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ELAINE DIAS DO CARMO
AVALIAÇÃO DA AÇÃO SISTÊMICA DE EXTRATO
LIOFILIZADO DE Pfaffia glomerata NA CARCINOGÊNESE
QUIMICAMENTE INDUZIDA PELO DMBA EM PELE DE
CAMUNDONGOS HAIRLESS
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-
Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL,
Área Biopatologia Bucal.
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ELAINE DIAS DO CARMO
AVALIAÇÃO DA AÇÃO SISTÊMICA DE EXTRATO LIOFILIZADO DE
Pfaffia glomerata NA CARCINOGÊNESE QUIMICAMENTE INDUZIDA
PELO DMBA EM PELE DE CAMUNDONGOS HAIRLESS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de DOUTOR, pelo Programa de Pós-Graduação em
BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia Bucal
Orientador: Prof. Adj. Luiz Eduardo Blumer Rosa
São José dos Campos
2007
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Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
Bellini AB. Manual para elaboração de monografias: estrutura do trabalho
científico. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2006.
Carmo, Elaine Dias.
Avaliação da ação sistêmica de extrato liofilizado de Pfaffia
glomerata na carcinogênese quimicamente induzida pelo DMBA em
pele de camundongos hairless/ Elaine Dias do Carmo; orientador
Luiz Eduardo Blumer Rosa._São José dos Campos, 2007.
107p.;IL
Tese (Programa de Pós-Graduação em Biopatologia Bucal, Área
Biopatologia Bucal)- Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista; 2007.
Palavras-chaves: Plantas medicinais; quimioprevenção; toxicidade
de drogas; 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno; carcinoma espinocelular;
camundongos endogâmicos HRS; imunoistoquímica
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 24 de outubro de 2007.
Assinatura:
E-mail: [email protected]/ dia[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Carmo ED. Avaliação da ação sistêmica de extrato liofilizado de Pfaffia
glomerata na carcinogênese quimicamente induzida pelo DMBA em pele
de camundongos hairless. [Tese]. São José dos Campos: Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos, UNESP; 2007.
Banca Examinadora
1) Prof. Adj. Luiz Eduardo Blumer Rosa
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
2) Prof. Dr. Daniel Araki Ribeiro
Departamento Ciências da Saúde
Universidade Federal de São Paulo
3) Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho
Divisão de Farmacologia e Toxicologia
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da
UNICAMP
4) Profa. Dra. Adriana Aigotti Haberback Brandão
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
5) Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Célio e Wanda, pelo amor que me orienta.
Ao meu marido, Juarez, pelo amor que me estimula.
Ao meu filho, Thomás, pelo amor que me inspira.
Ao meu sobrinho, João Victor, pelo amor que me encanta.
Aos meus irmãos, Régis e Eneida, pelo amor que me confiam.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador, Prof. Adj. Luiz Eduardo Blumer Rosa pela orientação,
amizade e incentivo à minha carreira acadêmica.
À Profª Adj. Rosilene Fernandes da Rocha pelo carinho, atenção e
principalmente pela confiança em meu trabalho.
À Profª. Drª. Adriana Aigotti Haberbeck Brandão pela amizade,
dedicação e apoio inestimável durante todos estes anos.
À Profª. Drª. Maria Nadir Gasparoto Mancini pela amizade e colaboração
em uma das etapas deste trabalho.
Às amigas, Susana, Gisele, Renata e Vanessa pela amizade e carinho a mim
dispensados, e em especial, à Andresa, grande amiga, incentivadora,
colaboradora e cúmplice deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, na pessoa do
diretor da F.O.S.J.C. Profº Dr. José Roberto Rodrigues pelo incentivo ao
ensino e a pesquisa.
À Profª Dra. Cristiane Yumi Koga Ito, Coordenadora do Programa de Pós-
Graduação em Biopatologia Bucal, pela dedicação ao nosso curso.
À Profª Adj. Yasmin Rodarte Carvalho pela competência, dedicação e
disposição em transmitir conhecimentos.
A todos os docentes do Programa de Pós-Graduação em Biopatologia Bucal
pela atenção que dedicaram à minha formação.
Aos alunos de Iniciação Científica Ana Paula, Micheline, Paula, Mariana e
Luciano pelo auxílio inestimável durante todas as etapas deste trabalho.
À Profª. Drª. Marília Trieveiler Martins pela atenção com que me recebeu
no Laboratório de Patologia/Imunoistoquímica da Faculdade de Odontologia
da Universidade de São Paulo para realização de uma etapa deste trabalho.
A todos os colegas de Pós-Graduação pelo convívio harmonioso durante todos
estes anos.
À amiga e técnica de laboratório, Ana Lourdes da Silva Machado, pela
amizade e auxílio na confecção das lâminas.
À Ângela de Brito Bellini, Diretora dos Serviços de Biblioteca e
Documentação, pela orientação e pelo excelente trabalho de revisão das
normas de apresentação deste trabalho.
Às funcionárias da Pós-Graduação Rose, Erena, Cidinha e Lilian pela atenção
e dedicação dispensadas.
Aos funcionários do Biotério, Antônio e Lourival, pelo auxílio na manipulação
dos animais durante a fase experimental deste trabalho.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e à Fundação para o Desenvolvimento da UNESP
(Fundunesp) pelo
apoio financeiro durante o curso de Doutorado.
“Devagar se vai ao longe, diz a moral da conhecida fábula de Esopo, da
tartaruga e a lebre. Muitas coisas que não podem ser superadas de
imediato cedem quando enfrentadas pouco a pouco. A assiduidade e a
persistência são irresistíveis e, com o tempo, superam e destroem as
mais poderosas forças, pois o tempo é amigo e protetor daqueles que
usam o juízo para aguardar a melhor ocasião e é inimigo destruidor
daqueles que se adiantam sem pensar.”
William J. Bennett
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................... 10
1 INTRODUÇÃO ..............................................................................
11
2 REVISÃO DA LITERATURA..........................................................
13
2.1 Carcinogênese............................................................................
13
2.2 Carcinogênese química induzida pelo 9,10-dimetil-1,2 -
benzantraceno.............................................................................
14
2.3 Modelos animais..................................... ...................................
16
2.4 Carcinoma de pele não-melanoma.............................................
17
2.5 Quimioprevenção........................................................................
19
2.5.1 Plantas e seus derivados utilizados na quimioprevenção do
câncer........................................................................................
21
2.6 Pfaffia glomerata.........................................................................
2.7 Toxicidade das plantas medicinais..............................................
2.8 Marcadores imunoistoquímicos associados à proliferação,
apoptose e angiogênese .............................................................
23
26
33
3 PROPOSIÇÃO ..............................................................................
39
4 MATERIAL E MÉTODO.................................................................
40
4.1 Animais........................................................................................
40
4.2 Obtenção de extrato liofilizado de Pfaffia glomerata...................
4.3 Administração sistêmica da P. glomerata...................................
40
41
4.4 Carcinogênese............................................................................
42
4.5 Avaliação clínica..........................................................................
43
4.6 Procedimentos cirúrgicos............................................................
4.6.1 Biópsia das lesões de pele ......................................................
4.6.2 Coleta de sangue.....................................................................
4.6.3 Remoção de fígado e rins........................................................
44
44
44
45
4.7 Avaliação histológica de pele......................................................
45
4.8 Avaliação imunoistoquímica........................................................
4.8.1 Análise quantitativa da expressão de PCNA, VEGF, bax e
bcl-2........................................................................................
4.9 Avaliação toxicológica ................................................................
4.9.1 Avaliação macroscópica de fígado e rins.................................
4.9.2 Avaliação histológica de fígado e rins......................................
4.9.3 Análises bioquímicas................................................................
4.9.3.1 Determinação da atividade enzimática de fosfatase alcalina
(ALP)......................................................................................
4.9.3.2 Determinação da atividade de aspartato aminotransferase
(AST)......................................................................................
4.9.3.3 Determinação da concentração de uréia..............................
4.10 Análise estatística.....................................................................
48
51
52
52
52
53
53
54
54
55
5 RESULTADOS..........…………………………………………………
5.1 Análise clínica.............................................................................
5.2 Análise histológica.......................................................................
5.3 Análise imunoistoquímica............................................................
5.4 Análise toxicológica.....................................................................
5.4.1 Análise macroscópica de fígado e rins.....................................
5.4.2 Análise histológica de fígado e rins..........................................
5.4.3 Análises bioquímicas................................................................
6 DISCUSSÃO…………………………………………………………...
7 CONCLUSÃO………………………………………………………….
8 REFERÊNCIAS..............................................................................
56
56
58
62
68
68
69
72
75
83
84
Anexo................................................................................................
Apêndices..........................................................................................
ABSTRACT……………………………………………………………….
102
103
107
CARMO ED. Avaliação da ação sistêmica de extrato liofilizado de Pfaffia
glomerata na carcinogênese quimicamente induzida pelo DMBA em pele
de camundongos hairless [tese]- Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2007.
RESUMO
Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito da administração sistêmica de extrato
liofilizado de Pfaffia glomerata em modelo de carcinogênese química em pele de
camundongos hairless, bem como investigar a toxicidade hepática e renal das doses
administradas. Foram utilizados 32 camundongos hairless, fêmeas com 5 semanas de
vida, distribuídos em grupos controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3). Os grupos E1,
E2 e E3 receberam a administração sistêmica de extrato liofilizado de P. glomerata nas
doses de 200, 400 e 1000 mg/Kg/dia, respectivamente, via oral, durante 15 semanas. O
grupo C recebeu somente água filtrada. Duas semanas após o início da administração
de extrato liofilizado de P. glomerata, os animais foram submetidos à carcinogênese
química induzida pelo DMBA a 0,5% na região do dorso. Na 15ª semana foi realizada a
avaliação clínica, biópsia das lesões de pele, coletada amostra de sangue e removidos
fígado e rins dos animais. As lesões de pele seguiram para avaliação histopatológica e
imunoistoquímica, os órgãos para análise histopatológica e as amostras de sangue para
toxicológica. Nesta última, foram realizadas as análises da atividade enzimática de
fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase e da concentração de uréia. Comparados
os grupos C e E o teste estatístico de Kruskal-Wallis não mostrou diferença estatística
significativa em relação ao tipo, tamanho e graduação de malignidade das lesões. Não
foi observada significância nas análises de fosfatase alcalina, aspartato aminotransferase
e uréia. O teste de correlação de Spearman mostrou relação significativa para VEGF e
PCNA e o qui-quadrado para infiltrado inflamatório em fígado e rins. Conclui-se que o
tratamento com as doses de 200, 400 e 1000mg/kg/dia de extrato liofilizado de P.
glomerata não apresentou ação quimiopreventiva e revelou indícios de toxicidade
hepática e renal neste modelo experimental.
PALAVRAS-CHAVES: Plantas medicinais; quimioprevenção; toxicidade de drogas; 9,10-
dimetil-1,2-benzantraceno; carcinoma espinocelular; camundongos endogâmicos HRS;
imunoistoquímica.
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma basocelular (CB) e o carcinoma espinocelular
(CEC), classificados como carcinomas de pele não-melanomas (CPNMs),
são as lesões malignas mais comuns em populações brancas em todo o
mundo e sua incidência aumenta a cada ano
8,37
.
Tal fato tem estimulado estudos com enfoque tanto
preventivo quanto terapêutico. A quimioprevenção é uma das
modalidades de controle do câncer de pele e consiste na utilização de
agentes químicos naturais ou sintéticos que previnem e detêm a
carcinogênese
9,50,58
.
Diversos estudos têm validado o uso de compostos
naturais e de seus derivados na quimioprevenção. Alguns destes
compostos estudados, que têm sido identificados como potenciais
agentes quimiopreventivos, são o chá verde, a cúrcuma, o alho, o tomate
e a Pfaffia. Tais agentes naturais, administrados sistêmica ou
topicamente, em modelos animais têm mostrado sua ação antineoplásica
nos diferentes estágios da carcinogênese
9,12,44,48,59,64,107
.
A busca por novos medicamentos é uma urgente
necessidade na quimioprevenção do câncer, sendo que os naturais são
considerados como uma rica e potencial reserva para a descoberta destas
novas substâncias anticarcinogênicas
110
.
As pesquisas devem buscar compostos naturais que
demonstrem eficácia farmacológica sem provocar efeitos colaterais, pois
os medicamentos naturais podem causar danos irreversíveis ao usuário,
decorrentes, por exemplo, da interação destes com outras plantas e até
mesmo com outros medicamentos alopáticos
25,32
.
12
As plantas do gênero Pfaffia, mostram-se promissoras na
quimioprevenção do câncer, já que os estudos em modelos animais
demonstraram suas propriedades antiinflamatória e antineoplásica e a
segurança de uso em relação à toxicidade
74,106,107,127
, justificando, desta
maneira, a realização deste trabalho.
2 REVISÃO DA LITERATURA
O câncer é um dos mais antigos males da humanidade
128
. A
denominação câncer foi utilizada pela primeira vez por Galeno
(aproximadamente 138-201 d.C.), origina-se da tradução latina da palavra
grega Karkinos (crustáceo, caranguejo)
20
e sua relação com carcinoma
deveu-se presumivelmente ao fato deste infiltrar qualquer região tecidual,
agarrando-se de modo obstinado à semelhança de um caranguejo
33
.
O câncer é um importante problema de saúde pública em
países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais
de seis milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de
todas as causas de morte no mundo
49
.
A etiopatogenia do câncer é entendida como resultado da
quebra dos mecanismos reguladores que governam o comportamento de
crescimento normal das células, ou seja, a regulação é perdida nas
células cancerosas que se proliferam de maneira descontrolada,
independente da necessidade de renovação celular, e finalmente
espalham-se por todo o organismo, interferindo nas funções dos tecidos e
órgãos
31,69
.
2.1 Carcinogênese
A carcinogênese envolve uma complexa sucessão de
eventos, que usualmente se desenvolve durante muitos anos e pode ser
dividida em três estágios: iniciação, promoção e progressão
20,31,53,67
.
