amostra do sítio anatômico mais adequado para o tipo de
infecção, usando a técnica mais adequada e os meios apropriados, evitando-se a
contaminação com a microbiota adjacente ao sítio da infecção.
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Além disso, a amostra deve ser colhida antes do início da terapia antimicrobiana,
que se essa regra não for seguida riscos de um resultado falso negativo provocado pela
ação “in vitro” dos medicamentos.
Lembrar sempre das características biológicas dos microrganismos mais prováveis
de serem isolados de acordo com a suspeita clínica e o quadro apresentado pelo paciente.
Assim se suspeitamos de uma infecção por anaeróbios, deveremos colher a amostra
em um recipiente adequado que atenda as condições de sobrevida dos germes envolvidos.
Ou ainda quando há suspeita de um material conter bactérias do gênero Neisseria ou
Haemophilus, que por não resistirem a baixas temperaturas e necessitarem de
microaerofilia para se desenvolver, requerem cuidados especiais na hora de colher,
transportar, semear e incubar.
Devemos lembrar também da importância de se colher volumes adequados de cada
amostra. Isso é particularmente importante no caso das hemoculturas, em que a relação
sangue/meio de cultura deve ser rigorosa.
O momento ideal da coleta é também outro ponto importante de ser lembrado.
Nunca esquecer a identificação correta de cada amostra e pedido médico, que deve
incluir o nome do paciente, da etiqueta, do prontuário, unidade de internação, data e
hora da coleta, exames solicitados, indicação clínica, doença de base, informações sobre o
uso de antimicrobianos e identificação legível do médico requisitante.
A amostra deve, sempre, ser coletada em um recipiente adequado, que além de
permitir a sobrevida dos micróbios, impeça vazamentos ou contaminação da equipe de
saúde.
Cada material deverá ser imediatamente encaminhado ao laboratório para ser
processado.
Considerações sobre biossegurança:
-Toda amostra deve ser considerada como potencialmente patogênica.
-A equipe de saúde deve utilizar equipamento de proteção individual adequado, como
luvas, máscara, óculos de proteção e avental ou jaleco longo de mangas compridas.
-Antes de manusear cada amostra verificar se vazamentos ou respingos. Se houver,
fazer descontaminação com álcool a 70% ou outro germicida equivalente, como o
hipoclorito de sódio a 0,5%.
-Evitar a formação de aerossóis, especialmente ao trabalhar com semeadura de material.
-Utilizar ainda equipamento de proteção coletiva como cabine de segurança biológica,
chuveiro de emergência, lava-olhos, extintor de incêndio, microincinerador de alça
metálica ou uso de alça estéril descartável.
-Trabalhar em cabine de segurança biológica de risco biológico de acordo com os
agentes envolvidos no trabalho diário.
-Há quatro níveis de segurança biológica. O laboratório de microbiologia do HRAS
trabalha com segurança de nível 3, já que lida não só com os agentes patogênicos de
nível moderado, como ainda com agentes causadores de infecções sistêmicas mais
graves e letais (como o M. tuberculosis). Todas as barreiras de proteção individual
devem ser utilizadas e toda manipulação deve ser feita em cabine de segurança
biológica. O acesso ao laboratório deve ser controlado, assim como deve haver um
sistema de ventilação especial.
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-A cabine de segurança biológica deve ser dotada de filtro HEPA(filtro com eficiência
de 99,99% para partículas de até 0,3 micra de diâmetro), e com abertura frontal, que
protege o operador, o material e o meio ambiente.
-Dentro do laboratório será proibido guardar alimentos ou líquidos -como água, sucos e
refrigerantes-, fazer refeições ou aplicar cosméticos.
-Não será permitido o uso de pipetagem com a boca.
-Estabelecer um plano de gerenciamento de resíduos sólidos, contemplando os passos
de geração, segregação, acondicionamento, coleta, armazenamento, transporte,
tratamento e descarte.
-Todo material contaminado deve ser descontaminado antes de ser descartado.
-Ter um plano previamente estabelecido de como agir em casos de acidentes
envolvendo agentes infecciosos.
-Limpar e desinfetar todas as superfícies de trabalho no início e no término da jornada,
e sempre que houver risco de contaminação.
-Lavar as mãos imediatamente após contato com alguma amostra, após remover as
luvas e ao final do turno de trabalho.
-Manter organizadas todas as áreas de trabalho.
Critérios para rejeição de amostras consideradas inadequadas para cultura:
Qualquer amostra recebida em formol ou outro tipo de germicida.
Coleta de escarro ou de urina de 24 horas.
Amostras recebidas em recipientes apresentando vazamentos.
Amostras recolhidas de sondas de Foley.
Amostras recebidas em duplicata (exceto hemoculturas), em um período de 24 horas.
Amostras de secreção uretral colhidas em swab de algodão (o algodão é tóxico para o
gonococo).
Amostras recebidas sem identificação adequada e/ou sem pedido médico.
