( PDF ) Desenvolvimento de sistema microestru-turado contendo extrato padronizado de cecropia glaziovii sneth (embaúba)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA MICROESTRU-

TURADO CONTENDO EXTRATO PADRONIZADO DE

CECROPIA GLAZIOVII SNETH (EMBAÚBA)

DANIELA PAULA AREND

Florianópolis, 2010

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA MICROESTRU-

TURADO CONTENDO EXTRATO PADRONIZADO DE

CECROPIA GLAZIOVII SNETH (EMBAÚBA)

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-graduação em Farmácia como

requisito parcial à obtenção do grau

de MESTRE em Farmácia

Orientadora: Profa. Dra. Angela Machado de Campos

Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Gomes dos Santos

DANIELA PAULA AREND

Florianópolis – SC

2010

A681d Arend, Daniela Paula

Desenvolvimento de Sistema Microestruturado contendo

extrato padronizado de Cecropia glaziovii Sneth (embaúba)

[dissertação] / Daniela Paula Arend ; orientadora,

Angela Machado de Campos. - Florianópolis, SC, 2010.

174 p.: il., grafs., tabs.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Santa

Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-

Graduação em Farmácia.

Inclui referências

1. Farmácia. 2. Cecropia glaziozii. 3. Micropartículas.

4. Ácido Clorogênico. 5. Ácido cafeico. 6. Atividade anti-

diabética. 7. Extrato padronizado. 8. Vaso dilatador. I.

Campos, Angela Machado de. II. Universidade Federal de

Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. III.

Título.

CDU 615.12

DEDICATÓRIA

Aos meus filhos que são meus tesouros, Laís e Caio,

aos meus inestimáveis e amados pais, Roswitha e Danilo.

O presente trabalho foi realizado com o apoio da CAPES (bolsa

de Mestrado), no Laboratório de Farmacotécnica do Programa de Pós-

Graduação em Farmácia da Universidade Federal de Santa Catarina, em

colaboração com os seguintes laboratórios: Laboratório de Hormônios e

Transdução de Sinais do Departamento de Bioquímica da Universidade

Federal de Santa Catarina e do Laboratório de Farmacologia de Produ-

tos Naturais do Departamento de Farmacologia da Universidade Federal

de Santa Catarina, locais em que foram realizados os testes farmacológi-

cos.

“Não há fatos eternos, como não há verdades absolutas”.

(Nietszche)

AGRADECIMENTOS

Acima de tudo, a Deus pela minha vida, pelos desafios, obstácu-

los e conquistas.

À minha família, especialmente meus pais pelo apoio, incentivo,

segurança, dedicação e exemplos de vida, ética, justiça e determinação.

Aos meus filhos pela paciência, carinho, entusiasmo e alegria de viver,

sem eles eu não estaria aqui hoje.

Às Profa. Angela, Ana e Diva pela confiança inicial, orientação,

amizade, suporte e discussões construtivas.

A todos os professores que colaboraram no desenvolvimento des-

te trabalho com seus ensinamentos e profundo conhecimento, suas su-

gestões e apoio. Prof. Flávio Reginatto, Eloir Paulo Schenkel, Marcos

Segatto, Fátima Barreto, Elenara Lemos-Senna, Rosane Budal, Miriam

Falkenberg, Simone Cardoso, Valdecir Laura.

Aos funcionários que sempre contribuíram e muito com o meu

trabalho: Sandrinha, Nilson (por todas as suas “invenções”), Solange,

Claudinha, Bruno e Rodrigo.

Aos colegas de laboratório: Juliana Bidone, Carine Dal Pizzol,

Daiane Nemen, Letícia Mazzarino, Cristiana Dora (Kiki), Mariana Da-

lagnol, Luis Felipe, Bianca. Ao Felipe Tasca, pela ajuda com as figuras

e programa Design Expert

Aos colegas de mestrado que tanto me ajudaram e incentivaram,

em especial: Geison com toda a sua paciência, Mônica, Fábio, Tati Loi-

ra, Francielly, Tati Morena, Gustavo Baiano, Danielle, Mariana, Polia-

ne, Luisa, Bruno, Rafa, Larissa, Paulo, Gislaine, Silvana, Jadel, Karin,

Rodrigo, Letícia, Taty, Iza, Thiaguinho.

Às alunas de iniciação científica que me ajudaram nos experi-

mentos: Duda e Narjara. E aos outros alunos de iniciação que também

participaram do meu dia-a-dia: Fernanda, Mariana, Paula, Cassiana,

Gabriela.

Aos meus alunos por me mostrarem o quanto é valiosa a troca de

conhecimento.

RESUMO

A Cecropia glaziovii Sneth, popularmente conhecida como embaúba, é

utilizada na medicina popular visando os efeitos diurético, anti-

hipertensivo, antiinflamatório, expectorante, antiasmático e antitérmico.

Esta planta é principalmente encontrada em áreas de reflorestamento e

na Mata Atlântica brasileira. O presente trabalho tem como objetivo a

padronização de soluções extrativas de Cecropia glaziovii e posterior-

mente realizar um estudo preliminar para a encapsulação dos extratos

padronizados em um sistema microestruturado. A influência dos fatores

tecnológicos como teor etanólico, tempo e temperatura sobre a extração

de compostos fenólicos foi avaliada para os métodos estudados, macera-

ção e decocção. As soluções foram preparadas utilizando delineamento

fatorial 2

com ponto central e avaliadas quanto ao seu resíduo seco, pH,

teor de fenólicos totais, teor de ácido clorogênico e ácido cafeico, sendo

estas duas substâncias consideradas como marcadores químicos e dose-

ados por metodologia validada de CLAE. Os extratos obtidos com 20%

de etanol apresentaram elevada concentração de ácido cafeico, substân-

cia que praticamente não está presente nas outras soluções extrativas.

Em função deste resultado, foram realizados estudos para avaliação da

influência da temperatura e da presença de conservante sobre os teores

dos marcadores químicos durante o processo extrativo, sendo para isto

elaborados dois delineamentos fatoriais 2

. A atividade dos extratos

brutos no tratamento do diabetes e da hipertensão foi avaliada. Os extra-

tos obtidos por maceração foram efetivos na redução da glicemia em

ratos hiperglicêmicos e apresentaram surpreendente atividade vasorrela-

xadora. A atividade farmacológica serviu como fator de escolha dos

extratos a serem microencapsulados em sistema polimérico, utilizando a

técnica de dupla emulsão (A/O/A) com evaporação/extração do solven-

te. Para avaliação da interferência dos diferentes fatores na formulação

das micropartículas foi utilizado o delineamento fatorial 2

. As micro-

partículas foram avaliadas quanto ao seu rendimento, formação, aparên-

cia, tamanho e eficiência de encapsulação.

Palavras-chave Cecropia glaziovii Sneth, micropartículas, ácido cloro-

gênico, ácido cafeico, atividade anti-diabética, extrato padronizado, vaso

dilatador.

ABSTRACT

Cecropia glaziovii Sneth, known as embaúba, is used in folk medicine

as diuretic, antihypertensive, anti-inflammatory, expectorant, as relief

for asthma and fever. This plant is mainly found in reforestation areas

and Brazilian Atlantic Rain Forest. The present work aims to develop

Cecropia glaziovii padronized extracts and lately perform preliminary

extracts encapsulation in microstructured system. The influence of some

technological factors as ethanol concentration, time and temperature

extraction above phenolic compounds was evaluated in studied methods,

maceration and decoction. The extractive solutions were prepared em-

ploying a 2

factorial design with central point and evaluated as dry

residue, pH, total phenolics content, chlorogenic and caffeic acids con-

centration, both considered as chemical markers and the assay was car-

ried out by HPLC validated methodology. In the 20% ethanolic extracts

a great amount of caffeic acid was observed, compound that was not

detected in the extracts with higher ethanolic concentrations. In order to

investigate this result, the influence of temperature and the presence of a

preservative on chemical markers content during extraction process

were evaluated according to a two 2

factorial designs. The antidiabetic

and antihypertensive activity of the extracts were evaluated. The ex-

tracts obtained by maceration reduced glucose level on blood samples in

hyperglycemic rats and showed surprisingly vasodilator activity. The

pharmacological activity was used as a factor to choose the extracts for

microencapsulation in polymeric system, using double emulsion tech-

nique (W/O/W) with solvent evaporation/extraction. In order to investi-

gate the influence of different factors in microparticles formulation a 2

factorial design was performed. Microparticles were evaluated as yield,

formation, aspect, size and encapsulation efficiency.

Keywords Cecropia glaziovii Sneth, microparticles, chlorogenic acid,

caffeic acid, antidiabetics activity, standard extract, vasodilator.

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Análise granulométrica por tamisação da matéria-prima

vegetal moída ............................................................................... 38

TABELA 2. Linearização do diâmetro granulométrico médio obtido

através do modelo de probitos ...................................................... 40

TABELA 3. Limites microbiológicos preconizados pela OMS para as

diferentes categorias relacionadas ao material vegetal de acordo

com a sua utilização e características. .......................................... 43

TABELA 4. Programação da fase móvel para CLAE ........................... 48

TABELA 5. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções

extrativas por maceração a temperatura ambiente. Fatores

avaliados: concentração de etanol e tempo .................................. 51

TABELA 6. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções

extrativas por decocção utilizando água purificada como líquido

extrator. Fatores avaliados: temperatura e tempo ......................... 52

TABELA 7. Dados de linearidade dos marcadores químicos obtidos

para a validação do método de CLAE .......................................... 59

TABELA 8. Dados de precisão: repetibilidade e precisão intermediária

dos marcadores químicos obtidos para a validação do método de

CLAE ........................................................................................... 61

TABELA 9. Dados de exatidão do doseamento dos marcadores

químicos nos extratos utilizados para a validação do método de

CLAE ........................................................................................... 62

TABELA 10. Limites de quantificação e detecção dos marcadores

químicos obtidos para a validação do método de CLAE ............. 62

TABELA 11. Resultados da caracterização dos extratos obtidos por

maceração usando o delineamento fatorial 2

.............................. 63

TABELA 12. Análise de variância dos resultados da caracterização dos

extratos obtidos por maceração usando o delineamento fatorial 2

(p  0,05) ...................................................................................... 64

TABELA 13. Resultados da caracterização dos extratos obtidos por

decocção usando o delineamento fatorial 2

................................ 64

TABELA 14. Análise de variância dos resultados da caracterização dos

extratos obtidos por decocção usando o delineamento fatorial 2

 0,05) .......................................................................................... 65

TABELA 15. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções

extrativas e respectivas condições extrativas, destinadas à

avaliação da influência da temperatura no processo extrativo dos

marcadores químicos .................................................................... 91

TABELA 16. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções

extrativas destinadas à avaliação da influência do conservante no

processo extrativo dos marcadores químicos ............................... 92

TABELA 17. Densidade dos extratos obtidos por maceração 8d20, 6d50

e 8d80 ........................................................................................... 94

TABELA 18. Áreas médias dos picos de ácido clorogênico e ácido

cafeico obtidas de diferentes diluições do extrato 8d20 para

determinação da linearidade das respostas por CLAE ................. 95

TABELA 19. Áreas médias dos picos de ácido clorogênico e ácido

cafeico obtidas de diferentes diluições do extrato 6d50 para

determinação da linearidade das respostas por CLAE ................. 97

TABELA 20. Áreas médias dos picos de ácido clorogênico e ácido

cafeico obtidas de diferentes diluições do extrato 8d80 para

determinação da linearidade das respostas por CLAE ............... 100

TABELA 21. Resultados de quantificação dos marcadores químicos

ácido clorogênico e ácido cafeico nos extratos obtidos por

delineamento fatorial 2

em diferentes condições extrativas,

destinadas à avaliação da influência da temperatura no processo

extrativo dos marcadores ........................................................... 104

TABELA 22. Análise de variância dos resultados de quantificação dos

marcadores químicos ácido clorogênico e ácido cafeico nos

extratos obtidos por maceração utilizando delineamento fatorial 2

em diferentes condições extrativas, destinadas à avaliação da

influência da temperatura e da presença de conservante no

processo extrativo dos marcadores (p  0,05) ............................ 107

TABELA 23. Resultados de quantificação dos marcadores químicos nos

extratos obtidos por delineamento fatorial 2

em presença ou

ausência de conservante, destinados à avaliação da influência deste

no processo extrativo dos marcadores ....................................... 109

TABELA 24. Nomenclatura estabelecida para identificação da

concentração e do tipo de extrato incorporado em cada uma das

formulações ................................................................................ 116

TABELA 25. Fatores e níveis utilizados no estudo de formulação:

delineamento fatorial 2

............................................................. 118

TABELA 26. Delineamento fatorial 2

para obtenção das

micropartículas poliméricas destinado a avaliação dos fatores

concentração do polímero, tipo de extrato, concentração do extrato

e velocidade de agitação da primeira emulsão ........................... 119

TABELA 27. Resultados da caracterização das micropartículas obtidas

usando o delineamento fatorial 2

.............................................. 123

TABELA 28. Análise de variância dos resultados da caracterização das

micropartículas obtidas usando o delineamento fatorial 2

(p 

0,05) ........................................................................................... 124

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Equilíbrio protolítico de ácidos polifenólicos...................... 6

FIGURA 2. Estrutura química do ácido cafeico ..................................... 7

FIGURA 3. Estrutura química do ácido quínico ..................................... 8

FIGURA 4. Estrutura química do ácido clorogênico .............................. 8

FIGURA 5. Esquema geral dos quatro passos principais do processo de

preparo de micropartículas por extração/evaporação do solvente 18

FIGURA 6. Estrutura molecular do Eudragit

RS100 .......................... 25

FIGURA 7. Distribuição granulométrica referente à fração retida obtida

através da análise granulométrica ................................................ 39

FIGURA 8. Curvas cumulativas de retenção e passagem após tamização

da matéria-prima vegetal moída ................................................... 40

FIGURA 9. Representação gráfica da linearização do diâmetro

granulométrico médio obtido através do modelo de probitos ...... 41

FIGURA 10. Sobreposição de cromatogramas dos primeiros 8 minutos

das soluções extrativas obtidas por maceração (4d20, 8d20, 6d50 e

8d80) ............................................................................................ 56

FIGURA 11. Cromatograma típico obtido por CLAE do ácido cafeico e

respectivo espectro obtido com detector DAD na região de 180 a

400 nm.......................................................................................... 57

FIGURA 12. Cromatograma do extrato 4d20 salientando o pico do

ácido cafeico e seu espectro, obtido com detector DAD na região

de 180 a 400 nm ........................................................................... 58

FIGURA 13. Curva analítica média do ácido clorogênico obtida por

CLAE ........................................................................................... 60

FIGURA 14. Curva analítica média do ácido cafeico obtida por CLAE

...................................................................................................... 60

FIGURA 15. Representação gráfica dos fatores concentração de etanol e

tempo dos extratos obtidos por maceração para resíduo seco ...... 66

FIGURA 16. Representação gráfica dos fatores temperatura e tempo dos

extratos obtidos por decocção para resíduo seco .......................... 67

FIGURA 17. Gráfico tridimensional dos resultados obtidos para o

ensaio de pH relacionando os fatores concentração de etanol e

tempo dos extratos obtidos por maceração................................... 68

FIGURA 18. Representação gráfica dos fatores temperatura e tempo dos

extratos obtidos por decocção para o ensaio de pH ...................... 69

FIGURA 19. Curva analítica média do ácido gálico obtida por

espectrofotometria UV/Vis. Detecção: 765 nm ........................... 71

FIGURA 20. Gráfico tridimensional dos resultados obtidos para o

ensaio de fenólicos totais relacionando os fatores concentração de

etanol e tempo dos extratos obtidos por maceração ..................... 72

FIGURA 21. Representação gráfica dos fatores temperatura e tempo dos

extratos obtidos por decocção para o ensaio de fenólicos totais .. 73

FIGURA 22. Gráfico de interação entre os fatores concentração de

etanol e tempo dos extratos obtidos por maceração para o

doseamento de ácido clorogênico ................................................ 74

FIGURA 23. Gráfico de interação após aplicação de raiz quadrada, entre

os fatores concentração de etanol e tempo dos extratos obtidos por

maceração para o doseamento de ácido cafeico ........................... 75

FIGURA 24. Gráfico de interação entre os fatores temperatura e tempo

dos extratos obtidos por decocção para o doseamento de ácido

clorogênico................................................................................... 76

FIGURA 25. Gráfico de interação entre os fatores temperatura e tempo

dos extratos obtidos por decocção para o doseamento de ácido

cafeico .......................................................................................... 77

FIGURA 26. Gráfico comparativo do efeito agudo entre os marcadores

químicos (isolados e em associação) e os extratos obtidos por

maceração na curva de tolerância à glicose oral. Administração

dos extratos liofilizados por gavagem: 400 mg/kg ...................... 79

FIGURA 27. Gráfico comparativo do efeito agudo entre os marcadores

químicos (isolados e em associação) e os extratos obtidos por

decocção na curva de tolerância à glicose oral. Administração dos

extratos liofilizados por gavagem: 400 mg/kg ............................. 81

FIGURA 28. Alteração percentual da glicemia em ratos diabéticos após

administração dos extratos obtidos por maceração (400 mg/kg) e

dos marcadores químicos isolados e em associação .................... 83

FIGURA 29. Alteração percentual da glicemia em ratos diabéticos após

administração dos extratos obtidos por decocção (400 mg/kg) e

dos marcadores químicos isolados e em associação .................... 84

FIGURA 30. Curvas concentração resposta cumulativas aos extratos

liofilizados obtidos por maceração e por decocção (0,1 – 1000

µg/mL) em anéis de aorta torácica isolada de rato, contraídos

previamente com fenilefrina (1 µM). Cada ponto representa média

± EPM de 6 experimentos ............................................................ 86

FIGURA 31. Curva média de linearidade do extrato 8d20 para análise

do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE ......... 95

FIGURA 32. Curva média de linearidade do extrato 8d20 para análise

do marcador químico ácido cafeico obtida por CLAE ................. 96

FIGURA 33. Curva média de linearidade do extrato 6d50 para análise

do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE.......... 98

FIGURA 34. Curva média corrigida de linearidade do extrato 6d50 para

análise do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE

...................................................................................................... 98

FIGURA 35. Curva média de linearidade do extrato 6d50 para análise

do marcador químico ácido cafeico obtida por CLAE ................. 99

FIGURA 36. Curva média de linearidade do extrato 8d80 para análise

do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE........ 100

FIGURA 37. Curva média corrigida de linearidade do extrato 8d80 para

análise do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE

.................................................................................................... 101

FIGURA 38. Perfil cromatográfico do extrato 8d80 a 758,20 mg/mL

obtido por CLAE. Fase móvel em sistema de gradiente, fluxo 1,0

mL/min., detecção a 330nm ....................................................... 102

FIGURA 39. Gráficos tridimensionais dos resultados obtidos na

quantificação dos marcadores químicos ácido clorogênico e ácido

cafeico no estudo de estabilidade relacionando os fatores

concentração de etanol, tempo e avaliação da influência da

temperatura dos extratos obtidos por maceração ....................... 106

FIGURA 40. Gráficos tridimensionais dos resultados obtidos na

quantificação dos marcadores químicos ácido clorogênico e ácido

cafeico no estudo de estabilidade relacionando os fatores

concentração de etanol, tempo e avaliação da presença de

conservante dos extratos obtidos por maceração ....................... 110

FIGURA 41. Gráfico de interação entre os fatores concentração de

polímero e concentração de extrato das micropartículas obtidas

para a determinação do rendimento, utilizando os EM .............. 125

FIGURA 42. Representação em cubo da influência dos fatores

concentração do polímero, tipo de extrato e concentração do

extrato sobre os resultados de rendimento das micropartículas . 126

FIGURA 43. Microfotografias obtidas por MEV das micropartículas

para avaliação da formação e da aparência ................................ 127

FIGURA 44. Gráficos de interação entre os fatores concentração de

polímero, concentração de extrato e velocidade de agitação da 1°

emulsão para avaliação da formação das micropartículas,

utilizando os EM ........................................................................ 128

FIGURA 45. Gráfico de interação entre os fatores concentração de

polímero e velocidade de agitação da 1° emulsão para avaliação da

aparência das micropartículas, utilizando os EM4 ..................... 129

FIGURA 46. Representação em cubo da influência dos fatores

concentração do polímero, concentração do extrato e velocidade

de agitação da 1° emulsão sobre os resultados de tamanho de

micropartículas. .......................................................................... 130

FIGURA 47. Curva analítica média do ácido cafeico obtida por

espectrofotometria UV/Vis. Detecção: 328 nm ......................... 131

FIGURA 48. Gráfico de interação entre os fatores tipo de extrato e

concentração do extrato para avaliação da eficiência de

encapsulação das micropartículas, utilizando os EM ................. 132

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ACF Ácido cafeico

ACG Ácido clorogênico

ACN Acetonitrila

AINE Antiinflamatório não esteróide

ANOVA Análise de variância

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCR Curva concentração resposta

Ceme Central de Medicamentos

CG Classe granulométrica

CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência

CPQBA Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas,

Biológicas e Agrícolas

DAD Diode Array Detector: detecção ultravioleta por

arranjo de diodos

DCI Disease - Consensus Index

DG Diâmetro granulométrico médio

DM Diabetes mellitus

dp Desvio padrão

DPR Desvio padrão relativo

E Exatidão

ECA Enzima conversora da angiotensina

ED Extrato obtido por decocção

EE Eficiência de encapsulação

EM Extrato obtido por maceração

EPM Erro padrão da média

ERO Espécies reativas de oxigênio

ET Endotelina

EtOH Etanol

EXP Experimento/n° amostra definido pelo delineamento

fd Fator de diluição

FR Fração retida

FRA Fração retida acumulada

FP Fração de passagem

GLUT Facilitador do transporte de glicose

HTA Hipertensão arterial

HVLP Polivinilidenfluorido

IC Inclinação da curva analítica

ICH International Conference on the Harmonization of

Technical Requirements for the Registration of

Pharmaceuticals for Human Use

IDF International Diabetes Federation

LD Limite de detecção

Log P Coeficiente de partição óleo/água

LQ Limite de quantificação

m Massa

MCP Micropartículas

MEV Microscopia eletrônica de varredura

Radical ânion superóxido

OMS Organização Mundial de Saúde

ON Óxido nítrico

OPAS Organização Pan-Americana da Saúde

PA Pressão arterial

PD Perda por dessecação

PM Peso molecular

pKa Constante de dissociação acídica

PPPM Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais

PVA Álcool polivinílico

r Coeficiente de correlação

RS Resíduo seco

SBD Sociedade Brasileira de Diabetes

SBH Sociedade Brasileira de Hipertensão

SGLT1 Transportador de glicose ativo

TE Teor de extrativos

UNICAMP Universidade de Campinas

USP United States Pharmacopeia

UV Ultravioleta

WHO World Health Organization

∆ Intervalo de abertura de malha

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................ 1

OBJETIVOS ......................................................................................... 29

CAPÍTULO 1 ........................................................................................ 31

Caracterização da Cecropia glaziovii .................................................... 31

1. Apresentação ..................................................................................... 32

2. Materiais e Métodos .......................................................................... 32

2.1. Material .......................................................................................... 32

2.1.1. Matérias-primas ........................................................................... 32

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes ................................................... 32

2.1.3. Equipamentos .............................................................................. 33

2.2. Metodologia ................................................................................... 33

2.2.1. Aquisição do material vegetal de estudo ..................................... 33

2.2.2. Moagem do material vegetal ....................................................... 33

2.2.3. Perda por dessecação ................................................................... 34

2.2.4. Teor de extrativos ........................................................................ 34

2.2.5. Granulometria.............................................................................. 34

2.2.6. Cinzas totais ................................................................................ 35

2.2.7. Avaliação da qualidade microbiológica da matéria-prima vegetal

............................................................................................................... 35

2.2.7.1. Pré-tratamento do material a ser examinado ............................ 35

2.2.7.2. Determinação numérica de formas viáveis ............................... 36

3. Resultados e Discussão ..................................................................... 36

3.1. Perda por dessecação ...................................................................... 37

3.2. Teor de extrativos ........................................................................... 37

3.3. Granulometria................................................................................. 38

3.4. Cinzas Totais .................................................................................. 41

3.5. Qualidade microbiológica do material ........................................... 41

CAPÍTULO 2 ........................................................................................ 45

Padronização das soluções extrativas .................................................... 45

1. Apresentação ..................................................................................... 46

2. Materiais e Métodos .......................................................................... 46

2.1. Material .......................................................................................... 46

2.1.1. Matérias-primas .......................................................................... 46

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes................................................... 46

2.1.3. Aparelhos, equipamentos e materiais especiais .......................... 47

2.2. Metodologia ................................................................................... 47

2.2.1.Validação da metodologia analítica por CLAE ............................ 47

2.2.2. Delineamento experimental ........................................................ 50

2.2.3. Preparo das soluções extrativas ................................................... 52

2.2.4. Análise das soluções extrativas ................................................... 52

2.2.4.1. Resíduo seco ............................................................................ 52

2.2.4.2. pH ............................................................................................. 53

2.2.4.3. Fenólicos totais ........................................................................ 53

2.2.5. Doseamento por CLAE dos marcadores químicos ..................... 54

2.2.6. Liofilização das soluções extrativas ............................................ 54

2.2.7. Avaliação in vivo da atividade anti-diabética .............................. 54

2.2.8. Avaliação ex vivo da atividade anti-hipertensiva ........................ 55

3. Resultados e Discussão ..................................................................... 55

3.1. Validação da metodologia analítica por CLAE .............................. 58

3.1.1. Linearidade ................................................................................. 58

3.1.2. Precisão ....................................................................................... 61

3.1.3. Exatidão ...................................................................................... 61

3.1.4. Limite de quantificação e limite de detecção .............................. 62

3.2. Análise das soluções extrativas: Maceração e Decocção ............... 63

3.3. Avaliação in vivo da atividade anti-diabética ................................. 77

3.3.1. Avaliação dos EM em animais hiperglicêmicos ......................... 78

3.3.2. Avaliação dos ED em animais hiperglicêmicos .......................... 80

3.3.3. Avaliação dos extratos obtidos em animais diabéticos ............... 81

3.4. Avaliação ex vivo da atividade anti-hipertensiva ........................... 84

CAPÍTULO 3 ........................................................................................ 87

Monitoramento dos teores dos marcadores químicos nas soluções

extrativas ............................................................................................... 87

1. Apresentação ..................................................................................... 88

2. Materiais e Métodos .......................................................................... 88

2.1. Material .......................................................................................... 88

2.1.1. Matérias-primas ........................................................................... 88

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes ................................................... 88

2.1.3. Aparelhos, equipamentos e materiais especiais ........................... 89

2.2. Metodologia ................................................................................... 89

2.2.1. Linearidade das respostas por CLAE das soluções extrativas ..... 89

2.2.2. Estabilidade das soluções extrativas ............................................ 90

3. Resultados e Discussão ..................................................................... 92

3.1. Linearidade das respostas por CLAE das soluções extrativas ........ 93

3.2. Estabilidade das soluções extrativas ............................................. 103

CAPÍTULO 4 ...................................................................................... 113

Desenvolvimento do sistema microestruturado .................................. 113

1. Apresentação ................................................................................... 114

2. Materiais e Métodos ........................................................................ 114

2.1. Material ........................................................................................ 114

2.1.1. Matérias-primas ......................................................................... 114

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes ................................................. 114

2.1.3. Aparelhos e equipamentos......................................................... 115

2.2. Metodologia ................................................................................. 115

2.2.1. Preparo dos extratos .................................................................. 115

2.2.2. Preparo das micropartículas ...................................................... 116

2.2.3. Rendimento ............................................................................... 120

2.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ............................. 120

2.2.4.1. Formação e aparência das micropartículas ............................. 120

2.2.4.2. Tamanho de partícula ............................................................. 120

2.2.5. Eficiência de encapsulação (EE) ............................................... 120

3. Resultados e Discussão ................................................................... 121

3.1. Rendimento .................................................................................. 124

3.2. Formação...................................................................................... 126

3.3. Aparência ..................................................................................... 128

3.4. Tamanho de partícula ................................................................... 129

3.5. Eficiência de encapsulação .......................................................... 130

CONCLUSÕES ................................................................................... 133

REFERÊNCIAS .................................................................................. 137

ANEXOS / APÊNDICES .................................................................... 157

Introdução geral

Introdução geral - 2

APRESENTAÇÃO

Entre as doenças não transmissíveis de maior impacto sobre o

SUS encontram-se o Diabetes melito e a hipertensão arterial (OPAS,

2004). O tratamento destas patologias crônicas necessita de atenção

prioritária quanto ao desenvolvimento científico, tecnológico e de ino-

vação, visando diminuir custos e qualificar as condições de vida da po-

pulação. Como estratégias de prevenção, incluem-se a educação e modi-

ficações do estilo de vida da população, complementadas por terapias

medicamentosas, quando necessário (SBD, 2007; SBH, 2002).