14
A iniciação é o resultado de uma alteração genética que leva
à proliferação anormal de uma única célula
31,53
. Além desta alteração, ou
seja, da modificação no DNA, são necessárias a replicação e a
proliferação celular para que a mutação possa se fixar
67
.
Durante a promoção da neoplasia, o material genético
alterado das células iniciadas modifica a expressão dos genes que
regulam a diferenciação e o crescimento celular
67
, resultando na
proliferação ou expansão clonal das células iniciadas
20,53
.
Muitos carcinógenos são tanto iniciadores quanto
promotores. Entretanto, uma dose baixa não indutora torna-se efetiva se
administrada juntamente com substâncias não carcinogênicas, como por
exemplo, o 12-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato (TPA), conhecido
promotor de neoplasia. Tais substâncias podem levar à alterações da
proliferação celular e da expressão fenotípica
67
.
O terceiro estágio da carcinogênese consiste na
transformação de uma lesão pré-maligna para uma maligna, o que
envolve sucessivas modificações na expressão gênica das células
neoplásicas, além de depender também de fatores do hospedeiro
20,67
.
O câncer representa o resultado final de toda seqüência e é
estabelecido quando as células adquirem a capacidade autônoma de
invasão e metástase
53
.
2.2 Carcinogênese química induzida pelo 9,10-dimetil-1,2-
benzantraceno
A observação de que a exposição dos seres humanos a
determinadas substâncias presentes no meio ambiente ou em seu local
de trabalho poderiam levar ao desenvolvimento do câncer é muito antiga,
datando do final do século XVIII
67
.
15
Percival Pott (1775), conforme relatado em alguns
trabalhos
20,37,67
, foi o primeiro a observar que o câncer poderia ser
causado por agentes químicos, descrevendo que limpadores de chaminé
apresentavam risco aumentado de desenvolver CEC de escroto, devido à
exposição aos produtos do carvão e da fuligem que se depositavam sobre
a pele.
Os principais carcinógenos químicos capazes de
desencadear neoplasias malignas são os hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPAs), as aminas aromáticas, os azocompostos, as
nitrosaminas, os alquilantes, as aflatoxinas e o asbesto
20
.
Os HPAs são uma importante classe de agentes químicos
mutagênicos, encontrados no ambiente ocupacional e residencial e estão
entre os mais perigosos poluentes atmosféricos. Originam-se da queima
de plantações agrícolas, da indústria metalúrgica, da combustão do
carvão mineral e de derivados de petróleo, da fumaça de cigarro e da
produção de plásticos, pesticidas e tintas. Podem ser encontrados em
alimentos defumados, frutas, grãos e vegetais devido à deposição
atmosférica sobre estes últimos
11,20,69,94
.
Os HPAs são moléculas orgânicas formadas por átomos de
hidrogênio e carbono encontradas como subprodutos da combustão
incompleta de matéria orgânica. Estes compostos não são ativos na forma
em que são ingeridos ou inalados, tornando-se reativos apenas após
serem enzimaticamente convertidos por meio de reações específicas do
metabolismo
69
. São ativados pelo citocromo P450 e pelas hidrolases,
produzindo epóxidos capazes de se ligar ao DNA e iniciar o processo de
carcinogênese
11
.
O 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno (DMBA) é o
carcinógeno mais potente dentre os HPAs e é considerado um
carcinógeno completo, pois possui atividades iniciadora e promotora
simultâneas
52
.
16
2.3 Modelos animais
As exposições controladas de seres humanos às
substâncias perigosas ou potencialmente perigosas são restringidas por
considerações éticas. Deste modo, recorrem-se aos estudos em animais,
como modelos experimentais para que se possa analisar de maneira
comparativa os efeitos que estas substâncias provocariam em humanos
6
.
A carcinogênese química induzida em animais de
laboratório data de 1915, quando Yamagiwa e Ichikawa
123
, de acordo com
Boffeta et al.
15
, desenvolveram carcinomas de pele em coelhos, após
aplicações de carvão mineral. Em 1925, de acordo com citação de
Eveson
41
, Bonne
18
descreveu o desenvolvimento de papilomas na
mucosa bucal e no estômago de ratos que tiveram sua pele pincelada
também com carvão mineral. Os animais lambiam-se e provocavam
lesões nestes locais.
A combinação essencial entre um tecido suscetível e um
carcinógeno potente foi descoberta por Salley
103
, de acordo com a citação
de HELLER et al.
54
, quando ele demonstrou que aplicações de HPAs
produziam CEC em bolsa jugal de hamsters. Desde então, diversos
estudos têm utilizado o DMBA para a indução da carcinogênese em
diferentes órgãos, tecidos e sítios anatômicos
16,26,43,60,71-2,77
.
A pele tem sido muito utilizada no estudo da carcinogênese
química experimental, devido às facilidades de manipulação e de
observação das lesões
20,52
.
Estudos têm mostrado grande sucesso na utilização dos
camundongos hairless na indução da carcinogênese cutânea, sendo que
as principais vantagens são a facilidade de aplicação do carcinógeno, o
aparecimento de lesões em um menor período de latência e a avaliação
dos resultados
26,61,89,93,112
.
17
Em 1924, a mutação hairless (Hr
hr
) foi encontrada em um
camundongo encontrado em um aviário em Londres, o qual foi levado ao
The Jackson Laboratory em 1956, onde o Dr. Green cruzou este animal
com uma fêmea BALB/c. Posteriormente, os descendentes foram
cruzados entre si e em 1964, na geração F24, a espécie foi nomeada
HRS/J
117
.
A acetona é o veículo mais utilizado na diluição do pó de
DMBA, pois desde o trabalho de Salley
103
, citado por Heller et al.
54
,
estabeleceu-se que a acetona era menos tóxica, provocava menor índice
de mortalidade e exigia menor período de latência para o
desenvolvimento do CEC.
A concentração da solução de DMBA varia nos diversos
estudos, contudo a concentração de 0,25 a 0,5% são as mais utilizadas
na iniciação e na promoção da carcinogênese. As aplicações tópicas
variam de doze a cinqüenta semanas, de acordo com o tipo histológico da
lesão a ser desenvolvida
16,26,43,61,125
.
2.4 Carcinoma de pele não-melanoma
O processo de reorganização global, ou seja, a alteração na
demografia mundial, devido à redução nas taxas de mortalidade e
natalidade com aumento da expectativa de vida e envelhecimento,
determinou grande modificação nos padrões de saúde-doença no mundo.
Tal modificação, conhecida como transição epidemiológica, foi
caracterizada pela mudança no perfil de mortalidade com diminuição da
taxa de doenças infecciosas e aumento da taxa de doenças crônico-
degenerativas, especialmente as doenças cardiovasculares e o câncer
49
.
Alguns tipos de cânceres têm se tornado mais freqüente em
países onde existem fatores de risco como fumo, hábitos alimentares
18
pouco saudáveis e exposição a produtos químicos e a agentes físicos
carcinogênicos no trabalho ou no meio ambiente
128
.
Nos Estados Unidos são diagnosticados mais de um milhão
de novos casos de câncer de pele anualmente, representando
aproximadamente 40% de todos os novos casos de câncer
diagnosticados. Aproximadamente 80% dos cânceres cutâneos são
representados pelo carcinoma basocelular, 16% pelo carcinoma
espinocelular e 4% pelo melanoma
38
.
No Brasil, segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCa),
órgão vinculado ao Ministério da Saúde, a neoplasia maligna mais
freqüente na população brasileira é o CPNM. Foi estimado para o ano de
2006, um total de 116.640 novos casos, sendo 55.480 em homens e de
61.160 em mulheres. Estes valores correspondem a um risco estimado de
61 casos novos a cada 100 mil homens e 65 para cada 100 mil
mulheres
19
.
O CPNM origina-se dos queratinócitos da epiderme, sendo
que o CB pode causar grande morbidade, apesar de apresentar
crescimento lento e raramente provocar metástase, ao contrário do CEC
que metastatiza com freqüência
38
.
O crescente aumento do número de casos de CPNM deve-
se a uma maior exposição dos indivíduos à radiação ultravioleta (UV) do
Sol, que é considerado o principal fator etiológico do CPNM
8,118
. Contudo,
a exposição aos agentes químicos como os HPAs, compostos orgânicos
voláteis e metais pesados também levam ao desenvolvimento desta
neoplasia
11
.
A pele é um dos trajetos de entrada de agentes químicos no
corpo, sendo considerada como porta de entrada, pois quando os
poluentes penetram na pele, atingindo camadas abaixo da derme, e
alcançam a circulação sanguínea, podem causar danos a outros órgãos
11
.
19
2.5 Quimioprevenção
Apesar da alta incidência e dos inúmeros fatores de risco, o
CPNM apresenta altas taxas de cura quando diagnosticado
precocemente, além de ser passível de prevenção
37
.
A prevenção primária é uma das principais abordagens para
o controle do câncer de pele e o seu objetivo é reduzir a incidência destas
lesões. Para tal, preconiza-se evitar a exposição aos agentes
carcinógenos; aumentar os mecanismos de defesa do hospedeiro, através
da correção de deficiências nutricionais e estimular o consumo de dietas
diversificadas
58
.
O aumento da incidência de câncer em todo o mundo tem
estimulado os estudos em prevenção, sendo a quimioprevenção uma
promissora estratégia para se evitar a ocorrência de vários tipos de
cânceres, inclusive o carcinoma de pele
118
.
O termo quimioprevenção foi descrito pela primeira vez por
Sporn
109
em 1976, quando este se referiu à prevenção do
desenvolvimento do câncer através do uso de formas naturais da vitamina
A e de seus análogos sintéticos, denominados retinóides.
Atualmente, a quimioprevenção é definida como uma
estratégia intervencionista que consiste na administração de um ou mais
agentes naturais ou sintéticos que previnem ou detêm a
carcinogênese
48,50,58
.
A quimioprevenção, além de atuar na prevenção primária,
quando se quer evitar que indivíduos saudáveis venham a ter câncer,
pode atuar na prevenção secundária, quando a finalidade é bloquear a
evolução de lesões pré-malignas para câncer, e finalmente na prevenção
terciária, quando se quer evitar ou impedir o aparecimento de segundos
tumores primários
76
.
20
Desta maneira, existem três grupos de indivíduos candidatos
a quimioprevenção: indivíduos da população em geral, indivíduos que
sabidamente têm risco aumentado para o desenvolvimento do câncer e
indivíduos que já tiveram câncer, com a finalidade de impedir um segundo
tumor
76,118
.
Os agentes quimiopreventivos, naturais ou sintéticos, podem
ser divididos em duas categorias: agentes bloqueadores e agentes
supressores. Os agentes bloqueadores são compostos que impedem os
carcinógenos de alcançarem ou interagirem com o tecido alvo, atuando
como uma barreira. Deste modo, agem prevenindo a ativação de
carcinógenos ou de promotores da neoplasia, inativando-os antes que
atinjam o tecido alvo. Já os agentes supressores impedem a evolução do
processo neoplásico em células que, de outra forma, se tornariam
malignas
76
.
Os estudos em quimioprevenção ganharam força quando se
observou que o uso de inibidores da cicloxigenase-2 (COX-2) agia na
prevenção do câncer colo-retal. Verificou-se que pacientes que usavam
continuamente a Aspirina® para problemas cardiovasculares e cerebrais,
apresentavam menor incidência de câncer colo-retal, e em menor
proporção, outros tipos de cânceres
124
.
Atualmente, o mais importante nos estudos em
quimioprevenção é a padronização e o teste de novos agentes que agem
em alvos moleculares e celulares específicos. Além disso, é essencial que
a eficácia e a segurança destes novos agentes sejam validadas em
modelos experimentais em animais e em cultura de células antes de
serem realizados os testes clínicos
110
.
21
2.5.1 Plantas e seus derivados utilizados na quimioprevenção do câncer
A utilização de plantas com fins medicinais para prevenção e
tratamento de doenças é uma das mais antigas formas de prática médica
da humanidade
120
.
Foi através da observação e da experimentação pelos povos
primitivos que as propriedades terapêuticas de determinadas plantas
foram sendo descobertas e propagadas de geração em geração, fazendo
parte da cultura popular
119
. A informação, no início, foi transmitida
verbalmente, contudo após o aparecimento da escrita, passou a ser
compilada e guardada como um tesouro precioso
34
.
Atualmente, observa-se que a cada dia aumenta o interesse
e o consumo de plantas medicinais. Este fato é promovido pela
insatisfação com a medicina convencional; pelo desenvolvimento de
novas doenças com complicações severas e para as quais ainda não há
tratamento adequado; pela crença de que ervas medicinais são inócuas e
superiores às substâncias sintéticas; pela idéia de que aquilo que é
natural só pode ser bom e pela atenção que movimentos ecológicos têm
dado aos remédios naturais
24,25,113
.
Na prevenção e tratamento do câncer, as plantas também
exercem um importante papel
73
, pois muitos agentes quimiopreventivos e
quimioterápicos utilizados atualmente são derivados de plantas. Estima-se
que 2/3 dos medicamentos antineoplásicos aprovados em todo o mundo
sejam derivados de plantas
121
.
Uma ampla variedade de fitoquímicos, compostos químicos
derivados de plantas, é considerada como a maior fonte de medicamentos
antineoplásicos. Os fitoquímicos com potencial para quimioprevenção têm
sido classificados em grupos como: carotenóides, isotiocianatos,
glucosinolatos, sulfidos, saponinas, polifenóis e flavanóides
27,55,59,124
.
22
O paclitaxel e o docetaxel são agentes quimioterápicos
oriundos da planta Taxus brevifolia e utilizados no combate ao câncer de
mama, pulmão e ovário. As substâncias irinotecano, topotecano, 9-
aminocamptotecina e 9-nitrocamptotecina obtidas da planta Camptotheca
acuminata são utilizadas no tratamento do câncer de mama, ovário,
pulmão e colo-retal
73
.