Amostras de urina recebidas sem condições adequadas de transporte,ou seja, em recipiente
sem gelo
Coleta, transporte e semeadura de amostras para cultura:
Hemocultura:
O sangue deve ser coletado antes de se iniciar a terapia antimicrobiana. Se isso não
for possível, coletar a amostra imediatamente antes da próxima dose do antimicrobiano.
Fazer antissepsia do local da punção venosa, inicialmente com álcool a 70% e
depois com solução iodada a 1% (ou com solução de clorohexidina), utilizando
movimentos circulares de dentro para fora. Deixar secar a área por 1 a 2 minutos, antes da
punção. Após a coleta, retirar a solução de iodo com álcool a 70%, para evitar a irritação da
pele.
As bacteremias podem ser transitórias (durante um procedimento cirúrgico;
presença de infecção grave como meningite, pneumonia, osteomielite, etc.), intermitentes
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(presença de abscesso não drenado) e contínuas (endocardite bacteriana, infecção associada
a cateter, septicemia, etc.). Ao menos duas hemoculturas, devem ser colhidas em um espaço
de 24 horas, com um intervalo de 30 a 60 minutos entre elas. Com isso mais de 90% dos
episódios bacteriemicos costumam ser detectados.
O volume de sangue recolhido deve ser de 1/10 do volume do frasco, no sentido de
minimizar a ação de fatores do hospedeiro que podem afetar o resultado dos exames
(anticorpos, complemento, leucócitos,etc.). Para adultos colhe-se em torno de 20 ml de
sangue por dia, e para crianças entre 1 e 5 ml. Logo após a coleta, os frascos de
hemocultura deverão invertidos 2 a 3 vezes para uma adequada homogenização e em
seguida encaminhados ao laboratório, para serem colocados em estufa a 35°C.
Nunca colocar os frascos de hemocultura em geladeira, porque isso poderá impedir
o crescimento de bactérias como as Neisserias e os Haemophilus. A coleta de mais de um
frasco é também útil para a interpretação dos resultados das culturas. Bactérias
consideradas geralmente como contaminantes (S. epidermidis, S. viridans, espécies do
gênero Corynebacterium, do gênero Bacillus e do gênero Propionibacterium) podem ser
valorizadas se forem isoladas em mais de uma amostra de um mesmo paciente.
O mero máximo aceitável de frascos é de até 4 por dia para um mesmo paciente,
mas como o custo desse material é elevado, deve-se procurar evitar a solicitação desse tipo
de pedidos sempre que possível.
Não se deve colher amostras a partir de um cateter intravascular porque essa prática
aumenta o número de isolamentos de bactérias presumidamente contaminantes.
O HRAS utiliza um equipamento automatizado para a realização de hemoculturas
(Bact-Alert) que se baseia na detecção colorimétrica de CO2 produzido pelo metabolismo
microbiano. A estufa possui ainda movimento de rotação dos frascos. A cada 10 minutos o
equipamento faz uma leitura de todos os frascos. Se em algum deles tiver havido
crescimento suficiente para mudança de cor do fundo do frasco, o aparelho emite um sinal
sonoro e seu monitor alerta para a existência de um recipiente com crescimento microbiano.
Cada frasco costuma se positivar geralmente em 24 a 48 horas de incubação, exceto nos
casos de crescimento de leveduras ou bactérias anaeróbicas onde esse tempo pode ser mais
elevado.
Durante o ano de 2006 o laboratório recebeu 1976 frascos de hemoculturas de
pacientes oriundos, principalmente, do Berçario, UTI neonatal, UTI Pediátrica e Cirurgia
Pediátrica.
Dessas 314 foram positivas (15,9% do total), sendo 195 (62,1%) constituída pelo
grupo dos cocos gram positivos, 82 (26,1%) pelo dos bacilos gram negativos, 32 (10,2%)
por leveduras e o restante por bactérias fastidiosas (H. influenzae e N. meningitidis) e
bacilos gram positivos(Corynebacterium spp.).
Entre os cocos gram positivos houve predomínio de estafilococos coagulase
negativos(65,6% do grupo), especialmente o S. epidermidis, sendo a maioria resistente à
oxacilina.
A característica maior dessas cepas é a grande produção de uma substância mucóide
que, ao infectar implantes biomédicos como cateteres intravasculares, aumenta
consideravelmente de seu potencial patogênico.
Entre os bacilos gram negativos predominaram as cepas de Klebsiella pneumoniae e
Serratia marcescens(68,3% do grupo).
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Entre as leveduras a espécie mais isolada foi a Candida guillermondii(43,7% do
grupo).
Ao longo dos anos, tem-se verificado um aumento gradual na incidência de
hemoculturas positivas com isolamento de leveduras, o que pode estar relacionado a
diversos fatores, como maior tempo de internação dos pacientes imunodeprimidos, uso
maior de associações de antibióticos, maior nascimentos de prematuros, maior utlização de
procedimentos de risco, uso mais elevado de nutrição parenteral, entre outros.