Vários segmentos da população utilizam plantas medicinais como

adjuvantes ao tratamento de diversas patologias (VEIGA JÚNIOR,

2005). Entre as espécies nativas do Estado de Santa Catarina, destaca-se

a Cecropia glaziovii Sneth, amplamente utilizada na medicina tradicio-

nal na forma de infusão (chá) como anti-hipertensiva, cardiotônica, anti-

inflamatório, expectorante, antiasmático e antitérmico. Sua atividade

hipotensora foi comprovada em humanos e os resultados de sua toxici-

dade aguda e crônica foram considerados promissores (LIMA-

LANDMAN, 2007; NINAHUAMAN, 2007; STANGE, 2009).

Contudo, a possibilidade de variação na composição e nos teores

dos constituintes ativos a partir deste tipo de preparação, aliada aos ris-

cos inerentes à utilização de um produto não padronizado, conduz à

necessidade de estudos fitoquímicos, toxicológicos, farmacológicos e

tecnológicos.

O desenvolvimento de um extrato padronizado, através da utili-

zação de técnicas apropriadas e de substâncias auxiliares ou adjuvantes,

viria conferir qualidade ao produto intermediário, aspecto essencial para

garantir um produto final estável, seguro e terapeuticamente eficaz.

Por outro lado, a decisão sobre o tipo de forma farmacêutica onde

um fármaco será incluído envolve a avaliação de sistemas que possibili-

tem o maior aproveitamento do potencial terapêutico do mesmo. Parti-

cularidades que poderiam comprometer a eficácia do tratamento, tais

como irregularidade de absorção, toxicidade elevada, estreita faixa tera-

pêutica, rápida metabolização ou ainda utilização em esquemas terapêu-

ticos de longa duração devem ser consideradas. Em se tratando de ad-

ministração rotineira, como é o caso de agentes hipoglicemiantes

(CHEN, 1998), a via oral representa uma estratégia adequada para libe-

ração de fármacos, evitando o inconveniente da dor e de possíveis con-

seqüências indesejáveis após aplicações invasivas (ANSEL, 2007;

AULTON, 2005). No entanto, a administração oral de fármacos consti-

tui-se num grande desafio, uma vez que a biodisponibilidade por esta

Introdução geral - 3

via é complexa. A pesquisa e o desenvolvimento de sistemas cada vez

mais adequados para veicular fármacos pela via oral é uma necessidade

que se impõe àqueles envolvidos com a pesquisa e o desenvolvimento

de medicamentos (ANSEL, 2007). A obtenção de sistemas terapêuticos

capazes de modular a liberação de fármacos tem constituído, nos últi-

mos anos, uma estratégia promissora para a melhoria do perfil biofar-

macêutico de medicamentos.

As micropartículas são sistemas farmacêuticos altamente reco-

mendados para o tratamento de patologias crônicas devido à elevada

capacidade de controle de liberação do fármaco, o que acarreta um pro-

longamento da manutenção da concentração plasmática em níveis tera-

pêuticos, redução de flutuações das concentrações séricas dos fármacos

e, consequentemente, uma redução do número de doses diárias (RAVI

KUMAR, 2000).

Assim, com o objetivo de aliar-se a estratégia promissora dos sis-

temas microestruturados quanto à melhoria do perfil biofarmacêutico e o

potencial terapêutico de uma planta tradicionalmente utilizada para o

tratamento da Hipertensão Arterial e Diabetes melito, esta linha de pes-

quisa propõe o desenvolvimento de sistemas fitoterápicos microestrutu-

rados contendo extratos da espécie Cecropia glaziovii Sneth. Além das

vantagens biofarmacêuticas, esses sistemas terapêuticos constituiriam

uma inovação tecnológica em nível mundial, considerando a quase ine-

xistência de investigação científica constatada na literatura para a asso-

ciação de extratos vegetais e sistemas microestruturados.

Dentro deste contexto, este trabalho visou inicialmente o desen-

volvimento extratos padronizados de C. glaziovii de forma a maximizar

sua atividade anti-diabética e hipoglicemiante. Para isto, um planeja-

mento experimental foi conduzido para estudar a influência dos fatores

envolvidos na extração, entre eles método de extração, tempo, líquido

extrator, temperatura, e a possível interação entre eles. Como marcado-

res analíticos e biológicos foram selecionados os ácidos fenólicos, por

sua abundância e conhecida atividade tanto no Diabetes melito como na

Hipertensão arterial. O biomonitoramento dos extratos e marcadores

para ambas as atividades foi considerado como o principal critério de

seleção de um ou mais extratos para os estudos de microencapsulação.

Dentro desta proposta ainda foi realizado um estudo preliminar de mi-

croencapsulação dos extratos selecionados, utilizando para isto o polí-

mero Eudragit

RS100.

Introdução geral - 4

REVISÃO DA LITERATURA

A flora americana representa a mais rica do mundo com relação à

atividade farmacológica, sendo várias espécies levadas para Europa a

partir do século XVI. Ainda hoje o Brasil permanece como um impor-

tante fornecedor de matéria-prima vegetal para o mercado farmacêutico

internacional, além da sua população tanto rural quanto urbana, utilizar

essas plantas como medicação caseira (BRANDÃO, 2008).

O gênero Cecropia proveniente da família Urticaceae (HADIAH,

2008; SYTSMA, 2002), é considerado pioneiro e a sua presença em

florestas primárias é limitada a grandes espaços em formação, sendo

mais comum em florestas perturbadas ou áreas de reflorestamento

(PAULILO, 2007).

As principais aplicações populares de espécies de Cecropia são

na medicina tradicional, destacando-se o uso das folhas, além de cascas

e brotos. De maneira geral, este gênero é usado no tratamento de pro-

blemas respiratórios, como tosse, asma e bronquite, pressão alta, diabe-

tes, inflamações, além de empregado como diurético e cardiotônico (DI

STASI, 2002; LORENZI, 2008; MORS, 2000; PIO CORRÊA, 1978;

SIMÕES, 1998). Esta relevância pode ser comprovada pela inclusão de

Cecropia hololeuca, identificada como imbaúba, na 1ª edição da Phar-

macopeia Brasileira (PHARMACOPEIA, 1926).

Várias espécies deste gênero vêm sendo utilizadas como plantas

medicinais. A Cecropia hololeuca é citada como adjuvante no tratamen-

to da malária, em casos de febre alta e sintomas neurológicos, além de

outros tratamentos: diurética, anti-hipertensiva, sedativa, refrescante,

antiinflamatória, expectorante, antiasmática, supressão da tosse, anti-

térmica (BOTSARIS, 2007). Cecropia peltata usada no tratamento do

diabetes, apesar do mecanismo de ação ainda não ter sido elucidado

(ANDRADE-CETTO, 2006).

Em 2001 Andrade-Cetto e col. relataram o preparo de extratos

com as folhas de Cecropia obtusifolia, planta usada tradicionalmente

para o tratamento do diabetes, os quais diminuíram a concentração

plasmática de glicose em ratos com diabetes induzido por estreptozoto-

cina. O maior constituinte desses extratos foi identificado como sendo o

ácido clorogênico, composto também presente no café e outros vegetais

e que apresentaram efeito hipoglicemiante (ANDRADE-CETTO, 2007;

HERRERA-ARELLANO, 2004; JOHNSTON, 2003).

Introdução geral - 5

Cecropia glaziovii Sneth

A Cecropia glaziovii Sneth. é utilizada pela população como hi-

potensora, cardiotônica, diurética, anti-diabética, antiasmática e na

bronquite (NICOLAU, 1988 apud HEBERLÉ, 2000).

Em 1986 a Ceme (Central de Medicamentos) definiu o elenco fi-

nal de 74 espécies vegetais medicinais, selecionadas para a realização

dos estudos farmacológicos pré-clínicos, clínicos e toxicológicos, pelo

Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais (PPPM). Essas plantas

serviriam para o tratamento alternativo ou auxiliar de doenças da popu-

lação brasileira. A Cecropia glaziovii foi uma destas espécies seleciona-

das. Em 1991, o PPPM publicou um folder confirmando as ações hipo-

tensora e anti-hipertensiva da C. glaziovii, bem como a inexistência de

efeito tóxico (BRASIL, 2006).

Numa prospecção fitoquímica da Cecropia glaziovii Sneth já foi

relatada a presença de polifenóis, taninos, esteróides, triterpenos, flavo-

nóides e saponinas nas amostras avaliadas em diferentes épocas do ano

(LUENGAS-CAICEDO, 2007).

Alguns estudos farmacológicos desenvolvidos no Brasil foram

realizados com a espécie C. glaziovii Sneth, indicando que o extrato

aquoso apresentou efeitos broncodilatador (DELARCINA JÚNIOR,

2007), anti-hipertensivo (LIMA-LANDMAN, 2007) e antidepressivo

(ROCHA, 2007), provavelmente atribuídos aos compostos majoritários

catequinas, procianidinas e flavonóides presentes nesse extrato (TANA-

E, 2007). Estes dois últimos compostos também foram os responsáveis

por comprovar a ação anti-hipertensiva dessa espécie em estudo de Lu-

engas-Caicedo (2002), desenvolvido com animais e humanos.

Compostos polifenólicos

Os compostos fenólicos ou simplesmente polifenóis, são um dos

mais importantes grupos de substâncias que ocorrem em plantas, fazen-

do parte do seu metabolismo secundário, os quais apresentam como

característica principal a presença de múltiplos grupos funcionais do

tipo fenol. Exercem papel importante na morfologia e fisiologia vege-

tais, na medida em que estão relacionados a diversos aspectos do cres-

cimento, reprodução vegetal e defesa contra infecções e danos, princi-

palmente contra estresse fotossintético e formação de espécies reativas

de oxigênio. Baseado em sua estrutura química, os polifenóis podem ser

divididos em pelo menos dez diferentes classes, sendo que as principais

são os flavonóides, taninos e ácidos fenólicos e derivados (tanto benzói-

Introdução geral - 6

cos quanto cinâmicos) com mais de 5000 compostos já descritos

(MAURICIO, 2006; PYRZYNSKA, 2009).

A susceptibilidade à degradação dos compostos fenólicos estrutu-

ralmente diferentes de plantas depende fortemente do pH e da estrutura

do fenol (FRIEDMAN, 2000).

A constante de dissociação acídica (pKa) dos ácidos fenólicos é

um parâmetro físico-químico biologicamente importante no que diz

respeito a suas características farmacocinéticas e de toxicidade pois

constitui um dado importante para entender certos fenômenos químicos

como a atividade e a taxa de reação, absorção biológica e ligação a re-

ceptores em nível molecular (BELTRÁN, 2003; HERRERO-

MARTINEZ, 2008). Várias moléculas biologicamente ativas estão

completamente ou parcialmente ionizadas em pH fisiológico e sabe-se

que a presença de grupos ionizados é necessária para a atividade bioló-

gica, solubilidade ou ambos (OZKORUCUKLU, 2009).

Figura 1. Equilíbrio protolítico de ácidos polifenólicos

(BELTRÁN, 2003)

Os ácidos fenólicos já foram amplamente estudados, tendo sido

demonstradas a atividade antiinflamatória, anticarcinogênica e antimu-

tagênica, proteção contra doenças cardiovasculares devido à ação antio-

xidante entre outros (DINIZ, 2007; MOTA, 2008).

Além dos efeitos antioxidantes dos compostos fenólicos, vem

aumentando as pesquisas relacionadas aos seus efeitos de alterar a ab-

sorção de glicose no intestino, sob os mais variados mecanismos de

ação, bem como o metabolismo de carboidratos (JOHNSTON, 2003;

WANG, 2008).

O primeiro representante de interesse desta classe é o ácido cafei-

co (ACF), que apresenta dois grupos OH fenólicos. Quimicamente co-

nhecido como ácido 3,4-diidroxicinâmico, apresenta fórmula estrutural

(figura 2) e massa molecular (MM) igual a 180. Sua solubilida-

de em água é baixa, sendo 2,92 g/L a 50 °C e 0,98 g/L a 25 °C (GON-

THIER, 2006; Sigma-Aldrich; MOTA, 2008).

Alguns estudos levantam a possibilidade do ACF ser sensível ao

calor, podendo dar lugar a produtos de decomposição térmica (DIM-

BERG, 1996; MAURICIO, 2006).

Introdução geral - 7

Figura 2. Estrutura química do ácido cafeico

A absorção do seu espectro de UV é fortemente alterada pelo pH.

Isto sugere que os dois grupamentos OH fenólicos adjacentes que estão

ligados ao anel benzênico são responsáveis pelas mudanças observadas.

Importante observar que a mudança é tempo dependente e irreversível

(FRIEDMAN, 2000).

O ACF apresenta três pKa: 4,4; 8,5 e 11,2 (AMORATI, 2006).

Considerando os dois primeiros pKa, estima-se que em pH 7,2 já ocorra

a desprotonação de parte das hidroxilas fenólicas (MAURICIO, 2006).

O segundo representante de interesse é o ácido clorogênico

(ACG), um éster conjugado do ácido quínico com o ácido cafeico (AS-

THER, 2005; OLTHOF, 2001; RICE-EVANS, 1996).

O termo ácido clorogênico parece ter sido introduzido em 1846

por Payen para designar um composto fenólico com função ácida, de

estrutura ainda desconhecida, que conferia cor verde ao meio aquoso

quando em meio levemente alcalino e exposto ao ar. Esse ácido foi iso-

lado em 1907 na forma de um complexo cristalino, denominado cloro-

genato de cafeína, a partir do qual se preparou um ácido puro. A estrutu-

ra química para este composto foi estabelecida por Fischer como ácido

3-cafeoilquínico (atualmente conhecido como ácido 5-cafeoilquínico).

Mais tarde, outros compostos fenólicos ácidos foram isolados, caracteri-

zados quanto à estrutura química e agrupados na mesma família. Atual-

mente, o termo ACG é usado para designar ésteres do ácido trans-

cinâmico com o ácido quínico (ácido 1L-1(OH),3,4,5- tetra-hidróxi-

ciclo-hexanóico) (BASTOS DE MARIA, 2004).

Introdução geral - 8

Figura 3. Estrutura química do ácido quínico

(CLIFFORD, 2006)

Figura 4. Estrutura química do ácido clorogênico

Quimicamente conhecido como ácido 5-cafeoilquinico, possui

fórmula estrutural C

e MM igual a 354. Sua solubilidade em

água é muito baixa, sendo 245,34 µg/mL a temperatura ambiente. Apre-

senta ainda coeficiente de partição óleo/água (log P) igual a 0,30 e pKa

igual a 2,66 (DINIZ, 2007; GONTHIER, 2006; Sigma – Aldrich; XI-

ANG, 2008).

O isômero mais comumente encontrado nas plantas é o ácido 5-

O-cafeoilquínico (CLIFFORD, 1999) e também é o único comercial-

mente disponível.

Os resultados de absorção para o ácido clorogênico são bem simi-

lares aos do ACF. As mudanças espectrais observadas em pH elevados

são irreversíveis, quando o pH é reduzido de 10 para 7. Estas observa-

ções sugerem que a esterificação do grupamento carboxílico do ácido

cafeico com o ácido quínico não muda a susceptibilidade da molécula

quanto ao efeito do pH. O fato das mudanças espectrais serem irreversí-

veis sugere que estes compostos sofrem mudanças químicas sob a influ-

ência do pH. Em contraste, foi observada a estabilidade de uma solução

aquosa de ACG aquecida a 90 °C por 1 hora (FRIEDMAN, 2000).

A estabilização do ACG é uma das preocupações mais importan-

tes para a sua utilização (SHI, 2007). Ainda são poucas as informações,

Introdução geral - 9

mas acredita-se que os cinamatos são liberados (dos conjugados) por

hidrólise e subseqüente descarboxilação por aquecimento ou ação de

microorganismos. Essa perda de ácido clorogênico ainda é divergente,

dependendo da planta estudada e do tipo de processamento que o mate-

rial vegetal sofre, sendo inclusive dependente do tempo (CLIFFORD,

2000). Vários estudos foram realizados buscando entender o processo de

degradação e absorção do ACG e apesar destes não definirem exatamen-

te o mecanismo de absorção, todos declaram haver um papel fundamen-

tal da microbiota fecal para a quebra da ligação éster e absorção posteri-

or do ACF (ANDREASEN, 2001; COUTEAU, 2001; GONTHIER,

2006; NARDINI, 2002; PLUMB, 1999).

A literatura que trata da degradação enzimática do ACG ou da

habilidade de bactérias colônicas humanas produzirem esterases capazes

de hidrolisá-lo, bem como a biodisponibilidade deste em humanos ainda

não é conclusiva (ASTHER, 2005; JOHNSTON, 2003), mas Olthof e

col. (2001) mostraram que a absorção de 33 % do ACG e 95 % do ACF

administrado a pacientes ocorreu no intestino delgado. O trabalho ainda

estabeleceu que a absorção do ACG é três vezes mais lenta do que a do

ACF (OLTHOF, 2001).

Quanto à estabilidade, estudos demonstram que ao estocarem tan-

to o fruto quanto o suco de espinheiro branco (Hawthorn) a 40 °C por 6

meses, houve degradação do ACG inicialmente presente, sendo mais

expressivo nos frutos (40 %), provavelmente devido à oxidação e/ou

degradação por enzimas presentes nos mesmos. Estas enzimas seriam

inativadas pelo processo de preparo do suco (por aquecimento). Já à

temperatura ambiente (em torno de 23 °C) houve uma diminuição de 30

% do ACG. Apenas em baixas temperaturas (em torno de 4°C) é que o

ACG manteve-se estável (CHANG, 2006).

Os possíveis mecanismos de degradação dos fenólicos podem es-

tar relacionados à oxidação, hidrólise ou isomerização (CHANG, 2006).

Sabe-se que o ACG hidrolisa em ACF e ácido quínico em meio

aquoso alcalino, sendo esta reação descrita como de primeira ordem.

Esta hidrólise depende da temperatura, do tempo e do pH estudado.

Quanto maior a temperatura e maior o pH, mais rápida a velocidade de

hidrólise (TONG, 2009).

Diabetes melito

O Diabetes melito (DM) é a desordem endócrina mais comum e a

estimativa da Federação Internacional de Diabetes (IDF) é de que em

duas décadas haverá um crescimento mundial no número de doentes, em

Introdução geral - 10

torno de 285 milhões em 2009, para 440 milhões em 2030, quantidade

essa maior do que a população do México, Estados Unidos e Canadá

juntos (IDF, 2009).

As mortes relacionadas ao diabetes estão em torno de 9,0 % da

mortalidade global (ANDRADE-CETTO, 2008a). Este número é consi-

derado bastante subestimado, uma vez que o diabetes não é mencionado

na declaração de óbito pelo fato de serem atribuídas às suas complica-

ções, particularmente as cardiovasculares e cerebrovasculares, as causas

da morte (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES – SBD, 2007).

O número de indivíduos diabéticos está aumentando devido ao

crescimento e ao envelhecimento populacional, à maior urbanização, à

crescente prevalência de obesidade e sedentarismo, bem como à maior

sobrevida do paciente com diabetes (SBD, 2007). Sua natureza crônica,

a gravidade de suas complicações e os meios necessários para controlá-

las tornam o diabetes uma doença muito onerosa, não apenas para os

indivíduos afetados e suas famílias, mas também para o sistema de saú-

de (SBD, 2007). Além disso, devem ser considerados os custos intangí-

veis (dor, ansiedade, inconveniência e perda de qualidade de vida, por

exemplo), que apresentam grande impacto na vida das pessoas com

diabetes, e os gastos indiretos causados pela diminuição da produtivida-

de devido à perda de habilidades (retinopatias, nefropatias, neuropatias,

microangiopatias, doenças cardíacas, cegueira e amputações não trau-

máticas) e a mortalidade prematura da população economicamente ativa

(ANDRADE-CETTO, 2006; BARCELÓ, 2003; HERRERA-

ARELLANO, 2004).

O DM não é uma única doença, mas um grupo heterogêneo de

distúrbios metabólicos que apresentam em comum a hiperglicemia. A

classificação mais recente, proposta pela OMS inclui 4 classes: a) DM

tipo 1, caracterizada pela insuficiente produção de insulina pelo pân-

creas; b) DM tipo 2, que começa com um período de resistência à insu-

lina e aumento da secreção pancreática de insulina pelas células β nor-

mais (ANDRADE-CETTO, 2008b), sendo esta responsável pelo acome-

timento de 90-95 % dos diabéticos; c) outros tipos específicos de DM e

d) DM gestacional (SBD, 2007). Diabetes é uma doença crônica que

requer um tratamento medicamentoso contínuo e que representa um

fator de risco significativo na aterosclerose (BARCELÓ, 2003; SAID,

2008).

Estudos mostram o aumento significativo do diabetes tipo 2 em

jovens e crianças e a sua associação com a obesidade (GABBAY, 2003),

predispondo a um alto risco cardiovascular (CERCATO, 2004). Vale

lembrar que a prevalência de hipertensão em diabéticos é pelo menos

Introdução geral - 11

duas vezes maior do que na população em geral (SOCIEDADE BRA-

SILEIRA DE HIPERTENSÃO - SBH, 2002).

Existem evidências de que as alterações no estilo de vida, com

ênfase na alimentação e na redução da atividade física, estão associadas

ao acentuado aumento na prevalência do DM2 (SBD, 2007). Neste con-

texto da doença ocorre a compensação da resistência à insulina pelo

aumento da sua secreção; entretanto a exposição excessiva das células β

a altos níveis de glicose causa a disfunção destas que prejudica a secre-

ção de insulina e sua biossíntese. Desta forma as células não são mais

capazes de atender a demanda periférica, falhando na manutenção re-

querida pelo organismo (ANDRADE-CETTO, 2008b; UN, 2006). O

diabetes do tipo 2, portanto, caracteriza-se pela disfunção das células

pancreáticas β acompanhada de resistência à insulina.

O objetivo de se tratar o diabetes por via oral é alcançar a normo-

glicemia, evitando futuras complicações. Manter a glicose sob níveis

próximos ao normal (glicose no plasma pré-prandial (antes da refeição)

– 90 – 130 mg/dL e o pico pós-prandial de glicose no plasma < 180

mg/dL) já demonstrou diminuir significativamente o risco de complica-

ções a longo prazo (ANDRADE-CETTO, 2008a).

Inibidores de α-glicosidase estão entre os medicamentos disponí-

veis para diminuição da glicose. A enzima α-glicosidase está localizada

nas microvilosidades do intestino delgado e é requerida para a quebra

dos carboidratos e absorção dos monossacarídeos. Os inibidores da α-

glicosidase retardam, mas não previnem a absorção dos carboidratos

ingeridos, reduzindo a glicose pós-prandial e os picos de insulina (AN-

DRADE-CETTO, 2008a). Alguns autores mencionam que os flavonói-

des e polifenóis, assim como os seus açúcares derivados, são tidos como

os responsáveis pela inibição da α-glicosidase. Os ácidos fenólicos pre-

sentes no extrato de C. obtusifolia (ACG e isoorientina) inibiram a α-

glicosidase, diminuindo a absorção de glicose no intestino; mas nenhum

outro possível mecanismo de ação foi descartado (ANDRADE-CETTO,

2008a).

Outros estudos estabelecem os benefícios obtidos por consumido-

res de café (tanto cafeinado quanto descafeinado) na diminuição dos

riscos de se desenvolver o diabetes tipo 2, havendo várias evidências de

que são outros compostos do café que não a cafeína, que promovem os

efeitos benéficos no metabolismo da glicose. Componentes estes como o

ACG, que já demonstrou efeito na homeostase da glicose em modelos

animais e na diminuição da pressão arterial (VAN DAM, 2008); e o

ACF que promoveu a alteração do metabolismo da glicose (UN, 2006).

Introdução geral - 12

As substâncias e o(s) mecanismo(s) permanecem incertos, embo-

ra haja algumas evidências de estudos in vitro que o ACG possa dissipar

o gradiente eletroquímico de Na

, o qual promove a força de ativação de

absorção da glicose (WANG, 2008). Desta forma há o potencial desse

composto de proteger contra o desenvolvimento do diabetes tipo 2 e da

síndrome metabólica. Estudos demonstraram que, em níveis normais de

alimentação, a concentração de ACG presente no café (bebida) e no

suco de maçã induz uma modificação significativa na secreção de hor-

mônio gastrointestinal de voluntários, bem como a tolerância a glicose.

Os mecanismos bioquímicos para esta proteção não estão claros, mas

estudos in vitro com vários polifenóis puros sugerem o retardo da absor-

ção intestinal da glicose pela inibição do transportador de glicose ativo

(SGLT1) e/ou do facilitador do transporte de glicose (GLUT) como um

dos possíveis mecanismos (WANG, 2008; WELSCH, 1989).

WELSCH e colaboradores (1989) verificaram que a 1 mM o ACF

reduziu a absorção de glicose em torno de 35 – 40 % e o ACG diminuiu

80% independente do seu estado de oxidação. Também evidenciaram

que a permeabilidade da membrana das microvilosidades não foi altera-

da e que o ACG não atua diretamente no carreador de glicose, mas pode

reduzir a absorção de glicose por alterar o gradiente eletroquímico de

, que fornece a força para ativar o acúmulo de glicose.

Ainda, interações hidrofóbicas podem contribuir para a perda da

capacidade de transportar glicose. Uma vez que a maioria dos fenólicos

possui alto coeficiente de partição octanol/água e permeia rapidamente a

bicamada lipídica, distúrbios na membrana causados pela interação com

fosfolipídeos ou outros componentes da membrana podem também ser

um fator causador. Desta forma, o efeito do ACG e do ACF pode vir de

um ou da combinação de vários mecanismos, envolvendo desde a inte-

ração direta com o transportador ou uma associação indireta com a

membrana.

Um fator patogênico importante no desenvolvimento das compli-

cações do diabetes é o estresse oxidativo (UN, 2006), estando o diabetes

associado ao aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e na

redução das defesas antioxidativas (GAYATHRI, 2008; SAID, 2008).

A redução na lipoperoxidação pode ser atribuída à atividade anti-

oxidante de vários compostos fitoquímicos presentes nos extratos vege-

tais, sugerindo que a maior função dos extratos é proteger tecidos vitais

como fígado, rins, pâncreas e cérebro de danos e, desta forma, reduzir os

efeitos posteriores do diabetes (GAYATHRI, 2008). Antioxidantes, os

quais incluem compostos fenólicos e polifenólicos, ao eliminarem radi-

Introdução geral - 13

cais livres poderão ser úteis na prevenção ou atraso no desenvolvimento

de aterosclerose, diabetes e obesidade (LANDRAULT, 2003).

Os tratamentos atuais do diabetes focam o controle e o retorno

dos níveis de glicose no sangue a um nível normal. Os fármacos clini-

camente usados no tratamento do diabetes podem ser divididos em insu-

lina, secretagogo de insulina, fatores de aumento da sensibilidade a insu-

lina, fator de crescimento insulino-mimético, inibidores da aldose redu-

tase, inibidores da α-glicosidase e inibidores de glicação de proteínas.

De maneira geral esses fármacos são responsáveis por promover diver-

sos efeitos colaterais (LI, 2004).