Experimentos avaliando agentes quimiopreventivos naturais,
plantas medicinais e seus derivados em modelos animais e em cultura de
células têm mostrado a ação anticarcinogênica e não-tóxica destas
substâncias, através de efeitos inibitórios em vários estágios da
carcinogênese. Os mecanismos pelos quais tais compostos exercem sua
ação inibitória, ainda não estão totalmente elucidados. Porém, acredita-se
que na iniciação, estimulam a resposta imunológica, alteram o
metabolismo, aumentam a detoxificação do carcinógeno e aumentam a
reparação do DNA. Na promoção e progressão, induzem a supressão de
genes, suprimem a proliferação celular, bloqueiam danos oxidativos ao
DNA, estimulam a apoptose e inibem a angiogênese
44,126
.
A oxidação apresenta um papel relevante em muitas
doenças crônicas da pele, e também na iniciação e promoção da
carcinogênese. Estudos têm mostrado que carcinógenos ambientais,
incluindo a luz UV do Sol, à qual a população está constantemente
exposta, exercem seus efeitos biológicos em parte pela geração de
espécies de oxigênio reativo (ERO) e radicais livres. A geração de ERO e
de radicais livres apresenta papel importante na indução do câncer de
pele, especialmente na fase de promoção da carcinogênese. Assim, os
efeitos dos compostos antioxidantes presentes nas frutas e vegetais têm
recebido atenção especial com intuito de utilizá-los como agentes
quimiopreventivos do carcinoma cutâneo
50
.
23
2.6 Pfaffia glomerata
Dentre as plantas medicinais nativas brasileiras mais
utilizadas nos últimos anos, destacam-se as espécies do gênero Pfaffia,
conhecidas popularmente como ginseng brasileiro, para-tudo e fáfia
92,97
. A
espécie tem sido indicada para o tratamento de anemia, distúrbios
gástricos, doenças reumáticas, diabetes mellitus, fadiga crônica, estresse
e como coadjuvante no tratamento do câncer
45,74,87,88,92,116
.
São conhecidas cerca de 90 espécies de Pfaffia, distribuídas
na América Central e na América do Sul. No Brasil, foram descritas 27
espécies, sendo que as mais conhecidas são a Pfaffia paniculata, a
glomerata e a iresinoides, encontradas principalmente nos estados de
São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Mato Grosso e Amazonas
74,81,116
.
Figura 1 – Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen. Disponível em:
http://fm2.fieldmuseum.org/plantguides/jpgs/AMRA.pfaf-gl-bra-6282.jpg.
A planta apresenta como característica ramos moles e
nodosos nas articulações, sendo que a parte subterrânea é tuberosa,
24
apresentando uma parte de caule e a outra de raiz, que atinge porte
elevado. As folhas são opostas, membranáceas, simples e inteiras e as
flores pequenas surgem nos ramos terminais
92
.
São encontradas algumas diferenças interespecíficas na
composição química das espécies de Pfaffia, que podem definir perfis
farmacológicos e toxicológicos distintos, além de auxiliar na diferenciação
das espécies
99
.
A P. glomerata apresenta os ácidos glomérico, famérico e
oleanólico, além de ecdisterona e rubrosterona
105
. Na P. iresinoides são
encontrados a 25-0-β-D-glicopiranosil ecdisterona, 24-0- β-D-glicopiranosil
pterosterona, B-25-0- β-D- glicopiranosil-podecdisona, iresinosídeo A e B
e chikusetsusaponina
84
. A P. paniculata contém em sua composição
química dois fitoesteróis: sitosterol e estigmasterol que inibem a absorção
do colesterol, além de outros componentes, tais como β-ecdisona,
saponinas, alantoína, nortriterpenos, fafosídeos A, B, C, D, E, F e ácido
fáfico
79,84,90,115
.
Estudos têm mostrado a ação analgésica e antiinflamatória
da Pfaffia em modelos animais
75,82,116
. Em adição, de acordo com Neto et
al.
81
, a P. glomerata é usada popularmente como “novalgina”.
Mazzanti e Braghiroli
75
avaliaram a atividade analgésica e
antiinflamatória do extrato alcoólico de P. paniculata nas doses de 2,5; 5 e
10 g/kg em testes de placa quente e de indução de edema em patas de
ratos. Observaram que o extrato apresenta atividade antiinflamatória
neste modelo de inflamação aguda, pois houve a inibição do edema.
Verificaram ainda que é efetivo em dores inflamatórias, contudo não
apresenta resultado positivo em dores não-inflamatórias, pois foi ineficaz
no teste da placa quente. Concluíram que o extrato de P. paniculata tem
ação analgésica e antiinflamatória e apresenta baixa toxicidade, pois não
foi observado exsudato inflamatório no peritônio dos animais tratados.
O extrato aquoso de P. iresinoides em dose única de 25 e
50mg/Kg, apresentou efeito antiinflamatório em modelo de indução de
25
inflamação em ratos. Os resultados mostraram que o pó das raízes de P.
iresinoides é efetivo em doenças reumáticas, quando administrado
repetidas vezes por algumas semanas
116
.
Freitas et al.
45
examinaram os efeitos do extrato aquoso de
P. glomerata no trato gastrintestinal. Foram utilizados ratos Wistar pré-
tratados com a administração oral de 125, 250, 500 e 1000mg/Kg de P.
glomerata e com indometacina (20mg/Kg, via subcutânea), antes da
indução de úlceras pelos métodos de estresse restrito a hipotermia (3
horas a 4º C), etanol (administração oral de 0,5 ml de etanol a 70%). Os
resultados mostraram que a administração oral de P. glomerata, uma hora
antes da indução de lesões gástricas por estresse e pelo etanol diminuiu
o número total de lesões gástricas, o que não foi observado com a
indometacina. Concluíram que a P. glomerata é capaz de proteger a
mucosa gástrica e inibir a secreção de ácido gástrico.
Neto et al.
82
avaliaram os efeitos antiinflamatório e
analgésico do extrato hidroalcoólico de P. glomerata nas doses de 100,
200 e 300 mg/Kg. Para a avaliação da ação antiinflamatória foi induzido
edema em uma das patas do rato e para avaliar o efeito analgésico foi
usado o teste da placa quente, sendo que a resposta foi determinada a
cada 30 minutos, durante 120 minutos. O extrato de P. glomerata foi
administrado 30 minutos antes da indução de edema e do teste da placa
quente. Os resultados mostraram que tanto o efeito antiinflamatório
quanto o analgésico foram similares aos observados com os
antinflamatórios não-esteroidais, como a indometacina, sugerindo que o
mecanismo de ação da P. glomerata deve estar associado à inibição da
síntese de prostaglandina.
Estudos in vitro têm demonstrado que o extrato da raíz de P.
glomerata não apresenta efeito citotóxico sobre linhagens de células
tumorais
99
. Contudo, experimentos com animais têm mostrado a ação
anticarcinogênica da P. paniculata
74,106,107,127
.
26
Watanabe et al.
127
, estudando o efeito da administração
subcutânea e intraperitoneal de P. paniculata sobre a incidência de
leucemia espontânea em ratos AKR/J, observaram que houve supressão
da doença quando os animais tratados foram comparados com os
controles.
Matsuzaki et al.
74
investigaram a ação da administração oral
da P. paniculata no crescimento do tumor de Ehrlich em sua forma
ascítica. Verificaram que o volume total dos tumores foi significativamente
menor nos camundongos tratados, quando comparados com os animais
do grupo controle. Os resultados sugerem que este efeito está
relacionado à atividade antiinflamatória da P. paniculata.
Silva et al.
107
avaliaram os efeitos quimiopreventivos das
raízes de P. paniculata em lesões pré-neoplásicas hepáticas em
camundongos BALB/c. Os resultados do estudo mostraram que o
tratamento reduziu a incidência, a área e o número de lesões, indicando a
propriedade antineoplásica da P. paniculata e sua ação nas fases de
promoção e progressão da hepatocarcinogênese.
Não há relato na literatura demonstrando a ação
antineoplásica da P. glomerata em estudos in vivo, e aqueles que utilizam
a P. paniculata são escassos e não comprovam, apenas sugerem, quais
são os mecanismos de ação desta planta no processo de carcinogênese.
Desta maneira, novos estudos que comprovem a eficácia farmacológica e
o mecanismo de ação das plantas do gênero Pfaffia em modelos animais
de carcinogênese são necessários.
2.7 Toxicidade das plantas medicinais
Nos países em desenvolvimento, bem como nos
desenvolvidos, os apelos da mídia para o consumo de produtos à base de
27
fontes naturais aumentam a cada dia. Os ervanários prometem saúde e
vida longa, com base no argumento de que as plantas são efetivas e
seguras para o uso em um grande número de doenças
120
.
Contudo, a idéia de que as plantas e seus derivados são
seguros e estão livres de efeitos colaterais é falsa, pois estas podem
conter centenas de constituintes em sua composição e alguns deles
podem ser altamente tóxicos
24
.
A toxicidade das plantas medicinais é conhecida desde a
Antigüidade, quando o filósofo e botânico Teofrasto, escreveu a sua obra
“História das Plantas”, em que deixou descrições botânicas preciosas
sobre as propriedades curativas e os efeitos tóxicos das plantas
34
.
Atualmente, entende-se que a toxicidade das plantas
medicinais é um sério problema de saúde pública, pois podem provocar
graves efeitos colaterais. Tais efeitos podem ser causados pela toxicidade
natural dos constituintes da planta, pois esta pode apresentar substâncias
potencialmente perigosas. Pesquisas têm mostrado que muitas plantas
possuem substâncias potencialmente agressivas, devendo ser utilizadas
com cuidado, respeitando seus riscos toxicológicos
25,120
.
Outros fatores também têm sido associados aos riscos de
efeitos colaterais, como o uso concomitante de diferentes plantas;
interações entre plantas medicinais e medicamentos alopáticos;
automedicação; efeitos de superdosagens; presença de contaminantes
como microrganismos, metais pesados e agrotóxicos; armazenagem
inadequada do produto; adulteração durante o acondicionamento e forma
de uso
25,32,98,111,120
.
As plantas medicinais possuem atividade farmacológica
significativa, e conseqüentemente, podem interagir com outras plantas e
com os medicamentos alopáticos
113
, como corticosteróides, fármacos
depressores do sistema nervoso central e analgésicos opióides,
produzindo sérios efeitos colaterais
62
. Um exemplo clássico é o uso
concomitante de antiinflamatórios não-esteroidais e ervas que apresentam
28
atividade antiplaquetária, levando a um aumento do risco de sangramento
estomacal ou de qualquer outro órgão
1
.
As interações medicamentosas podem ser sinergistas,
quando a planta aumenta ou potencializa a ação do medicamento. Mas,
podem ser também antagonistas, pois as interações entre a planta
medicinal e o medicamento alopático envolvem mecanismos
farmacodinâmicos e farmacocinéticos que podem resultar em efeitos
benéficos ou colaterais
1
.
A automedicação também é um grave problema, pois os
pacientes nem sempre mencionam a utilização de plantas medicinais
quando questionados sobre o uso de medicamentos
28
. Estudos mostram
que 70% dos pacientes não revelam ao seu médico ou a outro
profissional de saúde que estão usando algum tipo de medicamento
natural
32,62
.
Outro grande risco para a população são os fitoterápicos
contaminados com metais pesados, principalmente arsênio e mercúrio,
que causam efeitos tóxicos graves, como neuropatia e dor abdominal
aguda
32,36
. O risco aumenta para aqueles fitoterápicos importados de
países asiáticos, uma vez que suas formulações são bastante diferentes
das preparadas pelos ocidentais, contendo altas concentrações de metais
pesados, muitas vezes, ultrapassando os valores seguros para o
consumo
120
.
Com relação à adulteração, muitas preparações são
usualmente compostas por uma mistura de diversas ervas, que podem
conter um grande número de substâncias com propriedades
desconhecidas, toxicidade pré-existente e efeitos incertos
36,83
.
Existe também o risco da adulteração do medicamento
natural com antiinflamatórios esteroidais e não-esteroidais, estimulantes
do sistema nervoso central, diuréticos e antibióticos
32,36,39,83
.
A possibilidade de contaminações com microrganismos deve
ser atentamente observada, em especial quando se faz uso de plantas
29
medicinais vendidas em feiras e mercados populares, como ocorre
comumente no Brasil
120
.
Na Europa há mais controle no registro e na comercialização
dos produtos obtidos de plantas, pois as normas para a certificação e o
controle de qualidade de preparações vegetais são mais rígidas. No
Brasil, as pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de plantas
medicinais ainda são incipientes, assim como o controle da
comercialização pelos órgãos oficiais em feiras livres, mercados públicos
ou lojas de produtos naturais. Desta maneira, as plantas medicinais da
flora nativa são consumidas com pouca ou nenhuma comprovação de
suas propriedades farmacológicas, e muitas vezes são empregadas para
fins medicinais diferentes daqueles utilizados por silvícolas
120
.
A crença de que medicamento natural não faz mal e o seu
uso inadequado tem provocado diversos efeitos colaterais na população,
podendo atingir diferentes órgãos e sistemas, como coração, fígado, pele,
rins e sistema nervoso
40,83,107
.
É importante ressaltar ainda que o risco de efeitos colaterais
aumenta em crianças, idosos e, particularmente, em gestantes, pois as
plantas medicinais nem sempre são testadas quanto aos seus efeitos
abortivo e teratogênico
1,32
.
O padrão dos efeitos colaterais desencadeados por plantas
medicinais é similar ao observado com o uso de medicamentos
alopáticos
83
. Os efeitos colaterais mais observados em pacientes que
fazem uso de plantas medicinais prescritas por um profissional ou por
automedicação são as reações alérgicas, tóxicas, cefaléia, náusea,
vômito, diarréia, hepatotoxicidade, nefrotoxicidade e convulsão
25
.