LCR:
O LCR é coletado geralmente por meio de punção lombar, entre L3 e L4, após
prévia antissepsia do local a ser puncionado. O material é recolhido em dois frascos estéreis
e imediatamente semeado em meio de agar chocolate. Deve ser em seguida encaminhado
ao laboratório. Lembrar ainda que não se deve manter esses materiais em geladeira ou a
baixas temperaturas, por afetar bactérias como o meningococo e o Haemophilus influenzae,
comumente envolvidas em quadros de meningite bacteriana.
No laboratório será feita bacterioscopia e pesquisa de antígeno bacteriano quando a
bacterioscopia for sugestiva de meningite (glicose baixa, proteina elevada, aumento de
polimorfonucleares, etc.). Nos casos de suspeita de infecção por micobactéria ou por
fungos (Cryptococcus neoformans) poderá ser feita uma pesquisa de BAAR ou de
leveduras (método da tinta nanquim), após prévia centrifugação do material (3000 rpm por
30 minutos), desprezando o sobrenadante e utilizando apenas o sedimento para a análise.
Líquidos orgânicos:
Materiais nobres como liquido pleural, líquido peritoneal, liquido pericardico,
líquido sinovial e liquido ascítico devem ser colhidos, após antissepsia prévia, por aspiração
de seringa com agulha em um volume de 5 a 10 ml.
Após entrega imediata ao laboratório, o material deve ser utilizado parte para a
inoculação dos meios de cultura e parte para a realização de exames diretos.
Além do uso de meios tradicionais como o agar sangue, agar MacConkey e o agar
chocolate, pode-se inocular parte do material em um frasco normalmente utilizado para
hemocultura, que será depois incubado.
Para os exames diretos recomenda-se (nos casos de material fluido) centrifugação
da amostra (3000 rpm por 30 minutos), sendo descartado o sobrenadante e o esfregaço
realizado a partir do sedimento. Poderá ser feito Gram, Zihel e pesquisa de fungos, de
acordo com o pedido médico e a suspeita clínica.
Secreções do trato respiratório:
a)secreção de nasofaringe nos casos de suspeita de coqueluche, colher o material com
swab (previamente umedecido em água ou salina estéril) e inocular logo em seguida em
meio de Regan-Lowe agar (composto de agar carvão com 10% de sangue de cavalo,
além de cefalexina) e depois incubar em estufa. Nos casos de pesquisa de portadores de
S. aureus (como MRSA), colher o material com swab e semear em agar manitol sal. A
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secreção de nasofaringe não é indicada para a pesquisa de agente etiológico de sinusite
bacteriana.
b)Secreção de orofaringe colher a amostra com o uso de um abaixador de língua e de um
swab. Introduzir o swab entre os pilares das amigdalas e atrás da úvula, sem tocar a
língua e as bochechas. Procurar colher o material das áreas de hiperemia, próximas aos
pontos de supuração. Para a pesquisa de Streptococcus beta-hemolítico do grupo A (S.
pyogenes) devemos semear o material em um meio seletivo, onde a chance de
isolamento dessa bactéria é maior, como em agar sangue com trimetoprim e em caldo
Todd-Hewitt. Nos casos de suspeita de epiglotite, em que o agente costuma ser o H.
influenzae, devemos semear o material em agar chocolate suplementado (com fatores V
e X) ou usando a técnica do satelitismo, com uma estria de estafilococo (com as placas
incubadas em atmosfera de 5% de CO2). Nos casos de suspeita de difteria colher o
material a partir da placa suspeita, e fazer duas lâminas. Uma para a coloração de Gram
e a outra para a de Löffler (azul de metileno), em que se procura visualizar granulações
metacromáticas de espécies de Corynebacterium.
c)Escarro, lavado broncoalveolar e aspirado traqueal o escarro (que não é considerado
um material ideal em casos de pneumonia) deve ser colhido pela manhã, após uma tosse
profunda, antes de se alimentar e após lavar a boca com água. Uma maneira de avaliarmos
se a amostra foi adequadamente colhida é relação de polimorfonucleares e células
epiteliais, em campo de 400x. Mais de 10 polimorfonucleares/campo e menos de 10 células
epiteliais/campo é a relação esperada nesses casos. As bactérias que se procura isolar a
partir do escarro dependem do tipo de paciente. Se a infecção for comunitária procuramos
isolar o Streptococcus pneumoniae, o Staphylococcus aureus e o Haemophilus influenzae,
principalmente. se for de origem hospitalar, são as enterobactérias (Klebsiella
pneumoniae, Serratia marcescens, etc.) e os bacilos gram negativos não fermentadores
(Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., etc.) os mais envolvidos com essas
infecções. Em conseqüência deveremos semear esses materiais em agar sangue, agar
chocolate, agar MacConkey e em um caldo como o tioglicolato ou o tripticase soja. O
aspirado traqueal é obtido em pacientes intubados, através da sonda de aspiração. Os
resultados podem refletir apenas colonização, sendo sua interpretação, muitas vezes, difícil.
No caso de lavado broncoalveolar (considerado o método mais adequado para investigação
microbiológica do trato respiratório inferior) é necessária a realização de contagem de
colonias (usando a técnica da alça calibrada de 0,01 ml onde o de colonias encontradas
na placa de agar sangue deve ser multiplicado por 100). Em consequência, o tempo entre a
coleta da amostra e a semeadura do material deve ser mínimo (até 30 minutos). A presença
de mais de 10 mil UFC/ml de uma determinada espécie é sugestiva de ter significado
clínico.