Inúmeras espécies de plantas com comprovadas propriedades hi-

poglicemiantes apresentam uma composição química rica em flavonói-

des, um grupo de compostos fenólicos amplamente encontrados em

plantas. Muitos estudos demonstraram o efeito hipoglicemiante de fla-

vonóides isolados e de frações enriquecidas com flavonóides (CAZA-

ROLLI, 2006; De SOUSA, 2004; HNATYSZYN, 2002; JORGE, 2004;

KAMALAKKANNAN, 2006; SRINIVASAN, 2005; ZANATTA, 2007;

ZANATTA, 2008).

Hipertensão arterial

Na grande maioria dos casos, a hipertensão arterial (HTA) é con-

siderada essencial, isto é, ela é uma doença por si mesma. O apareci-

mento da hipertensão é favorecido por excesso de peso, sedentarismo,

elevada ingestão de sal, baixa ingestão de potássio e consumo excessivo

de álcool. No grupo com pressão limítrofe também contribuem para o

aumento do risco cardiovascular as dislipidemias, intolerância à glicose

e diabetes, tabagismo, menopausa e estresse emocional (SBH, 2002).

A hipertensão arterial apresenta elevado custo médico-social,

principalmente por sua participação em complicações como doenças

cerebrovasculares, doença arterial coronária, insuficiência cardíaca,

insuficiência renal crônica, doença vascular de extremidades (SBH,

2002). A hipertensão arterial é um dos mais importantes fatores de risco

para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares, explicando 40 %

das mortes por acidente vascular encefálico e 25 % daquelas por doença

arterial coronariana (SBH, 2002).

A partir da década de 60, as doenças cardiovasculares superaram

as infecto-contagiosas como primeira causa de morte no Brasil. Em

1998, foram registrados 930 mil óbitos no país. Desse total, as doenças

cardiovasculares foram responsáveis por 27 %. Excluindo-se os óbitos

Introdução geral - 14

por causas mal definidas e por violência, tal cifra aproxima-se de 40 %

(SBH, 2002).

A medida da pressão arterial é comprovadamente o elemento

chave para estabelecer o diagnóstico da doença, sendo o critério atual de

diagnóstico uma pressão arterial ≥ 140/90 mmHg (SBH, 2002).

O objetivo primordial do tratamento da hipertensão arterial é a

redução da morbidade e da mortalidade cardiovasculares do paciente

hipertenso, aumentadas em decorrência dos altos níveis tensionais e de

outros fatores agravantes (SBH, 2002).

A hipertensão arterial também está associada à disfunção endote-

lial, a qual é causada pela produção de radicais livres de oxigênio que

destroem o óxido nítrico (ON), impossibilitando os seus efeitos proteto-

res na parede vascular (ALCÂNTARA, 2003; GRIEDLING, 2003). Em

condições fisiológicas, as espécies reativas de oxigênio (ERO) são pro-

duzidas de maneira controlada, em baixas concentrações, e funcionam

como moléculas sinalizadoras regulando a contração e o relaxamento

das células do músculo liso vascular e o seu crescimento. Sob condições

patológicas a produção aumentada de ERO leva à disfunção endotelial,

aumentando a contratilidade, o crescimento e a apoptose do músculo

liso vascular, migração de monócitos, peroxidação lipídica, inflamação,

e aumentando a deposição de proteínas da matriz extracelular, contribu-

indo para o dano vascular na doença cardiovascular (GRIENDLING,

2003; TOUYZ, 2004a).

O endotélio tem uma função autócrina/parácrina, reguladora da

secreção de substâncias que controlam o tônus e a estrutura vascular

(ALCÂNTARA, 2003; MONCADA, 2006; RUBIO, 2004).

O fator relaxante melhor caracterizado e mais importante é o ON,

derivado da L-arginina pela atividade da sintetase do ON endotelial. O

ON tem uma produção e liberação basais, e uma outra dependente da

influência de vários agonistas, entre eles acetilcolina (ALCÂNTARA,

2003; MONCADA, 2006).

As ERO possuem um papel fisiopatológico importante no desen-

volvimento da hipertensão, em parte devido ao excesso de O

e diminu-

ição da biodisponibilidade do óxido nítrico (ON). O tratamento com

antioxidantes melhora a estrutura e função vascular, prevenindo o dano

ao órgão alvo, e reduzindo a pressão arterial em modelos animais e na

hipertensão humana (TOUYZ, 2004a; TOUYZ, 2004b).

Os anti-hipertensivos em uso em nosso meio podem ser divididos

em seis grupos: diuréticos, inibidores adrenérgicos, vasodilatadores

diretos, inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA), blo-

queadores dos canais de cálcio e antagonistas do receptor AT

da angio-

Introdução geral - 15

tensina II. Qualquer grupo de medicamentos, com exceção dos vasodila-

tadores de ação direta, pode ser apropriado para o controle da pressão

arterial em monoterapia inicial, especialmente para pacientes com hiper-

tensão arterial em estágio I (leve) que não responderam às medidas não-

medicamentosas. Entretanto, a monoterapia inicial é eficaz em apenas

40 % a 50 % dos casos. Para pacientes em estágio II e III, pode-se con-

siderar o uso de associações de fármacos anti-hipertensivos como tera-

pia inicial (SBH, 2002).

Além do tratamento medicamentoso, existe o tratamento não me-

dicamentoso recomendado pela SBH e que associa a reeducação alimen-

tar para redução de peso, redução no consumo de sódio, bebidas alcoóli-

cas e tabagismo, suplementação de potássio, cálcio e magnésio e exercí-

cios físicos (SBH, 2002). A população, de maneira geral, adota o uso de

plantas medicinais como adjuvante para a redução da hipertensão.

Lima-Landman e colaboradores (2007) estudaram extratos aquo-

sos e frações butanólicas de C. glaziovii e observaram uma atividade

anti-hipertensiva da espécie em ratos normotensivos e hipertensos de

maneira tempo e dose dependente. Dando continuidade a este trabalho,

Ninahuaman e colaboradores (2007) investigaram um possível meca-

nismo de ação, e concluíram que este não está relacionado a inibição da

ECA, porém não foi possível elucidar o mecanismo pelo qual esta planta

atua.

Liberação modificada de fármacos: micropartículas

A liberação modificada de fármacos tem despertado grande inte-

resse como uma estratégia promissora para a melhoria do perfil biofar-

macêutico de medicamentos, pois oferece inúmeras vantagens em rela-

ção aos sistemas convencionais de dosagem de medicamentos. Entre

elas pode-se citar a redução do número de doses diárias do medicamen-

to, levando à redução de flutuações das concentrações séricas dos fár-

macos e à manutenção da concentração plasmática em níveis terapêuti-

cos e, por consequência, à redução da toxicidade e uma maior conveni-

ência para os pacientes, uma vez que os efeitos colaterais gerados pelos

sistemas convencionais de administração podem ser minimizados pelas

pequenas quantidades de substância ativa circulantes. Do ponto de vista

econômico, sistemas de liberação modificada de medicamentos são

potencialmente mais baratos, pois geram uma maior eficiência de apli-

cação do fármaco, permitindo que tratamentos que não eram possíveis

se tornassem rotineiros (LANGER, 1981; RAFFIN, 2009; RAVI KU-

MAR, 2000).

Introdução geral - 16

Entre os sistemas capazes de modificar eficientemente a liberação

de um fármaco destacam-se as micropartículas. O desenvolvimento de

micropartículas a partir de polímeros naturais ou sintéticos tem sido

considerado uma boa estratégia para obter formas farmacêuticas de libe-

ração modulada. As micropartículas são partículas sólidas com tamanho

que varia entre 1 e 1000 μm (RAVI KUMAR, 2000). Subdividem-se em

microcápsulas, sistemas reservatório contendo a substância ativa reves-

tida por polímeros de espessuras variáveis, que constituem a membrana

da cápsula, e em microsferas, sistemas matriciais nos quais o fármaco se

encontra uniformemente disperso e/ou dissolvido numa rede polimérica

(SILVA, 2003).

O mecanismo de liberação do fármaco encapsulado no interior da

partícula envolve processos de natureza difusional e/ou a degradação

enzimática da rede polimérica previamente formada (BATYCKY, 1997;

LINHARD, 1988). De todos os sistemas farmacêuticos disponíveis, as

micropartículas apresentam a maior capacidade de controle de liberação

do fármaco, possibilitando uma otimização da posologia, através da

redução do número de doses diárias. Assim, estes sistemas são particu-

larmente interessantes para o tratamento de patologias crônicas (GER-

WIN, 2006; KIM, 2005).

As vantagens mais específicas destes sistemas são a liberação

precisa de baixas doses de fármacos potentes, redução da concentração

do fármaco em outros locais que não os órgãos ou tecidos alvo e prote-

ção dos compostos lábeis, antes e depois da administração, até exerce-

rem a sua ação farmacológica (SILVA, 2003).

Porém algumas desvantagens deste sistema de liberação modifi-

cada também são observadas como a baixa eficiência de encapsulação

de fármacos hidrofílicos, uma rápida liberação inicial (tipo burst), utili-

zação de solventes orgânicos que poderão permanecer residualmente nas

micropartículas (JAIN, 2000), é um processo mais caro do que os con-

vencionais, as micropartículas podem apresentar aglomerados e em caso

de reação adversa, o estado inicial somente será recuperado após total

liberação do fármaco (PICOS, 2000).

Um grande número de técnicas tem sido desenvolvido para a ob-

tenção das micropartículas, tendo em vista que a técnica ideal deve ser

simples, reprodutível, rápida, fácil de ser transposta à escala industrial e

deve ser pouco dependente das características de solubilidade do fárma-

co e polímero; mas sobretudo deve minimizar a perda da atividade bio-

lógica (SILVA, 2003).

Introdução geral - 17

A técnica escolhida deve assegurar a estabilidade e a atividade

biológica da substância ativa durante e ao final do processo de encapsu-

lação. Ao final deste processo a maior parte das micropartículas deve

possuir tamanhos não superiores a 250 μm (idealmente este valor deve

estar abaixo de 125 μm), uma alta eficiência de encapsulação e não de-

vem exibir agregados ou aderência. Além disso, a qualidade das micro-

partículas bem como o perfil da liberação da substância ativa devem ser

reprodutíveis (JAIN, 2000).

Vários são os métodos de preparação de micropartículas, poden-

do-se citar coacervação, polimerização interfacial, spray-drying, etc.,

entre este destacando-se a emulsificação/evaporação do solvente.

A técnica de emulsificação seguida de evaporação do solvente

tem sido muito utilizada devido à simplicidade dos procedimentos en-

volvidos na obtenção das partículas, além de representar a possibilidade

de modular as características físico-químicas das partículas pela escolha

dos componentes da formulação e das condições de preparação. Esta

técnica não requer temperaturas elevadas nem agentes que induzam a

separação de fases e é possível atingir tamanhos de partícula controlados

na faixa nano e micrométrica (FREITAS, 2005). No entanto, muitas

vezes são necessárias modificações desta técnica para obter valores

satisfatórios de eficiência de encapsulação. No caso de substâncias ati-

vas hidrofílicas, a adaptação mais utilizada é a utilização de dupla emul-

são A/O/A.

Processo por Dupla Emulsão (A/O/A)

Este método consiste na preparação de uma emulsão em três fases

água/óleo/água (A/O/A) e é mais adequado para promover a encapsula-

ção de fármacos hidrofílicos (JAIN, 2000).

O preparo das micropartículas associa o processo de dupla emul-

são à extração/evaporação do solvente, que basicamente consiste em 4

passos principais: a) dissolução ou dispersão do composto bioativo fre-

quentemente em uma fase orgânica contendo o material formador da

matriz, formando uma emulsão água/óleo; b) emulsificação desta emul-

são (A/O) numa segunda fase contínua (normalmente aquosa) imiscível

com a primeira, com vigorosa agitação obtém-se uma emulsão á-

gua/óleo/água (A/O/A); c) extração do solvente da fase dispersa pela

fase contínua, o qual é opcionalmente acompanhado pela evaporação do

solvente, transformando as gotas em micropartículas sólidas; d) coleta e

secagem das micropartículas (FREITAS, 2005; JAIN, 2000) (figura 5).

Introdução geral - 18

(FREITAS, 2005)

Figura 5. Esquema geral dos quatro passos principais do processo de

preparo de micropartículas por extração/evaporação do solvente

Este processo apresenta como desvantagens o fato de ser compos-

to de várias etapas e rígidos controles dos vários parâmetros envolvidos

como a temperatura e a viscosidade do disperso na fase contínua (A/O).

Além destes, outros fatores também afetam diretamente a obtenção das

micropartículas. Pode-se citar, por exemplo, a natureza, a concentração

e a solubilidade do fármaco, a massa molar do polímero, a razão fárma-

co/polímero, o solvente utilizado, a concentração e a natureza do emul-

sionante, agitação e velocidade do processo de emulsificação (JALIL,

1990).

Outra desvantagem está relacionada à dificuldade na encapsula-

ção de altas concentrações de fármacos hidrofílicos (JAIN, 2000; JA-

LIL, 1990; TAKADA, 1995). Por isso, compostos bioativos podem

Introdução geral - 19

ainda ser adicionados à solução do material da matriz usando a co-

dissolução em um solvente comum, dispersão de um material sólido

finamente pulverizado ou emulsificação de uma solução aquosa do

composto ativo imiscível com a solução do material da matriz (FREI-

TAS, 2005).

A microencapsulação de compostos hidrofílicos por dispersão

destes compostos aquosos em uma solução orgânica do material da ma-

triz foi mais eficiente com emulsões A/O microfinas, isto é, numa razão

menor do diâmetro das gotas de material bioativo em micropartículas.

Aumentando o volume da fase aquosa interna diminui-se a eficiência de

encapsulação devido à coalescência das gotas e aumento da probabilida-

de de contato entre a solução interna do fármaco e a fase de extração

externa resultando em perda de fármaco, além do aumento da liberação

tipo burst e porosidade das micropartículas (FREITAS, 2005).

Para uma encapsulação eficiente de fármacos dissolvidos em uma

fase aquosa a ser dispersa em uma solução orgânica com a matriz, é

requerida a estabilização da emulsão A/O, muitas vezes com o uso de

surfactantes. Estes devem ser escolhidos com cautela, uma vez que a

coencapsulação de surfactantes pode afetar negativamente a eficiência

de encapsulação e liberação do fármaco (FREITAS, 2005).

O passo de formação da gota determina o tamanho e a polidisper-

são das micropartículas resultantes. O tamanho das micropartículas pode

afetar a velocidade de liberação do fármaco, eficiência de encapsulação,

possibilidade de o produto ser injetável, possibilidade de ser fagocitado

in vivo e biodistribuição das partículas após injeção subcutânea (FREI-

TAS, 2005; ROSCA, 2004).

Agitação

É o método mais direto para gerar gotas de dispersão do fárma-

co/matriz na fase contínua para subseqüente extração do solvente, onde

uma velocidade específica produzirá o tamanho de gotas desejado.

Normalmente com o aumento da velocidade, tem-se a diminuição do

tamanho das gotas e, por conseguinte, a diminuição das micropartículas.

A extensão da redução das micropartículas obtidas depende da viscosi-

dade das fases dispersa e contínua, da tensão interfacial entre as fases, a

razão entre seus volumes, a geometria e o número de pás do agitador e a

razão do tamanho entre as pás e o recipiente onde as micropartículas são

preparadas (FREITAS, 2005). Quanto maior a viscosidade, maior é a

força de cisalhamento necessária para reduzir o tamanho das gotas, po-

dendo torná-las maiores. Essa viscosidade pode ser aumentada em fun-

Introdução geral - 20

ção do aumento da concentração ou da massa molecular da matriz, que

pode ser desejado para restringir a migração do fármaco para a fase

contínua, aumentando assim a encapsulação. Além disso, quanto menor

o diâmetro do recipiente, mais vigorosa torna-se a agitação resultando

em menor polidispersão das micropartículas (FREITAS, 2005).

Para prevenir a coalescência das gotas de dispersão fárma-

co/matriz, um ativo de superfície ou espessante, como o PVA, pode ser

necessário, sendo este adicionado à fase contínua. O aumento da con-

centração do estabilizante pode levar a diminuição das micropartículas

(FREITAS, 2005). Os emulsionantes também são fatores críticos em

processos de extração/evaporação de solvente, pois suas propriedades

físico-químicas e estruturais e sua concentração influenciam diretamente

nas características das micropartículas (SPENLEHAUER, 1986). Os

emulsionantes proporcionam uma camada fina protetora ao redor das

gotículas de solvente/polímero e princípio ativo diminuindo a coales-

cência e a coagulação durante o processo de fabricação. Quando se está

eliminando o solvente, os emulsionantes mantêm as gotículas em sua

configuração esférica, prevenindo também a ocorrência de agregados.

Quanto à razão entre os volumes da fase dispersa e contínua, os

trabalhos são conflitantes. Enquanto alguns reportam a diminuição do

tamanho das micropartículas com a diminuição do volume da fase con-

tínua; outros dizem não ter observado efeito significativo desta variação

(FREITAS, 2005).

Remoção do solvente

Já é bem conhecido que a emulsificação evaporação do solvente é

de maneira geral um processo de dois passos: emulsificação de uma

solução polimérica contendo a substância encapsulada, seguida pela

solidificação das partículas através da evaporação do solvente e precipi-

tação do polímero (ROSCA, 2004).

Tanto na extração quanto na evaporação do solvente, o solvente

da fase dispersa (dispersão fármaco/matriz) deve ser pouco miscível na

fase contínua, assim a partição para a fase contínua pode ocorrer condu-

zindo à precipitação do material da matriz. Na evaporação do solvente, a

capacidade da fase contínua é insuficiente para dissolver todo o volume

do solvente da fase dispersa. Consequentemente, o solvente deve evapo-

rar da superfície da dispersão para produzir micropartículas suficiente-

mente duras. Na extração do solvente, a quantidade e composição da

fase contínua são escolhidas de tal forma que todo o volume do solvente

da fase dispersa possa ser dissolvido (FREITAS, 2005).

Introdução geral - 21

Geralmente, a fase contínua que seja um não-solvente para o

composto bioativo microencapsulado é preferida. Enquanto que para

compostos lipofílicos, soluções aquosas podem ser confortavelmente

escolhidas, o uso de líquidos orgânicos (hidrofóbicos) como fase contí-

nua para a encapsulação de compostos hidrofílicos é mais delicada.

Fluidos de extração hidrofóbicos podem não ser prontamente removidos

do produto final, causando potencialmente resíduos indesejados. Sendo

assim, soluções aquosas são frequentemente usadas como fase contínua,

mesmo para a microencapsulação de compostos hidrofílicos. Aqui, a

perda de compostos bioativos é tipicamente prevenida pelo aumento da

concentração da solução do material da matriz; o aumento da viscosida-

de resultante restringe a migração do composto bioativo das micropartí-

culas em solidificação para a fase externa, devido à baixa difusão e au-

mento da estabilidade da dispersão fármaco/matriz. Outra maneira de

prevenir a perda do material bioativo para a fase contínua inclui a adap-

tação do pH da fase contínua para diminuir a solubilidade do composto

bioativo ou a adição de eletrólitos para aumentar a pressão osmótica da

fase contínua.

A razão ideal de remoção do solvente depende da variedade dos

fatores como o tipo de material da matriz, fármaco e solvente, assim

como o perfil de liberação desejado. Exemplo, a solidificação mais rápi-

da das micropartículas será preferida se o fármaco é facilmente particio-

nado para a fase contínua. Por outro lado, uma solidificação mais lenta

favorece a formação de micropartículas mais densas em detrimento das

porosas, afetando a liberação do fármaco (FREITAS, 2005).

Uma vez iniciada a eliminação do solvente, o processo é acelera-

do pela precipitação do polímero e o solvente remanescente é pratica-

mente expulso das microgotas gerando as micropartículas finais (ROS-

CA, 2004). Para as concentrações usuais de polímero (1 – 10 % m/V),

há um significativo encolhimento durante a formação das micropartícu-

las, sendo assim o diâmetro final destas é várias vezes menor do que o

diâmetro da microgota correspondente (ROSCA, 2004).

Evaporação do solvente

A velocidade de remoção do solvente volátil do meio de solidifi-

cação das micropartículas pode ser controlada pela temperatura da dis-

persão das destas. Temperaturas mais altas facilitarão a evaporação do

solvente da fase contínua, mantendo um alto gradiente de concentração

para o solvente entre as micropartículas e a fase contínua (FREITAS,

2005).

Introdução geral - 22

Como uma alternativa para as elevadas temperaturas, a redução

da pressão é algumas vezes utilizada para promover a evaporação do

solvente. A lenta remoção do solvente à pressão atmosférica favorece a

formação de matrizes poliméricas cristalinas em detrimento das amor-

fas, as quais prevalecem em condições de pressão reduzida. No estado

amorfo, dados indicam uma dispersão molecular do polímero e do fár-

maco, diminuindo a velocidade de liberação tardia. A eficiência de en-

capsulação não foi afetada pelo modo de remoção do solvente (FREI-

TAS, 2005).

Tirando vantagem da rápida eliminação do solvente, o tempo de

evaporação pode ser reduzido significativamente se a emulsão inicial é

vertida em uma quantidade suficientemente grande de fase aquosa para

que o solvente não exceda seu limite de solubilidade (ROSCA, 2004).

A eficiência de encapsulação é afetada pelo rápido encolhimento

evitando a drenagem da substância encapsulada durante a expulsão do

solvente. Alta concentração de polímero aumenta a eficiência de encap-

sulação, principalmente através do menor encolhimento e prolongada

polimerização das cadeias do polímero (ROSCA, 2004).

Já é bem conhecido que micropartículas preparadas por emulsão

evaporação do solvente apresentam liberação inicial tipo burst devido à

localização superficial da substância encapsulada (ROSCA, 2004).

Uma das razões para a obtenção de diferentes morfologias das

micropartículas é a gota da emulsão com diferentes quantidades de fase

aquosa interna: pode conter uma microgota de fase aquosa encapsulada

e com mais de uma microgota. Esta composição de gotas se comporta de

maneiras diferentes durante a eliminação do solvente, consequentemente

conduzindo a diferentes morfologias (ROSCA, 2004).

Extração do solvente

A extração do solvente é frequentemente realizada em dois pas-

sos. Primeiro, a dispersão fármaco/matriz é misturada a uma pequena

quantidade de fase contínua para obter uma emulsão de tamanho de gota

desejado (distribuição). Em seguida, mais fase contínua é adicionada

numa quantidade suficiente para absorver todo o solvente extraído das

micropartículas solidificadas (FREITAS, 2005).

A rápida formação de uma película na periferia das micropartícu-

las reduz a perda de fármaco para a fase contínua, o que é especialmente

importante quando esta última é um bom solvente para o fármaco. A

combinação da evaporação do solvente e sua extração é sugerida para

aumentar a eficiência econômica do processo de microencapsulação.

Introdução geral - 23

Após a formação da emulsão, uma quantidade suficiente de um fluido

extrator é adicionada para induzir a formação da película na periferia

das micropartículas enquanto o solvente remanescente é removido por

evaporação. Este passo de formação da película minimiza a perda de

fármaco durante a fase sucessiva de evaporação. Os dois passos de eva-

poração/extração do solvente podem ser combinados usando uma mistu-

ra de solventes (FREITAS, 2005).

Durante a eliminação do solvente e encolhimento das microgotas

internalizadas coalescentes e a recente parede de polímero formada ao

redor destas pode iniciar a expulsão da fase aquosa internalizada. Seu

diâmetro é um parâmetro global que abrange todos os parâmetros da

formulação: energia de emulsificação, concentração do polímero, con-

centração do tensoativo, volume das fases, viscosidade das fases, entre

outros (ROSCA, 2004).

A eficiência de encapsulação está diretamente relacionada à ex-

tensão de encapsulação da primeira emulsão; assim, para o sucesso da

encapsulação, é necessário escolher as condições de formulação que

produzam microgotas de uma primeira emulsão com o menor diâmetro

do que o da segunda emulsão (ROSCA, 2004).

Dependendo das condições de formulação, a fase aquosa interna é

parcialmente perdida durante a eliminação do solvente e encolhimento

através de “buracos” na superfície. Ainda, durante a evaporação do sol-

vente, a substância encapsulada remanescente é continuamente particio-

nada com a fase aquosa externa através desses “buracos”. Estes vão

contribuir decisivamente para a liberação burst inicial (ROSCA, 2004).

Nem a extração nem a evaporação do solvente requerem temperaturas

elevadas ou agentes de indução de separação de fases. O controle de

tamanho de partículas de nano a micrômetros pode ser conseguido, mas

a seleção cuidadosa das condições de encapsulamento e dos materiais

utilizados é necessária para atingir altas eficiências de encapsulação e

níveis residuais de solventes (FREITAS, 2005).

Recolhimento (colheita, obtenção) das microsferas e secagem

A separação das micropartículas solidificadas da fase contínua é

tanto realizada por filtração quanto por centrifugação. As partículas

podem então ser lavadas com líquido apropriado para remover substân-

cias aderidas, como estabilizantes de dispersão ou fármaco não encapsu-

lado. A lavagem pode envolver elevadas temperaturas ou o uso de agen-

tes de extração para reduzir a quantidade de solvente residual nas mi-

cropartículas. Finalmente, as micropartículas são secas em temperatura

Introdução geral - 24

ambiente, sob pressão reduzida, por aquecimento ou por liofilização

para render um pó com bom fluxo. O procedimento de secagem remove

não somente a fase contínua e lava o fluido aderido à superfície das

micropartículas, mas também traços de solventes e da fase contínua do

interior das partículas. Desta forma as condições e a velocidade de seca-

gem influenciam a quantidade de resíduo de solvente e de umidade,

morfologia e porosidade das micropartículas, assim como a recristaliza-

ção do fármaco no interior das esferas e pode, desta forma, afetar o

comportamento de liberação do produto final (FREITAS, 2005).

Polímero

Eudragit

é o nome comercial adotado pela Röhm Pharma Poly-

mers (Degussa) para os polímeros derivados do ácido metacrílico. Os

diferentes copolímeros possuem diversos substituintes, o que lhes confe-

re diferentes características para as mais diversas finalidades. Esses

derivados podem ser utilizados como polímeros de revestimento (RIE-

DEL, 2005; KRISHNAMACHARI, 2007), na produção de pellets

(BECKERT, 1996), em associação a polímeros naturais na formação de

filmes resistentes a degradação gastrointestinal (BENEKE, 2009; VER-

VOORT, 1996), como carreadores inertes no preparo de microsferas

como sistema de liberação oral com ação específica na região do cólon

(KENDALL, 2009; LAMPRECHT, 2003, 2004 e 2005), dispersões

sólidas contendo fármacos hidrofílicos para redução de efeitos colaterais

(PIGNATELLO, 2001), nanosuspensões com AINE incorporados para o

tratamento intraocular (PIGNATELLO, 2002a, 2002b e 2006), micros-

feras contendo verapamil para o tratamento de doenças cardiovasculares

(KILIÇARSLAN, 2003), associados a ciclodextrinas na encapsulação de

glutationa (LOPEDOTA, 2007 e 2009; TRAPANI, 2007), preparo de

micropartículas de uso parenteral (JIAO, 2002), entre muitas outras

finalidades.

O Eudragit

RS100 é um copolímero dos ácidos acrílico e meta-

crílico (etilacrilato, metil-metacrilato e clorotrimetil-

amonioetilmetacrilato), com baixa quantidade de grupamentos quaterná-

rios de amônia (4,5 – 6,8 %) (PIGNATELLO, 2001, 2002a, 2002b e

2006; VACHON, 1998). Insolúvel em pH fisiológico, mas intumesce

em água, além de representar um bom material para dispersão de fárma-

cos (TRAPANI, 2007). Por possuir 5 % de grupos funcionais de amônio

quaternário (carregado positivamente) sua permeabilidade é pH inde-

pendente (JIAO, 2002; KILIÇARSLAN, 2003; VACHON, 1998). Pos-

sui características mucoadesivas, sendo um polímero não-biodegradável

Introdução geral - 25

(LOPEDOTA, 2009). Possui massa molecular aproximada de 150.000

Da (DEGUSSA, 1999).

Sua estrutura molecular é representada na figura 6.