As reações alérgicas podem variar de uma dermatite de
contato, passando por erupções pruriginosas, urticária, fotosensibilização,
chegando até a reação anafilática. Estudos têm mostrado que a erva de
São João (Hypericum perforatum), babosa (Aloe vera), eucalipto
(Eucalyptus glóbulos) e henna (Lawsonia inermis) podem causar sérios
30
efeitos colaterais na pele. Ervas medicinais que contêm arsênio e
mercúrio em sua composição também podem desencadear lesões
dérmicas
13,39
. Os óleos essenciais usados topicamente para aromaterapia
e em cremes podem causar fotosensibilização
39
.
Ernst
40
relata que algumas plantas medicinais, como o
ginseng (Panax ginseng), valeriana (Valeriana officinalis), ginkgo (Ginkgo
biloba) e a erva de São João (Hypericum perforatum) têm sido associados
a efeitos psiquiátricos e neurológicos adversos. Foram relatados efeitos
como arterite cerebral, edema cerebral, delírio, coma, confusão,
encefalopatia, alucinações, hemorragia intracerebral, distúrbios de humor,
desordens de movimento, fraqueza muscular e parestesia. Estes efeitos
estão relacionados aos constituintes das plantas, à sua contaminação
e/ou adulteração, às interações com outros medicamentos e à
superdosagem.
As plantas medicinais e/ou seus metabólitos podem
provocar lesões celulares principalmente no fígado e nos rins, devido à
intensa participação destes órgãos na degradação e excreção desses
produtos
51
.
A atividade metabólica do fígado é bem conhecida por sua
capacidade de detoxificar ou excretar na bile muitos medicamentos
51
. A
lesão hepática provocada por medicamentos, resulta de toxicidade direta;
da conversão hepática de um xenobiótico em uma toxina ativa; ou de
mecanismos imunes, em geral por uma droga ou metabólito que atua
como hapteno para converter uma proteína celular em um imunógeno
33
.
Os medicamentos naturais são biotransformados no fígado
pela ação de enzimas metabolizadoras, tais como as enzimas do sistema
citocromo P450, monooxigenases, glutationa-S-transferase,
sulfotransferases e UDP-glucuronosiltransferases
111,113
.
As injúrias no fígado provocadas pelos remédios naturais
incluem principalmente aumento dos níveis séricos das transaminases,
necrose focal, esteatose, injúria ducto-biliar, injúria vascular,
31
especialmente doença veno-oclusiva, hepatite aguda e crônica, colestase
e cirrose
28,111,113
.
Tais injúrias são freqüentemente causadas por alcalóides
pirrolizidínicos encontrados em grande número de plantas medicinais,
como por exemplo, no confrei (Symphytum officinalis) que possui
potencial hepatotóxico
28,111,113
. Há alguns anos, o confrei levou à
ocorrência de óbitos, decorrrentes de cirrose resultante de doença
hepática veno-oclusiva, e desta forma, teve seu uso condenado pela
Organização Mundial de Saúde (OMS) e foi legalmente proibido no Brasil
para o uso interno (Portaria 10/SVS, 10.03.1992)
98,120
.
A avaliação da toxicidade hepática pode ser realizada por
meio da análise histológica do fígado e também por análises bioquímicas
em que pode ser investigada a dosagem de fosfatase alcalina (ALP) e
aspartato aminotransferase (AST); enzimas cuja elevação sérica constitui-
se em indicativo de hepatotoxicidade
96
.
A AST também conhecida como transaminase glutâmico-
oxalacética (GOT ou TGO) é uma enzima encontrada em concentração
muita alta no músculo cardíaco, fígado, músculos esqueléticos e em
menor concentração nos rins e pâncreas
66
.
Nas células hepáticas, a AST localiza-se no citoplasma e na
mitocôndria. Lesões ou doenças hepatocelulares de qualquer etiologia
(hepatite aguda e crônica, disfunção hepática induzida por medicamentos,
tumor hepático metastático, cirrose, etc) afetando o parênquima hepático
libera uma maior quantidade da enzima para a corrente sanguínea,
elevando os níveis séricos da AST
66
.
A fosfatase alcalina compreende um grupo de enzimas
fosfohidrolase encontrada em vários tecidos, com maiores concentrações
no fígado, epitélio do trato biliar e tecido ósseo. No fígado, a fosfatase
alcalina é secretada pelos hepatócitos e pelas células do trato biliar.
Patologias como cirrose, obstrução biliar intra e extra-hepática, tumor
primário ou metastático do fígado e disfunção hepática induzida por
32
medicamentos podem aumentar os níveis de fosfatase alcalina na
circulação sanguínea
66
.
Os rins também são bastante afetados pela eliminação de
substâncias tóxicas, pois constituem o principal mecanismo de excreção
dos metabólitos, dos quais o organismo já não necessita. Entre estas
substâncias incluem-se a uréia, creatinina, ácido úrico, os produtos finais
da degradação da hemoglobina, como a bilirrubina e os metabólitos de
diversos hormônios. Estas substâncias têm que ser eliminadas do corpo
tão rapidamente quanto são produzidas. Os rins também eliminam toxinas
e outras substâncias ingeridas, como pesticidas, medicamentos e aditivos
alimentares
51
.
A uréia, a creatinina e o ácido úrico são compostos
nitrogenados não-protéicos (NNP) formados no organismo a partir do
catabolismo das proteínas, ácidos nucléicos e aminoácidos. Como os rins
exercem uma função importante na excreção dos metabólitos citados, a
determinação laboratorial destes é muito empregada para o diagnóstico,
prognóstico e acompanhamento de diversas patologias renais
66
.
A uréia é o principal composto NNP do sangue, sendo
formada no fígado a partir da amônia e do gás carbônico, através do ciclo
da uréia. Mais de 90% da uréia formada no fígado é eliminada pelos rins,
pele e trato gastrointestinal. Nos rins, a uréia é filtrada livremente e cerca
de 40 a 70% sofre reabsorção passiva nos túbulos renais
66
.
Desta maneira, é essencial que as plantas medicinais sejam
avaliadas em modelos experimentais quanto a seu possível potencial
tóxico e que demonstrem eficácia farmacológica antes de serem
comercializadas.
33
2.8 Marcadores imunoistoquímicos associados à proliferação,
apoptose e angiogênese
Os métodos imunoistoquímicos baseiam-se na utilização de
anticorpos que reconhecem antígenos específicos e, portanto, realçam os
constituintes específicos das células
21
.
A imunoistoquímica é uma técnica essencialmente
qualitativa. Embora métodos quantitativos sejam muito utilizados para
determinar o número de elementos presentes ou a intensidade da reação,
seu objetivo fundamental é o encontro e a localização topográfica de
antígenos nos tecidos
20
.
Desta maneira, têm-se utilizado com grande freqüência,
marcadores imunoistoquímicos que auxiliam no diagnóstico, prognóstico e
tratamento das neoplasias. A imunoistoquímica permite conhecer a
origem das células neoplásicas com base em marcadores moleculares, e
não somente em relação aos aspectos morfológicos das lesões. Além
disso, permite conhecer o comportamento biológico e o prognóstico da
lesão
21
.
Através desta técnica também é possível avaliar os
mecanismos de ação molecular e celular dos agentes
quimiopreventivos
110
. Múltiplos mecanismos podem estar envolvidos na
quimioprevenção do câncer, tais como inibição da inflamação e da
proliferação celular, supressão da angiogênese, modulação da
diferenciação celular e apoptose
126
.
O PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) é um dos
antígenos mais utilizados para detecção e quantificação das taxas de
crescimento tecidual normal e/ou neoplásico. É uma proteína nuclear não-
histona de 36 Kda, com papel crítico na fase inicial da proliferação celular,
atuando como cofator da enzima DNA polimerase-α. Aparece no núcleo
34
celular durante a fase G1, atinge seu máximo na fase S, declina durante a
fase G2 e apresenta níveis não-detectáveis na fase M do ciclo celular
42,46
.
Nos tecidos normais, os estímulos anti-proliferativos mantêm
as células no estado G0, garantindo desta forma a homeostase tecidual,
enquanto que, em neoplasias, as células proliferam independentemente
da necessidade de renovação celular. O índice de proliferação celular é
um fator tradicionalmente associado com o comportamento da
neoplasia
68
.
Além da proliferação, também é possível o estudo da
apoptose e de suas proteínas reguladoras, estabelecendo-se um balanço
entre proliferação e morte celular
21
.
A apoptose, também denominada de morte celular
programada, é um processo fisiológico de morte celular pelo qual as
células que perderam suas funções ou apresentam defeitos são
eliminadas do organismo. Desta forma, está implicada em muitas
doenças, incluindo-se o câncer, doenças auto-imunes, cardiovasculares e
neurovegetativas
47
.
Na apoptose um programa de "suicídio" é ativado dentro da
célula, levando à fragmentação do DNA, vacuolização do citoplasma,
alterações da membrana e morte da célula sem lise ou dano às células
vizinhas
3
.
A indução da apoptose é atualmente reconhecida como uma
promissora estratégia no tratamento e na prevenção do câncer
14
. A
resistência a apoptose é uma característica provavelmente inerente a
todos os cânceres, onde a célula cancerosa deve ser capaz de evadir-se
ao controle dos sensores pró-apoptóticos para que obtenha sucesso
68
.
Os marcadores relacionados a apoptose como o bcl-2 e bax
têm sido amplamente estudados nas diferentes fases da carcinogênese e
em diversos tipos de câncer
7,13,23,35,56,85,100,101
.
O gene bcl-2 foi associado pela primeira vez à inibição da
apoptose em 1988
68
. Este gene está localizado no braço longo do
35
cromossomo 18q21 que codifica uma proteína de mesmo nome, membro
de uma grande família de proteínas, que contêm membros pró-
apoptóticos (bax, bak, bad, bid) e anti-apoptóticos (bcl-2, bcl-xl, bcl-
w)
23,33,35,68
.
A proteína bax é expressa em órgãos como rins, fígado e
pâncreas que contêm pouca ou nenhuma expressão de bcl-2. Em
linfonodos, há uma superexpressão de bax nos centros germinativos, pois
estes apresentam uma alta taxa de apoptose
108
.
A proteína bcl-2 suprime a apoptose de dois modos: por
ação direta sobre as mitocôndrias, liberando o citocromo-C que é o mais
potente catalisador de morte celular e por efeitos mediados por interações
com outras proteínas
33,68
.
As moléculas da proteína bcl-2 parecem agrupar-se na
membrana externa das mitocôndrias. Estudos recentes indicaram que a
expressão aumentada de bcl-2 nesta região impede que a mitocôndria
perca seu gradiente de potencial, o que inibe a resposta aos sinais
apoptóticos
69
. Assim, é possível observar uma forte expressão da família
bcl-2 em cânceres
108
, inclusive em carcinomas de pele não-melanoma
35
.
Estudos têm mostrado que a superexpressão das proteínas
bcl-2 e bcl-xl, ao mesmo tempo, aumentam a resistência a múltiplos
quimioterápicos e à radioterapia
69
. Por outro lado, algumas drogas
quimioterápicas usadas atualmente, como a cisplatina e o 5-fluoracil,
induzem a apoptose. Contudo não o fazem somente em células
neoplásicas, ou seja, atuam também em células normais, sugerindo que
este processo pode contribuir para a toxicidade associada à
quimioterapia
55,70
.
Desta maneira, o desenvolvimento de agentes
antineoplásicos mais seletivos, ou seja, com melhor distinção entre as
células neoplásicas e normais, é possivelmente o maior objetivo das
recentes pesquisas em câncer
5,70
.
36
A angiogênese constitui um outro importante pré-requisito
para o desenvolvimento do câncer
57
, visto que as neoplasias não podem
ultrapassar um a dois milímetros de diâmetro ou de espessura, sem
serem vascularizadas. Além disso, as células neoplásicas são incapazes
de promover metástases sem acesso à vasculatura
33
.
A regulação de crescimento de vasos sanguíneos para
corresponder às necessidades do tecido normal depende de fatores
indutores e inibidores da angiogênese, sendo que, dentre os indutores, os
mais importantes são o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e
o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e, entre os inibidores, a
trombospondina e os interferons
21,33,68
.
Os cânceres promovem a angiogênese através da quebra
do equilíbrio entre os indutores e inibidores, podendo ser observado o
aumento da expressão de indutores ou a diminuição da expressão de
inibidores ou ambos os processos simultaneamente
68,108
. Os mecanismos
regulatórios são complexos, contudo, parece que oncogenes e genes
supressores de tumor, como o Ras e o p53, são capazes de modificar
este equilíbrio
17,68
.
Nos cânceres, os fatores angiogênicos podem ser
produzidos pelas próprias células neoplásicas ou por células inflamatórias
que infiltram as neoplasias
33
. O VEGF é o principal promotor da
angiogênese em tumores sólidos, portanto está comumente expresso
numa ampla variedade de células neoplásicas
5,33,63,114
.
O controle de produção de VEGF é feito por meio de
mudanças na estabilidade de seu RNA mensageiro e de sua taxa de
transcrição. Por exemplo, a hipóxia causa um aumento na concentração
intracelular da forma ativa da proteína reguladora fator I induzido por
hipóxia (HIF-1), que estimula a transcrição do gene VEGF. Desta forma, a
proteína VEGF é secretada, difunde-se através do tecido e atua sobre as
células endoteliais
3
.
37
Nos cânceres, o VEGF atua no endotélio, induzindo sua
proliferação, migração e diferenciação em novos capilares
20
. A invasão de
células endoteliais é um evento essencial durante a angiogênese. As
células endoteliais são ativadas, degradam a matriz extracelular, migram
através dela e proliferam, formando novos vasos sanguíneos
30
. A
produção de enzimas líticas capazes de digerirem componentes
específicos da matriz extracelular é que favorecem a invasão celular
15,21
.
Como a angiogênese é crítica para o crescimento e a
disseminação dos cânceres, têm sido realizados inúmeros estudos,
utilizando-se inibidores da angiogênese como adjuvantes na terapia do
câncer
15,33
.