Urina:
Pelo menos quatro tipos de amostras de urina podem ser coletadas para cultura.
Em se tratando de neonatos ou crianças de baixa idade pode-se utilizar a punção
suprapúbica. Este procedimento requer que a bexiga esteja cheia e que antes se faça uma
antissepsia da pele. A bexiga é puncionada acima da sínfese pubiana e cerca de 5 a 10 ml
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de urina são coletados. A amostra deve ser imediatamente encaminhada ao laboratório e
logo em seguida semeada nos meios convencionais (agar sangue e agar MacConkey).Aqui
qualquer contagem de colônias é significativa, portanto devemos utilizar nesses casos uma
alça calibrada de até 0,1 ml. Em crianças maiores, mas ainda sem controle esfincteriano,
pode-se utilizar saco coletor. Deve ser feita uma prévia higienização do períneo, coxas e
nádegas com água e sabão neutro. Caso não haja micção, o saco coletor deverá ser trocado
a cada 30 minutos, repetindo-se a higienização do períneo.
No caso de adultos o procedimento mais utilizado é a coleta do jato médio de urina. A
mulher deve proceder a uma higiene da área uretral e períneo com água e sabão, com gaze
estéril. Em seguida deve secar a área lavada com uma gaze seca. Afastar os grandes lábios e
em seguida desprezar o primeiro jato de urina (de preferência da 1ª urina da manhã)e colher
o jato médio dentro de um recipiente estéril de boca larga, sem encher demasiadamente o
recipiente (cerca de metade do volume do frasco), sendo desprezado o jato final . Em
seguida fechar o frasco hermeticamente e conservar em gelo até a entrega ao laboratório.
Nos casos em que essa entrega não puder ser imediata, a urina pode ser mantida em
geladeira (2 a 8°C) por até 24 horas. Nos casos de pacientes masculinos a recomendação é
de que lavem a glande com água e sabão, e recolham a pele do prepúcio antes de urinar.
Colher o jato médio e desprezar o jato final de urina.
No caso de paciente em uso de cateter a recomendação é que se puncione a cânula do
coletor, após prévia desinfecção com álcool a 70%. Com seringa e agulha puncionar a
cânula e aspirar até 10 ml de urina, transferir em seguida para um frasco esterilizado e
encaminhar ao laboratório. Este material não é considerado o mais adequado devido aos
riscos de contaminação, porém em casos excepcionais também podeser utilizado. Nunca
utilizar urina colhida a partir do saco coletor de paciente cateterizado.
Com relação à contagem de colônias, os critérios de Kass, elaborados em 1956, não
são tão verdadeiros hoje em dia. Como exemplo, podemos citar o caso da síndrome uretral
aguda, em que mulheres com vida sexual ativa podem desenvolver infecção urinária com
contagens tão baixas como 100 a 10 mil UFC/ml. Um dos motivos para a existência de
infecção com esse número baixo de micróbios pode ser o aumento do mero de micções
induzido pela infecção ou o aumento da ingestão de líquidos que leva à diluição da amostra
de urina. Nesses casos é fundamental que o médico indique a possibilidade desse evento -
síndrome uretral aguda - para que o laboratório possa dar valor a contagens tão baixas
quanto essas.
Trato genital:
a)feminino a secreção vaginal pode ser um excelente material para a realização de
exame direto, realizado logo após a coleta da amostra. Primeiro a suspensão de
um material recém-colhido é feita com cerca de 1 ml de salina estéril. Após
agitação uma gota é colocada entre lâmina e lamínula e com outra parte é feito
esfregaço para coloração de Gram e Giemsa. Com esses três exames podemos
fazer diagnósticos variados, como nas vaginoses, causadas por agentes diversos
como a Gardnerella vaginalis (com a presença das “clue cells”, ou seja lulas
epiteliais recobertas de flora cocobacilar), a Candida albicans (presença de
leveduras e pseudo-hifas) e o Trichomonas vaginalis (onde o exame direto
permite verificar o movimento e a forma do protozoário). No caso de material
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para diagnóstico de cervicite por gonococo, a amostra deve ser colhida com swab
introduzido 1 a 2 cm no canal endocervical e em seguida feita rotação por alguns
segundos. Retirar o swab sem tocar a superfície da vagina. Colocar o swab em
meio de transporte, ou preferencialmente semear diretamente em meio de
Thayer-Martin, depois levar ao laboratório e incubar em estufa com atmosfera de
5% de CO2.
b)Masculino para a pesquisa de gonococo pode-se usar tanto a secreção uretral como
o jato de urina. No caso de haver secreção colhida, de preferência, pela
manhã, antes de urinar - o swab é inserido 2 a 4 cm no interior da uretra e é feita
uma rotação. Em seguida o material é colocado em meio de transporte (meio de
Stuart) e semeado da mesma forma que em pacientes do sexo feminino. Em
homens a bacterioscopia da secreção uretral pode ser diagnóstica, por meio da
detecção de diplococos gram negativos intracelulares. Nos casos de ulcera onde
se for pesquisar o Haemophilus ducrey, deve-se coletar o material da base da
ulcera. Ao Gram vamos encontrar bacilos gram negativos pleomórficos e
cocobacilos em cadeias.