Figura 6. Estrutura molecular do Eudragit

RS100

Praticamente insolúvel em éter de petróleo, hidróxido de sódio

1,0 N e água. 1,0 g de Eudragit

RS100 dissolve em 7,0 g de metanol

aquoso, etanol e isopropanol (contendo aproximadamente 3,0 % de

água), assim como em acetona, acetato de etila e cloreto de metileno

(DEGUSSA, 1999).

Vários estudos têm demonstrado a importância da utilização de

sistemas particulados (micro e nano-estruturados) buscando a estabiliza-

ção dos compostos ativos de extratos vegetais, assim como um sistema

de liberação adequado ao tecido alvo e melhora das características orga-

nolépticas dos ativos presentes nos extratos vegetais (BORODINA,

2008; CHAN, in press; KOSARAJU, 2006 e 2008; LACATUSU, 2009;

SCALIA, 2009; ZHANG, 2007).

Introdução geral - 26

Planejamento experimental como ferramenta no desenvolvimento

galênico

O objetivo do desenho experimental é planejar e conduzir expe-

rimentos com o intuito de extrair o máximo de informações dos resulta-

dos obtidos com um número reduzido de experimentos. A idéia básica é

alterar todos os fatores relevantes simultaneamente, baseado num plane-

jamento de experimentos e então conectá-los e interpretá-los usando

modelos matemáticos (GABRIELSSON, 2002).

O delineamento chamado full factorial possui como objetivo e-

xaminar os fatores de um processo ou otimizá-lo, sendo que as variáveis

que influenciam as respostas são o centro das nossas atenções (GABRI-

ELSSON, 2002).

As variáveis receberão valores máximos e mínimos baseado em

conhecimento prévio. Todas as variáveis são alteradas simultaneamente

para cobrir a área total de interesse com o menor número possível de

experimentos. Outra razão importante para se utilizar o delineamento

fatorial é a possibilidade de se avaliar a interação entre os fatores nos

resultados obtidos. O ponto central, o valor médio de cada variável, é

também incluído para se detectar uma possível curvatura na região ex-

perimental. A dimensão e o sinal (+ ou -) dos coeficientes de regressão

dos valores selecionados assim como dos pontos centrais indicam a

influência das variáveis nas respostas (GABRIELSSON, 2002).

Num delineamento experimental full factorial, todas as combina-

ções dos valores extremos estão incluídos nos experimentos. Se existem

k variáveis, o número de experimentos será 2

. Para a validação estatísti-

ca de um experimento, normalmente o ponto central será repetido pelo

menos três vezes. Os experimentos são realizados numa ordem aleatória

para eliminar erros sistemáticos (GABRIELSSON, 2002).

Algumas tentativas foram feitas tentando correlacionar estatisti-

camente os fatores que podem interferir na extração dos marcadores

químicos, na estabilidade dos extratos obtidos, na formação das micro-

partículas. Um desenho experimental pode ser usado para reduzir o

número de variáveis a um tamanho manuseável, onde outros experimen-

tos poderão ser realizados usando os fatores como chaves para um me-

lhor entendimento do processo. Esta estratégia de reduzir o número de

variáveis permite que os experimentos estejam focados no incremento

do processo e a união de vários fatores de interesse numa única formu-

lação. A análise estatística usando a regressão linear não somente eluci-

da o significado de cada parâmetro, como também fornece uma equação

para cada propriedade em estudo. As equações permitem uma otimiza-

Introdução geral - 27

ção das propriedades desejadas levando em consideração somente os

parâmetros significativos (ABREU, 2008).

O programa Design Expert foi utilizado como um suporte para

avaliação dos delineamentos experimentais realizados durante este tra-

balho. Esta ferramenta mostrou-se de grande valia para estudos de pré-

formulação e formulação, permitindo a análise simultânea de variáveis

tanto para screening como para otimização de formulações farmacêuti-

cas.

Objetivos

Objetivos - 30

Objetivo geral

Desenvolver um sistema microestruturado para a administração oral de

extrato padronizado de Cecropia glaziovii Sneth.

Objetivos específicos

- Caracterização da planta Cecropia glaziovii Sneth;

- Otimização da extração, avaliando diferentes solventes e métodos de

extração;

- Caracterização físico-química e tecnológica das soluções extrativas;

- Validação da metodologia de análise das soluções extrativas;

- Estudo de estabilidade das soluções extrativas;

- Realização de estudo de formulação para obtenção das microesferas

contendo o extrato padronizado de embaúba;

- Caracterização morfológica, físico-química e tecnológica dos sistemas

mciroestruturados desenvolvidos, bem como avaliação da eficiência de

encapsulação do marcador químico.

Capítulo 1

Caracterização da Cecropia glaziovii

Sneth

Capítulo 1 - Caracterização - 32

1. APRESENTAÇÃO

A qualidade do material vegetal depende em grande parte do estado

da planta fresca. A qualidade e a quantidade de princípios ativos depen-

dem em parte do metabolismo, fixado geneticamente, assim como gran-

demente influenciado pelas características ambientais. A localização, o

estado do solo, a exposição a luz, a altitude, o clima, a estação do ano do

momento da colheita são alguns fatores que condicionam o valor do

material vegetal (VOIGT, 1982). Uma característica bastante relevante

do metabolismo secundário dos vegetais é a elevada capacidade biossin-

tética, tanto em relação ao número de substâncias produzidas quanto à

sua diversidade numa mesma espécie, sendo determinado por uma ne-

cessidade ecológica de sobrevivência (SIMÕES, 2003).

Nesse sentido, no desenvolvimento de fitoterápicos faz-se necessá-

rio o desenvolvimento de produtos com características físicas, químicas,

físico-químicas e tecnológicas bem definidas. O desenvolvimento de

extratos padronizados requer o conhecimento prévio de aspectos ligados

ao vegetal, tais como identificação do vegetal, conhecimento de sua

composição química, disponibilidade de métodos analíticos para a maté-

ria-prima, conhecimento das substâncias responsáveis ou envolvidas nas

atividades terapêuticas relatadas. Em suma, para garantir a qualidade de

um produto fitoterápico é necessário o conhecimento e a padronização

das características da matéria-prima vegetal, de modo a garantir a obten-

ção de um produto final que atenda aos itens de segurança, eficácia,

qualidade e de reprodutibilidade, característicos de um medicamento.

Esta parte do trabalho descreve a avaliação da matéria-prima vege-

tal, folhas secas e moídas de Cecropia glaziovii, caracterizando-a e ava-

liando sua qualidade, como uma etapa prévia ao desenvolvimento de um

extrato padronizado desta planta.

2. MATERIAIS e MÉTODOS

2.1. Material

2.1.1. Matérias-primas

Folhas de Cecropia glaziovii Sneth

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes

Agar nutriente (OXOID)

Agar sabouraud (MicroMed – Isofar)

Capítulo 1 - Caracterização - 33

Água purificada

Etanol

Fosfato de potássio monobásico (VETEC)

2.1.3. Equipamentos

Aparelho de hidrodestilação FABBE

Auto-clave Phoenix AY50

Balança Ohaus Analytical Standard

Balança semi-analítica Gehaka BG 4000

Banho termostatisado B. Braun Biotech International 18 BU

Banho termostatisado Marte

Chapa de aquecimento Fisatom

Dessecador

Estufa Binder 30 °C

Estufa Biomatic 20 – 25 °C

Estufa Nova Ética 402 3G

Fluxo laminar de fluxo horizontal LABCONCO

Tamises (Mesh 12, 18, 25, 35, 45 e 80, conforme ASTM)

Manta de aquecimento Quimis Q321A24

Moinho de facas Macmont

Mufla Fornitec UL 1400

Tamisador Bertel 1400

2.2. Metodologia

2.2.1. Aquisição do material vegetal de estudo

O material vegetal, folhas secas e grosseiramente rasuradas de

Cecropia glaziovii foi adquirido do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas

Químicas, Biológicas e Agrícolas, CPQBA, da Universidade de Campi-

nas – UNICAMP, em junho de 2007, sendo este constituído por folhas

secas. O laudo de identificação fornecido pelo Instituto de Botânica de

São Paulo encontra-se no anexo 1.

2.2.2. Moagem do material vegetal

As folhas de Cecropia glaziovii foram cominuídas em moinho de

facas em malha de 3,0 mm. O material resultante foi utilizado para a

realização dos ensaios de caracterização, bem como matéria-prima para

as preparações extrativas.

Capítulo 1 - Caracterização - 34

2.2.3. Perda por dessecação (Farmacopéia Brasileira, 1988)

A perda por dessecação da matéria-prima vegetal foi avaliada por

gravimetria, utilizando balança e estufa. Em pesa-filtros previamente

tarados, foram pesados exatamente cerca de 2,0 g de folhas secas moí-

das. Estes foram colocados em estufa a 105 °C pelo tempo inicial de 2

horas e posteriormente na mesma temperatura por períodos de 30 minu-

tos, até peso constante (variação máxima de 5,0 mg, conforme Farma-

copéia Brasileira). Os resultados expressos em percentual ponderal re-

presentam a média de três determinações.

2.2.4. Teor de extrativos (BUNDESVEREINIGUNG, 1986)

Cerca de 1,0 g do material vegetal moído, exatamente pesado, foi

aquecido à fervura com 100,0 g de água purificada, durante 10 minutos.

Após o resfriamento, a massa de 100,0 g foi reconstituída com adição de

água purificada, filtrada em papel filtro e os 20,0 mL iniciais foram

desprezados. Do restante do filtrado, alíquota de cerca de 20,0 g foi

exatamente pesada em pesa-filtro, previamente tarado, evaporando-se a

mesma até secura em banho-maria, sob eventual agitação. Após evapo-

ração completa do solvente, o pesa-filtro foi colocado em estufa a 105

°C por 2 horas, resfriado em dessecador e então pesado.

Esse procedimento foi repetido duas vezes, dando origem a duas

soluções de extrativos (A1 e A2). Cada solução foi colocada em 3 pesa-

filtros (n = 3).

O teor de extrativos (TE) foi calculado em percentual ponderal,

utilizando-se a média de três determinações da massa de resíduo seco,

segundo a equação:

TE = (RS x fd x 100)/m – (m x PD/100)

onde:

TE = teor percentual de extrativos (%, m/m)

PD = perda por dessecação (%)

RS = massa do resíduo seco (g)

m = massa do material vegetal (g)

fd = Fator de diluição (5)

2.2.5. Granulometria (PASQUALOTO, 2005; VILA – JATO, 1997)

Cerca de 30,0 g do material vegetal moído homogeneizado foi

exatamente pesado e submetido à passagem por um conjunto de tamises

de abertura de malha de 0,18 a 1,70 mm. O sistema foi fechado e a ope-

Capítulo 1 - Caracterização - 35

ração realizada em tamisador vibratório, a 3,5 vibrações por segundo.

Após 10 minutos, a quantidade de material vegetal moído retido nos

tamises bem como o do coletor foi pesada.

Para a análise granulométrica foram considerados os seguintes

parâmetros: classe granulométrica (CG, mm); intervalo de abertura de

malha (∆, mm); diâmetro granulométrico médio (DG, mm); fração reti-

da (FR, %); fração retida acumulada (FRA, %); e fração de passagem

(FP, %).

O cálculo para o diâmetro médio utilizou o modelo dos probitos

(VILA-JATO, 1997; PASQUALOTO, 2005) para linearização da curva

sigmóide da distribuição granulométrica. Na representação gráfica, os

valores de diâmetro (DG) foram dispostos nas abscissas (x) e os valores

transformados em probitos foram indicados nas ordenadas (y). O diâme-

tro médio das partículas foi calculado através da equação da reta obtida

por regressão linear: DG (mm) versus probitos, tratando-se de uma dis-

tribuição normal, com desvio-padrão aritmético.

2.2.6. Cinzas totais (Farmacopéia Brasileira, 1988)

A determinação de cinzas totais destina-se a estabelecer a quantida-

de de substância residual não-volátil no processo de incineração especi-

ficado.

Cerca de 3,0 g do material vegetal pulverizado foram exatamente

pesados e transferidos para cadinho de porcelana previamente calcinado,

resfriado e pesado. Após distribuição uniforme da amostra no cadinho,

este foi levado a uma manta de aquecimento para queima inicial do

material. Em seguida colocado em mufla e incinerado pelo aumento

gradual da temperatura, não ultrapassando 600 °C, pelo tempo inicial de

2 horas e posteriormente na mesma temperatura por períodos de 30

minutos, até peso constante. Ao final de cada período, o cadinho foi

resfriado em dessecador e pesado. Os resultados expressos em percentu-

al ponderal representam a média de três determinações.

2.2.7. Avaliação da qualidade microbiológica da matéria-prima vegetal

2.2.7.1. Pré-tratamento do material a ser examinado

Cerca de 10,0 g de planta moída e seca foram suspensos em 90,0

mL de solução tampão fosfato pH 7,2. A amostra tratada correspondeu à

diluição 10

-1

(WHO, 2005).

Capítulo 1 - Caracterização - 36

2.2.7.2. Determinação numérica de formas viáveis

Contagem de bactérias aeróbias

A amostra previamente tratada foi diluída em séries decimais,

empregando a mesma solução utilizada no pré-tratamento, até a diluição

-9

. Cada diluição foi plaqueada em duplicata, empregando-se a técnica

oficial da semeadura em profundidade no agar nutriente. A incubação

foi feita a 30 – 35 °C, por 7 dias (WHO, 2005). Após este período as

colônias formadas foram contadas nas placas de Petri e os resultados

expressos como unidades formadoras de colônia por mililitro

(UFC/mL).

Contagem de bolores e leveduras

Da mesma forma que para contagem de bactérias aeróbicas, fo-

ram preparadas diluições decimais da amostra previamente tratada, até a

diluição 10

-9

. A técnica empregada foi a da semeadura em profundidade

no agar sabouraud. Cada diluição foi plaqueada em duplicata e incubada

a 20 – 25 °C, por 7 dias (WHO, 2005). Após este período as colônias

formadas foram contadas nas placas de Petri e os resultados expressos

como unidades formadoras de colônia por mililitro (UFC/mL).

3. RESULTADOS e DISCUSSÃO

No desenvolvimento de um fitoterápico, a primeira etapa a ser con-

trolada é referente à obtenção da planta. Buscando diminuir os impactos

ambientais causados pela coleta do material vegetal, ter controle sobre o

mesmo, assim como manter o mais constante possível a composição da

matéria-prima vegetal no sentido de facilitar a transposição de escala,

optou-se por utilizar o vegetal cultivado em centro especializado:

(CPQBA da UNICAMP). Desta forma tem-se a sua correta classificação

botânica, certificada através do laudo de identificação emitido pelo Ins-

tituto de Botânica de São Paulo. O material vegetal utilizado deve man-

ter uma constância para que se possa prever a qualidade do fitoterápico

que será obtido.

A adequada transformação da droga vegetal é um dos fatores fun-

damentais para garantir que o material possua o grau de qualidade ne-

cessário para a formulação (grau farmacêutico). Neste ponto é impres-

cindível conhecer a droga vegetal em questão e sua caracterização pos-

Capítulo 1 - Caracterização - 37

sibilita conhecer a matéria-prima e estabelecer limites para os ensaios de

qualidade, que posteriormente garantirão uma matéria-prima com as

mesmas características quali e quantitativas das inicialmente utilizadas.

3.1. Perda por dessecação

A secagem do material vegetal implica em alterações importantes

no estado físico e físico-químico no interior das células do vegetal. O

estado gelatinoso do plasma é alterado pela desidratação, e essa modifi-

cação estrutural propicia o contato entre substâncias ativas, originalmen-

te dissolvidas nos fluidos celulares, com enzimas presentes em outros

compartimentos (LIST, 1989). Dependendo da enzima e do substrato,

podem ocorrer diferentes reações, tais como oxidação, hidrólise, fer-

mentação e complexação (VOIGT, 1982). A umidade, além de influen-

ciar as reações intra e extracelulares do vegetal, pode ainda promover a

proliferação de microorganismos, principalmente fungos. Esta contami-

nação pode comprometer a integridade das substâncias farmacologica-

mente ativas.

Estes fatores determinam a importância do conhecimento do teor de

umidade no material vegetal, que é definido através do ensaio de perda

por dessecação. A umidade em excesso permite a ação de enzimas, le-

vando à degradação de constituintes químicos e desenvolvimento de

fungos e bactérias (GIL, 2007). Em geral a faixa do teor de umidade

preconizado pela Farmacopéia Brasileira (1988) é de 8 – 14 %.

O resultado encontrado para a perda por dessecação da matéria-

prima vegetal foi de 13,10 % (± 0,06) com desvio padrão relativo de

0,44 % (n = 3), verificando-se que estes se encontram dentro do preco-

nizado.

3.2. Teor de extrativos

O teor de extrativos é um método auxiliar no controle da matéria-

prima, assumindo grande importância quando não estão estabelecidos

métodos químicos e biológicos para determinação dos constituintes

ativos, ou quando a identidade destes não é conhecida em sua totalidade.

Avalia o rendimento de extração de substâncias sob condições específi-

cas, servindo como um parâmetro de avaliação das características da

matéria-prima vegetal, permitindo sua comparação com outros lotes da

mesma. Uma vez que o ensaio utilizou água como solvente, este permite

indicar a presença de compostos hidrossolúveis presentes na matéria-

prima vegetal, como aminoácidos, açúcares, heterosídeos flavonoídicos

e mucilagens (BARNI, 2009).

Capítulo 1 - Caracterização - 38

O teor de extrativos em água obtido para a matéria-prima vegetal

seca e moída é 21,93 % ± 0,82 , com DPR igual a 3,75%.

3.3. Granulometria

A determinação da granulometria visa estabelecer e padronizar a

faixa de tamanho das partículas do vegetal cominuído, uma vez que este

tamanho e a superfície de contato apresentam relação direta no acesso

do solvente ao material vegetal, conferindo homogeneidade e reproduti-

bilidade do processo extrativo. Comparativamente ao material inteiro, o

material rasurado ou moído apresenta uma maior superfície de contato

com o líquido extrator, e a presença de maiores proporções de células

cujas paredes encontram-se rompidas, expondo imediatamente os conte-

údos celulares à ação do solvente. No entanto, partículas excessivamente

pequenas podem apresentar inconvenientes tais como difícil separação

do marco da solução extrativa ao final da extração (VOIGT, 1982).

A granulometria foi determinada considerando os seguintes fatores:

classe granulométrica (CG, mm), intervalo de abertura de malha (Δm,

mm), diâmetro granulométrico médio (DG, mm), fração retida (FR, %),

fração retida acumulada (FRA, %) e fração de passagem (FP, %). A

tabela 1 apresenta os resultados obtidos.

TABELA 1. Análise granulométrica por tamisação da matéria-prima

vegetal moída

CG (mm)

Mesh

(mm)

Intervalo

(∆; mm)

(mm)

Planta

(g)

(%)

FRA

(%)

FP (%)

> 1,70

1,70

0,08

0,27

99,73

1,70 - 1,00

1,00

0,70

1,35

3,35

11,20

11,47

88,53

1,00 - 0,71

0,71

0,29

0,86

7,31

24,45

35,92

64,08

0,71 - 0,50

0,50

0,21

0,61

8,85

29,60

65,52

34,48

0,50 - 0,355

0,355

0,15

0,43

4,31

14,41

79,93

20,07

0,355 - 0,18

0,180

0,175

0,27

3,45

11,54

91,47

8,53

Coletor

0,00

< 0,18

0,09

2,55

8,53

100,00

0,00

Total

29,90

CG: classe granulométrica; DG: diâmetro granulométrico médio; FR:

fração retida; FRA: fração retida acumulada; FP: fração de passagem

Capítulo 1 - Caracterização - 39

A figura 7 representa a distribuição granulométrica do material

vegetal, enquanto a figura 8 representa as curvas características de re-

tenção e passagem acumuladas do material através da análise granulo-

métrica por tamisação.

Uma vez que os resultados mostraram uma distribuição normal, o

diâmetro médio das partículas foi calculado utilizando o modelo de

probitos para a linearização da curva de distribuição granulométrica. A

análise de probitos permite a transformação estatística da distribuição

normal dos cumulativos % em uma linha reta. O ponto 50 % (probito =

5) foi utilizado para a determinação do diâmetro médio das partículas

(DG50) e os pontos 16 % (probito = 4, DG16, diâmetro menor) e 84 %

(probito = 6, DG84, diâmetro maior) como os limites do intervalo, por

corresponderem a um desvio-padrão à direita e à esquerda da média, na

curva de distribuição normal. Deste modo, se o tamanho das partículas

seguir uma distribuição normal, o desvio-padrão aritmético será calcula-

do ou subtraindo-se do valor correspondente ao diâmetro médio das

partículas (50 %, probito = 5, DG50) o valor correspondente a um des-

vio-padrão à direita (16 %), ou subtraindo-se do valor correspondente a

um desvio-padrão à esquerda (84 %) o valor correspondente ao diâmetro

médio (DG50); DG50 - DG16, ou DG84 - DG50.

Figura 7. Distribuição granulométrica referente à fração retida obtida

através da análise granulométrica

0,0000

5,0000

10,0000

15,0000

20,0000

25,0000

30,0000

35,0000

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00

Fração Retida (%)

Abertura da Malha (mm)

Distribuição Granulométrica

Capítulo 1 - Caracterização - 40

Figura 8. Curvas cumulativas de retenção e passagem após tamização da

matéria-prima vegetal moída. FRA: fração retida acumulada; FP: fração

de passagem

A tabela 2 apresenta os resultados obtidos pela avaliação dos pro-

bitos e a figura 9 a representação gráfica dos mesmos. A equação da reta

obtida e coeficiente de correlação são: y = 2,454x + 3,095 e r = 0,9961,

respectivamente.

TABELA 2. Linearização do diâmetro granulométrico médio obtido

através do modelo de probitos

DG (mm)

FP (%)

Probitos

1,7000

99,73

7,326

1,3500

88,53

6,227

0,8550

64,08

5,358

0,6050

34,48

4,615

0,4275

20,07

4,158

0,2675

8,53

3,659

0,1800

0,00

0,000

DG: diâmetro granulométrico médio; FP: fração de passagem

0,0000

20,0000

40,0000

60,0000

80,0000

100,0000

120,0000

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00

Fração (%)

Abertura da Malha (mm)

FRA (%)

FP (%)

Capítulo 1 - Caracterização - 41

DG: diâmetro granulométrico médio

Figura 9. Representação gráfica da linearização do diâmetro granulomé-

trico médio obtido através do modelo de probitos

Desta forma determinou-se que o diâmetro médio do material comi-

nuído, com base nos gráficos acima apresentados, é de 0,78 mm (± 0,41

mm).

3.4. Cinzas Totais

As cinzas totais incluem as derivadas de tecido vegetal (cinzas fisio-

lógicas) e de materiais estranhos, especialmente areia e terra aderente à

superfície da droga (cinzas não-fisiológicas) (Farmacopéia Brasileira,

1988). Desta forma, o ensaio de cinzas totais pode ser usado inclusive

como um indicador da idoneidade do fornecedor do material (GIL,

2007). Os valores preconizados pelas monografias da Farmacopéia Bra-

sileira variam entre 3 e 9,5 %.

O teor de cinzas totais obtido para a matéria-prima vegetal seca e

moída (n = 3) foi de 7,92 % (± 0,03) com um desvio padrão relativo de

0,33 %, estando dentro da faixa determinada pela farmacopéia (FAR-

MACOPÉIA, 1988).

3.5. Qualidade microbiológica do material

O ensaio microbiológico nos permite tecer importante consideração

quanto à qualidade do material vegetal. A presença de microorganismos

influencia diretamente na qualidade geral deste, principalmente no que

diz respeito à garantia de estabilidade dos princípios ativos, refletindo,

0 0,5 1 1,5 2

Probitos

DG (mm)

Capítulo 1 - Caracterização - 42

por conseguinte, nos resultados das análises quali e quantitativas reali-

zadas no âmbito do controle de qualidade físico-químico (GIL, 2007).

As matérias-primas vegetais possuem, naturalmente, uma carga mi-

crobiana elevada, geralmente, proveniente do solo. Além da microflora

natural, a manipulação durante a coleta e processamento pode levar à

contaminação adicional (GIL, 2007).

Não há hoje ainda uma uniformidade nas especificações estabele-

cidas dos limites de contaminação permitidos. Nos últimos anos tem-se

verificado uma tentativa de harmonização entre algumas farmacopéias:

Européia, Americana, embora não haja a adoção de uma diretriz univer-

salmente aceita. A Farmacopéia Brasileira IV (1998) não apresenta ori-

entação de padrão específico para os produtos fitoterápicos, e limites

para a contagem de microorganismos viáveis totais constam, somente,

de algumas monografias (GIL, 2007).

A tabela 3 apresenta os limites microbiológicos preconizados pela

OMS (Organização Mundial de Saúde) (WHO, 2005).

Capítulo 1 - Caracterização - 43

TABELA 3. Limites microbiológicos preconizados pela OMS (WHO, 2005) para as diferentes categorias relaciona-

das ao material vegetal de acordo com a sua utilização e características.

Categoria

Bactérias

aeróbias

Fungos e

leveduras

E. coli

Outras entero-

bactérias

Salmonella

Shigella

Clostridia

(UFC/mL)

< 10

Ausente

< 10

Ausente

< 10

Ausente

< 10

Ausente

< 10

Ausente

< 10

Ausente

1: Matéria-prima vegetal medicinal, material vegetal medicinal a ser processado posteriormente, incluindo procedi-

mentos de descontaminação química ou física;

2: Material vegetal medicinal que foi pré-tratado (por exemplo com água fervente, de acordo com o preparo de chás e

infusões) ou que será usado em formas farmacêuticas tópicas;

3: Outros materiais vegetais medicinais para uso interno;

4: Fitoterápicos aos quais água fervente é adicionada antes do uso;

5: Outros fitoterápicos.

Capítulo 1 - Caracterização - 44

Uma vez que o material vegetal em estudo será posteriormente

processado utilizando alta temperatura ou etanol para a extração das

substâncias de interesse, pode ser enquadrado na descrição n°1 da tabela

3. Na contagem de bactérias aeróbias o valor encontrado foi de 1,04 x

UFC/mL e na contagem de bolores e leveduras, 8,25 x 10

UFC/mL.

Desta forma, a matéria-prima vegetal utilizada neste trabalho encontra-

se abaixo do limite preconizado pela OMS.

Com base no conjunto de resultados obtidos, a droga vegetal objeto

deste trabalho foi caracterizada e considerada adequada para a continui-

dade dos estudos.

Capítulo 2

Padronização das soluções extrativas

Capítulo 2 – Padronização - 46

1. APRESENTAÇÃO

A qualidade exigida e a disponibilidade de matérias-primas para a

fabricação de fitoterápicos são fatores limitantes para a indústria farma-

cêutica, uma vez que é necessária a padronização da mesma forma que

para os produtos sintéticos, embora respeitando suas especificidades.

Desta forma, a definição dos parâmetros necessários da padronização de

métodos para a avaliação da qualidade da matéria-prima vegetal e de

insumos vegetais para medicamentos fitoterápicos é de extrema relevân-

cia. Muitas espécies possuem poucos dados científicos que permitam a

validação de sua utilização, tanto do ponto de vista farmacológico quan-

to químico. Estes conhecimentos estão na base para o desenvolvimento

de fitoterápicos que agreguem qualidade com o desenvolvimento de

produtos.

Este capítulo trata da padronização da extração de folhas de C.

glaziovii no sentido de maximizar sua potencial atividade anti-diabética

e anti-hipertensiva, utilizando para isto métodos de fácil passagem de

escala e economicamente viáveis para processos industriais que devem

obter o máximo de rendimento. Os métodos de maceração e decocção

atendem a estes requisitos, tendo sido avaliados por delineamentos ex-

perimentais que permitiram o conhecimento da interferência dos fatores

de extração. Um método analítico de doseamento por CLAE dos marca-

dores químicos foi desenvolvido e validado. Os extratos foram ainda

avaliados farmacologicamente tanto para a atividade anti-diabética

quanto anti-hipertensiva.