As células endoteliais que estão no processo de formação
de novos vasos expressam distintos marcadores de superfície,
possibilitando uma maneira promissora pela qual elas podem ser
atacadas sem colocar em risco os vasos sanguíneos, já existentes nos
tecidos não-cancerosos
3
.
Em geral, o VEGF é superexpresso em tumores sólidos e
neoplasias malignas hematológicas, sendo um indicador de prognóstico
ruim e curta sobrevida
14
. O papel do VEGF na angiogênese, progressão e
prognóstico da doença tem sido extensivamente estudado em displasia e
em CEC de boca
57
. Em carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço
tem sido observado um aumento na expressão de VEGF nos casos mais
avançados que apresentam curta sobrevida dos pacientes
63
.
Estudos recentes demonstram que a expressão de VEGF é
detectável em metade dos cânceres humanos, tais como o colo-retal,
tireóide, próstata, estômago, pulmão e esôfago. Os estudos também
apontam a correlação entre a expressão de VEGF, o crescimento do
tumor primário e o desenvolvimento de metástases
21,63
.
Em neoplasias cutâneas é observado um aumento na
produção de VEGF, sugerindo que seus altos níveis estão relacionados
com o comportamento biológico agressivo destes tipos de câncer
65
.
38
Novas drogas anti-VEGF, já estão sendo avaliadas nestas neoplasias em
testes clínicos
30
.
Estudos têm mostrado que drogas como os antiinflamatórios
não-esteroidais, principalmente os inibidores da COX-2, levam à inibição
da angiogênese, proporcionando novas possibilidades do uso de agentes
naturais e sintéticos com propriedades antiinflamatórias na prevenção e
cura do câncer
4,122
.
Desta maneira, nota-se que os processos de proliferação
celular, apoptose e angiogênese são importantes no desenvolvimento do
CEC, e o que se busca são novos agentes quimiopreventivos, naturais ou
sintéticos, que interfiram bloqueando estes processos.
3 PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito da
administração sistêmica da Pfaffia glomerata na carcinogênese química
experimental em pele de camundongos hairless, bem como investigar a
toxicidade hepática e renal das doses administradas.
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais
Foram utilizados 32 camundongos Hairless (HRS/J -
Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), fêmeas, adultos, com cinco
semanas de vida e peso em torno de 25g.
Os animais foram alojados no Biotério da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos – UNESP, sendo distribuídos oito
animais em quatro gaiolas de policarbonato e alimentados com ração
(Guabi – Nutrilabor) durante todo o experimento.
Este trabalho experimental seguiu os Princípios Éticos na
Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA), com a aprovação fornecida pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos – UNESP, sob o Protocolo n
o
016/2005-PA/CEP de
09/08/2005 (Anexo A).
4.2 Obtenção de Extrato de Raízes de Pfaffia glomerata
O extrato de P. glomerata tem sua origem no campo
experimental do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas
e Agrícolas (CPQBA) – UNICAMP e nos foi cedido pela Profa. Dra.
Carmen Lucia Queiroga da Divisão de Fitoquímica. As raízes de P.
41
glomerata secas foram moídas com gelo seco em moinho de facas, e em
seguida, extraídas com etanol 70% por três vezes sob agitação mecânica.
O extrato permaneceu sob refrigeração a 8º C (geladeira)
devido a limitação da evaporação do solvente. Em média evaporou-se 1,5
litros de extrato por dia.
Após a filtração, parte do extrato foi concentrado em
evaporador rotativo e liofilizado fornecendo uma goma. A outra parte do
extrato foi centrifugada a 3200 rpm por 40 minutos.
O extrato (50g) foi concentrado em evaporador rotativo e
liofilizado, obtendo-se um sólido higroscópico.
4.3 Administração sistêmica da P. glomerata
Os animais foram distribuídos em três grupos
experimentais (E1, E2 e E3) e um grupo controle (C), sendo oito animais
em cada grupo (Figura 1).
Para os animais do grupo E1 foram administrados
200mg/Kg/dia do extrato liofilizado de Pfaffia glomerata dissolvido em
160ml de água filtrada (Figura 1a). A solução foi oferecida ad libitum aos
animais, em substituição à água de beber, a partir da primeira até a
décima quinta semana do experimento.
Para o grupo E2 foram administrados 400mg/Kg/dia
(Figura 1b) e para o grupo E3 1000mg/Kg/dia (Figura 1c). Aos animais do
grupo C foi administrada somente água filtrada ad libitum, como descrita
para os grupos experimentais (Figura 1d).
42
a) Grupo E1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
b) Grupo E2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
c) Grupo E3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
d) Grupo C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
200mg/Kg/dia
Pfaffia glomerata
400mg/Kg/dia
Pfaffia glomerata
1000mg/Kg/dia
Pfaffia glomerata
Água filtrada
DMBA
Eutanásia dos animais
FIGURA 2 – Cronograma do experimento e distribuição dos grupos experimentais e
controle: a) grupo E1 200mg/Kg/dia; b) grupo E2 400mg/Kg/dia; c) grupo
E3 1000mg/Kg/dia; d) grupo C água filtrada.
4.4 Carcinogênese
Nos animais dos grupos experimentais (E1, E2 e E3) e
controle (C), foi aplicada a solução de DMBA (Sigma Chemical, St. Louis,
MI, USA) a 0,5% diluída em acetona, previamente preparada em capela e
estocada a 4ºC.
A aplicação da solução de DMBA foi realizada uma vez
por semana até a décima quarta semana, sendo que a primeira aplicação
ocorreu somente a partir da terceira semana do experimento (Figura 1).
43
Cada aplicação consistiu de três pinceladas da solução,
com pincel de pêlo de camelo número zero (Tigre®), na região da crista
ilíaca no dorso dos animais, dos lados direito e esquerdo. Antes de cada
aplicação, o operador teve o cuidado de realizar a remoção do excesso
de solução. Para isso o pincel foi pressionado contra as paredes do frasco
que continha a solução de DMBA.
Durante a aplicação da solução de DMBA, os animais
foram submetidos à contenção física, sem a necessidade de sedação.
Para realização dos procedimentos, ou seja, durante toda a etapa de
aplicação e manipulação da solução de DMBA, foram necessários dois
operadores, que utilizaram paramentação adequada de proteção
individual, consistindo de avental cirúrgico, luvas de nitrilo, máscara para
proteção respiratória com filtro e máscara de proteção facial.
4.5 Avaliação clínica
Na 15ª semana do experimento, todos os animais (C, E1,
E2 e E3) foram submetidos à avaliação das lesões cutâneas clinicamente
visíveis na região de aplicação da solução de DMBA.
Para realização deste procedimento, os animais foram
anestesiados com a solução de cloridrato de xilazina (Anasedan®) e
cloridrato de cetamina (Dopalen®), na proporção de 0,8:0,5
administrando-se 0,1ml/100g de peso, por via intramuscular.
Em seguida, os animais foram fotografados e as lesões
presentes avaliadas quanto ao tamanho e aspecto (elevada, plana,
ulcerada). Todos estes dados foram anotados em uma ficha pré-
confeccionada (Apêndice A).
44
4.6 Procedimentos cirúrgicos
Os animais foram mantidos anestesiados para a realização
de todos os procedimentos cirúrgicos. Somente após a coleta do material
a ser examinado foi realizada a eutanásia dos animais utilizando-se uma
dose excessiva da solução anestésica, por via intramuscular.
4.6.1 Biópsia das lesões de pele
Os animais foram mantidos anestesiados para a realização
da biópsia excisional, no qual foi removida a maior lesão encontrada no
dorso do animal.
Imediatamente após a biópsia, o material foi identificado e
armazenado em formol tamponado a 10%.
4.6.2 Coleta de sangue
Foi feita uma incisão na região abdominal do animal para
exposição da artéria aorta. Em seguida, com o auxílio de uma seringa de
vidro (volume 5 ml) heparinizada foi coletada uma amostra de
aproximadamente 2 ml de sangue.
O material coletado foi imediatamente transportado para
tubos de ensaio acondicionados em gelo, e em seguida, armazenados a
-20ºC.
45
4.6.3 Remoção de fígado e rins
Foram removidos o fígado e os rins dos animais para
avaliação macroscópica e histológica. O material coletado foi identificado
e armazenado em formol tamponado a 10%.
4.7 Avaliação histológica de pele
As lâminas coradas pela HE e PAS, foram analisadas
qualitativamente por meio de microscopia de luz (Axiophot – Axioplan –
Carl Zeiss, Oberküchen, Germany).
Dois observadores calibrados, utilizando as lâminas
coradas pela HE, realizaram primeiramente a análise histológica por meio
da graduação de malignidade proposta por Bánóczy e Csiba
10
.
Posteriormente, foi avaliada a integridade da membrana basal nas
amostras coradas pelo PAS.
Desta maneira, quando a membrana basal mostrou-se
integra, as lesões foram classificadas em não-infiltrativas (NI), e quando
observado o rompimento da membrana basal em infiltrativas (I). Para
avaliação das lesões infiltrativas foi utilizada a graduação histológica de
Broders
22
.
Para facilitar a inclusão dos dados relacionados à
graduação de malignidade e de Broders
22
foi previamente confeccionada
uma ficha para anotação dos dados (Apêndice B).
A listagem apresentada a seguir inclui os critérios de
Bánóczy e Csiba
11
:
46
a) queratinização:
- ausente: ausência das camadas de paraqueratina e
ortoqueratina;
- paraqueratina: camada de queratina, nas quais
núcleos epiteliais ficam retidos;
- hiperparaqueratina: aumento da espessura da
camada de paraqueratina;
- ortoqueratina: camada de queratina, nas quais há
perda dos núcleos epiteliais;
- hiperortoqueratina: aumento da espessura da camada
de ortoqueratina.
b) camada granulosa:
- ausente;
- presente.
c) epitélio:
- sem projeções papilíferas;
- com projeções papilíferas exofitícas;
- atrofia: redução do número de camadas do epitélio;
- hiperplasia: aumento do número de camadas de
células do epitélio, alongamento dos cones epiteliais;
- acantose: espessamento do epitélio às custas de um
aumento de células da camada espinhosa;
- espongiose: edema intercelular;
- exocitose: presença de células inflamatórias no
epitélio.
d) atipias celulares:
- pleomorfismo celular e nuclear: variações da forma e
do tamanho da célula e do núcleo;
- perda de estratificação epitelial: maturação epitelial
alterada com desorganização do arranjo em camadas,
que pode se estender por toda a espessura do epitélio;
47
- hipercromatismo nuclear: os núcleos apresentam-se
mais basofílicos que o normalmente observado;
- aumento do tamanho do núcleo: relação núcleo/
citoplasma alterada;
- núcleolos aumentados: tanto em tamanho quanto em
número;
- duplicação da camada basal: camada basal ou
germinativa com duas ou mais camadas de células;
- queratinização individual ou de grupos de células na
camada espinhosa ou em camadas mais profundas;
- projeção dos cones epiteliais em gota: projeções
epiteliais, nas quais a porção terminal da projeção é
mais ampla do que sua base;
- figuras mitóticas na porção mediana do epitélio:
podem ser encontradas em quantidade variável;
- mitoses atípicas: ocorrência de divisões celulares
aberrantes ou bizarras;
- aumento de figuras mitóticas: aumento do número de
divisões celulares;
- perda de coesão celular: perda da união ou união
reduzida entre as células por alteração de suas
junções;
- perda de polaridade das células basais: perda da
disposição em paliçada e colunar assumida pelas
células da camada basal.
A graduação de malignidade, segundo a proposta de
Bánóczy e Csiba
10
, é assim definida:
a) atipia leve: até dois critérios presentes
b) atipia moderada: de três a quatro critérios presentes
c) atipia intensa: 5 ou mais critérios presentes
48
A graduação histológica de lesões neoplásicas proposta
por Broders
22
leva em consideração a diferenciação celular, sendo
classificada da seguinte maneira:
a) grau 1: bem diferenciado
b) grau 2: moderadamente diferenciado
c) grau 3: pobremente diferenciado
d) grau 4: indiferenciado
4.8 Avaliação imunoistoquímica
A expressão do bcl-2, bax, VEGF e PCNA foi avaliada por
meio da técnica de imunoistoquímica da Estreptoavidina-Biotina. Do
material emblocado em parafina, foram obtidos cortes de 3µm que foram
estendidos em lâminas de vidro previamente lavadas em álcool absoluto,
secas e silanizadas com a solução de 3-aminopropiltriethoxi-silano (Sigma
Chemical CO., St Louis, MO/USA) a 10% em álcool absoluto.
Os cortes foram desparafinizados com xilol I por 30
minutos a 60
o
C, e em seguida com xilol II por 20 minutos à temperatura
ambiente. Foi feita a secagem das lâminas com papel filtro e a colocação
destas em cubeta limpa. Em seguida, os cortes foram rehidratados em
série descendente de etanol absoluto I, II, III, 95º e 85º por 5 minutos
cada.
Posteriormente, foi feita a remoção dos pigmentos
formólicos com hidróxido de amônia 10% em etanol 95º durante 10
minutos. Em seguida, foi feita a lavagem dos cortes em água corrente por
10 minutos e duas passagens em água destilada.
As lâminas receberam o tratamento de recuperação
antigênica. Foram tratadas em microondas com ácido cítrico 10 mM (pH
6,0), durante 15 minutos a 700 W.
49
Após o tratamento, as lâminas foram novamente lavadas
em água corrente, seguidas de duas passagens em água destilada. Os
cortes foram mergulhados em dois banhos de 15 minutos cada, em
solução de peróxido de hidrogênio (20 volumes) em metanol 1:1, com o
objetivo de bloquear a peroxidase endógena existente no tecido.
Em seguida, foi feita a passagem das lâminas em água
corrente, duas passagens em água destilada e imersão por três vezes na
solução tampão de TRIS (pH 7,4), durante 5 minutos cada.