Cateter:
O cateter (periférico, central, arterial, Swan-Ganz, etc.) deve ser retirado do paciente
com os mesmos cuidados de antissepsia da pele que precederam a sua colocação, para se
evitar a sua contaminação com a microbiota da pele. Após remoção do cateter com técnica
asséptica, cortar os 5 cm da ponta onde estava inserida a veia do paciente, e em seguida
colocá-la em um frasco estéril e encaminhá-lo imediatamente ao laboratório.
Com a ajuda de uma pinça rolar o cateter sobre a superfície de uma placa média de
Agar sangue e em seguida colocá-lo em um tubo com caldo (tioglicolato, tripticase soja,
etc.). Incubar a placa e o tubo por até 48 horas. Fazer a contagem de colônias na placa de
Agar sangue. Segundo a técnica de Maki, devem ser valorizadas as contagens de colônias
iguais ou maiores do que 15 UFC/placa. Se não houver crescimento na placa e houver
crescimento no caldo, devemos repicar o caldo para novo Agar sangue e Agar MacConkey,
para a identificação desses microrganismos. É importante ressaltar que mesmo sem haver
isolamento na placa (ou com contagens consideradas baixas) pudemos verificar que havia
resultados significativos, ao isolarmos bactérias que normalmente não seriam valorizadas.
Um dos motivos para isso poderia ser a existência de bactérias apenas no interior do cateter
e que a simples rolagem não permitiria o seu isolamento.
Fezes:
A amostra utilizada pode ser 1 a 2 g de fezes ou swab retal. De preferência o
material deve ser colhido e imediatamente encaminhado ao laboratório. Algumas bactérias,
como as espécies de Shigella, resistem pouco a variações bruscas de pH e por esse motivo
as amostras devem ser colhidas em meio tamponado (tampão fosfato 0,03M com igual
volume de glicerol) ou meio de transporte, como o Cary-Blair. A bacterioscopia das fezes
pode auxiliar para a pesquisa do provável agente causador do quadro diarréico
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(estafilococos, leveduras, etc.). As bactérias habitualmente pesquisadas são a Salmonella,
Shigella, E. coli (enteropatogenica, enteroinvasora, etc.), Yersinia enterocolítica e o
Campylobacter (pequenos bacilos gram negativos curvos ou em forma de asa de gaivota).
As espécies de Aeromonas (A. hydrophila e A. caviae) e a Plesiomonas
shigelloides(bacilos gram negativos oxidase positivos) e a E. coli entero-hemorrágica
(O157: H7) são espécies mais raras de serem isoladas, mas que devem ser pesquisadas
quando houver indicação clínica. Por exemplo, nos casos de suspeita de síndrome
hemolítico uremica, causada pela E. coli O157:H7, devemos procurar utilizar o meio de
Agar MacConkey sorbitol (ou procurar identificar cepas de E. coli que não utililizam o
sorbitol). Esse meio pode tornar-se ainda mais seletivo se acrescentarmos cefixime e
telurito de potássio. A síndrome hemolítico-uremica se caracteriza por um quadro de
anemia hemolítica, insuficiência renal aguda e trombocitopenia. A ingestão de hamburgers
contaminados tem sido a causa mais comum de eventuais surtos, apesar de outras fontes de
contaminação terem sido descritas. a Aeromonas costuma ser mais facilmente isolada
usando meio seletivo como o agar sangue com ampicilina (20 mcg/ml) e ainda o CIN agar,
que também aumenta a possibilidade de isolamento de Yersinia.
Nos casos de suspeita de cólera o material deverá ser enviado em meio tamponado
para o laboratório central de saúde pública, onde será feita a pesquisa do Vibrio cholerae,
ou se poderá isolar no próprio laboratório usando-se o agar TCBS (tiosulfato-citrato-sais
biliares-sacarose), onde as colonias da bactéria aparecem como colonias amarelas, por
fermentarem a sacarose. O V. cholerae é oxidase positivo e aglutina com o antisoro
específico.
Na coprocultura comum, logo após a chegada do material ao laboratório, fazer
bacterioscopia e semear em caldo de enriquecimento (GN ou tetrationato), agar sangue de
Skirrow - que contem sangue de cavalo, vancomicina, polimixina B e trimetoprim - , agar
MacConkey e agar SS. A placa de agar sangue deve ser colocada em microaerofilia
(atmosfera contendo 5% de oxigênio, 10% de CO2 e 85% de N2) por até 72 horas, a 42°C.
A espécie mais envolvida com quadros diarreicos é o C. jejuni, que hidroliza o hipurato, é
resistente ao disco de cefalotina e geralmente é sensível ao de ácido nalidíxico. As crianças
abaixo de dois anos de idade são particularmente susceptíveis às infecções por
Campylobacter.