2. MATERIAIS e MÉTODOS

2.1. Material

2.1.1. Matérias-primas

Ácido cafeico (Sigma – Aldrich)

Ácido clorogênico (Sigma – Aldrich)

Ácido gálico (Fluka, Sigma – Aldrich)

Folhas de Cecropia glaziovii Sneth

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes

Acetonitrila grau CLAE (J. T. Baker)

Ácido acético (Qhemis)

Água mili-Q (Millipore)

Capítulo 2 – Padronização - 47

Água purificada

Carbonato de sódio (Riedel de Häen)

Etanol

Metanol (J. T. Baker)

Reagente de Fenol de Folin-Ciocalteu (Fluka, Sigma – Aldrich)

Solução tampão pH 4,0 (Nuclear)

Solução tampão pH 7,0 (Nulcear)

2.1.3. Aparelhos, equipamentos e materiais especiais

Aparelho de hidrodestilação FABBE

Balança Ohaus Analytical Standard

Balança semi-analítica Gehaka BG 4000

Banho de Ultrassom – UltraSonic Cleaner USC 700 Unique

Banho termostatisado Marte

Bomba de vácuo EMC Platinum acoplada ao liofilizador

Bomba de vácuo Fisatom Mod. 830

Coluna Zorbax ODS (5 µm, 150 x 4,6 mm) Agilent

Cromatógrafo líquido de alta eficiência Perkin Elmer, equipado com:

Autosampler Perkin Elmer Series 200

Bomba binária Series 200

Degasser à vácuo Perkin Elmer Series 200

Detector DAD Series 200 EP

Detector UV/Vis Series 200

Interface 600 Series LINK

Dessecador

Espectrofotômetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda 10

Estufa Nova Ética 402 3G

Evaporador rotativo Marconi MA-120

Freezer Consul 180

Liofilizador Terroni LD 1500

Membranas HVLP 0,45 µm, com 47 e 13 mm de diâmetro Millipore

pHmetro Oakton, pH 5 Acorn series

Pré-coluna Phenomenex ODS (4,0 x 3,0 mm)

2.2. Metodologia

2.2.1.Validação da metodologia analítica por CLAE

O método desenvolvido para a análise das soluções extrativas

preparadas consistiu na utilização da cromatografia líquida de alta efici-

Capítulo 2 – Padronização - 48

ência (CLAE), técnica esta muito utilizada para a detecção e quantifica-

ção de compostos fenólicos (ANDRADE-CETTO, 2007; ASTHER,

2005; AZUMA, 1999; CHANG, 2006; DE SOUZA, 2002). A análise

foi desenvolvida em fase reversa com coluna C18 (Octadecilsilano -

ODS) baseada em estudos anteriores (COSTA, 2009). Os parâmetros de

validação foram desenvolvidos conforme ICH (2005) e BRASIL (2003).

Os parâmetros avaliados e validados do método foram: linearidade,

precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão, limite de

quantificação e limite de detecção.

Sistema Cromatográfico

- Coluna: Zorbax ODS (5 µm, 150 x 4,6 mm)

- Pré-coluna: ODS (4,0 x 3,0 mm)

- Fluxo: 1,0 mL/min

- Detecção: 330 nm. Conforme determinado em espectrofotômetro

UV/Vis e confirmado pela literatura (CELLI, 2007)

- Volume de injeção: 20 µL

- Fase móvel: A: Acetonitrila

B: Ácido acético 1,0%

A fase móvel foi preparada diariamente e desgaseificada em ba-

nho de ultrasom por 10 minutos, antes do uso. A tabela 4 apresenta a

programação da fase móvel utilizada no equipamento de CLAE.

TABELA 4. Programação da fase móvel para CLAE

Programação

(min)

Modo

Solvente A (%)

Solvente B (%)

0-15

Isocrático

15-25

Gradiente

25-34

Isocrático

Solvente A: Acetonitrila; solvente B: Ácido Acético 1,0%

Curva analítica, linearidade e intervalo

Para a obtenção das curvas analíticas foram preparadas soluções

de ácido clorogênico (ACG) e ácido cafeico (ACF), utilizando como

solvente metanol:água purificada (1:1, v/v), nas concentrações: 2,5; 5;

10; 12,5; 15; 20; 25; 50; 75; 100; 125; 150 e 200 µg/mL e 2,5; 5; 10;

12,5; 15; 20; 25; 50 e 100 µg/mL respectivamente. As soluções foram

Capítulo 2 – Padronização - 49

filtradas através de membrana de PVDF (Fluoreto de Polivinilideno) de

diâmetro de poro de 0,45 µm e injetadas no cromatógrafo por um injetor

automático.

As áreas foram representadas frente às concentrações para a cons-

trução das curvas de ácido clorogênico e ácido cafeico. A equação da

reta foi obtida por regressão linear e o coeficiente de correlação calcula-

do. Para determinar a linearidade da curva analítica, espera-se que o

coeficiente de correlação (r) seja r > 0,99 (BRASIL, 2003).

O intervalo consiste na faixa entre os limites de quantificação su-

perior e inferior de um método analítico, sendo derivado do estudo de

linearidade.

Precisão e exatidão (E)

A precisão e a exatidão do método analítico foram testadas por

análises inter e intra-dia.

A precisão consiste na habilidade do método reproduzir o mesmo

resultado. Para isso foram realizados os seguintes testes:

Repetibilidade: expressa a precisão sob as mesmas condições de opera-

ção num curto período de tempo. Na validação do método acima descri-

to, 3 concentrações (mínima, média e máxima) de ácido clorogênico

(2,5; 50 e 200 µg/mL) e de ácido cafeico (2,5; 25 e 100 µg/mL) foram

injetadas três vezes no mesmo dia. Desta forma foi possível calcular o

desvio padrão relativo, não devendo este ser maior do que 5,0 % (BRA-

SIL, 2003).

Precisão intermediária: expressa a precisão em diferentes dias,

analistas, equipamentos entre outros. Na validação do método em ques-

tão, a concentração de 50 µg/mL de ácido clorogênico e 25 µg/mL de

ácido cafeico foram injetadas três vezes em três dias diferentes. O des-

vio padrão relativo foi calculado, não devendo ser maior do que 5,0 %

(BRASIL, 2003).

A exatidão consiste na concordância entre o valor encontrado pe-

lo método e o valor aceito como verdadeiro (% de recuperação) (BRA-

SIL, 2003). A porcentagem de recuperação deve ficar entre 95 – 105 %.

Neste trabalho foram utilizados os extratos obtidos por maceração (8

dias 20 % etanol, 8d20; 6 dias 50 % etanol, 6d50; 8 dias 80 % etanol,

8d80) e aos mesmos foram adicionados 25,0 µg/mL de ácido clorogêni-

co e 25,0 µg/mL de ácido cafeico. O cálculo utilizado para a obtenção

da % de recuperação foi:

E = (concentração obtida – concentração real) x 100/concentração real

Capítulo 2 – Padronização - 50

Limite de quantificação (LQ)

Consiste na menor concentração do analito que pode ser determi-

nada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais

estabelecidas. A equação utilizada para o cálculo é apresentada a seguir:

LQ = dp x 10/IC

onde: dp é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de várias

curvas analíticas construídas contendo concentrações do fármaco pró-

ximas ao suposto limite de quantificação; IC é a inclinação da curva

analítica; 10 é utilizado com base na relação de dez vezes o ruído da

linha de base.

Limite de detecção (LD)

Consiste na menor concentração do analito que produz resposta

considerada detectável. Normalmente é avaliada pela relação si-

nal:ruído, em uma proporção 3,3:1. A equação utilizada para o cálculo é

apresentado a seguir:

LD = dp x 3,3/IC

onde: dp é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de várias

curvas analíticas construídas contendo concentrações do fármaco pró-

ximas ao suposto limite de quantificação; IC é a inclinação da curva

analítica; 3,3 é utilizado com base na relação de 3,3 vezes o ruído da

linha de base.

2.2.2. Delineamento experimental

Para avaliação da interferência dos fatores no preparo das solu-

ções extrativas foram elaborados dois delineamentos fatoriais com o

auxílio do programa Design Expert

, versão 6.0.6. Cada delineamento

consiste num desenho com 2 fatores e 2 níveis (máximo e mínimo) para

cada fator (2

). Um delineamento foi elaborado para os extratos obtidos

por maceração (EM), considerando como fator A o teor etanólico (%) e

como fator B o tempo (dias). Todos os sistemas foram mantidos a tem-

peratura ambiente durante o tempo de extração. Para os extratos obtidos

Capítulo 2 – Padronização - 51

por decocção (ED) considerou-se como fator A a temperatura (°C) e

fator B o tempo (minutos), utilizando como líquido extrator água purifi-

cada. Um ponto central foi proposto e cada ponto foi realizado em du-

plicata. No total foram preparados 20 extratos, 10 por maceração e 10

por decocção. Os delineamentos encontram-se descritos nas tabelas 5 e

6. Como parâmetro fixo foi adotada a proporção planta:solvente de 5,0

TABELA 5. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções extra-

tivas por maceração a temperatura ambiente. Fatores avaliados: concen-

tração de etanol (A) e tempo (B)

EXP

Etanol

(%)

Tempo

(dias)

Representação

4d20

4d80

8d20

8d80

6d50

Capítulo 2 – Padronização - 52

TABELA 6. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções extra-

tivas por decocção utilizando água purificada como líquido extrator.

Fatores avaliados: temperatura (A) e tempo (B)

EXP

Temperatura

(°C)

Tempo

(minutos)

Representação

7010

9010

7030

9030

8020

2.2.3. Preparo das soluções extrativas

Os parâmetros de preparação das soluções extrativas foram esta-

belecidos conforme o planejamento fatorial previamente descrito (item

2.2.2.). Os frascos para maceração foram mantidos a temperatura ambi-

ente protegidos da luz e, após o período determinado pelos delineamen-

tos, o material vegetal foi separado do solvente através de filtração a

vácuo. Já os extratos obtidos por decocção foram filtrados após resfria-

mento e reconstituição do volume.

2.2.4. Análise das soluções extrativas

Todos os ensaios descritos a seguir foram realizados para caracte-

rização das soluções extrativas obtidas por maceração (EM) e por de-

cocção (ED).

2.2.4.1. Resíduo seco (HARTKE e MUTSCHLER, 1987)

Para a avaliação do teor de resíduo seco (RS) pesou-se, exata-

mente, cerca de 20,0 g de cada solução extrativa em pesa-filtros previa-

mente tarados. O conteúdo de cada pesa-filtro foi levado à secura em

banho de água quente sob agitação ocasional e, a seguir os pesa-filtros

foram colocados em estufa a 105 °C por duas horas, resfriados em des-

Capítulo 2 – Padronização - 53

secador e então pesados. O resultado foi calculado em relação a 100,0 g

de solução extrativa (%, m/m) pela média de três determinações.

2.2.4.2. pH

O pH das soluções extrativas foi determinado utilizando-se um

pHmetro digital, calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0. A leitura

foi realizada em 20 mL da solução extrativa, aguardando a estabilização

da leitura. O resultado foi expresso pela média de três determinações.

2.2.4.3. Fenólicos totais (YU, 2002)

A determinação do teor de fenólicos totais foi realizada com a

utilização do reagente de fenol Folin-Ciocalteu. 20 µL de solução extra-

tiva, 500,0 µL do reagente de fenol Folin-Ciocalteu e 2,0 mL de água

purificada foram colocados em tubo de ensaio. Esta mistura foi agitada

e, num tempo não inferior a 30 segundos nem superior a 8 minutos,

foram adicionados a cada tubo 1,5 mL de solução de carbonato de sódio

20 %. O volume final foi completado a 10,0 mL com água purificada.

Após 2 h de reação numa temperatura de 24 °C, as amostras foram lidas

em espectrofotômetro de UV/Visível a 765 nm em cubeta de 10 mm. O

branco continha todas as substâncias da mistura de reação com exceção

da solução extrativa que foi substituída por água purificada. As leituras

foram realizadas em triplicata.

A solução-mãe de ácido gálico foi preparada em balão volumétri-

co de 100,0 mL, onde aproximadamente 0,5 g de ácido foram exatamen-

te pesados e dissolvidos em 10,0 mL de metanol com auxílio de ultras-

som por 10 minutos. Em seguida o volume foi completado com água

purificada. Desta solução-mãe foram obtidas as seguintes diluições: 50,

100, 150, 250 e 500 µg/mL em água purificada, para construção da cur-

va analítica. A mistura de reação continha 100,0 L de cada uma das

concentrações, 500,0 µL do reagente de fenol Folin-Ciocalteu e 2,0 mL

de água purificada. Em seguida, foi adotado o mesmo procedimento

acima descrito para as amostras das soluções extrativas. A absorvância

foi representada frente à concentração para a construção da curva analí-

tica do ácido gálico.

Os resultados foram calculados em termos de ácido gálico.

Capítulo 2 – Padronização - 54

2.2.5. Doseamento por CLAE dos marcadores químicos

Os teores de ACG e ACF foram avaliados por CLAE, conforme

condições anteriormente validadas, descritas neste capítulo, item 2.2.1.,

páginas 47 e 48.

Antes da injeção no cromatógrafo, as amostras foram preparadas

da maneira descrita a seguir. Alíquotas de 3,0 mL de cada uma das solu-

ções extrativas foram colocadas em balões volumétricos de 10,0 mL e o

volume completado com metanol:água purificada (1:1, v/v). O volume

de 3,0 mL foi escolhido com base em estudo de linearidade dos marca-

dores nas soluções extrativas que será discutido no capítulo 3 desta dis-

sertação, por ser esta uma concentração onde os resultados apresentam-

se de maneira linear.

Os picos obtidos foram caracterizados por comparação com o

tempo de retenção dos padrões de referência. A quantificação individual

dos compostos foi realizada usando a curva-padrão obtida por regressão

linear.

Todas as amostras foram analisadas em triplicata.

2.2.6. Liofilização das soluções extrativas

Como etapa prévia à liofilização, foi necessária a eliminação do

etanol dos EM, realizada com auxílio de evaporador rotativo a 60 °C.

Para evitar a precipitação de substâncias devido à menor relação solu-

to:solvente, foi previamente adicionado a cada solução extrativa uma

quantidade de água purificada equivalente à quantidade de etanol a ser

evaporada.

Para a realização da liofilização, dois procedimentos distintos fo-

ram adotados, em função da utilização posterior do extrato liofilizado.

Os extratos destinados à caracterização e ensaios biológicos foram trans-

feridos para frascos de vidro em alíquotas de volume aproximado de 20

mL; os extratos que seriam utilizados para o preparo das micropartículas

foram transferidos para frascos âmbar em volumes de 0,5, 1,0 e 2,0 mL.

Posteriormente, as amostras foram congeladas em freezer a -20 °C por

no mínimo 48 horas e então liofilizados por 48 horas a -50 °C sob pres-

são de 133,3 mBar. Após finalização desta operação, os liofilizados

foram mantidos em dessecador até a sua utilização.

2.2.7. Avaliação in vivo da atividade anti-diabética

Este estudo foi realizado em colaboração com a equipe da Profa.

Dra. Fatima Regina Mena Barreto Silva no Laboratório de Hormônios e

Capítulo 2 – Padronização - 55

Transdução de Sinais do Departamento de Bioquímica da UFSC com os

extratos liofilizados e os marcadores químicos isolados: ACG e ACF. O

procedimento foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais –

CEUA da UFSC em 19 de março de 2007 (anexo 2).

Dois estudos foram realizados: tolerância à glicose em ratos hi-

perglicêmicos e avaliação da atividade anti-diabética em ratos diabéticos

induzidos por aloxano. As amostras avaliadas foram os extratos 4d20,

8d20 e 6d50 (maceração) e 8020 e 9030 (decocção), na concentração de

400 mg/kg de rato. Para os marcadores químicos estas atividades foram

avaliadas utilizando as concentrações de 15,0 mg/kg para ACG, 2,0

mg/kg de ACG e ACF isolados ou a mistura de ambos nesta última

concentração.

No anexo 3, ao final desta dissertação, é apresentada uma descri-

ção dos métodos utilizados neste estudo.

2.2.8. Avaliação ex vivo da atividade anti-hipertensiva

Este estudo foi realizado em colaboração com a equipe da Profa.

Dra. Rosa Maria Ribeiro do Valle Nicolau, no Laboratório de Farmaco-

logia de Produtos Naturais do Departamento de Farmacologia da UFSC.

Para a atividade anti-hipertensiva foram testados os extratos liofilizados

4d20 e 8d20 (maceração) e 8020 e 9030 (decocção).

No anexo 4 é descrita a metodologia utilizada para avaliação des-

ta atividade.

3. RESULTADOS e DISCUSSÃO

No início deste trabalho, o marcador químico selecionado foi o

ACG, segundo a literatura o composto de maior concentração na espécie

Cecropia (ANDRADE-CETTO, 2001 e 2007; HERRERA-

ARELLANO, 2004; NICASIO, 2005; REVILLA-MONSALVE, 2007;

TANAE, 2007). Estudos anteriores realizados por nosso grupo de pes-

quisa confirmaram a sua presença também na Cecropia glaziovii Sneth.

Uma vez que suas características físico-químicas são amplamente rela-

tadas na literatura e por sua disponibilidade comercial como padrão

analítico, optou-se por utilizá-lo como marcador analítico.

Nas análises por CLAE dos extratos preparados para quantifica-

ção do marcador químico, o pico do ácido clorogênico (ACG) estava

resolvido, apresentando um tempo de retenção de 3,5 minutos, da mes-

Capítulo 2 – Padronização - 56

ma forma que o pico obtido pela injeção do padrão deste ácido. O extra-

to enriquecido com padrão de ACG foi injetado no cromatógrafo e a

área resultante teve um aumento proporcional à quantidade de padrão

adicionada ao extrato. Além disso, o espectro obtido por meio de detec-

tor DAD (detecção ultravioleta por arranjo de diodos) demonstrou um

grau de pureza de 1,04.

No entanto, observou-se nos extratos obtidos por maceração a

presença de um segundo pico, com tempo de retenção aproximado a 6,0

minutos. Este pico apresentava uma área bastante variável em função da

porcentagem de etanol no líquido extrator, com uma área inversamente

proporcional à concentração de etanol figura 10.

Figura 10. Sobreposição de cromatogramas dos primeiros 8 minutos das

soluções extrativas obtidas por maceração (4d20, 8d20, 6d50 e 8d80).

(a) Linha preta referente ao extrato 8d20, (b) linha verde referente ao

extrato 4d20, (c) linha vermelha referente ao extrato 6d50 e (d) linha

azul referente ao extrato 8d80

O ACG é um éster conjugado dos ácidos cafeico e quínico. Desta

forma investigou-se a possibilidade desta substância ser o ACF. Com o

intuito de verificar esta possibilidade, um padrão de ACF foi injetado no

cromatógrafo mantendo as mesmas condições cromatográficas, sendo

Capítulo 2 – Padronização - 57

verificado o mesmo tempo de retenção entre o padrão e a substância em

questão. Além disso, uma alíquota do extrato foi enriquecida com o

ACF padrão e observou-se um aumento da área proporcional à quanti-

dade de padrão adicionada. Para confirmar esta hipótese, padrão e extra-

tos foram injetados em cromatógrafo acoplado a um detector DAD.

As figuras 11 e 12 apresentam os cromatogramas obtidos para os

picos do padrão de ACF e do extrato 4d20, respectivamente. A similari-

dade dos dois espectros UV/Vis acoplados aos cromatogramas indica

que se trata da mesma substância, o ACF.

Figura 11. Cromatograma típico obtido por CLAE do ACF e respectivo

espectro obtido com detector DAD na região de 180 a 400 nm

Capítulo 2 – Padronização - 58

Figura 12. Cromatograma do extrato 4d20 salientando o pico do ACF e

seu espectro, obtido com detector DAD na região de 180 a 400 nm

A partir da qualificação do ACF iniciou-se o monitoramento do

mesmo, que foi considerado um segundo marcador químico, principal-

mente devido à variação de sua concentração em função dos parâmetros

de extração estudados. Além disso, relatos da literatura de sua atividade

no tratamento do diabetes justificaram o interesse na quantificação desta

substância (CELIK, 2009; UN, 2006; WELSCH, 1989).

A avaliação quantitativa das soluções extrativas foi, desta forma,

baseada nos ácido clorogênico e ácido cafeico, representantes polifenó-

licos da classe dos ácidos fenólicos.

3.1. Validação da metodologia analítica por CLAE

Neste trabalho foi desenvolvida uma metodologia de separação

por fase reversa utilizando CLAE combinada à detecção por espectrofo-

tometria de UV (ultravioleta) para a determinação quali e quantitativa de

compostos fenólicos nos extratos de Cecropia glaziovii. O método de-

senvolvido, cujas condições estão descritas nas p. 47 e 48, item 2.2.1.,

mostrou uma separação de alto desempenho dos dois compostos fenóli-

cos de interesse, o ácido clorogênico e o ácido cafeico.

3.1.1. Linearidade

A linearidade pode ser definida como a capacidade do método de

fornecer resultados que são diretamente proporcionais à concentração da

substância na amostra, dentro de um intervalo específico. Esta avaliação

Capítulo 2 – Padronização - 59

é realizada através da elaboração de uma curva analítica e da análise

estatística da linearidade através de regressão linear (BRASIL, 2003).

A linearidade do método foi investigada para o ácido clorogênico

no intervalo de 2,5 – 200 µg/ml e para o ácido cafeico no intervalo de

2,5 – 100 µg/ml, tendo sido elaboradas três curvas analíticas para cada

marcador. A tabela 7 apresenta as equações de reta utilizadas na conver-

são entre as áreas dos picos dos cromatogramas obtidas e a concentração

de cada um dos analitos, bem como o fator de correlação que deve ser r

> 0,99 (BRASIL, 2003). As figuras 13 e 14 apresentam as curvas analí-

ticas obtidas para o ACG e o ACF, respectivamente. O intervalo médio

das áreas obtidas para o ACG foi de 124.124,50 – 10.825.077,00 uV.s e

para o ACF foi de 220.669,78 – 9.158.942,30 uV.s.

TABELA 7. Dados de linearidade dos marcadores químicos obtidos

para a validação do método de CLAE

Composto

Intervalo de

Linearidade

(µg/mL)

Equação da reta

Coeficiente de

Correlação (r)

ACG

2,5 - 200

y = 54291x - 16595

0,999995

ACF

2,5 - 100

y = 91599x - 6746,9

0,999987

As curvas analíticas para os ácidos clorogênico e cafeico apresen-

taram excelente coeficiente de correlação (r), sendo, portanto linear nos

respectivos intervalos. Cada ponto da curva representa a média dos valo-

res obtidos para cada concentração com seu respectivo desvio padrão. A

avaliação dos resíduos não indica uma tendência em nenhuma das cur-

vas obtidas (ACG ou ACF).

Capítulo 2 – Padronização - 60

Figura 13. Curva analítica média do ácido clorogênico obtida por CLA-

E. Coeficiente de correlação, 0,999995; equação da reta: y = 54291x -

16595

Figura 14. Curva analítica média do ácido cafeico obtida por CLAE.

Coeficiente de correlação, 0,999987; equação da reta: y = 91599x –

6746,9

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0

Área (uV.s)

Concentração (µg/mL)

Curva Analítica -ACG

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0

Área (uV.s)

Concentração (µg/mL)

Curva Analítica -ACF

Capítulo 2 – Padronização - 61

3.1.2. Precisão

A repetibilidade foi caracterizada para ambos os marcadores por

desvios padrões relativos inferiores a 0,4 %. Já a precisão intermediária

apresentou desvios inferiores a 0,7 %, demonstrando que o método pro-

posto é preciso. A tabela 8 apresenta os resultados obtidos para precisão.

TABELA 8. Dados de precisão: repetibilidade e precisão intermediária

dos marcadores químicos obtidos para a validação do método de CLAE

Composto

Repetibilidade

Precisão Intermediária

Concentração

DPR

Concentração

DPR

(µg/mL)

(%)

(µg/mL)

(%)

ACG

2,5

0,2

50,0

0,6

0,4

200

0,2

ACF

2,5

0,4

25,0

0,7

0,3

100

0,2

DPR: desvio padrão relativo

3.1.3. Exatidão

A exatidão de um método analítico corresponde à proximidade

entre os resultados obtidos por um determinado método e o valor verda-

deiro. A exatidão pode ser avaliada através de amostras às quais são

adicionadas quantidades conhecidas da substância referência, sendo

expressa como porcentagem de recuperação (BRASIL, 2003; ICH,

2005). Quando todos os valores experimentais obtidos encontrarem-se

dentro dos limites aceitáveis de recuperação (95-105 %), o método será

considerado exato.

Como pode ser observado na tabela 9, a recuperação média de

todas as amostras avaliadas encontra-se dentro dos limites preconizados,

demonstrando então a exatidão do método.

Capítulo 2 – Padronização - 62

TABELA 9. Dados de exatidão do doseamento dos marcadores quími-

cos nos extratos utilizados para a validação do método de CLAE

Extratos

Composto

Concentração do

Extrato

Recuperação

(µg/mL)

Média (%)

DPR (%)

8d20

ACG (25 μg/mL)

65,9

100,6

0,4

ACF (25 μg/mL)

41,7

100,8

0,5

6d50

ACG (25 μg/mL)

155,9

98,0

0,2

ACF (25 μg/mL)

9,4

101,9

0,5

8d80

ACG (25 μg/mL)

138,7

100,1

0,5

ACF (25 μg/mL)

5,3

102,3

0,1

DPR: desvio padrão relativo

3.1.4. Limite de quantificação e limite de detecção

A sensibilidade da metodologia de quantificação dos ACG e ACF

foi avaliada através da determinação dos limites de detecção e quantifi-

cação. O limite de detecção é tido como a menor concentração absoluta

do analito numa amostra capaz de ser detectada, mas não necessaria-

mente quantificada sob as mesmas condições do experimento. O limite

de quantificação é tido como a menor concentração do analito numa

amostra capaz de ser quantificado com precisão aceitável e exatidão

(BRASIL, 2003; ICH, 2005). Neste contexto, a determinação do limite

de detecção e quantificação foi calculada com base no desvio padrão da

resposta, inclinação da curva analítica e ruído obtido durante análise. A

tabela 10 apresenta esses resultados.

TABELA 10. Limites de quantificação e detecção dos marcadores quí-

micos obtidos para a validação do método de CLAE

Composto

(µg/mL)

ACG

1,05

0,3460

ACF

0,22

0,0732

LQ: limite de quantificação; LD: limite de detecção

A determinação dos LD e LQ em função da área foi calculada a-

través da área do ruído obtido durante a análise da amostra e dos marca-

dores isolados. Considerando que o ICH (2005) determina que a área do

Capítulo 2 – Padronização - 63

LD deva ser 3 vezes a área do ruído e que a área do LQ deva ser 10

vezes a área deste mesmo ruído, obteve-se para o método os limites de

detecção e de quantificação de 136,41 uV.s e 454,70 uV.s, respectiva-

mente.

O conjunto dos resultados obtidos no estudo de validação permite

concluir que o método proposto é adequado e seguro para a quantifica-

ção dos marcadores químicos nos extratos obtidos. Desta forma, o ACG

e o ACF foram quantificados nos extratos utilizando o método de cro-

matografia líquida de alta eficiência devidamente validado. Os teores

destes ácidos nos extratos obtidos por maceração e decocção estão des-

critos nas tabelas 11 e 13, respectivamente. As tabelas 12 e 14 apresen-

tam a análise da variância (ANOVA) para todos os resultados obtidos

para os diferentes extratos.

3.2. Análise das soluções extrativas: Maceração e Decocção

As tabelas 11 e 12 apresentam, respectivamente, os resultados de

todos os ensaios realizados para a caracterização das soluções extrativas

obtidas por maceração e a análise estatística destes, dando uma visão

geral dos mesmos.