Posteriormente, os cortes histológicos foram secos com
papel filtro e incubados com soroalbumina bovina (BSA) (Sigma Chemical
CO., St Louis, MO/USA) a 5% durante uma hora, em câmara úmida a
temperatura ambiente, para remoção dos anticorpos inespecíficos.
O excesso de BSA foi removido com papel filtro e os
cortes foram incubados com o anticorpo primário diluído em solução de
TRIS (pH 7,4), acrescido de BSA a 1%, de acordo com o descrito na
tabela 1.
Posteriormente, os cortes foram lavados com a solução de
TRIS (pH 7,4), realizando-se duas trocas de 5 minutos cada. Em seguida,
foi feita a secagem dos cortes histológicos e seguiram para a incubação
com o anticorpo secundário biotilinado (LSAB Peroxidase Biotinylated Link
Universal Streptavidin – HRP, Dako North América, Inc Carpinteria, CA,
USA) durante 30 minutos, a temperatura ambiente em cuba umidificadora.
Lavagem com a solução de TRIS (pH 7,4), sendo duas trocas de 5
minutos cada e secagem das lâminas.
Em seguida, os cortes foram expostos ao complexo
Estreptoavidina-Biotina-Peroxidase (LSAB Peroxidase - LSAB Peroxidase
Biotinylated Link Universal Streptavidin – HRP, Dako North América, Inc
Carpinteria, CA, USA), durante 30 minutos, a temperatura ambiente em
cuba umidificadora.
Foi feita nova lavagem com a solução de TRIS (pH 7,4),
sendo duas trocas de 5 minutos cada, e em seguida foi realizada a
50
impregnação do cromógeno diaminobenzidina (Dako Cytomation Liquid
DAB + Substrate Chromogen System, Dako North América, Inc
Carpinteria, CA, USA). Aplicou-se a solução cromógena, sendo duas
gotas em cada corte, em cuba umidificadora por 6 minutos a temperatura
ambiente.
Em seguida, foi realizada a lavagem com a solução de
TRIS (pH 7,4), sendo duas trocas de 5 minutos cada, lavagem em água
corrente e duas passagens em água destilada.
A contra-coloração dos cortes foi feita com a hematoxilina
de Mayer por 6 minutos. Nova lavagem em água corrente, passagem em
água amoniacal rapidamente, lavagem em água corrente por 10 minutos
e duas passagens em água destilada.
Para finalizar, desidratação com série ascendente de
etanol 70º, 75º, 80º, 85º, 90º e 95º, sendo realizadas passagens rápidas,
e em seguida, imersão dos cortes em álcool absoluto I, II e III durante 2
minutos cada. Imersão em solução de álcool-xilol 1:1 durante 2 minutos.
Diafanização em xilol I por 2 minutos e em xilol II por 5 minutos e
montagem das lâminas em resina Permount.
Como controle positivo foi utilizado os centros germinativos
de linfonodos cervicais dos animais e como controle negativo, cortes
deste tecido com omissão dos anticorpos primários específicos nos
procedimentos imunoistoquímicos.
Tabela 1 – Detalhes dos anticorpos utilizados nas reações de
imunoistoquímica.
Anticorpos Clone Hospedeiro Diluição Incubação
Bax P-19* Coelho 1:100 18 h/ 4º C
Bcl-2 N-19* Coelho 1:400 18 h/ 4º C
VEGF A-20* Coelho 1:100 18 h/ 4º C
PCNA PC-10** Camundongo 1:50 18 h/ 4º C
*
Santa Cruz Biotechnology, CA, USA.
**Dako North América, Inc Carpinteria, CA, USA.
51
4.8.1 Análise quantitativa da expressão de PCNA, VEGF, bax e bcl-2
Foi realizada a análise quantitativa da expressão das
proteínas PCNA, VEGF, bax e bcl-2, sendo que para o VEGF, bax e bcl-2
foram consideradas como positivas somente as células que apresentaram
marcação de cor acastanhada, independente da intensidade da
coloração, restrita ao citoplasma e para o PCNA restrita ao núcleo.
As lâminas foram observadas em microscópio de luz
(Axiophot 2 – Carl Zeiss, Oberküchen, Germany). As imagens obtidas em
microscópio foram transferidas para um monitor de TV acoplado a um
sistema de câmera fotográfica e computador. Em seguida, foram
fotografados 10 campos de cada lâmina em aumento final de 400X.
As imagens foram transferidas para o computador onde foi
realizada a contagem de células positivas em aproximadamente 1.000
selecionadas aleatoriamente, em cada caso, com o auxílio do programa
Image J®. (software de domínio público, NIH, Wayne Husband, Bethesda,
USA)
Seguindo o proposto por Novellino et al.
86
, após a
contagem das células foi obtido um índice de positividade (IP) para cada
proteína investigada através da fórmula abaixo descrita:
IP= número de células positivas X 100
1.000 células aleatoriamente
Para determinar o índice apoptótico, a proporção da
expressão de bcl-2/bax foi calculada usando as porcentagens individuais
previamente obtidas, de acordo com Ribeiro et al
101
.
52
4.9 Avaliação toxicológica
4.9.1 Avaliação macroscópica de fígado e rins
Após 24 horas de fixação do material em formol
tamponado a 10%, o fígado e os rins dos animais foram fotografados e
avaliados quanto à coloração, presença de necrose, fibrose e hemorragia.
Para facilitar a avaliação foi pré-confeccionada uma tabela para anotação
dos dados (Apêndice C).
4.9.2 Avaliação histológica de fígado e rins
Após a fixação, o material foi processado e incluído em
blocos de parafina. Foram realizados cortes seriados com espessura de
5µm, os quais foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas
e desengorduradas com álcool absoluto.
Em seguida, os cortes foram corados pela HE e pelo PAS,
e analisados qualitativamente por dois observadores calibrados, por meio
da microscopia de luz (Axiophot – Axioplan – Carl Zeiss, Oberküchen,
Germany).
Foi investigada a ocorrência de degeneração hidrópica e
gordurosa, necrose de coagulação e liquefação, fibrose, infiltrado
inflamatório e lesões vasculares. Para facilitar a observação foi pré-
confeccionada uma ficha para anotação dos dados (Apêndice D).
53
4.9.3 Análises bioquímicas
A avaliação do potencial tóxico das doses administradas
de P. glomerata foi feita por meio de análises bioquímicas específicas
para fígado e rins. Para avaliação do fígado foram realizadas as análises
de fosfatase alcalina (ALP) e de aspartato aminotransferase (AST) e para
rins a análise da concentração de uréia.
As amostras de sangue foram centrifugadas a 4000 rpm
por 10 minutos para obtenção do soro. Estas amostras foram pipetadas,
armazenadas em microtubos e mantidas sob refrigeração a -20º C e
posteriormente, submetidas às análises espectrofotométricas.
4.9.3.1 Determinação da atividade enzimática de fosfatase alcalina (ALP)
A atividade enzimática da ALP nas amostras séricas, em
U/l, foram avaliadas pelo método descrito por Roy
102
, utilizando-se a
timolftaleína monofosfato como substrato, que após hidrólise libera a
timolftaléina, que apresenta cor azul em meio básico. A cor formada,
diretamente proporcional à atividade enzimática, foi registrada no
espectrofotômetro SHIMADZU – UV-1200 séries a 590 nm.
Para o cálculo da atividade enzimática (AE) em U/l foram
utilizadas, como referência padrão, soluções de timolftaleína
correspondente à atividade enzimática de 45, 22,5 e 12,25U/l. As
absorbâncias destes padrões foram medidas e utilizadas no levantamento
da curva padrão com a finalidade de se obter o fator de calibração (Fc),
cujo valor encontrado foi usado no cálculo das atividades enzimáticas das
amostras de sangue.
54
Durante as medidas da atividade enzimática foram
utilizadas alíquotas de 50µl de soro e os ensaios foram realizados em
duplicata.
4.9.3.2 Determinação da atividade de aspartato aminotransferase (AST)
A atividade enzimática da AST foi avaliada pelo método de
Reitman Frankel, descrito em Moura et al.
78
, no qual a enzima catalisa a
transferência do grupo amino do aspartato para o α-cetoglutarato,
formando o glutamato e o oxaloacetato. O oxaloacetato formado reage
com a 2,4-dinitrofenilhidrazina, produzindo a hidrazona correspondente,
cuja intensidade da cor alaranjada, em meio alcalino, foi medida no
espectrofotômetro SHIMADZU – UV-1200 séries a 505 nm.
Para o cálculo da atividade enzimática da enzima nas
amostras de sangue foram utilizadas como padrões de referências,
soluções de substrato de piruvato de sódio nas concentrações
correspondentes à atividade enzimática de 91,6; 54,9; 29,4 e 11,6 U/l. As
absorbâncias destes padrões foram utilizadas para o levantamento da
curva padrão com a finalidade de se obter o Fc, cujo valor foi usado no
cálculo das concentrações das amostras de sangue.
Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas
alíquotas de 0,1ml de soro.
4.9.3.3 Determinação da concentração de uréia
A concentração de uréia nas amostras de soro foi
avaliada pelo método da diacetilmonoxima, descrito por Moura et al.
78
,
55
que se baseia na reação direta entre a uréia e a diacetilmonoxima (2,3-
butadiona monoxima) na presença da tiossemicarbazida e íons cádmio
em meio ácido.
Durante os ensaios, em duplicata, foram utilizadas
alíquotas de 0,1ml de soro. Estas amostras foram imersas em água
fervente durante 10 minutos para que ocorresse a reação entre a uréia e
a diacetilmonoxima. Ao final da reação, as amostras apresentaram uma
cor rosa-púrpura, cuja resultante é proporcional à concentração de uréia.
Em seguida, foi adicionado 2 ml da amostra na cubeta de vidro do
espectrofotômetro SHIMADZU – UV-1200 séries e foi medida a
absorbância a 540 nm.
Para o cálculo da concentração de uréia nas amostras de
soro, foram utilizadas como padrões de referências, soluções do substrato
de piruvato de sódio correspondentes à atividade de 20, 40, 60, 80 e 100
U/l. As absorbâncias dos padrões foram medidas no espectrofotômetro e
utilizadas para o levantamento da curva padrão para obtenção do Fc, cujo
valor foi utilizado no cálculo da concentração das amostras.
4.10 Análise estatística
Terminada a análise qualitativa e quantitativa, todos os
dados foram tabulados e transferidos para a planilha eletrônica do Excel
(Microsoft – USA).
Para as variáveis quantitativas foi realizado o teste de
Kruskal-Wallis. A relação entre as variáveis qualitativas foi feita através do
uso da correlação de Spearman e do teste χ
2
de independência. Para
todos os testes estatísticos o nível de significância foi estabelecido em
5%.
5 RESULTADOS
5.1 Análise clínica
Todos os animais foram avaliados na 15ª semana do
experimento e apresentaram lesões localizadas na pele da região dorsal. Em
relação ao tipo foram observadas lesões elevadas com ou sem ulceração
(Figuras 3a e 3b). O teste qui-quadrado revelou diferença estatística
significativa entre os grupos controle e experimentais (p=0,0051). A
distribuição percentual de lesões ulceradas e não-ulceradas nos grupos
controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3) pode ser observada na figura 4.
FIGURA 3 – Características clínicas das lesões: a) lesão elevada com () e sem ulceração
() em animal do grupo C; b) lesão elevada sem ulceração () e com
ulceração () em animal do grupo E1.
57
37,5%
62,50%
87,5%
12,50%
100,0%
0,00%
100,0%
0,00%
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
100,0%
C E1 E2 E3
Não-ulcerada Ulcerada
FIGURA 4 – Distribuição percentual de lesões não-ulceradas e
ulceradas nos grupos
controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,0051).
O tamanho das lesões em mm foi calculado pelo seu maior
diâmetro, sendo que variou nos grupos C (média=3,88±2,23) e E2
(média=3,29±1,60) de 1 a 6 mm e nos grupos E1 (média=2,75±1,04) e E3
(média=2,43±1,27) de 1 a 4 mm (Figura 5). Não foi observada diferença
estatística significativa entre os grupos controle e experimentais (p=0,4976).
58
3,88
2,75
3,29
2,43
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Diâmetro
(mm)
C E1 E2 E3
FIGURA 5 – Valores médios do tamanho das lesões (mm) nos grupos controle (C) e
experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,4976).
5.2 Análise histológica
Utilizando-se os critérios de malignidade, propostos por
Bánóczy e Csiba
11
e a avaliação da integridade da membrana basal as
lesões encontradas foram classificadas em não-infiltrativas (Figura 6) e
infiltrativas (Figuras 7, 8 e 9).
O teste qui-quadrado não revelou diferença estatística
significativa entre os grupos controle e experimentais (p=0,1129). A
distribuição percentual de lesões não-infiltrativas e infiltrativas nos grupos
controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3) pode ser observada na figura 10.
Para avaliação das lesões infiltrativas foi utilizada a graduação
histológica de Broders
23
.
Verificou-se que todos os casos de todos os grupos
(C, E1, E2 e E3) apresentaram somente a classificação grau 1, ou seja,
59
carcinoma espinocelular (CEC) bem-diferenciado (Figuras 7, 8 e 9). Não
houve diferença estatística significativa entre os grupos controle e
experimentais (p=0,8598) em relação aos critérios de malignidade.
FIGURA 6 – Lesão não-infiltrativa de aspecto exofítico papilomatoso mostrando grande
quantidade de queratina na superfície, acumulada entre as projeções e
formando cistos intra-epiteliais. No detalhe observa-se cisto de queratina. (HE,
aumento original 100x).
60
FIGURA 7 – Lesão infiltrativa: CEC bem-diferenciado; hiperortoqueratinização ();
duplicação da camada basal (); perda de coesão celular (); ilhota
tumoral infiltrando a lâmina própria (). (HE, aumento original 200x).
FIGURA 8 – Detalhe da figura 7: notar presença de pleomorfismo celular e nuclear e
presença de algumas mitoses atípicas (). (HE, aumento original 200x).