Cerca de quatro horas após a semeadura inicial, deve-se repicar o caldo de
enriquecimento para outro agar SS, como nova tentativa de se isolar colônias de Salmonella
ou de Shigella.
Secreções diversas:
a)de ouvido – o ideal é a amostra colhida pelo médico por aspiração através do tímpano,
ou seja a cultura de secreção de ouvido médio. Se for necessária a coleta de material
do ouvido externo, o próprio pessoal do laboratório poderá realizá-la, desde que
utilize o procedimento adequado. Limpar o canal auditivo com antisséptico, em
seguida lavar com solução fisiológica estéril. depois colher o material com swab
estéril. Fazer esfregaço para Gram e semear em um caldo (tioglicolato ou tripticase
soja), agar sangue, agar chocolate e agar MacConkey. As bactérias mais
freqüentemente envolvidas são o Streptococcus pneumoniae, e o Haemophilus
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influenzae. Também pode ocorrer a participação de enterobactérias, bacilos gram
negativos não fermentadores e do S. aureus.
b)Ocular geralmente a coleta é feita com swab de material obtido por esfregaço do
saco conjuntival do olho afetado, a não ser que o médico solicite outro tipo de
amostra - blefarite: inflamação das margens da pálpebra; ceratite: inflamação da
córnea - . As bactérias mais freqüentemente envolvidas são o S. aureus, o S.
pneumoniae, as enterobactérias (especialmente em recém-nascidos) e o
Haemophilus influenzae. Lembrar ainda da possibilidade de conjuntivite
gonocócica em neonatos. Fazer esfregaço para Gram, e semear em agar sangue,
agar chocolate, agar MacConkey e caldo (tioglicolato ou tripticase soja).
c)Secreção de ferida operatória colher o material com swab (com meio de Stuart) das
bordas da lesão, após lavar a secreção purulenta com salina estéril. No laboratório
fazer esfregaço para Gram e semear em agar sangue, agar chocolate,agar
MacConkey e caldo tioglicolato. Os estafilococos (coagulase positivo e coagulase
negativos) são as bactérias mais freqüentemente envolvidas, depois as
enterobactérias e finalmente os bacilos gram negativos não fermentadores.
Material com suspeita clínica de infecção por anaeróbios:
Geralmente as infecções por anaeróbios estão relacionadas às infecções próximas as
membranas mucosas (boca, anus), com microbiota mista, após mordedura humana ou
de animal, infecções com odor fétido, com produção de gás e infecções associadas a
tumores ou a áreas com vascularização deficiente, como em pacientes diabéticos
apresentando necrose de extremidades. Um material cujo exame microscópico (Gram)
apresentou microbiota abundante e que depois a cultura para aeróbios foi negativa
também é sugestiva de ser causada por anaeróbios.
As amostras devem ser coletadas com agulha e seringa, sem ar (ou usar meio de
transporte para anaeróbios). Logo em seguida encaminhadas ao laboratório. Fazer
inoculação em frasco de hemocultura (frasco anaeróbio), em caldo tioglicolato e
esfregaço para Gram. Também semear em meios sólidos para anaeróbios, como o agar
sangue anaeróbico, que deve ser incubado por 72 horas em jarra com atmosfera de
anaerobiose.
A bacterioscopia pode fornecer informações bastante úteis: bacilos gram positivos
com esporos, sugerem espécies do gênero Clostridium; bacilos gram negativos
fusiformes sugerem bactérias do gênero Fusobacterium; rios tipos bacterianos podem
ser encontrados nas infecções mistas como peritonites, em que associação de
anaeróbios estritos como os Bacteróides e facultativos como as diferentes espécies de
enterobactérias.
Material com suspeita de infecção por micobactérias de crescimento rápido(MCR):
É cada vez mais frequente o encontro de algumas MCR em infecções hospitalares -
como Mycobacterium abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. bolletii e M.
fortuitum - decorrentes de procedimentos invasivos como injeções, sessões de
mesoterapia, sessões de acupuntura, cirurgias oculares (transplantes de córnea, cirurgias
refrativas, etc.) e cirurgias plásticas estéticas (lipoaspiração, próteses de mama, etc.).
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Essas infecções são associadas, principalmente, à materiais utilizados em videocirurgias
e que são reutilizados após desinfecção química.Os componentes do grupo MCR são
muito resistentes aos antimicrobianos e a vários desinfetantes, especialmente o
glutaraldeído. No entanto, costumam responder ao tratamento com associação de
antimicrobianos, como ciprofloxacina mais claritromicina por um período mínimo de
seis meses.
As MCR podem crescer em meios comuns, como agar sangue, agar Mueller-Hinton
e agar Sabouraud. Caracterizam-se por formarem colonias visíveis em três a sete dias de
incubação em temperatura ambiente (vedar a placa para evitar desidratação).
Para diagnóstico, coletar secreção ou fragmento de tecido e fazer pesquisa para
BAAR (material concentrado por centrifugação), além de cultura para micobactérias
usando, de preferência, meio sólido e meio líquido.