TABELA 11. Resultados da caracterização dos extratos obtidos por

maceração usando o delineamento fatorial 2

EXP

Extrato

Resíduo

seco (%)

Fenólicos totais

(mg/mL)

ACG

(µg/mL)

ACF

(µg/mL)

4d20

1,06

5,78

3,64

131,09

36,93

4d20

1,05

5,81

3,96

128,81

36,67

4d80

1,02

5,88

3,48

150,99

3,25

4d80

1,01

5,88

3,37

150,69

3,27

8d20

1,14

5,79

3,95

73,36

58,35

8d20

1,10

5,83

3,69

75,62

57,61

8d80

1,06

5,90

3,47

154,80

3,78

8d80

1,05

5,93

3,43

153,99

3,67

6d50

1,08

5,92

3,88

167,11

11,94

6d50

1,07

5,96

3,89

167,65

12,18

Capítulo 2 – Padronização - 64

TABELA 12. Análise de variância dos resultados da caracterização dos

extratos obtidos por maceração usando o delineamento fatorial 2

(p 

0,05)

ANOVA

Resíduo

seco (%)

Fenólicos

totais (mg/mL)

ACG

(µg/mL)

ACF

(µg/mL)

Modelo

0,0005

0,0008

0,0027

< 0,0001

0,0010

0,0008

0,0027

< 0,0001

0,0012

< 0,0001

Curvatura

0,3380

0,0020

0,0242

< 0,0001

Lack of Fit

0,2571

0,3187

0,9680

ACF: Transformação recomendada: Square root (Lambda = 0,5)

Fator A: Concentração de etanol (%)

Fator B: Tempo (dias)

Da mesma forma, as tabelas 13 e 14 apresentam os resultados dos

estudos realizados com as soluções extrativas obtidas por decocção,

assim como a análise estatística dos mesmos.

TABELA 13. Resultados da caracterização dos extratos obtidos por

decocção usando o delineamento fatorial 2

EXP

Extrato

Resíduo

seco (%)

Fenólicos totais

(mg/mL)

ACG

(µg/mL)

ACF

(µg/mL)

7010

0,82

5,88

2,09

179,09

7,75

7010

0,76

5,94

1,65

177,67

7,72

9010

0,91

5,72

2,19

190,17

7,59

9010

0,93

5,72

2,15

192,99

8,02

7030

0,87

5,85

2,21

185,41

8,06

7030

0,83

5,84

2,13

186,65

8,18

9030

0,91

5,70

2,19

191,55

8,70

9030

0,95

5,71

2,35

193,04

8,63

8020

0,77

5,65

2,15

220,87

4,86

8020

0,76

5,66

2,06

221,30

4,86

Capítulo 2 – Padronização - 65

TABELA 14. Análise de variância dos resultados da caracterização dos

extratos obtidos por decocção usando o delineamento fatorial 2

(p 

0,05)

ANOVA

Resíduo

seco (%)

Fenólicos

totais

(mg/mL)

ACG

(µg/mL)

ACF

(µg/mL)

Modelo

0,0035

0,0001

0,0983

0,0002

0,0045

0,0016

< 0,0001

0,1109

< 0,0001

0,0304

0,0977

0,0498

0,1103

0,0041

0,0017

0,0089

0,0679

Curvatura

0,0021

0,0003

0,9400

< 0,0001

Lack of Fit

0,1979

0,1334

0,3950

Fator A: Temperatura (°C)

Fator B: Tempo (minutos)

Resíduo Seco

O resíduo seco e o pH são parâmetros do controle de qualidade de

produtos fitoterápicos que auxiliam no estabelecimento de suas caracte-

rísticas e na sua padronização.

O resíduo seco avalia a quantidade total de substâncias extraídas

em condições específicas, desta forma podendo dar informações sobre a

influência das diferentes condições de extração (método de extração,

líquido extrator, tempo de extração, entre outros) sobre a qualidade do

processo extrativo.

Considerando os extratos obtidos por maceração pode-se obser-

var a influência tanto da concentração de etanol (fator A) quanto do

tempo de extração (fator B) (tabela 12) sobre o resíduo seco, sendo que

os dois fatores são significativos. O aumento da porcentagem de etanol

do líquido extrator provoca a diminuição do resíduo seco. Por outro

lado, o aumento do tempo resulta em uma maior quantidade de resíduo.

Esta relação pode ser observada na figura 15.

Capítulo 2 – Padronização - 66

Figura 15. Representação gráfica dos fatores concentração de etanol (A)

e tempo (B) dos extratos obtidos por maceração para resíduo seco. (▲):

8 dias; (■): 4 dias

Para a decocção, os dois fatores considerados também são signi-

ficativos. No entanto, no caso dos decoctos, tanto a temperatura como o

tempo, quando aumentados, provocam um aumento do resíduo seco

(figura 16).

Capítulo 2 – Padronização - 67

Figura 16. Representação gráfica dos fatores temperatura (A) e tempo

(B) dos extratos obtidos por decocção para resíduo seco. (▲): 30 minu-

tos; (■): 10 minutos

Não foi encontrada correlação entre o resíduo seco e o teor dos

marcadores químicos indicando que este método não pode ser utilizado

como indicativo da concentração dos mesmos.

Com relação ao pH, quando se observam os valores para os dife-

rentes extratos obtidos por maceração, verifica-se que apenas a concen-

tração de etanol é significativa, sendo que um aumento da concentração

de etanol acarreta um aumento no valor de pH (figura 17). No entanto,

este aumento não é linear, como indica o valor de significância da cur-

vatura expressa na tabela 12.

A diferença entre os valores de pH dos extratos mostrou-se esta-

tisticamente significativa após a aplicação do teste t de Student (α 

0,05). Contudo, esta diferença estatística pode ser considerada de pouco

Capítulo 2 – Padronização - 68

significado tecnológico, uma vez que os valores encontrados são muito

próximos.

Figura 17. Gráfico tridimensional dos resultados obtidos para o ensaio

de pH relacionando os fatores concentração de etanol (A) e tempo (B)

dos extratos obtidos por maceração

Na decocção, tanto a temperatura como o tempo sugerem ter in-

fluência sobre o pH. Como pode ser visualizado na figura 18, o aumento

da temperatura e do tempo resulta na diminuição do pH. No entanto, ao

contrário do observado para a maceração, não foram encontradas dife-

renças significativas entre os valores após a aplicação do teste t de Stu-

dent, mesmo considerando que a curvatura é significante (tabela 14).

Capítulo 2 – Padronização - 69

Figura 18. Representação gráfica dos fatores temperatura (A) e tempo

(B) dos extratos obtidos por decocção para o ensaio de pH. (▲): 30

minutos; (■): 10 minutos

Fenólicos totais

Os polifenóis são substâncias redutoras e, portanto, oxidam-se

com facilidade, resultando em substâncias coradas (SIMÕES, 2003).

O conteúdo total de compostos fenólicos foi determinado usando-

se a técnica de Folin-Ciocalteu. Este método colorimétrico consiste na

extração de compostos fenólicos (solução ácida) e sua quantificação por

espectrofotometria, após reação de oxi-redução em presença de álcali

(solução de carbonato de sódio). Esta reação resulta na formação de um

complexo de coloração azulada (SIMÕES, 2003; VERZA, 2007). O

agente de oxi-redução utilizado foi o reagente de fenol Folin-Ciocalteu,

composto por fosfomolibdato e fosfotungstato, que atua medindo a

quantidade de substâncias necessárias para inibir a oxidação do reagen-

te, de forma que a capacidade redutora da amostra é mensurada como

Capítulo 2 – Padronização - 70

um todo. O complexo colorido que se forma, no entanto, é extremamen-

te instável, constituindo-se esta a principal limitação do método, além da

interferência de outros constituintes. Este inconveniente pode ser mini-

mizado pela realização da medida de valores de absorvância no tempo

estabelecido de 120 minutos.

Este ensaio, bem como os demais que avaliam uma determinada

classe de substâncias, não é específico para um dado composto, poden-

do, com isto, incorrer em erro devido à presença de interferentes ou por

diferenças entre os máximos de absorção das substâncias envolvidas. No

entanto, apesar dos problemas inerentes a estes ensaios, no caso de ex-

tratos vegetais os mesmos podem dar informações importantes sobre a

qualidade da amostra avaliada. Ao tratar-se de uma matriz complexa,

que pode apresentar variações quali e quantitativa em sua composição, a

quantificação total pode ser considerada vantajosa. Além disso, as pro-

priedades biológicas dos extratos vegetais estão mais comumente rela-

cionadas a efeitos sinérgicos de vários compostos do que a substâncias

isoladas.

Os resultados de fenólicos totais foram expressos em termos de

ácido gálico (YU, 2002). Esta metodologia foi desenvolvida por Folin e

Ciocalteu em 1927 e utilizada por outros autores (SADLER, 1995; TE-

PE, 2007; VERZA, 2007), com pequenas modificações. A figura 19

apresenta a curva do ácido gálico utilizada para o doseamento. A curva

apresenta como equação da reta, y = 0,0008x + 0,0164 e coeficiente de

correlação, r = 0,9999.

Capítulo 2 – Padronização - 71

Figura 19. Curva analítica média do ácido gálico obtida por espectrofo-

tometria UV/Vis. Detecção: 765 nm. Coeficiente de correlação, 0,9999;

equação da reta: y = 0,0008x + 0,0164

Como pode ser observado nas tabelas 11 e 13, os EM apresentam

um maior teor fenólicos totais do que os ED. Várias podem ser as causas

desta diferença, entre as quais podem ser destacados dois fatores. Inici-

almente, devido aos solventes empregados. Na maceração o líquido

extrator é uma mistura de etanol/água, na decocção é utilizada somente

água, portanto, os solventes utilizados para os dois métodos apresentam

diferenças de polaridade. De acordo com a literatura, os polifenóis são

melhor extraídos em sistemas alcoólicos de concentração entre 40 e 80

% do que quando utilizados solventes puros (água, etanol, metanol)

(KATSUBE, 2009). Além disso, a influência da temperatura também é

marcante: seu aumento resulta num incremento da solubilidade dos

ácidos clorogênico e cafeico (MOTA, 2008) e, consequentemente, faci-

lita a sua extração; entretanto, pode potencializar a degradação e/ou

reações de polimerização dos compostos fenólicos (MA, 2009).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 100 200 300 400 500 600

Absorvância (UA)

Concentração (μg/mL)

Curva Analítica - Ácido Gálico

Capítulo 2 – Padronização - 72

Com relação aos EM, podemos observar que os resultados para

fenólicos totais são influenciados pela concentração de etanol no extra-

to. À medida que a concentração de etanol aumenta, a concentração de

fenólicos totais diminui (figura 20). Já na decocção os dois fatores são

significativos, conforme se aumenta a temperatura e o tempo, ocorre o

aumento da concentração de fenólicos totais (figura 21).

Figura 20. Gráfico tridimensional dos resultados obtidos para o ensaio

de fenólicos totais relacionando os fatores concentração de etanol (A) e

tempo (B) dos extratos obtidos por maceração

Capítulo 2 – Padronização - 73

Figura 21. Representação gráfica dos fatores temperatura (A) e tempo

(B) dos extratos obtidos por decocção para o ensaio de fenólicos totais.

(▲): 30 minutos; (■): 10 minutos

Teor de ácido clorogênico e ácido cafeico

No desenvolvimento de fitoterápicos, é desejável a recuperação

dos compostos químicos do material vegetal em sua totalidade, ou valo-

res muito próximos, em cada etapa de seu processamento. Em se tratan-

do dos compostos químicos responsáveis, ou parcialmente responsáveis

pela atividade biológica, como é o caso dos ácidos fenólicos na Cecro-

pia glaziovii, este requisito assume papel fundamental, por isto a impor-

tância do conhecimento de todos os fatores que possam interferir em

cada etapa deste processo.

Neste trabalho foi realizado um estudo de formulação utilizando

um delineamento fatorial que permitiu, com o auxílio do software De-

sign-Expert

, a análise da influência de diversos parâmetros simultane-

amente sobre respostas pré-estabelecidas. No caso dos teores dos mar-

cadores químicos, ACG e ACF, determinados através do método de

CLAE validado e apresentados na tabela 11, pode-se observar a influên-

Capítulo 2 – Padronização - 74

cia de todos os fatores estudados sobre esta resposta, bem como algumas

interações entre elas.

Para o ACG nos EM pode-se observar claramente uma interação

entre a porcentagem de etanol e o tempo (figura 22).

Figura 22. Gráfico de interação entre os fatores concentração de etanol

(A) e tempo (B) dos extratos obtidos por maceração para o doseamento

de ácido clorogênico. (▲): 8 dias; (■): 4 dias

Na concentração de etanol de 80 % é possível observar-se uma

constância nos teores do ACG nos tempos estudados, indicando que no

menor tempo estudado, 4 dias, a quantidade total passível de ser extraída

nestas condições já foi transferida ao líquido extrator, ou seja, o equilí-

brio de extração já foi alcançado a 4 dias. Por outro lado, quando o lí-

quido extrator utilizado foi o etanol 20 %, observou-se uma queda im-

portante no teor deste ácido com o aumento do tempo (tabela 11). Este

último resultado foi considerado bastante surpreendente, indicando al-

gum tipo de alteração na composição do extrato durante o processo

extrativo, o que motivou um estudo para elucidação deste fato. Este

estudo será apresentado no capítulo 3.

Capítulo 2 – Padronização - 75

Ainda observando a tabela 11, pode-se verificar que o extrato que

apresenta maior concentração de ACG é o extrato com 60 % de etanol,

seguido dos extratos com 80 % de etanol (independente do tempo em-

pregado), o extrato obtido após 4 dias com 20 % de etanol e após 8 dias

de extração com 20 % de etanol.

A análise dos teores de ACF encontrados nos extratos apresentou

valores acima de 10 entre o resultado máximo e o mínimo, que neste

tipo de análise indicam que uma transformação é necessária para melhor

interpretação dos resultados. No caso do ACF esta razão foi de 17,97 e,

por este motivo, os dados foram transformados utilizando a raiz quadra-

da. A figura 23 mostra o comportamento dos resultados, num gráfico de

interação.

Figura 23. Gráfico de interação após aplicação de raiz quadrada, entre os

fatores concentração de etanol (A) e tempo (B) dos extratos obtidos por

maceração para o doseamento de ácido cafeico. (▲): 8 dias; (■): 4 dias

A concentração de ACF em 20 % de etanol teve um aumento sig-

nificativo quando o tempo aumentou de 4 para 8 dias, passando de cerca

de 36 para 58 g/mL, respectivamente. Neste mesmo período, a concen-

tração de ACG diminuiu de aproximadamente 130 para 75 g/mL. Bus-

Capítulo 2 – Padronização - 76

cando justificar este resultado inusitado, foi levantada a hipótese de que

o ACG poderia ter sido convertido em ACF, uma vez que o ácido cloro-

gênico é um éster do ácido cafeico (OLTHOF, 2001). Esta conversão

poderia ter ocorrido devido à ação de enzimas extraídas da própria plan-

ta ou dos microorganismos que pudessem estar presentes nas soluções

extrativas, além de uma maior extração do composto. Estas hipóteses

foram avaliadas e os resultados deste estudo constituem o capítulo 3

desta dissertação.

A análise dos teores encontrados para o ACG nos extratos obtidos

por decocção também evidenciou uma interação entre os fatores tempe-

ratura e tempo, como pode ser observado na tabela 14 e na figura 24.

Com o aumento do tempo e da temperatura obteve-se uma maior

concentração de ACG. No entanto, a 90 °C a diferença entre 10 e 30

minutos foi pouco expressiva.

Figura 24. Gráfico de interação entre os fatores temperatura (A) e tempo

(B) dos extratos obtidos por decocção para o doseamento de ácido clo-

rogênico. (▲): 30 minutos; (■): 10 minutos

Capítulo 2 – Padronização - 77

A análise dos teores de ácido cafeico nos extratos obtidos por de-

cocção indica que em 10 minutos tem-se pouca influência da temperatu-

ra, já em 30 minutos a variação na concentração de ácido cafeico é mais

significativa (figura 25). No entanto, os valores de ACF nos decoctos

são pouco expressivos, principalmente se comparados aos elevados

teores de ácido clorogênico encontrados nos mesmos.

Figura 25. Gráfico de interação entre os fatores temperatura (A) e tempo

(B) dos extratos obtidos por decocção para o doseamento de ácido cafei-

co. (▲): 30 minutos; (■): 10 minutos

3.3. Avaliação in vivo da atividade anti-diabética

Um estudo realizado por Revilla-Monsalve e colaboradores

(2007) avaliou a atividade da C. obtusifolia em pacientes diabéticos por

32 semanas. Efeitos positivos foram obtidos após 18 semanas de trata-

mento, porém, este estudo não mostrou mudança significativa nos níveis

de insulina, levando a conclusão de que o efeito hipoglicemiante da

Capítulo 2 – Padronização - 78

Cecropia não poderia ser atribuído a indução de secreção de insulina,

mas poder-se-ia então sugerir uma atividade insulino-mimética. Esses

resultados interessantes nos levaram a investigar uma possível atividade

anti-diabética na C. glaziovii, uma vez que não foram encontrados rela-

tos na literatura de utilização desta planta com esta finalidade.

A possível atividade anti-diabética dos extratos foi avaliada utili-

zando dois modelos, administração oral em ratos hiperglicêmicos e em

ratos diabéticos porque, desta forma, é possível evidenciar a forma co-

mo esta atividade ocorre.

O pâncreas de ratos normais hiperglicêmicos possui células  ca-

pazes de secretar insulina, portanto este estudo permite a avaliação da

função secretagoga de insulina. Já nos ratos diabéticos o pâncreas não é

funcional; uma queda na glicemia nestes animais após a administração

do extrato evidencia uma atividade insulino-mimética (CAZAROLLI,

2009).

Os extratos selecionados para a realização destes estudos foram

os EM 4d20, 8d20 e 6d50 e os ED 8020 e 9030.

Os EM 4d20 e 8d20 foram escolhidos por apresentarem a maior

concentração de ACF (substância já relatada como possuindo atividade

anti-diabética), mas uma relação ACG:ACF diferente: para 4d20 a rela-

ção é de 3,6:1, enquanto que para 8d20 a relação é de 1,3:1. As diferen-

tes proporções entre os marcadores químicos podem permitir a observa-

ção de possível efeito sinérgico na atividade. O extrato 6d50 foi selecio-

nado por apresentar a maior concentração de ACG, dentre todos os EM

preparados. Já os ED foram escolhidos por apresentarem a maior con-

centração de ACG (8020) e a maior concentração de ACF (9030) do

delineamento realizado. Todos os extratos foram testados na concentra-

ção de 400 mg/kg.

Os marcadores isolados também foram testados. O ACG foi ava-

liado na concentração usual para este tipo de ensaio, 15,0 mg/kg (refe-

rência), e posteriormente em concentração próxima à encontrada nos

extratos, 2,0 mg/kg. O ACF foi testado na concentração de 2,0 mg/kg. A

mistura de ambos foi avaliada a 2,0 mg/kg de cada um dos ácidos.

3.3.1. Avaliação dos EM em animais hiperglicêmicos

O primeiro marcador químico a ser testado foi o ACG isolado, na

concentração de 15 mg/kg de animal. Em seguida foram testados os

extratos brutos obtidos por maceração na concentração de 400 mg/kg.

O ACG nesta concentração não foi capaz de reduzir a glicemia

dos animais no tempo do estudo, conforme observado na figura 26

Capítulo 2 – Padronização - 79

quando comparado ao controle hiperglicêmico tendo promovido inclusi-

ve o aumento da glicemia. Por outro lado, os EM 4d20 e 8d20 apresen-

taram resultados bastante expressivos na redução da glicemia, em espe-

cial o extrato 8d20. O mesmo apresentou diferença significativa (p <

0,001) nos tempos de 15, 30 e 60 minutos e p < 0,05 em 180 minutos. O

extrato 4d20 apresentou diferença significativa (p < 0,001) nos primei-

ros 15 minutos.

Figura 26. Gráfico comparativo do efeito agudo entre os marcadores

químicos (isolados e em associação) e os extratos obtidos por maceração

na curva de tolerância à glicose oral. Administração dos extratos liofili-

zados por gavagem: 400 mg/kg. Os resultados são a média ± EPM (n =

6 – 10)

Com base nas concentrações do ACG e do ACF nos extratos (ex-

pressos na tabela 11, página 63), é possível calcular a quantidade desses

ácidos administrada em média aos animais. Os ratos tratados com o

extrato 4d20, receberam em média 4,30 mg/kg de ACG e 1,54 mg/kg de

ACF. Os ratos tratados com o extrato 8d20, receberam em média 2,61

mg/kg de ACG e 2,39 mg/kg de ACF. Sendo assim verifica-se que no

Capítulo 2 – Padronização - 80

extrato 4d20 a concentração do ACG era aproximadamente 3 vezes

maior do que a concentração do ACF. Já no extrato 8d20 os marcadores

apresentavam uma relação praticamente de 1:1. Com essas constatações

foi decidido testar os marcadores de forma isolada e associados nesta

mesma proporção e numa concentração próxima ao encontrado nos

extratos. A concentração utilizada foi de 2,0 mg/kg de animal.

O ACG na concentração de 2,0 mg/kg apresentou diferença signi-

ficativa (p < 0,01) com o controle hiperglicêmico nos tempos de 15 e 30

minutos e após esse tempo apresentou aumento na glicemia. O ACF

nesta mesma concentração apresentou diferença significativa (p < 0,01)

do controle apenas em 15 minutos. Mas a associação de ambos foi signi-

ficativamente diferente (p < 0,01) do controle em 15, 30 e 60 minutos,

indicando um possível sinergismo na atividade hipoglicemiante destas

duas substâncias.

Ao serem comparados os resultados obtidos para os extratos bru-

tos 4d20 e 8d20 (EM) com os marcadores pode-se ainda sugerir que

outras substâncias, não estudadas neste trabalho, estejam atuando de

forma sinérgica na diminuição da glicemia em ratos.

O extrato 6d50 não apresentou resultados significativamente dife-

rentes do controle hiperglicêmico. Os ratos tratados com o extrato 6d50,

receberam em média 5,95 mg/kg de ACG e 0,42 mg/kg de ACF.

3.3.2. Avaliação dos ED em animais hiperglicêmicos

Na avaliação dos ED na curva de tolerância à glicose nenhum dos

extratos apresentou efeito hipoglicemiante, apesar da concentração de

ACG ser maior do que nos EM (figura 27). Ao serem retomados os

resultados obtidos para o ACG testado isoladamente nas concentrações

de 15 e 2,0 mg/kg, pode-se inferir que a resposta hipoglicemiante desse

ácido parece ser dose-dependente. Desta forma, era de se esperar que os

ED não apresentassem atividade hipoglicemiante.

Assim como para os EM, foi calculada a quantidade de ácidos

administrada aos animais, também para a decocção. Os ratos tratados

com o extrato 8020 receberam em média 7,36 mg/kg de ACG e 0,28

mg/kg de ACF. Os ratos tratados com o extrato 9030 receberam em

média 6,77 mg/kg de ACG e 0,46 mg/kg de ACF.

Confirmando o que foi anteriormente discutido, nenhum dos ex-

tratos que apresentaram alta concentração de ACG (acima de 5,0 mg/kg;

6d50, 8020 e 9030) apresentou atividade hipoglicemiante, mais uma vez

sugerindo uma atividade dose-dependente. Nicasio e colaboradores

(2005) avaliaram a atividade hipoglicemiante de extratos metanólicos de

Capítulo 2 – Padronização - 81

duas espécies de Cecropia (obtusifolia e peltata) e também concluíram

que a atividade do ACG seria dose-dependente. Além disso, pode-se

verificar um efeito sinérgico entre os dois ácidos (ACG e ACF) na pro-

porção 1:1, uma vez que mantida esta relação o efeito hipoglicemiante

foi potencializado.

Figura 27. Gráfico comparativo do efeito agudo entre os marcadores

químicos (isolados e em associação) e os extratos obtidos por decocção

na curva de tolerância à glicose oral. Administração dos extratos liofili-

zados por gavagem: 400 mg/kg. Os resultados são a média ± EPM (n =

6 – 10)

3.3.3. Avaliação dos extratos obtidos em animais diabéticos

Neste tipo de experimento, em que é necessária a indução do dia-

betes, a taxa da glicemia dos animais que apresentam a patologia é bas-

tante variável, sendo considerados diabéticos animais com glicemia

acima de 300 mg/dL (CAZAROLLI, 2009). Desta forma, para possibili-

tar a comparação entre os grupos, todos os animais tem determinada sua

Capítulo 2 – Padronização - 82

taxa glicêmica no tempo zero, ou seja, antes da administração das amos-

tras. Neste trabalho, o valor médio de glicemia inicial de cada grupo foi

considerado como valor referência e a alteração em cada um dos tempos

estudados foi definida como a variação percentual em relação a este

valor inicial.

Como comparativos para os dois tipos de extratos foi avaliada i-

nicialmente a atividade dos marcadores químicos isolados e em associa-

ção. O ACG, na concentração de 15 mg/kg, como pode ser observado

nas figuras 28 e 29, acarreta uma diminuição significativa (p  0,05) da

glicemia dos animais diabéticos em 2 e 3 horas (em torno de 30 % da

glicemia, quando comparado ao tempo zero do mesmo grupo). Estudos

similares demonstram a utilização de uma concentração bem próxima de

ACG ou de outras substâncias em que se espera encontrar atividade anti-

diabética (ANDRADE-CETTO, 2001; HSU, 2003). Em outros casos a

dose testada neste trabalho esteve abaixo do que se tem observado (CA-

ZAROLLI, 2009).

O ACG também foi testado na concentração equivalente a dos ex-

tratos, 2,0 mg/kg, não sendo observada alteração na glicemia dos ani-

mais, indicando que a resposta para o ACG em animais diabéticos é

dose-dependente. Ao contrário do que é observado nos ratos hipergli-

cêmicos, a redução da glicemia só ocorre em concentrações mais eleva-

das do ácido.

O ACF e a associação deste com o ACG também foram testados

na concentração de 2,0 mg/kg e em nenhuma destas situações foi obser-

vada a redução na glicemia.

Capítulo 2 – Padronização - 83

Todos os extratos, tanto os obtidos por maceração quanto os por

decocção, foram testados na concentração de 400 mg/kg, mas indepen-

dente do método de extração utilizado, nenhum deles apresentou resul-

tados satisfatórios para a atividade anti-diabética. Cabe salientar que

neste estudo somente os marcadores isolados foram capazes de reduzir a

glicemia quando comparados ao controle.

Figura 28. Alteração percentual da glicemia em ratos diabéticos após

administração dos extratos obtidos por maceração (400 mg/kg) e dos

marcadores químicos isolados e em associação

Capítulo 2 – Padronização - 84

Figura 29. Alteração percentual da glicemia em ratos diabéticos após

administração dos extratos obtidos por decocção (400 mg/kg) e dos

marcadores químicos isolados e em associação

Os resultados obtidos neste estudo revelam uma capacidade de di-

minuição da glicemia em ratos hiperglicêmicos, atividade esta ainda não

relatada para a C. glaziovii, o que pode ser considerado um resultado

bastante interessante. No entanto, diferente do que é relatado pelo traba-

lho de Revilla-Monsalve e colaboradores (2007) com a C. obtusifolia,

foi evidenciada uma atividade secretagoga de insulina, uma vez que em

animais com a hiperglicemia induzida as células β pancreáticas encon-

tram-se intactas e em bom funcionamento, capazes de produzir insulina.

Por outro lado, os resultados obtidos em animais diabéticos sugerem a

ausência de ação insulino-mimética.

3.4. Avaliação ex vivo da atividade anti-hipertensiva

A C. glaziovii vem sendo utilizada na medicina tradicional na forma

de infusão (chá) como anti-hipertensiva, cardiotônica e antiasmática

(ROCHA, 2002). Lima-Landman e colaboradores (2007) analisaram o

extrato aquoso de C. glaziovii e a fração butanólica deste quanto à ativi-

dade anti-hipertensiva, obtendo resultados satisfatórios. Com base nes-

ses resultados, este trabalho pretendeu avaliar a atividade anti-

Capítulo 2 – Padronização - 85

hipertensiva do extrato bruto aquoso, assim como de extratos obtidos

por maceração com etanol, buscando evidenciar a ação sinérgica dos

diferentes compostos.