61
FIGURA 9 – Detalhe da figura 7: hiperortoqueratinização (); camada granulosa evidente
(); células neoplásicas adjacentes a vasos sanguíneos (). (HE, aumento
original 400x).
50,0%50,0%
25,0%
75,0%
14,3%
85,7%
0,0%
100,0%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
C E1 E2 E3
Não-infiltrativa Infiltrativa
FIGURA 10 – Distribuição percentual de lesões não-infiltrativas e infiltrativas nos grupos
controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3).
(p=0,1129).
62
5.3 Análise imunoistoquímica
Após a marcação imunoistoquímica foi realizada a análise
quantitativa da expressão das proteínas, sendo que para o VEGF, bax e bcl-
2 foram consideradas como positivas somente as células que apresentaram
marcação de coloração acastanhada restrita ao citoplasma e para o PCNA
restrita ao núcleo, independente da intensidade da coloração. A expressão
foi considerada negativa quando o citoplasma e o núcleo das células
apresentaram coloração azulada, contra-corados com a hematoxilina de
Mayer.
A expressão da proteína VEGF nas lesões não-infiltrativas e
infiltrativas restringiu-se às camadas espinhosa e granulosa do epitélio,
notando-se maior intensidade na camada granulosa (Figura 11). Nas lesões
infiltrativas foi observada ainda a expressão nas ilhotas tumorais.
A marcação pela proteína bax foi observada nas camadas
espinhosa e granulosa do epitélio, tanto nas lesões não-infiltrativas quanto
nas infiltrativas (Figura 12).
A expressão da bcl-2 foi observada nas camadas espinhosa e
granulosa do epitélio nas lesões não- infiltrativas e infiltrativas (Figura 13), e
nesta última também nas ilhotas tumorais.
Marcação PCNA-positiva foi observada na camada basal do
epitélio em lesões não-infiltrativas (Figura 14) e nas camadas basal e
espinhosa nas infiltrativas (Figura 15).
63
FIGURA 11 – Imunoistoquímica para VEGF: células positivas observadas nas camadas
granulosa e espinhosa do epitélio em lesão não-infiltrativa. Aumento original
100x.
FIGURA 12 – Imunoistoquímica para bax: células positivas observadas nas camadas
granulosa e espinhosa do epitélio em lesão infiltrativa. No detalhe notar a
marcação citoplasmática das células. Aumento original 200x.
64
FIGURA 13 – Imunoistoquímica para bcl-2: Células positivas observadas nas camadas
granulosa e espinhosa do epitélio em lesão infiltrativa. Aumento original
100X.
FIGURA 14 – Imunoistoquímica para PCNA: células positivas observadas na camada basal
do epitélio em lesão não-infiltrativa. Aumento original 400X.
65
FIGURA 15 – Imunoistoquímica para PCNA: células positivas observadas nas camadas
basal e espinhosa do epitélio em lesão infiltrativa. Aumento original 200X.
Para cada proteína avaliada, contou-se o número de células
positivas em aproximadamente1000 células selecionadas aleatoriamente em
cada caso, obtendo-se ao final o índice de células positivas (IP). As figuras
16, 17, 18 e 19 mostram o IP para o PCNA, VEGF, bax e bcl-2,
respectivamente.
A análise estatística das proteínas avaliadas não revelou
diferença estatística significativa para o bax (p=0,8970), bcl-2 (p=0,8414) e
PCNA (p=0,2958). Para o VEGF mostrou uma tendência à significância
(p=0,0808).
O índice apoptótico obtido por meio do cálculo da proporção da
expressão de bcl-2/bax, usando as porcentagens individuais previamente
obtidas não mostrou diferença estatística significativa (p=0,8432) quando
comparados os grupos controle e experimentais (Figura 20).
O teste de correlação de Spearman que avaliou o índice de
positividade das proteínas e a presença de malignidade mostrou relação
significativa para o VEGF (p=0,0111; rs= -0,4159) e PCNA (p=0,0296;
66
rs=0,3484), e não significativa para bax (p=0,1319; rs=0,2106), bcl-2
(p=0,1454; rs=0,1993) e índice apoptótico (p=0,4764; rs=-0,0112).
32,5%
56,4%
51,2%
50,2%
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
C E1 E2 E3
FIGURA 16 – Índice de positividade (%) para o PCNA nos grupos controle (C) e
experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,2958).
67
78,3%
56,0%
58,1%
76,0%
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
C E1 E2 E3
FIGURA 17 – Índice de positividade (%) para o VEGF nos grupos controle (C) e
experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,0808).
55,0%
49,2%
53,8%
56,1%
44,0%
46,0%
48,0%
50,0%
52,0%
54,0%
56,0%
58,0%
C E1 E2 E3
FIGURA 19 – Índice de positividade (%) para o bcl-2 nos grupos controle (C) e experimentais
(E1, E2 e E3). (p=0,8414).
68
1,5
1,3
2,0
1,6
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
C E1 E2 E3
FIGURA 20 – Índice apoptótico nos grupos controle (C) e experimentais (E1, E2 e E3).
(p=0,8432).
5.4 Análise toxicológica
5.4.1 Análise macroscópica de fígado e rins
O fígado e rins dos animais foram avaliados
macroscopicamente quanto à coloração e a presença ou ausência de
necrose, fibrose e hemorragia.
Quanto à coloração foram observadas tanto em fígado quanto
em rins, nos grupos controle e experimentais, a presença de áreas
esbranquiçadas, acastanhadas e enegrecidas (Figuras 21a e 21b).
69
Não foi observada em nenhum dos grupos a ocorrência de
necrose e fibrose, tanto em fígado quanto em rins. Foi observado em fígado
um caso (14,3%) de hemorragia no grupo E2 e dois casos (28,6%) no grupo
E3. Em rins observou-se um caso no grupo C (12,5%) e dois (25,0%) no
grupo E3.
FIGURA 21 – Macroscopia de fígado e rins: a) coloração enegrecida em fígado de animal do
grupo E3 corresponde à área de hemorragia; b) coloração acastanhada em
rim correspondente à hemorragia em animal do grupo E3.
5.4.2 Análise histológica de fígado e rins
Foi observada em fígado e em rins nos animais dos grupos
controle e experimentais a presença de degeneração hidrópica, hiperemia,
hemorragia e infiltrado inflamatório mononuclear (Figuras 22 e 23).
Quando comparados os grupos controle e experimentais, o
teste qui-quadrado mostrou diferença estatística significativa somente para o
infiltrado inflamatório, tanto em fígado (p=0,0272) quanto em rins (p=0,0061).
A distribuição percentual da presença de infiltrado inflamatório em fígado e
70
em rins nos grupos controle e experimentais pode ser observada nas figuras
24 e 25.
FIGURA 22 – Aspecto histopatológico em fígado de animal do grupo E3: a) degeneração
hidrópica (); focos de infiltrado inflamatório mononuclear (). (HE, aumento
original 200x). b) degeneração hidrópica (); hiperemia (); hepatócitos
binucleados () (HE, aumento original 400x).
FIGURA 23 – Aspecto histopatológico em rim de animal do grupo E3: a) degeneração
hidrópica (); células inflamatórias mononucleares (); hiperemia ();
hemorragia (). (HE, aumento original 100x). b) intenso infiltrado
inflamatório mononuclear (). (HE, aumento original 400X).
71
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
C E1 E2 E3
Presença Ausência
FIGURA 24 – Distribuição percentual de infiltrado inflamatório em fígado nos grupos controle
(C) e experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,0272).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
C E1 E2 E3
Presença Ausência
FIGURA 25 – Distribuição percentual de infiltrado inflamatório em rins nos grupos controle
(C) e experimentais (E1, E2 e E3). (p=0,0061).
72
5.4.3 Análises bioquímicas
Os valores de médias e desvio padrão da determinação da
atividade enzimática de fosfatase alcalina (ALP), aspartato aminotransferase
(AST) e da concentração de uréia estão representados na tabela 3 e nas
figuras 26, 27 e 28.
Não foi observada diferença estatística significativa em relação
à ALP (p=0,3421) e à AST (p=0,3601) quando comparados os grupos
controle e experimentais. A concentração de uréia mostrou uma tendência à
significância (p=0,0728).
Tabela 3 – Valores de médias e desvio padrão da concentração de ALP, AST e uréia nos
grupos controle e experimentais.
Grupo ALP (U/L) AST (U/L) Uréia (U/L)
C 73,00±73,09 15,00±4,36 54,00±10,14
E1 98,00±60,72 19,00±24,63 40,00±12,25
E2 72,00±81,40 12,00±4,86 47,00±15,93
E3 52,00±50,90 16,00±4,17 50,00±9,19
73
98
72
52
73
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Concentração
(U/L)
E1 E2 E3 C
FIGURA 26 – Valores médios da concentração enzimática (U/L) de ALP nos grupos controle
(C) e experimentais (E1, E2 e E3).
(p=0,3421)
19
12
16
15
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Concentração
(U/L)
E1 E2 E3 C
FIGURA 27 – Valores médios da concentração enzimática (U/L) de AST nos grupos controle
(C) e experimentais (E1, E2 e E3).
(p=0,3601)
74
40
47
50
54
0
10
20
30
40
50
60
Concentração
(U/L)
E1 E2 E3 C
FIGURA 28 – Valores médios da concentração (U/L) de uréia nos grupos controle (C) e
experimentais (E1, E2 e E3).
(p=0,0728).
6 DISCUSSÃO
No Brasil são encontradas diversas espécies do gênero
Pfaffia, sendo que a diferenciação entre elas não é simples, pois depende
do conhecimento de sua composição química. Desta maneira, muitas
vezes, ocorre no comércio a substituição da P. paniculata pela P.
glomerata e vice-versa
99
.
A substituição de uma espécie pela outra não deve ser
feita, pois estudos
79,84,105,115
têm mostrado que apesar de apresentarem
alguns constituintes químicos em comum, existem outros específicos de
cada espécie, e portanto podem apresentar propriedades biológicas
distintas.
Os escassos estudos in vivo mostram que o gênero Pfaffia
apresenta ação analgésica, antiinflamatória e
antineoplásica
45,74,75,81,82,107,116,127
, o que nos motivou a testar a ação
quimiopreventiva da P. glomerata, uma planta brasileira nativa, em um
modelo experimental de indução de carcinogênese já implantado em
nosso laboratório
26
.
Não há consenso na literatura quanto à dose, à forma, à
via e ao período de administração dos vários extratos de plantas
medicinais, pois este fato depende do extrato e do modelo experimentais
a ser utilizado. As doses de 200, 400 e 1000mg/kg/dia, utilizadas neste
experimento, foram baseadas em estudos semelhantes em modelos
experimentais, que mostraram uma variação de 50 a
1000mg/kg/dia
45,74,82,90,95,104
.
A nossa opção pela diluição do extrato liofilizado de P.
glomerata em água baseou-se em estudos com modelos animais
45,82,104
.
76
Em relação à via de administração a literatura mostra que a
maioria dos modelos experimentais utiliza a gavagem para a
administração oral do extrato de plantas medicinais
13,74,82,95
. Entretanto,
durante o projeto piloto deste experimento foram feitas inúmeras
tentativas de administração pela gavagem e não obtivemos sucesso no
acesso ao esôfago destes animais devido ao calibre muito fino e delicado
do mesmo.
Diferentemente de outros autores, que utilizaram
ratos
97,105,117
como modelo experimentais, nosso trabalho avaliou
camundongos, os quais apresentam um tamanho reduzido quando
comparados aos ratos. Desta maneira, este fato dificultou a administração
do medicamento via gavagem e o extrato de P. glomerata foi adicionado à
água filtrada e a solução colocada em frascos de beber que foram
acoplados às gaiolas dos animais, e oferecidos ad libitum, assim como
realizado por outros autores
44,50,64,90
.
Durante o projeto piloto realizamos um experimento durante
quinze dias para estimar a quantidade de água ingerida por cada animal
por dia e verificamos que eram consumidos em média 20ml de água.
Desta maneira, como em cada gaiola foram alojados oito animais, o
extrato de P. glomerata foi diluído em 160ml de água filtrada.
A escolha de camundongos hairless para este experimento
baseou-se em nosso estudo anterior e de outros autores que mostraram
grande sucesso na utilização destes animais nos modelos de indução da
carcinogênese
26,61,89,93,112
, mostrando-se perfeitamente adaptável ao
estudo da quimioprevenção do câncer de pele.
O DMBA foi utilizado neste trabalho, pois é considerado um
carcinógeno completo, ou seja, possui atividade iniciadora e promotora
52
,
garantindo, desta forma, o desenvolvimento de todo o processo de
carcinogênese sem a necessidade de utilização de outros carcinógenos
16
.
Existem controvérsias na literatura quanto à concentração
de DMBA. Os estudos mostram uma variação de 0,25% a 0,5%
43,61,80
. De
77
acordo com os trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório a
concentração da solução de DMBA a 0,5% diluída em acetona é efetiva
no processo de indução do CEC, produzindo o máximo de resposta em
um curto período de latência
16,26,60,71,77
.
Neste experimento a toxicidade gerada pelas diferentes
doses de P. glomerata foi avaliada, pois julgamos que a análise de
toxicidade é muito importante, pois há inúmeros relatos na literatura,
mostrando que as plantas medicinais podem desencadear graves efeitos
colaterais
2,32,62,96,98
.
Como o principal órgão de metabolização e de excreção das
substâncias e medicamentos ingeridos são o fígado e os rins, realizamos
algumas análises que permitem avaliar suas funções. Para avaliação de
fígado foram feitas as análises de fosfatase alcalina (ALP) e aspartato
aminotransferase (AST), cuja elevação sérica indica hepatoxicidade
62
e
para os rins a análise da concentração de uréia. Não foi observada
diferença estatística entre os grupos controle e experimentais em relação
à ALP, AST e uréia.