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Exames diretos
Os exames diretos constituem alguns dos métodos mais rápidos e eficientes de
diagnóstico disponíveis em microbiologia. Além de poder servir de guia terapêutico para se
iniciar uma antibioticoterapia empírica com maior racionalidade, como em uma meningite
bacteriana em que a bacterioscopia do LCR ajuda a definir o provável agente etiológico e o
mais adequado grupo de antimicrobianos a ser empregado no tratamento, alguns exames
diretos chegam a diagnosticar a doença apresentada pelo paciente, como é o caso da
pesquisa de BAAR de linfa no caso de uma suspeita de hanseníase.
Algumas técnicas de exames diretos de amostras não coradas:
1. Montagem com salina.
Material: solução aquosa de salina estéril (0,85%), lamina de microscopia e lamínula.
Técnica: dispersar uma pequena quantidade da amostra em uma gota de salina sobre
uma lamina. Colocar lamínula e examinar ao microscópio com aumento de 40X,
fechando o diafragma para diminuir a passagem da luz transmitida.
Objetivo: verificar a presença de fungos, protozoários, etc.
2. Preparação com tinta nanquim.
Material: tinta nanquim, lâmina de microscopia e lamínula.
Técnica: após centrifugado o LCR, uma gota do sedimento é colocada ao lado de uma
gota de tinta. Misturar as duas gotas e colocar lamínula. Fazer emulsão fina, senão nada
poderá ser visto. Fazer leitura ao microscópio com aumento de 40X.
Objetivo: pesquisa de leveduras de Cryptococcus neoformans, cuja característica é a
presença de grande halo ao redor da levedura devido à sua capsula.
3. Montagem com KOH.
Material: solução aquosa de KOH a 10%, lamina de microscopia e lamínula.
Técnica: após ser feito raspado (de pele, couro cabeludo, unha, etc.) o material é
suspenso em uma gota de solução de KOH a 10%, sobre uma lamina. Em seguida
colocar lamínula e aquecer um pouco sobre uma chama de bico de Bunsen, para
acelerar o processo de clarificação. Deixar a lamina por cerca de 15 a 30 minutos à
temperatura ambiente, antes de levar ao microscópio . Fazer leituras com objetivas de
10 e de 40X.
Objetivo: pesquisar a presença de fungos (hifas, esporos, leveduras, etc.) em material
que contem queratina.
4. Pesquisa em campo escuro.
Material: microscópio com condensador de campo escuro, lâmina, lamínula, e salina.
Técnica: Colher secreção serosa do paciente (lesão tipo cancro duro da sífilis) e colocar
sobre a lamina. Colocar laminula e examinar imediatamente depois em microscópio
dotado de condensador de campo escuro (aumentos de 40 e de 100X).
Objetivo: pesquisar a presença de espiroquetas, por meio de seu movimento e sua
morfologia espiralar característica.
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Algumas técnicas de exames diretos de amostras coradas:
1. Löeffler.
Composição:
Azul de metileno – 0,3 g
Àlcool etílico 95% - 30 ml
Água destilada – 100ml
Técnica: após fixar o esfregaço pelo calor, deixar o corante agir por um minuto e em
seguida lavar a lamina com água corrente e deixar secar.
Objetivo: procurar bacilos gram positivos pleomórficos que apresentem granulações
metacromáticas (azul-escuras). Podem ocorrer ainda em outros microrganismos, como
nas bactérias do gênero Propionibacterium e nos actinomicetos. Assim um resultado
conclusivo só poderá ser dado por meio de cultura para bacilo diftérico.
2. Gram.
Composição:
a) Cristal violeta – 2,0 g
Álcool etílico 95% - 20 ml
Oxalato de amonio – 0,8 g
Água destilada – 100 ml
b) Iodeto de potássio – 2,0 g
Cristais de iodo – 1,0 g
Água destilada – 100 ml
c) Acetona – 50 ml
Álcool etílico 95% - 50 ml
d)Safranina O – 2,5 g
Àlcool etílico 95% - 10 ml
Água destilada – 90 ml
Técnica: após fixar o esfregaço pelo calor, colocar o corante inicial (cristal violeta)
por 1 minuto. Depois lavar com água corrente e colocar solução de iodo por mais
um minuto. Descorar rapidamente (cinco segundos) e depois lavar com água
corrente. Deixar o contracorante (safranina) agir por 30 segundos. Lavar com água
corrente e deixar secar.
Objetivo: descrever as principais bactérias por meio de sua morfologia e por sua
capacidade de reter a associação cristal violeta-iodo, ou seja, em gram positivas
(coradas em purpura) ou gram negativas (coradas em vermelho).
3. Ziehl-Neelsen.
Composição:
a)Cristais de fenol – 2,5 ml
Álcool etílico 95% - 5 ml
Fucsina básica – 0,5 g
Água destilada – 100 ml
b)Ácido clorídrico concentrado – 3,0 ml
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Álcool etílico 70% - 100 ml
c)Azul de metileno – 0,5 g
Ácido acético glacial – 0,5 ml
Água destilada – 100 ml
Técnica: após fixar o esfregaço pelo calor, colocar o corante de fucsina e aquecer a
lamina até a emissão dos primeiros vapores. Deixar agir por cinco minutos. Lavar com
água corrente e em seguida descorar com solução de álcool-ácido. Lavar novamente
com água corrente e em seguida colocar solução de azul de metileno. Deixar agir por
um minuto e depois lavar com água. Deixar secar. Ler toda a lamina com aumento de
100X.