A possível atividade anti-hipertensiva dos extratos brutos liofiliza-

dos 4d20, 8d20, 9030 e 8020 foi investigada através da avaliação do

efeito sobre a reatividade vascular em anéis de aorta torácica isolada de

ratos. A aorta é seccionada na forma de anéis de 3 a 4 mm de compri-

mento e mantida em condições ideais. Duas hastes metálicas são inseri-

das na luz do vaso, sendo uma delas adaptada a um transdutor de tensão

isométrica acoplado a um sistema de aquisição de dados. Após o perío-

do de equilíbrio (60 minutos) as preparações são contraídas com fenile-

frina (1 μM) e a presença do endotélio funcional é avaliada pela capaci-

dade da acetilcolina (ACh, 1 μM) induzir ao relaxamento das prepara-

ções. Somente as preparações que apresentarem relaxamento igual ou

superior a 75 % serão consideradas com endotélio íntegro. Em seguida

as amostras (extratos) são testadas após nova contração dos anéis com

fenilefrina, construindo-se curvas relacionando dose-resposta.

Neste estudo foram construídas curvas concentração resposta (CCR)

cumulativas na presença de endotélio funcional, demonstradas na figura

30. Todos os extratos apresentaram capacidade de induzir o relaxamento

dos anéis de aorta, mas as CCR cumulativas demonstraram um efeito

vasodilatador mais pronunciado nos EM quando comparados aos ED,

significando que uma resposta semelhante pode ser conseguida com

menores concentrações de extrato. Comparando estes resultados a estu-

dos realizados com Cyathea phalerata Mart. (HORT, 2006), observa-se

uma diminuição da contração da aorta bastante surpreendente. No traba-

lho citado, a concentração de início de relaxamento de uma fração solú-

vel em acetato de etila está em torno de 30 µg/mL. Os extratos brutos

liofilizados estudados de C. glaziovii apresentam uma concentração de

início de relaxamento dos anéis de aorta em torno de 0,5 µg/mL. Outros

estudos relatam concentrações ainda maiores de extratos ou frações

enriquecidas para obtenção da atividade vasodilatadora (CAMPANA,

2009; DALBÓ, 2008).

Capítulo 2 – Padronização - 86

Figura 30. Curvas concentração resposta cumulativas aos extratos liofi-

lizados obtidos por maceração e por decocção (0,1 – 1000 µg/mL) em

anéis de aorta torácica isolada de rato, contraídos previamente com feni-

lefrina (1 µM). Cada ponto representa média ± EPM de 6 experimentos

Capítulo 3

Monitoramento dos teores dos marcadores

químicos nas soluções extrativas

Capítulo 3 – Monitoramento - 88

1. APRESENTAÇÃO

Durante a avaliação dos extratos padronizados de Cecropia glaziovii

foram observados alguns resultados inesperados. Inicialmente, o apare-

cimento de uma nova substância nos extratos obtidos por maceração que

revelou ser o ácido cafeico, ainda não relatado para esta espécie e que

passou a ser considerado como um segundo marcador químico. O teor

deste ácido aumentou com a diminuição do teor alcoólico, sendo quase

inexpressivo quando se utilizou a máxima concentração de etanol, 80 %,

como líquido extrator. No extrato no qual o ácido cafeico apareceu em

maior teor, maceração com 20 % de etanol, sua concentração aumentou

com o aumento do tempo de extração, de 4 para 8 dias. No entanto,

neste mesmo extrato, foi observada uma diminuição bastante expressiva

do teor de ácido clorogênico, cujo teor foi reduzido praticamente à me-

tade no mesmo período de tempo. Esta observação conduziu à busca de

uma explicação plausível para este resultado surpreendente. Neste senti-

do, foram levantadas hipóteses sobre possível degradação microbiológi-

ca ou enzimática do ácido clorogênico. Com o intuito de avaliar estas

hipóteses, foi delineado um estudo no qual foram inseridos novos fato-

res que poderiam evitar a ação de microorganismos e de enzimas, atra-

vés da adição de conservante anti-microbiano ou da diminuição da tem-

peratura durante o processo extrativo. Este capítulo descreve os resulta-

dos obtidos neste estudo.

2. MATERIAIS e MÉTODOS

2.1. Material

2.1.1. Matérias-primas

Ácido cafeico (Sigma – Aldrich)

Ácido clorogênico (Sigma – Aldrich)

Folhas de Cecropia glaziovii Sneth

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes

Acetonitrila grau CLAE (J. T. Baker)

Ácido acético (Qhemis)

Água mili-Q (Millipore)

Água purificada

Etanol

Metanol (J. T. Baker)

Capítulo 3 – Monitoramento - 89

2.1.3. Aparelhos, equipamentos e materiais especiais

Aparelho de hidrodestilação FABBE

Balança Ohaus Analytical Standard

Balança semi-analítica Gehaka BG 4000

Banho de Ultrassom – UltraSonic Cleaner USC 700 Unique

Banho termostatisado Marte

Bomba de vácuo Fisatom Mod. 830

Coluna Zorbax ODS (5 µm, 150 x 4,6 mm) Agilent

Cromatógrafo líquido de alta eficiência Perkin Elmer, equipado com:

Autosampler Perkin Elmer Series 200

Bomba binária Series 200

Degasser à vácuo Perkin Elmer Series 200

Detector UV/Vis Series 200

Interface 600 Series LINK

Dessecador

Estufa Nova Ética 402 3G

Membranas HVLP 0,45 µm, com 47 e 13 mm de diâmetro Millipore

Pré-coluna Phenomenex ODS (4,0 x 3,0 mm)

Refrigerador Eletrolux R310

2.2. Metodologia

2.2.1. Linearidade das respostas por CLAE das soluções extrativas

As soluções extrativas foram preparadas conforme descrito no

capítulo 2, itens 2.2.2., p. 50 e 2.2.3., p. 52.

Os extratos utilizados para este estudo foram: 8d20, 6d50 e 8d80,

por representarem todas as polaridades possíveis das amostras estuda-

das.

As diferentes diluições foram preparadas adicionando-se o extra-

to em balões volumétricos de 10 mL e o volume completado com meta-

nol:água (1:1, v/v) quando necessário.

A linearidade das respostas foi determinada tanto para as concen-

trações de ácido clorogênico quanto para as concentrações de ácido

cafeico através de regressão linear. As áreas encontradas na validação

do método de doseamento de ácido clorogênico e ácido cafeico por

CLAE foram utilizadas como base para a determinação do intervalo de

estudo da linearidade dos extratos.

Os resultados de linearidade foram avaliados através da curva que

relaciona área com concentração (mg/mL), portanto houve a necessida-

Capítulo 3 – Monitoramento - 90

de de determinar a densidade dos extratos. As áreas obtidas que não se

encontravam dentro do intervalo da curva analítica dos ácidos (clorogê-

nico ou cafeico) não foram utilizadas para a construção da respectiva

curva.

Densidade

A densidade foi determinada através do resíduo seco, onde 25,0

mL de cada uma das soluções extrativas foram colocados em pesa-

filtros previamente tarados. Os pesa-filtros foram pesados, para que se

pudesse determinar a relação volume / massa. A solução extrativa foi

evaporada em banho de água quente, sob agitação ocasional. Após a

evaporação, os pesa-filtros foram colocados em estufa a 105 °C por duas

horas, resfriados em dessecador e então pesados. O resultado foi calcu-

lado em relação a 100,0 g de solução extrativa (%, m/m) pela média de

três determinações do resíduo seco.

2.2.2. Estabilidade das soluções extrativas

As soluções extrativas foram preparadas segundo as condições

descritas no capítulo 2, itens 2.2.2., p. 50 e 2.2.3., p. 52. Resumidamen-

te, frascos de boca larga foram adicionados a matéria-prima vegetal

moída e os diferentes líquidos extratores mantendo uma proporção plan-

ta:solvente de 5,0 %. Para cada uma das soluções extrativas (4d20,

4d80, 6d50, 8d20 e 8d80) foram também preparados extratos que foram

mantidos em geladeira durante a extração (4 °C) ou tiveram o acréscimo

de metilparabeno (Nipagin

, conservante antimicrobiano ativo na faixa

de 3,0 – 8,0 de pH) a 0,1 % no tempo zero (antes do início da extração).

A partir de então, os frascos contendo os diferentes sistemas foram man-

tidos nas condições descritas por períodos de tempo pré-determinados.

Decorrido este tempo, o marco foi separado das soluções extrativas por

filtração à vácuo.

Delineamento Fatorial

O preparo das soluções extrativas foi baseado em dois delinea-

mentos fatoriais desenhados obtidos com o auxílio do programa Design-

Expert

, versão 6.0.6. Cada delineamento consiste num desenho com 3

fatores e 2 níveis (máximo e mínimo) para cada fator (2

), sendo dois

fatores numéricos e um categórico. Um delineamento foi elaborado para

a avaliação da influência da temperatura durante o processo extrativo

dos EM, considerando como fatores numéricos o teor etanólico (%, fator

Capítulo 3 – Monitoramento - 91

A) e o tempo (dias, fator B) e como fator categórico a temperatura (ge-

ladeira ou ambiente, fator C). Para a avaliação da influência da presença

de conservante nas soluções extrativas durante o processo foram consi-

derados os mesmos fatores A e B alterando apenas o fator C (categóri-

co) para presença ou ausência de conservante. Dois pontos centrais fo-

ram propostos, devido o uso de fator categórico. Cada ponto foi realiza-

do em duplicata. No total foram preparados 36 extratos, 18 para avalia-

ção da temperatura e 18 para avaliação da influência do conservante. Os

delineamentos estão detalhados nas tabelas 15 e 16. Baseado na densi-

dade de cada extrato, os resultados foram expressos em µg de ACG ou

ACF por g de extrato.

TABELA 15. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções ex-

trativas e respectivas condições extrativas, destinadas à avaliação da

influência da temperatura no processo extrativo dos marcadores quími-

cos

EXP

EtOH (%)

Tempo (dias)

geladeira

ambiente

geladeira

ambiente

EtOH (%): concentração etanólica; T: temperatura

Capítulo 3 – Monitoramento - 92

TABELA 16. Delineamento fatorial 2

para obtenção das soluções ex-

trativas destinadas à avaliação da influência do conservante no processo

extrativo dos marcadores químicos

EXP

EtOH (%)

Tempo (dias)

Conservante

ausência

presença

ausência

presença

EtOH (%): concentração etanólica

3. RESULTADOS e DISCUSSÃO

Soluções extrativas obtidas de plantas são amostras biológicas e

consequentemente matrizes complexas, com a presença de inúmeras

substâncias não identificadas e que podem tornar-se interferentes em

análises como a CLAE, modificando a linearidade dos resultados. O teor

etanólico é um fator importante na determinação da polaridade das subs-

tâncias extraídas, quanto maior o teor de etanol, menor a polaridade da

solução extrativa.

O princípio de separação e quantificação de substâncias por

CLAE fundamenta-se na utilização de uma fase móvel que se move

sobre uma fase estacionária arrastando consigo os compostos a serem

Capítulo 3 – Monitoramento - 93

distribuídos entre essas duas fases. Para que esta distribuição aconteça, é

preciso que as polaridades entre as fases sejam diferentes, de tal modo

que permita a permanência de alguns compostos ligados à fase estacio-

nária, enquanto outros são arrastados pela fase móvel. Uma vez que

ocorre a mudança de polaridade da fase móvel e/ou da amostra injetada,

tem-se a modificação ou deformação da linearidade das respostas

(COLLINS, 1993).

Considerando que um volume fixo de 3 mL de extrato é adicio-

nado em um balão volumétrico de 10 mL e seu volume completado com

metanol:água (1:1, v/v), quando uma solução extrativa com 20 % de

etanol for adicionada, uma determinada polaridade será obtida para esta

amostra a ser analisada. Mas ao adicionarmos um extrato com 80 % de

etanol a esse mesmo balão volumétrico teremos consequentemente uma

amostra com menor polaridade. Desta forma verifica-se o potencial da

solução extrativa em alterar a polaridade da amostra e com isso possi-

velmente a linearidade das respostas.

3.1. Linearidade das respostas por CLAE das soluções extrativas

Uma vez que a relação entre área e concentração dos marcadores

químicos pode ser influenciada por fatores como polaridade do líquido

extrator e composição dos diferentes extratos, é necessário assegurar-se

que o intervalo de concentração considerado para a construção da curva-

padrão seja linear, ou seja, que seja garantida uma relação direta entre

área do pico e concentração do analito. Neste sentido, um estudo de

linearidade foi conduzido para os extratos 8d20, 6d50 e 8d80 utilizando

CLAE com as mesmas condições cromatográficas anteriormente valida-

das. Concentrações crescentes de cada extrato foram injetadas no cro-

matógrafo e a concentração de cada um dos marcadores foi medida.

Desta forma, foram obtidas seis curvas analíticas, uma para cada marca-

dor em cada extrato.

Para que as áreas encontradas tanto dos extratos quanto dos pa-

drões pudessem ser comparadas em termos de massa, foi determinada a

densidade de cada um dos extratos, podendo-se assim correlacionar o

volume pipetado para as diluições dos extratos com a sua massa. As

densidades dos extratos estudados podem ser visualizadas na tabela 17.

Capítulo 3 – Monitoramento - 94

TABELA 17. Densidade dos extratos obtidos por maceração 8d20, 6d50

e 8d80, calculada em função do resíduo seco obtido a partir de 25 mL de

solução extrativa

Extrato

Densidade (g/cm

)

8d20

0,9751

6d50

0,9381

8d80

0,8678

Extrato 8d20

Na construção das curvas analíticas dos ACG e ACF isolados, os

intervalos de área encontrados foram 124.124,50 – 10.825.077,00 uV.s e

220.669,78 – 9.158.942,30 uV.s, respectivamente (capítulo 2, página

59), o que significa que, dentro destes limites, existe uma relação linear

entre área do pico e a sua concentração. Portanto, a área encontrada para

cada um dos marcadores deve necessariamente encontrar-se dentro des-

tes limites. Conforme é possível observar na tabela 18, as diluições

27,17 mg/mL para ambos os ácidos e a diluição 38,32 mg/mL para o

ACF encontram-se abaixo do limite inferior. Desta forma, estas concen-

trações foram desconsideradas no momento de serem traçadas as curvas

de linearidade do extrato 8d20. As figuras 31 e 32 apresentam as curvas

obtidas para o ACG e ACF, respectivamente, onde é possível verificar a

linearidade para os dois ácidos fenólicos neste extrato dentro do interva-

lo de concentração considerado.

Capítulo 3 – Monitoramento - 95

TABELA 18. Áreas médias dos picos de ACG e ACF obtidas de dife-

rentes diluições do extrato 8d20 para determinação da linearidade das

respostas por CLAE

Concentração

extrato

(mg/mL)

Área – ACG

(uV.s)

Área – ACF

(uV.s)

27,17

120823,08

137908,32

38,82

171.576,43

195816,67

85,39

400.615,68

441.030,54

178,55

834.154,84

921.659,43

232,89

1.065.710,89

1.154.351,24

357,10

1.654.292,98

1.846.993,42

543,41

2.571.613,09

2.832.159,26

714,20

3.377.151,99

3.645.350,37

776,30

3.510.501,01

3.976.519,37

Figura 31. Curva média de linearidade do extrato 8d20 para análise do

marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE. Intervalo de

linearidade 38,32 – 776,30 mg/mL. Coeficiente de correlação, 0,9993;

equação da reta: y = 4632,6x + 3435,5

500.000

1.000.000

1.500.000

2.000.000

2.500.000

3.000.000

3.500.000

4.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 8d20 -ACG

Capítulo 3 – Monitoramento - 96

Figura 32. Curva média de linearidade do extrato 8d20 para análise do

marcador químico ácido cafeico obtida por CLAE. Intervalo de lineari-

dade 85,39 – 776,30 mg/mL. Coeficiente de correlação, 0,9998; equação

da reta: y = 5135,1x + 1591,4

Com base nestes resultados pode-se inferir que o extrato 8d20

deve ser analisado numa concentração acima de 85,39 mg/mL, pois

somente a partir desta concentração é possível obter respostas lineares

para os dois marcadores químicos.

Extrato 6d50

A tabela 19 apresenta as áreas dos picos dos ácidos clorogênico e

cafeico nas diluições das soluções extrativas Nesta tabela é possível

observar que, da mesma forma que para o extrato 8d20, existem áreas

que se encontram abaixo do intervalo determinado pelas curvas analíti-

cas (124.124,50 – 10.825.077,00 uV.s para o ACG e 220.669,78 –

9.158.942,30 uV.s para o ACF, ver capítulo 2,página 59). Portanto esses

pontos devem ser retirados das curvas analíticas, reduzindo a faixa de

concentração de linearidade das respostas.

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 8d20 -ACF

Capítulo 3 – Monitoramento - 97

TABELA 19. Áreas médias dos picos de ACG e ACF obtidas de dife-

rentes diluições do extrato 6d50 para determinação da linearidade das

respostas por CLAE

Concentração

extrato

(mg/mL)

Área – ACG

(uV.s)

Área – ACF

(uV.s)

11,65

109.842,31

7.238,97

23,30

257.119,47

16.640,20

46,60

519.887,05

37.421,13

93,20

989.102,90

73.351,94

186,40

1.840.600,78

155.756,67

279,60

2.522.003,79

238.732,96

354,16

3.016.827,62

295.318,15

419,40

3.357.912,63

349.689,09

559,20

4.029.543,08

466.214,31

699,00

4.622.032,17

592.477,86

932,00

5.503.401,58

767.357,73

Na análise por regressão linear da curva demonstrada na figura

33, que representa as áreas dos picos do ACG versus concentração da

solução extrativa, pode-se observar que a mesma apresenta um valor não

satisfatório (r = 0,9819). Desta forma, foi necessária a redução do inter-

valo da curva com a retirada dos pontos de maior diluição dos extratos.

Portanto o intervalo de concentração do extrato 6d50 no qual a área do

pico de ACG apresenta uma relação linear e pode ser co-relacionada

com seu teor é de 279,60 a 932,00 mg/mL (figura 34).

Por outro lado, a curva ACF apresentou excelente linearidade,

demonstrada pelo coeficiente de correlação igual a 0,9996 (figura 35).

Capítulo 3 – Monitoramento - 98

Figura 33. Curva média de linearidade do extrato 6d50 para análise do

marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE. Intervalo de

linearidade 23,30 – 932,00 mg/mL. Coeficiente de correlação, 0,9819;

equação da reta: y = 5819,1x + 575133

Figura 34. Curva média corrigida de linearidade do extrato 6d50 para

análise do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE. Inter-

valo de linearidade 279,60 – 932,00 mg/mL. Coeficiente de correlação,

0,9958; equação da reta : y = 4504,9x + 1406787,3

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

6.000.000

7.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1.000,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 6d50 -ACG

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

6.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1.000,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 6d50 -ACG

Capítulo 3 – Monitoramento - 99

Figura 35. Curva média de linearidade do extrato 6d50 para análise do

marcador químico ácido cafeico obtida por CLAE. Intervalo de lineari-

dade 279,60 – 932,00 mg/mL. Coeficiente de correlação, 0,9996; equa-

ção da reta: y = 821,14x + 7757,6

Com base nestes resultados pode-se inferir que o extrato 6d50

deve ser analisado numa concentração acima de 279,60 mg/mL, pois

somente a partir desta concentração é possível obter respostas lineares

para os dois marcadores químicos.

Extrato 8d80

A tabela 20 apresenta as áreas dos picos dos ácidos clorogênico e

cafeico nas diluições das soluções extrativas. Nesta tabela é possível

observar que todas as áreas encontram-se abaixo do limite inferior de

linearidade da curva analítica do ACF (220.669,78 – 9.158.942,30

uV.s), ver capítulo 2, página 59). Portanto, não foi possível traçar a

curva analítica do extrato 8d80 para o ACF.

A figura 36 apresenta a curva obtida para o ACG, onde é possível

verificar a linearidade para este ácido fenólico neste extrato nas dilui-

ções estudadas.

200.000

400.000

600.000

800.000

1.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1.000,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 6d50 -ACF

Capítulo 3 – Monitoramento - 100

TABELA 20. Áreas médias dos picos de ACG e ACF obtidas de dife-

rentes diluições do extrato 8d80 para determinação da linearidade das

respostas por CLAE

Concentração

extrato

(mg/mL)

Área – ACG

(uV.s)

Área – ACF

(uV.s)

13,27

174.694,59

6.511,37

22,75

297.650,97

8.426,98

41,70

560.347,95

19.299,99

83,40

1.076.881,48

42.484,99

166,80

1.899.433,83

92.037,18

227,50

2.242.411,72

123.178,06

333,61

2.634.238,01

169.260,98

454,92

3.049.574,38

568,65

3.434.325,37

758,20

3.976.159,07

Figura 36. Curva média de linearidade do extrato 8d80 para análise do

marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE. Intervalo de

linearidade 13,27 – 758,20 mg/mL. Coeficiente de correlação, 0,9607;

equação da reta: y = 5093,8x + 574127

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 8d80 -ACG

Capítulo 3 – Monitoramento - 101

Na análise por regressão linear da curva demonstrada na figura

36, que representa as áreas dos picos do ACG versus concentração da

solução extrativa, pode-se observar que a mesma apresenta um valor não

satisfatório (r = 0,9607). Desta forma, foi necessária a redução do inter-

valo da curva com a retirada dos pontos de maior diluição dos extratos.

Portanto o intervalo de concentração do extrato 8d80 no qual a área do

pico de ACG apresenta uma relação linear e pode ser co-relacionada

com seu teor é de 166,80 a 758,20 mg/mL (figura 37).

Figura 37. Curva média corrigida de linearidade do extrato 8d80 para

análise do marcador químico ácido clorogênico obtida por CLAE. Inter-

valo de linearidade 166,80 – 758,20 mg/mL. Coeficiente de correlação,

0,9959; equação da reta: y = 3455,9x + 1427156,27

A figura 38 apresenta um cromatograma do extrato 8d80 injetado

na concentração de 758,20 mg/mL, que corresponde à injeção direta do

extrato no cromatógrafo, sem diluição prévia. Neste cromatograma pode

ser observada a indefinição e a pouca relevância da área do pico do ACF

1.000.000

2.000.000

3.000.000

4.000.000

5.000.000

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0

Área (uV.s)

Concentração extrato (mg/mL)

Linearidade 8d80 -ACG

Capítulo 3 – Monitoramento - 102

(tempo de retenção de 6,0 minutos) nestas condições. De fato, concen-

trações de extrato acima de 333,61 mg/mL resultam na diminuição da

resolução do pico, não permitindo que a área seja determinada. Por ou-

tro lado, em concentrações inferiores a este valor, mesmo com melhor

resolução, o pico apresenta área inferior à área de menor concentração

obtida na curva analítica do padrão do ácido, apesar de manter-se dentro

do limite de quantificação do método.

Figura 38. Perfil cromatográfico do extrato 8d80 a 758,20 mg/mL obti-

do por CLAE. Fase móvel em sistema de gradiente, fluxo 1,0 mL/min.,

detecção a 330nm

Com base nos resultados obtidos, para obter respostas lineares e,

assim, garantir a confiabilidade do doseamento do ACG no extrato

8d80, a concentração mínima do extrato em diluições deverá ser de

166,80 mg/mL.

De maneira geral, os extratos etanólicos de Cecropia glaziovii

deverão ser analisados por CLAE na faixa de 280,0 a 775,0 mg/mL.

Capítulo 3 – Monitoramento - 103

3.2. Estabilidade das soluções extrativas

A análise dos teores encontrados para os marcadores químicos

nos diferentes extratos obtidos por maceração mostrou alguns resultados

inesperados e surpreendentes, já comentados anteriormente, principal-

mente com relação aos extratos preparados com 20 % de etanol. Nestes

extratos, encontrou-se uma concentração de 130 g/mL para o ACG

após 4 dias de processo extrativo (solução 4d20); no entanto, após 8 dias

a concentração deste marcador caiu para cerca de 75 g/mL (solução

8d20). Por outro lado, a concentração de ACF no mesmo período au-

mentou de 36 para 58 g/mL. Considerando que, por tratar-se de um

dímero, a degradação do ACG pode levar a um aumento da concentra-

ção de ACF e que os teores de ACF são consideravelmente mais baixos

nas outras EM, com concentrações alcoólicas mais elevadas a busca por

uma possível explicação para este fato tornou-se necessária, levando ao

estudo da estabilidade dos EM durante o processo extrativo e não como

costumeiramente é encontrado, após o período de extração (HEBERLÉ,

2000; WEI, 2007; VATAI, 2009).

Os compostos fenólicos são substâncias sensíveis à luz, aquecimen-

to e à presença de oxigênio (MA, 2009). Portanto, a suposta degradação

do ACG poderia ser consequência de uma reação química e/ou enzimá-

tica ou ainda microbiológica.

Desta forma, foram elaborados dois novos planejamentos fatoriais,

onde foram incluídos como fatores categóricos a temperatura e a pre-

sença de conservante. Os resultados deste estudo são apresentados nas

tabelas 21 e 23.

Capítulo 3 – Monitoramento - 104

TABELA 21. Resultados de quantificação dos marcadores químicos

ACG e ACF nos extratos obtidos por delineamento fatorial 2

em dife-

rentes condições extrativas, destinadas à avaliação da influência da tem-

peratura no processo extrativo dos marcadores

EXP

Extrato

ACG

(µg/g)

ACF

(µg/g)

4d20

geladeira

112,24

21,38

4d20

geladeira

116,12

18,95

4d80

geladeira

152,89

5,60

4d80

geladeira

139,65

4,94

8d20

geladeira

84,81

31,32

8d20

geladeira

90,32

30,95

8d80

geladeira

145,86

5,45

8d80

geladeira

145,56

5,59

4d20

ambiente

97,01

32,65

4d20

ambiente

119,15

34,64

4d80

ambiente

173,59

6,17

4d80

ambiente

140,35

4,90

8d20

ambiente

62,76

46,21

8d20

ambiente

67,62

42,79

8d80

ambiente

155,19

5,90

8d80

ambiente

159,86

6,12

6d50

geladeira

160,75

7,85

6d50

ambiente

165,09

10,07

T: temperatura

Para avaliar o nível de significância dos fatores e as possíveis in-

terações entre eles em um delineamento fatorial, é necessário que a vari-

ação entre os valores das respostas seja estabelecida. Quando a relação

entre o maior e o menor valor de uma determinada resposta é superior a

10, uma transformação é requerida, podendo esta ser do tipo raiz qua-

drada, base log, base log

No caso do ACF foi requerida uma transformação para melhor

avaliação destes resultados, uma vez que a razão entre as concentrações

máxima e mínima de ACF encontrada nos extratos foi de 9,44, sendo

recomendada pelo programa Design-Expert a transformação dos resul-

tados em raiz quadrada (square root, lambda = 0,5).

Capítulo 3 – Monitoramento - 105

A adequação do modelo foi avaliada pelo teste-F e determinada

pelo coeficiente R

. O valor-F do modelo para ACG é de 33,58 e para o

ACF é de 552,06, indicando que existe apenas 0,01% de chance do va-

lor-F ser consequência do ruído, sendo o modelo considerado adequado.

A análise de variância (ANOVA) também mostrou serem os fatores do

modelo adequados para a avaliação a que se destina, comprovado pelo

valor de p < 0,0001 tanto para o ACG quanto o ACF (tabela 22). Os

valores dos R

preditos estão de acordo com os R

ajustados para os dois

ácidos e não há falta de ajuste ao modelo, uma vez que os valores de

lack of fit (falta de ajuste) não são significativos (p > 0,05). A curvatura

é significativa para ambos, sugerindo que o traçado tridimensional des-

sas respostas é mais curvilíneo do que linear no espaço de desenho estu-

dado.