Os valores obtidos da concentração de ALP, AST e uréia
não foram homogêneos dentro dos grupos avaliados, tanto no controle
quanto nos experimentais. Acreditamos que este fato se deva a
dificuldade que tivemos na coleta do sangue dos animais devido ao
calibre muito pequeno da artéria aorta dos camundongos hairless. A
dificuldade de coleta em seringa de vidro heparinizada fez com que
ocorresse a hemólise do sangue de alguns animais, levando a alteração
nos valores reais das enzimas e da uréia.
Apesar de não ter sido observada diferença estatística entre
os grupos controle e experimentais na avaliação de toxicidade, foi
possível notar que os animais dos grupos experimentais (E1, E2 e E3)
apresentaram presença maior de infiltrado inflamatório mononuclear do
que o grupo controle, tanto em fígado quanto em rins, com exceção do
grupo E2 em rins.
78
Não há relato na literatura sobre a toxicidade da P.
glomerata em modelos animais e poucos são os trabalhos
74, 75, 90,106
que
investigaram a toxicidade apresentada pela P. paniculata.
Comparando nosso estudo com os trabalhos que avaliaram
a toxicidade da P. paniculata, observamos que o trabalho de Silva
106
está
em desacordo com o nosso no que se refere à análise de AST, pois
mostrou que camundongos tratados com 10% da raiz de P. paniculata
apresentaram níveis significantemente superiores de AST, quando
comparados com os tratados com 0,5 e 2%.
Por outro lado, o estudo de Silva
106
corrobora com o nosso
no que se refere à análise histopatológica, pois mostrou presença de
infiltrado inflamatório mononuclear no grupo tratado com maior dose de P.
paniculata. Em contrapartida, Matsuzaki et al.
74
não encontraram
alterações histopatológicas em fígado, rins e baço nos animais tratados
com as dosagens de 200 e 400 mg/Kg de P. paniculata.
O estudo de Mazzanti e Braghiroli
75
mostrou que animais
tratados com a dose de 10g/kg de P. paniculata apresentaram reações
adversas, como sedação, perda de coordenação motora, perda de
reflexos e hipotermia, enquanto que os animais que receberam dosagens
de 2,5 e 5 g/kg não apresentaram nenhuma alteração.
Não há relato na literatura sobre a utilização da P.
glomerata como agente quimiopreventivo do câncer e poucos são os
trabalhos que mostram a ação antineoplásica da P. paniculata
74,107,127
.
Estes estudos não elucidaram o mecanismo de ação da P.
paniculata, o que nos levou a investigar a possibilidade da ação da P.
glomerata sobre a angiogênese, a apoptose e a proliferação celular. Além
disso, tais mecanismos têm sido pouco explorados em modelos
experimentais de carcinogênese
o que
também nos motivou avaliá-los em
nosso modelo de carcinogênese química por meio da análise
imunoistoquímica.
79
O VEGF age induzindo a proliferação, migração e
diferenciação de novos vasos sanguíneos. É promotor da angiogênese
em muitos tipos de câncer, e assim, tem sido alvo de inúmeros estudos
57
.
A literatura mostra que na carcinogênese química induzida pelo DMBA em
pele de camundongos, a marcação pelo VEGF é detectada em células da
epiderme e em vasos sanguíneos presentes em hiperplasias, papilomas,
displasias e carcinomas espinocelulares, indicando que estas células
proliferam nas diferentes etapas do processo de carcinogênese
17,30,80
.
Os nossos resultados mostraram que a avaliação da
angiogênese pela marcação imunoistoquímica com o VEGF mostrou uma
tendência à significância quando comparados os grupos controle e
experimentais. Foi realizado então o teste de Spearman que se mostrou
significativo. Houve correlação entre o índice de positividade de VEGF e a
graduação de malignidade, ou seja, quanto maior o número de células
VEGF-positivas, maior a graduação de malignidade.
Os relatos da literatura estão de acordo com nossos
resultados, pois mostram o aumento da angiogênese e da expressão de
VEGF durante o desenvolvimento tumoral, tanto em modelos
animais
30,80,81
quanto em tecidos humanos
57,63,65,114
.
Os estudos revelam também a correlação entre o
comportamento agressivo dos cânceres e o aumento da expressão de
VEGF
57,65,80,114
.
Os nossos resultados corroboram com o estudo de
Nayaha et al.
80
que revelou em lesões não-infiltrativas a expressão de
VEGF nas camadas mais superficiais do epitélio. Por outro lado, nosso
trabalho difere do estudo acima referido, pois os autores verificaram que a
expressão de VEGF em lesões infiltrativas ocorreu em todas as camadas
do epitélio.
O bcl-2 e bax são genes importantes envolvidos no
processo de apoptose. Estudos imunoistoquímicos têm mostrado o
80
aumento gradual no número de células bcl-2 e bax-positivas durante o
desenvolvimento da carcinogênese experimental
7,85,91,101
.
Em nosso estudo não foi observado diferença estatística
significativa entre o grupo controle e os experimentais em relação ao
índice de positividade de bax e bcl-2 e ao índice apoptótico. Também não
foi observada correlação entre o número de células bax-positivas, bcl-2-
positivas, índice apoptótico e a graduação de malignidade.
Contudo, estudos mostram um aumento das proteínas
que suprimem a apoptose, como a bcl-2 e uma diminuição da expressão
das proteínas pró-apoptóticas, como a bax em CEC cutâneo
13,23,56,100
.
No presente estudo as células com marcação bax-positiva
foram observadas nas camadas espinhosa e granulosa do epitélio, tanto
em lesões não-infiltrativas quanto nas infiltrativas.
Os nossos resultados estão de acordo com relatos da
literatura que mostraram que em epitélio normal e em lesões não-
infiltrativas a marcação pela bax é notada nas camadas mais superficiais
do epitélio
35,91,101
. Delehedde et al.
36
relatam a expressão de bax nas
camadas espinhosa e granulosa do epitélio. O nosso trabalho está em
desacordo com o de Nishimura
85
que verificou que em derme sem
alteração histológica, a marcação pela bax é observada nas camadas
basal e espinhosa do epitélio.
Em relação às lesões infiltrativas nosso estudo está em
desacordo com o de Nishimura
85
e Ribeiro et al
101
que verificaram em
lesões displásicas e em CECs a marcação pela bax em todas as camadas
do epitélio. Por outro lado, corrobora com estes estudos, pois os autores
observaram também a expressão nas células periféricas das ilhotas
tumorais de CEC.
A expressão de bcl-2 também foi observada nas camadas
espinhosa e granulosa nas lesões não-infiltrativas e nas infiltrativas,
sendo que esta última também mostrou marcação nas ilhotas tumorais.
81
Os resultados de bcl-2 nas lesões não-infiltrativas
mostrou-se diferente dos encontrados por Delehedde et al.
36
, Nishimura
85
e Ribeiro et al.
101
. Os autores verificaram que nestas lesões a marcação
pela bcl-2 é observada nas camadas basal e suprabasal do epitélio. Em
relação às lesões infiltrativas, nosso trabalho difere do de Nishimura
85
e
Ribeiro et al
101
que observaram a expressão pela bcl-2 em todas as
camadas do epitélio e está de acordo quando estes autores se referem a
expressão nas ilhotas tumorais em CECs.
A relação entre o potencial maligno das neoplasias e a
atividade de proliferação celular pode ser avaliada usando-se o marcador
PCNA, que permite verificar a verdadeira fração proliferativa da entidade
estudada
46,86
.
O presente estudo não mostrou diferença estatística
significativa na análise de PCNA quando comparado os grupos controle e
experimentais. Entretanto, foi observada correlação significativa entre a
expressão de PCNA e os graus de malignidade.
Estes resultados estão de acordo com outros
estudos
46,86,91
que mostraram a correlação entre a graduação histológica
de malignidade e o índice de células PCNA-positivas em carcinoma de
boca e de colo de útero. Mostrando que os casos com maior graduação
histológica apresentaram maior potencial proliferativo, o que contribui para
um comportamento mais agressivo destas lesões.
No presente estudo a marcação PCNA-positiva foi
observada na camada basal do epitélio em lesões não-neoplásicas e nas
camadas basal e espinhosa em lesões neoplásicas.
Nossos achados corroboram com os estudos de
Delehedde et al.
35
, Fabbrocini et al.
42
e Ouhtit et al.
91
que mostraram que
a expressão de PCNA em lesões não-infiltrativas restringe-se à camada
basal, enquanto que em lesões displásicas e em CEC a marcação pode
ser observada também na camada suprabasal do epitélio.
82
Embora não tenha sido observada diferença estatística
significativa entre o grupo controle e os experimentais em relação à
graduação de malignidade, acreditamos que este fato seja decorrente do
número pequeno de animais por grupo, os nossos resultados mostraram
que os grupos experimentais apresentaram maior número de lesões
infiltrativas do que o grupo controle.
Desta maneira, o presente estudo mostrou que o extrato
liofilizado de P. glomerata não apresentou a ação quimiopreventiva
esperada. Fato que pode estar relacionado à metodologia empregada e à
amostragem pequena de animais utilizada neste experimento.
Além disso, a presença de infiltrado inflamatório
mononuclear em fígado e rins revelou que as doses de 200, 400 e
1000mg/kg/dia mostraram indícios de toxicidade hepática e renal.
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos foi possível concluir que o
tratamento com as doses de 200, 400 e 1000mg/kg/dia de extrato liofilizado de
P. glomerata não apresentou ação quimiopreventiva e revelou indícios de
toxicidade hepática e renal neste modelo experimental.
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102
Anexo A – Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos – UNESP
103
Apêndice A – Ficha de avaliação clínica das lesões de pele dos animais.
Animal nº: Fotos nº:
E D D E
Características clínicas Dimensão
104
Apêndice B – Ficha para avaliação histológica de pele: Bánóczy & Csiba
(1976) e Broders (1926).
Grupo: Animal nº
Avaliação Histológica de Pele
Bánóczy & Csiba (1976) e B
roders (1926)
OBS 1 OBS 2
Ausente
Paraqueratina
Hiperparaqueratina
Ortoqueratina
Queratinização
Hiperortoqueratina
Ausente
Camada Granulosa
Presente
Sem projeções papilíferas
Com projeções papilíferas exofíticas
Hiperplasia
Atrofia
Acantose
Espongiose
Epitélio
Exocitose
Pleomorfismo celular e nuclear
Perda de estratificação epitelial
Hipercromatismo nuclear
Aumento do tamanho do núcleo
Nucléolos aumentados
Duplicação da camada basal
Perda de continuidade da camada basal
Queratinização individual ou de grupo de células na:
- camada espinhosa
- camadas mais profundas
Projeção em gota dos cones epiteliais
Figuras mitóticas na porção mediana do epitélio
Mitoses atípicas
Aumento de figuras mitóticas
Perda da coesão celular
Atipias
epitelais
(Bánóczy & Csiba, 1976)
Perda da polaridade das células basais
Leve
Moderada
Graus de atipia
(Bánóczy & Csiba, 1976)
Intensa
Grau 1
Grau 2
Grau 3
Diferenciação celular
(Broders, 1926)
Grau 4
105
Apêndice C – Ficha de avaliação macroscópica de fígado e rins.
Avaliador nº:
Grupo: Animal nº:
Avaliação Macroscópica
Fígado e Rins
Fígado Rins
Coloração
Necrose
Fibrose
Hemorragia
Observações
106
Apêndice D – Ficha de avaliação histológica de fígado e rins.
Avaliador nº:
Grupo: Animal nº:
Avaliação Histológica – Fígado e Rins
Fígado Rins
Presente
Degeneração
Hidrópica
Ausente
Presente
Degeneração
Gordurosa
Ausente
Presente
Necrose
Ausente
Presente
Fibrose
Ausente
Presente
Infiltrado
Inflamatório
Ausente
Presente
Lesão Vascular
Ausente
Observações
107
CARMO ED. Evaluation of systemic action of lyophilized extract of Pfaffia
glomerata in the chemically inducted carcinogenesis by DMBA on the skin
of hairless mice. [Doctorate thesis]. São José dos Campos: School of
Dentistry of São José dos Campos. UNESP – São Paulo State University;
2007.
ABSTRACT
The goals of this study were both to evaluate the effect of systemic administration of the
extract of Pfaffia glomerata in the chemical carcinogenesis model on the skin of hairless
mice, as well as to investigate the hepatic and renal toxicity of the administered doses.
For that we have used 32 hairless mice, female, aged 5 weeks, distributed in control
group (C) and experimental groups (E1, E2 e E3). The experimental groups E1, E2 e E3
received systemic administration of the lyofilized extract of P. glomerata in 200, 400 and
1000 mg/Kg/day doses, respectively, by oral means, during 15 weeks. Group C received
only filtered water. Two weeks after the beginning of the lyophilized extract of P.
glomerata administration, the animals were submitted to chemical carcinogenesis
induced by the 0,5% DMBA brushed in the dorsal region. At the 15
th
week a clinical
evaluation was conducted, skin biopsy made, blood sample collected and liver and
kidneys of the animals removed. After that the following evaluation were conducted:
histopathological and immunohistochemical evaluation of the skin lesions,
histopatological evaluation of the organs, and toxicological evaluation of the blood
samples. The blood samples went also thorough the following analysis: enzimatic activity
of alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase and urea concentration. When
comparing C and E groups, the Kruskal-Wallis statistical analysis has not shown any
statistically significant difference of type, size and malignancy grading. It has not been
observed statistically significant difference in the alkaline phosphatase, aspartate
aminotransferase and urea analysis. The Spearman correlation test showed significant
relation for VEGF and PCNA and the
χ
2 test for inflammatory infiltrate in the liver and
kidneys. We therefore concluded that the treatment using 200, 400 and 1000mg/Kg/day
of the lyophilized extract of P. glomerata in such an experimental model has not shown
chemopreventitive action and revealed evidence of toxicity for liver and kidneys.
KEY-WORDS: Medicinal plants; chemoprevention; drug toxicity; 9,10-Dimethyl-1,2-
benzanthracene; squamous cell carcinoma; mice inbred HRS, immunohistochemistry.
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