Objetivo: detectar a presença de BAAR, que se cora em vermelho.
4. Wright-Giemsa.
Composição:
Corante de Wright em pó – 9,0 g
Corante de Giemsa em pó – 1,0 g
Glicerina – 90 ml
Álcool metílico absoluto – 2910 ml
Misturar em frasco âmbar e deixar estabilizar por um mês antes de usar.
Técnica: usar metodologia semelhante a utilizada em hematologia.
Objetivo: importante na pesquisa de protozoários (Leishmania) e fungos (Histoplasma),
ou ainda na pesquisa de inclusões intracelulares (Chlamydia).
5. Solução de lactofenol.
Composição:
Cristais de fenol – 20,0 g
Ácido láctico –20,0 g
Glicerol – 40 ml
Água destilada – 20 ml
Dissolver o ácido láctico e glicerol em água destilada. Depois acrescentar azul de
algodão (0,05 g). Deixar a suspensão repousar por dois dias e, em seguida, filtrar em
papel.
Técnica: uma gota do corante sobre uma preparação de pesquisa de fungos. Colocar
lamínula em ângulo de 45º, para evitar a formação de bolhas. Fazer leitura com objetiva
de 10 e de 40X.
Objetivo: ver as estruturas coradas de fungos filamentosos (micélios e órgãos de
reprodução).
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Meios de cultura
Os meios de cultura utilizados em microbiologia podem ser de vários tipos:
a-Meios sólidos: geralmente utilizados para obter colônias isoladas, como o agar sangue
e o agar MacConkey.
b-Meios líquidos: geralmente utilizados para facilitar o desenvolvimento microbiano,
porém sem propiciar a obtenção de colônias isoladas, como o caldo tioglicolato ou o
caldo tripticase soja.
c-Meios de transporte: servem apenas para a manutenção da viabilidade das bactérias
entre a coleta de material e a semeadura nos meios adequados. Exemplos: meio de
Stuart (secreções) e meio de Cary-Blair (fezes).
d-Meios não seletivos: são meios com suplemento que facilitam o crescimento
microbiano, como o agar sangue e o agar chocolate.
e-Meios seletivos: meios que contêm substâncias inibidoras do crescimento de alguns
grupos de bactérias, como o agar MacConkey que inibe o crescimento de cocos
gram positivos, sendo útil para o crescimento de bacilos gram negativos.
f-Meios diferenciais: meios usados como prova bioquímica, ou seja para avaliar se o
microrganismo possui uma enzima responsável por uma determinada via de
atividade metabólica. Exemplo: agar DNAse para verificar se a bactéria possui a
enzima desoxirribonuclease, que degrada o DNA.
g-Meio base: geralmente são meios utilizados como base à qual adicionamos
suplementos para obtermos um produto como o agar sangue, em que podemos usar
como meio base o agar tripticase soja ou o agar Columbia.
Alguns dos meios mais usados em microbiologia:
a-Agar sangue: meio não seletivo que possibilita o crescimento de diversos grupos
microbianos e permite verificar a presença de hemólise. Composição: meio base
agar tripticase soja com 5% de sangue de carneiro (adicionados quando o meio
estiver em torno de 50°C). Distribuir 20 a 25 ml em placas de 90 mm.
b-Agar chocolate: meio não seletivo que possibilita, além do que se obtem com o
uso do agar sangue, isolar ainda cepas de Haemophilus e de Neisseria.
Composição: agar GC ou agar Mueller-Hinton com 5% de sangue de carneiro
(adicionados com temperatura em torno de 80°C). Depois de achocolatado, o
meio é resfriado até 50°C quando então é adicionado o suplemento VX (10 ml
de suplemento/litro de meio).Distribuir de forma semelhante a do agar sangue.
c-Agar MacConkey: meio seletivo usado para isolamento de bacilos gram negativos
e para verificar a capacidade de fermentação da lactose. Lactose negativas são as
colonias transparentes. Lactose positivas as colonias de cor rosa.
d-Agar SS
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: meio seletivo e diferencial usado para o isolamento de Salmonella e
Shigella. Permite diferenciar as cepas lactose positiva e lactose negativa, além
de permitir visualizar as que produzem H2S.
e-Agar Thayer-Martin: meio seletivo usado para isolamento de cepas de Neisseria
gonorrhoeae. Composição: agar chocolate com suplemento VX e suplemento
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Alguns preferem utilizar o Agar XLD, por permitir mais facilmente identificar colônias de Shigella
e de Salmonella.
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VCNT (vancomicina, colistina, nistatina e trimetoprim), adicionados com o
meio com temperatura em torno de 50°C.
f-Caldo tioglicolato: usado para o crescimento de vários grupos de microrganismos,