Os resultados apresentam fortes evidências de interação entre os

fatores concentração de etanol e tempo, assim como entre a concentra-

ção de etanol e a temperatura tanto para a concentração do ACG quanto

do ACF durante a extração (p < 0,05) (tabela 22). Entretanto os efeitos

dessas interações são diferentes. No caso do ACG isso implica dizer que

num menor tempo de extração (4 dias) um aumento na concentração de

etanol e da temperatura leva a um considerável aumento da concentra-

ção do ácido (figura 39a e 39b), enquanto num maior tempo de extração

(8 dias), em baixa concentração de etanol (20%), ocorre um decréscimo

nessa concentração, independente da temperatura (figura 39a e 39b).

Capítulo 3 – Monitoramento - 106

Figura 39. Gráficos tridimensionais dos resultados obtidos na quantifi-

cação dos marcadores químicos ACG e ACF no estudo de estabilidade

relacionando os fatores concentração de etanol (A), tempo (B) e avalia-

ção da influência da temperatura (C) dos extratos obtidos por macera-

ção. (a) influência no teor de ACG a 4 °C; (b) influência no teor de

ACG a 25 °C; (c) influência no teor de ACF a 4 °C e (d) influência no

teor de ACF a 25 °C

Ao contrário, quando falamos em termos de ACF, observa-se um

aumento da sua concentração conforme aumenta o tempo (8 dias) e a

temperatura (ambiente), numa menor concentração de etanol (20 %)

(figura 39c e 39d).

Capítulo 3 – Monitoramento - 107

TABELA 22. Análise de variância dos resultados de quantificação dos

marcadores químicos ACG e ACF nos extratos obtidos por maceração

utilizando delineamento fatorial 2

em diferentes condições extrativas,

destinadas à avaliação da influência da temperatura e da presença de

conservante no processo extrativo dos marcadores (p  0,05)

Valor - p

ANOVA

Temperatura

Conservante

ACG

ACF

ACG

ACF

Modelo

< 0,0001

0,0049

< 0,0001

0,0072

0,0001

0,8598

< 0,0001

0,0025

0,0049

< 0,0001

0,0009

0,0255

0,0258

< 0,0001

0,0059

Curvatura

0,0002

< 0,0001

0,0001

Lack of Fit

0,741

0,3872

0,7574

0,4334

0,9385

0,996

0,9452

0,9958

Adj R

0,9106

0,9942

0,9326

0,9939

Pred R

0,8661

0,989

0,9171

0,9874

Adeq Precision

15,184

53,808

19,359

48,172

ACF, delineamento temperatura: Transformação recomendada: Square

root (Lambda = 0,5)

ACF, delineamento conservante: Transformação recomendada: Base 10

log (Lambda = 0,0)

Fator A: Concentração de etanol (%)

Fator B: Tempo (dias)

Fator C: Temperatura ou conservante

Lack of Fit: Falta de ajuste

Adj R

: R

ajustado

Pred R

: R

predito

Capítulo 3 – Monitoramento - 108

Da mesma forma que no caso da temperatura, o modelo escolhido

para avaliação da influência do conservante também foi a interação entre

2 fatores (2FI) para as duas respostas. No caso do ACF, uma vez que a

razão entre as concentrações máxima e mínima de ACF encontradas nos

extratos foi de 9,44, os resultados foram transformados para melhor

avaliação, nesse caso, sendo recomendada pelo programa a transforma-

ção dos resultados em base log

(Base 10 log, lambda = 0,0).

A adequação do modelo foi avaliada pelo teste-F e determinada

pelo coeficiente R

. O valor-F do modelo para ACG é de 74,79 e para o

ACF é de 526,29, indicando que existe apenas 0,01 % de chance do

valor-F ser consequência do ruído, indicando a adequação do modelo. A

análise de variância (ANOVA) mostrou que os fatores do modelo são

adequados para a avaliação a que se destina, comprovado pelo valor de

p < 0,0001 tanto para o ACG quanto o ACF (tabela 22). Os valores dos

preditos estão de acordo com os R

ajustados para os dois ácidos e

não há falta de ajuste ao modelo, uma vez que os valores de lack of fit

(falta de ajuste) não são significativos (p > 0,05). A curvatura é signifi-

cativa para ambos, sugerindo que o traçado tridimensional dessas res-

postas é mais curvilíneo do que linear no espaço de desenho estudado.

Capítulo 3 – Monitoramento - 109

TABELA 23. Resultados de quantificação dos marcadores químicos

ACG e ACF nos extratos obtidos por delineamento fatorial 2

em pre-

sença ou ausência de conservante, destinados à avaliação da influência

deste no processo extrativo dos marcadores

EXP

Extrato

Conservante

ACG

(µg/g)

ACF

(µg/g)

4d20

ausência

119,15

34,64

4d20

ausência

97,01

32,65

4d80

ausência

173,59

6,17

4d80

ausência

139,86

4,90

8d20

ausência

62,76

46,21

8d20

ausência

67,62

42,79

8d80

ausência

155,19

5,90

8d80

ausência

159,86

6,12

4d20

presença

100,18

25,82

4d20

presença

101,45

24,81

4d80

presença

140,15

4,92

4d80

presença

148,64

5,53

8d20

presença

72,04

34,53

8d20

presença

74,45

34,49

8d80

presença

155,14

6,02

8d80

presença

152,43

5,93

6d50

ausência

165,09

10,07

6d50

presença

166,51

10,34

A interação entre os fatores concentração de etanol e tempo é

significativa para as respostas do ACG. O comportamento desta intera-

ção é o mesmo do anteriormente descrito para a temperatura. Com o

aumento da concentração de etanol há um incremento na concentração

do ACG (figura 40a e 40b). Por outro lado com 20 % de etanol num

período de 8 dias, a concentração do ACG diminui, como previamente

discutido. O fator presença de conservante não é significativo, indicando

que a presença ou não deste não altera a concentração do ácido (figura

40a e 40b). Este fato sugere que a diminuição do ACG no extrato 8d20

quando comparado ao 4d20 não ocorre devido à ação microbiana duran-

te o processo de extração. Para o ACF, observa-se a influência das inte-

rações entre a concentração de etanol e o tempo, assim como entre a

Capítulo 3 – Monitoramento - 110

concentração de etanol e a presença de conservante. Com a diminuição

do teor etanólico e aumento do tempo, ocorre o aumento do ACF (figura

40c e 40d). Para a interação entre a concentração de etanol e a presença

de conservante, a maior extração de ACF acontece com 20 % etanol na

ausência de conservante (figura 40c).

Figura 40. Gráficos tridimensionais dos resultados obtidos na quantifi-

cação dos marcadores químicos ACG e ACF no estudo de estabilidade

relacionando os fatores concentração de etanol (A), tempo (B) e avalia-

ção da presença de conservante (C) dos extratos obtidos por maceração.

(a) influência da ausência de conservante no teor de ACG; (b) influência

da presença de conservante no teor de ACG; (c) influência da ausência

de conservante no teor de ACF e (d) influência da presença de conser-

vante no teor de ACF

Após avaliação detalhada dos resultados obtidos, verifica-se que

estes não permitem afirmar que a diminuição do ACG em função do

tempo ocorre devido a uma possível degradação microbiológica. Isto

porque o perfil de diminuição do ACG em 8 dias se manteve em todas

Capítulo 3 – Monitoramento - 111

as condições estudadas, não sendo alterado na presença ou ausência do

conservante.

Além disso, valores mais baixos de temperatura interferem no

processo extrativo, diminuindo a possibilidade de reações químicas, a

ação enzimática, assim como o poder extrativo do solvente nestas con-

dições. Desta forma, os resultados obtidos não nos permitem uma afir-

mação conclusiva quanto ao fator responsável pela diminuição da con-

centração do ACG ao longo do tempo quando da utilização do etanol a

20 %. Sendo necessários estudos adicionais para tentarmos responder a

este questionamento.

Capítulo 4

Desenvolvimento do sistema

microestruturado

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 114

1. APRESENTAÇÃO

O desafio no desenvolvimento de novos sistemas de liberação

modificada de fármacos tem estimulado inúmeros investimentos na

investigação científica na área de Tecnologia Farmacêutica nas últimas

décadas. Diferentes tecnologias têm obtido pleno sucesso científico e

comercial, sendo que os sistemas particulados têm-se destacado em

relação a sistemas monolíticos tradicionalmente utilizados, tais como

comprimidos e cápsulas. Assim, o desenvolvimento de novos sistemas

multiparticulados de liberação modificada destinados à administração

pela via oral, especialmente os sistemas microestruturados, por sua ex-

cepcional capacidade de controle da liberação das substâncias encapsu-

ladas, redução dos efeitos colaterais e diminuição na freqüência de ad-

ministração do medicamento, ocupam posição relevante no tratamento

de patologias que necessitam de esquemas terapêuticos para administra-

ção contínua de fármacos, como é o caso do Diabetes melito e da hiper-

tensão arterial.

Neste capítulo foi realizado um estudo preliminar de formulação

com vistas a desenvolver um sistema microestuturado para a encapsula-

ção dos extratos padronizados de Cecropia glaziovii que apresentaram

um melhor desempenho na avaliação das atividades hipoglicemiante e

anti-hipertensiva.

2. MATERIAIS e MÉTODOS

2.1. Material

2.1.1. Matérias-primas

Diclorometano P.A. (Cromoline)

Eudragit

RS100 (Röhm Pharma)

Extrato de C. glaziovii Sneth ED 9030 liofilizado

Extrato de C. glaziovii Sneth EM 8d20 liofilizado

2.1.2. Solventes, soluções e reagentes

Água purificada

Etanol

PVA (Mowiol 40-88 – Sigma-Aldrich)

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 115

2.1.3. Aparelhos e equipamentos

Agitador magnético ARE Heating Magnetic Stirrer VELP Scientifica

Aparelho de hidrodestilação FABBE

Balança Ohaus Analytical Standard

Balança semi-analítica Gehaka BG 4000

Banho de Ultrassom – UltraSonic Cleaner USC 700 Unique

Banho termostatizado Marte

Bomba de vácuo Fisatom Mod. 830

Centrífuga Sigma 4K15

Cronômetro Casio

Dessecador

Espectrofotômetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda 10

Estufa Nova Ética 402 3G

Freezer Consul 180

Haste S25N-8G IKA - WERKE

Microscópio Eletrônico de Varredura Philips XL30

Microscópio ótico Leica DC300, software IRFANVIEW

Membrana HVLP 0,45 µm Millipore

2.2. Metodologia

2.2.1. Preparo dos extratos

Os extratos ED 9030 e EM 8d20 foram preparados conforme des-

crito no capítulo 2, itens 2.2.2., p. 50 e 2.2.3., p. 52. Posteriormente estes

extratos foram liofilizados em alíquotas de 1,0, 2,0 e 4,0 mL, como

descrito no cap. 2, item 2.2.6., página 54. Imediatamente antes da prepa-

ração das formulações de micropartículas, os liofilizados foram disper-

sos com a adição de 1,0 mL de água purificada, sendo assim obtidos

extratos nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 mL de extrato liofiliza-

do/mL de água purificada.

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 116

TABELA 24. Nomenclatura estabelecida para identificação da concen-

tração e do tipo de extrato incorporado em cada uma das formulações

Nomenclatura

Preparação prévia dos extratos

padronizados

Formulações

EM1

1,0 mL de extrato obtido por mace-

ração liofilizado, posteriormente

ressuspendido em 1,0 mL de água

purificada

1, 2, 9, 10

EM2

2,0 mL de extrato obtido por mace-

ração liofilizados, posteriormente

ressuspendidos em 1,0 mL de água

purificada

17, 19, 21, 23

EM4

4,0 mL de extrato obtido por mace-

ração liofilizados, posteriormente

ressuspendidos em 1,0 mL de água

purificada

5, 6, 13, 14

ED1

1,0 mL de extrato obtido por decoc-

ção liofilizado, posteriormente res-

suspendido em 1,0 mL de água

purificada

3, 4, 11, 12

ED2

2,0 mL de extrato obtido por decoc-

ção liofilizados, posteriormente

ressuspendidos em 1,0 mL de água

purificada

18, 20, 22, 24

ED4

4,0 mL de extrato obtido por decoc-

ção liofilizados, posteriormente

ressuspendidos em 1,0 mL de água

purificada

7, 8, 15, 16

2.2.2. Preparo das micropartículas

As micropartículas foram preparadas pela técnica da dupla emul-

são A/O/A, com extração/evaporação do solvente, conforme descrito

por Lamprecht e colaboradores (2004). Brevemente, 0,5 mL de extrato

liofilizado ressuspendido foi adicionado a uma solução do polímero

(Eudragit

RS100) em diclorometano e a mistura foi submetida à agita-

ção do equipamento Ultraturrax por 1 minuto. Desta forma, obteve-se a

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 117

emulsão primária A/O, que foi vertida sobre 75,0 mL de solução de

PVA 0,5% e mantida sob agitação magnética por 5 minutos, formando a

dupla emulsão A/O/A. Esta dupla emulsão foi vertida sobre 425,0 mL

de solução de PVA 0,1% e mantida sob agitação magnética por 3 horas

a temperatura ambiente, para completa evaporação do solvente orgâni-

co. Após este período as micropartículas foram mantidas em repouso

por aproximadamente 18 horas para decantação. A seguir, o sobrenadan-

te foi descartado e as micropartículas foram transferidas para tubos de

ensaio com a ajuda de 40,0 mL de água purificada, centrifugadas a 3000

rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. Este procedimento

foi repetido três vezes.

Após esse procedimento as micropartículas foram filtradas utili-

zando filtro HVLP sob vácuo com 50,0 mL de água purificada e coloca-

das em dessecador contendo sílica gel por 4 dias para secagem. Após

esse período as micropartículas foram colocadas em frascos e mantidas

em dessecador.

Para realização de ensaios comparativos foram preparadas tam-

bém micropartículas brancas, onde a solução extrativa foi substituída

por água purificada.

Estudo de formulação: planejamento fatorial

Para o preparo das micropartículas foi elaborado um delineamen-

to fatorial com o auxílio do programa Design Expert

, versão 6.0.6. Este

consiste num desenho com 4 fatores e 2 níveis (máximo e mínimo) para

cada fator (2

). Os fatores avaliados foram: fator A (numérico), quanti-

dade de polímero (Eudragit

RS100) (mg); fator B (categórico), tipo de

extrato (macerado ou decocto); fator C (numérico), concentração do

extrato em relação ao extrato inicial (mL de extrato submetidos à liofili-

zação com posterior reconstituição do volume a 1 mL com água purifi-

cada; fator D (numérico) velocidade de agitação na formação da primei-

ra emulsão (rpm). Dois pontos centrais foram propostos, sendo cada um

repetido quatro vezes. Os fatores e os níveis de cada fator podem ser

visualizados na tabela 25.

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 118

TABELA 25. Fatores e níveis utilizados no estudo de formulação: deli-

neamento fatorial 2

Níveis/Fatores

Polímero

(mg)

Extrato

Concentração extra-

to (mL ext. liof./mL

água purif.)

Velocidade

(rpm)

Inferior

100

1,0

9500

Ponto médio

200

2,0

13500

Superior

300

4,0

17500

Extrato M: macerado; extrato D: decocto

No total foram preparadas 24 formulações, 12 com os EM e 12

com os ED.

As formulações resultantes do delineamento estão detalhadas na

tabela 26.

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 119

TABELA 26. Delineamento fatorial 2

para obtenção das micropartícu-

las poliméricas destinado a avaliação dos fatores concentração do polí-

mero (A), tipo de extrato (B), concentração do extrato (C) e velocidade

de agitação da primeira emulsão (D)

EXP

Polímero

(mg)

Extrato

Concentração extrato (mL

ext. liof./mL água purif.)

Velocidade

(rpm)

100

1,0

9500

300

1,0

9500

100

1,0

9500

300

1,0

9500

100

4,0

9500

300

4,0

9500

100

4,0

9500

300

4,0

9500

100

1,0

17500

300

1,0

17500

100

1,0

17500

300

1,0

17500

100

4,0

17500

300

4,0

17500

100

4,0

17500

300

4,0

17500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

200

2,0

13500

Branca

300

Água

1,0

17500

Extrato M: macerado; extrato D: decocto

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 120

2.2.3. Rendimento

O rendimento foi calculado em relação à quantidade de polímero

e de extrato utilizadas no preparo das MCP, e o resultado é apresentado

em porcentagem.

Rendimento = (massa polímero + massa extrato) – massa MCP x

100/(massa polímero + massa extrato)

2.2.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

As formulações de micropartículas foram analisadas quanto à

formação, aparência e tamanho por MEV no Laboratório de Materiais

(LabMat) da UFSC. As amostras foram metalizadas com ouro e analisa-

das em aumentos de 25 a 400 vezes, em microscópio eletrônico de var-

redura Philips XL30.

2.2.4.1. Formação e aparência das micropartículas

Para a determinação da formação das partículas foi utilizada uma

escala na qual o grau 1 corresponde à quase inexistência de partículas

formadas e o grau 5 para formulações com grande número de partículas

e onde não se observam restos de polímero.

Da mesma forma, para a avaliação da aparência das micropartícu-

las foi definida uma escala de 1 a 5. O grau 1 foi atribuído para as for-

mulações cujas partículas apresentaram superfície extremamente porosa

e o grau 5 para as formulações nas quais a quase totalidade das partícu-

las apresentou superfície lisa.

2.2.4.2. Tamanho de partícula

As micropartículas foram medidas a partir das fotomicrografias,

utilizando-se o programa Size Meter desenvolvido por Luiz H. C. Carl-

son do Laboratório de Controle de Processos da UFSC

(UFSC/CTC/EQA).

2.2.5. Eficiência de encapsulação (EE)

A eficiência de encapsulação foi determinada utilizando-se a téc-

nica de espectroscopia no UV/Vis.

Curva analítica

Para a obtenção da curva analítica foi preparada uma solução-

mãe inicial de ácido cafeico pesando-se 50,0 mg em balão volumétrico

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 121

de 10,0 mL. Em seguida 3,0 mL de metanol foram adicionados e colo-

cados em banho de ultrassom para completa dissolução do ácido cafei-

co, sendo o volume completado com acetonitrila. Desta solução-mãe

foram preparadas soluções com as seguintes concentrações: 2,5; 5; 7,5;

10; 15 e 20 µg/mL utilizando-se acetonitrila como solvente. As soluções

foram lidas em espectrofotômetro UV/Vis a 328nm. Três soluções-mãe

foram preparadas, desta forma obtiveram-se 3 curvas padrão. Cada con-

centração de cada curva foi lida em triplicata.

As áreas foram representadas frente às concentrações para a cons-

trução das curvas de ácido cafeico. A equação da reta foi obtida por

regressão linear e o coeficiente de correlação calculado.

Preparo das amostras e determinação da EE

Cerca de 10,0 mg de micropartículas foram pesadas em duplicata

e dissolvidas em acetonitrila. O volume de acetonitrila adicionado foi

definido em função da quantidade de extrato contida na formulação.

Assim, as formulações que continham EM1 e ED1 receberam 1,0 mL;

as formulações contendo EM2 e ED2 ou EM4 e ED4 foram dissolvidas

em 2,0 mL ou 4,0 mL de acetonitrila, respectivamente. Procedeu-se,

então a medida da absorção das soluções em espectroscopia de UV/Vis

em 328 nm. Para o cálculo da eficiência de encapsulação procedeu-se a

correção em função da diluição. Para o branco utilizou-se micropartícu-

las brancas, dissolvidas em acetonitrila numa proporção 10:1 (mg:mL).

Os resultados foram expressos em termos de percentual de ácido

cafeico contido nas micropartículas em relação à quantidade de ácido

cafeico contida no extrato adicionado em cada formulação. Para deter-

minar a quantidade teórica de ácido cafeico, 100,0 µL de cada um dos

extratos (ED 9030 ou EM 8d20) foi dissolvido em 8,0 mL de acetonitri-

la e, a seguir, procedeu-se a medida da absorvância das soluções em 328

nm.

3. RESULTADOS e DISCUSSÃO

O método da dupla emulsão A/O/A consiste no método mais uti-

lizado para encapsulação de fármacos hidrofílicos (ERDEN, 1996; JA-

IN, 2000).

Para a encapsulação de fármacos com alta solubilidade em água,

a emulsificação em fase aquosa geralmente não obtém sucesso, levando

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 122

a baixas eficiências de encapsulação. Isso ocorre devido à rápida parti-

ção do fármaco hidrofílico da solução hidrofóbica que contém o políme-

ro, em direção à fase aquosa que circunda esta solução (ERDEN, 1996;

FREITAS, 2005; HASAN, 2007; ROSCA, 2004).

Vários são os fatores que afetam a formação das micropartículas,

sendo os mais conhecidos: natureza e solubilidade do fármaco a ser

encapsulado; concentração, composição e massa molecular do polímero;

razão fármaco/polímero; solvente orgânico utilizado; concentração e

natureza do emulsionante; temperatura e velocidade de agitação do pro-

cesso de emulsificação; as viscosidades e razão entre os volumes das

fases dispersa e contínua (JAIN, 2000).

Devido à influência de todos esses fatores, além do conhecimento

do problema de eficiência de encapsulação, se faz necessário um estudo

detalhado de formulação. Neste caso, o planejamento fatorial apresenta-

se como uma ferramenta bastante adequada, garantindo a formação das

micropartículas bem como o máximo de encapsulação do fármaco.

Os resultados obtidos para as micropartículas preparadas pela

técnica de dupla emulsão, com posterior extração/evaporação do solven-

te, são apresentados na tabela 27.

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 123

TABELA 27. Resultados da caracterização das micropartículas obtidas

usando o delineamento fatorial 2

EXP

Rendimento

(%)

Aparência

Formação

Tamanho partícu-

la (µm) ± DPR

(%)

33,62

77,03 ± 21,43

70,17

59,87

97,04 ± 31,54

69,89

60,05

63,34 ± 26,54

56,00

72,95

79,15 ± 14,46

62,59

65,59

72,05 ± 23,14

36,65

64,83

105,16 ± 20,62

45,61

79,32

68,93 ± 19,62

37,83

83,84

117,02 ± 23,15

50,11

44,23

78,24 ± 19,36

72,16

54,96

93,84 ± 28,52

65,67

40,93

78,44 ± 21,15

57,81

74,99

109,04 ± 23,47

53,59

66,14

89,35 ± 12,23

48,81

58,97

136,98 ± 14,77

44,85

80,81

103,13 ± 27,01

44,76

83,28

98,97 ± 25,89

50,75

55,09

111,07 ± 17,56

49,72

83,00

83,78 ± 18,34

53,31

60,18

110,52 ± 17,99

49,29

81,25

90,01 ± 16,13

54,96

50,89

94,05 ± 17,03

37,60

81,46

105,23 ± 16,65

54,12

46,16

91,96 ± 18,91

52,50

84,02

88,60 ± 17,06

56,92

Branca

74,29

76,86 ± 22,90

0,00

EE: Eficiência de encapsulação; DPR: Desvio padrão relativo

A tabela 28 apresenta os valores da análise de variância para to-

dos os fatores estudados, suas interações e outros parâmetros do modelo.

Como podem ser observados, todos os modelos são significativos para

os ensaios realizados. A curvatura é significativa (p < 0,05) para a for-

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 124

mação das MCP, sugerindo que o traçado tridimensional dessas respos-

tas é mais curvilíneo do que linear no espaço de desenho estudado. A-

lém disso, é possível observar que não há falta de ajuste (p > 0,05) de

nenhum dos modelos para as análises em questão.

TABELA 28. Análise de variância dos resultados da caracterização das

micropartículas obtidas usando o delineamento fatorial 2

(p  0,05)

Valor – p

ANOVA

Rendimento

Aparência

Forma-

ção

Tama-

nho

Modelo

< 0,0001

0,0049

0,0002

< 0,0001

0,0033

< 0,0001

0,0356

0,0002

< 0,0001

0,0237

0,7167

< 0,0001

0,0030

0,1455

0,0183

< 0,0001

0,0248

0,0356

0,0257

0,0028

0,0356

0,0248

0,0237

0,0356

Curvatura

0,1770

0,7805

0,0175

0,2991

0,2123

Lack of Fit

0,1333

0,1832

0,3418

0,3048

EE: Eficiência de encapsulação

Fator A: Quantidade de polímero (mg)

Fator B: Tipo de extrato

Fator C: Concentração do extrato

Fator D: Velocidade de agitação, 1° emulsão (rpm)

Lack of Fit: Falta de ajuste

3.1. Rendimento

O rendimento corresponde à relação entre massa total de políme-

ro e de extrato utilizadas para o preparo de cada uma das formulações e

a massa obtida de MCP, podendo assim sinalizar perdas durante o pro-

cesso de preparo.

Como podem ser observados na tabela 27, os valores de rendi-

mento obtidos para as formulações foram bastante heterogêneos, varian-

do entre 33 a 84 %. A análise da variância (tabela 28) demonstra que

estes resultados são influenciados principalmente pelas diferentes carac-

terísticas dos extratos obtidos pelos dois métodos de preparação (fator

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 125

B), pela interação entre a quantidade de polímero (fator A) e a concen-

tração do extrato (fator C). A figura 41 permite melhor visualização da

interação AC, onde as MCP que utilizaram a menor concentração de

EM (EM1) apresentam aumento do rendimento quando se aumenta a

concentração do polímero. Por outro lado, com concentrações de extrato

mais elevadas (EM4), não se observa alteração do rendimento, podendo-

se inferir que este depende exclusivamente da quantidade de polímero.

Figura 41. Gráfico de interação entre os fatores concentração de políme-

ro (A) e concentração de extrato (C) das MCP obtidas para a determina-

ção do rendimento, utilizando os EM. (■): EM1; (▲): EM4

Este mesmo perfil é observado para as MCP que contém os extra-

tos obtidos por decocção (fator B), apesar de o rendimento obtido ser de

maneira geral mais elevado para estas formulações.

A figura 42 apresenta os resultados de rendimento relacionando

todos os fatores envolvidos. Esses resultados são obtidos independentes

da velocidade de agitação durante a formação da primeira emulsão (fator

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 126

D) utilizada, conforme pode ser observado na tabela 28, onde o valor da

ANOVA para este fator não é significativo.

Figura 42. Representação em cubo da influência dos fatores concentra-

ção do polímero (A), tipo de extrato (B) e concentração do extrato (C)

sobre os resultados de rendimento das MCP

3.2. Formação

Para a avaliação da formação das partículas foi definida uma es-

cala, na qual o valor 1 indica um número baixo de partículas formadas,

aumentado gradativamente até atingir grau 5, onde todas as partículas

estariam formadas e íntegras, sem restos de polímero perceptíveis. A

figura 43 apresenta fotomicrografias de formulações classificadas como

grau 1 e grau 4. Como pode ser visualizado na tabela 27, a nenhuma das

formulações foi atribuído grau 5, uma vez que todas as formulações

apresentaram partículas rompidas, em maior ou menor grau. No entanto,

a primeira vista já é possível observar a influência das características de

cada extrato, diferentes em decorrência dos diferentes métodos utiliza-

dos em sua preparação, sobre a microencapsulação dos mesmos. Todas

as formulações que foram classificadas como de grau 4, com um grande

número de partículas formadas, contém o extrato EM 8d20, enquanto

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 127

que todas que receberam grau 1 contém o extrato ED 9030. Esse resul-

tado pode ser comprovado pela significância do fator B na tabela 28.

(A.1) (A.2)

(B.1) (B.2)

Figura 43. Microfotografias obtidas por MEV das micropartículas para

avaliação da (A) formação e da (B) aparência. (A.1) Formulação 7, grau

1; (A.2) Formulação 22, grau 4; (B.1) Formulação 1, grau 1; (B.2) For-

mulação 8, grau 5

A formação das partículas é influenciada ainda por duas intera-

ções importantes entre os fatores AC e CD. Na figura 44 pode-se obser-

var que, na medida em que se aumenta a velocidade de agitação, o au-

mento da concentração do polímero permite a melhor formação das

MCP com uma concentração mais baixa do extrato, não sendo importan-

te para a concentração mais alta do extrato, que já apresenta boa forma-

ção com a maior concentração de polímero.

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 128

Figura 44. Gráficos de interação entre os fatores concentração de polí-

mero (A), concentração de extrato (C) e velocidade de agitação da 1°

emulsão (D) para avaliação da formação das MCP, utilizando os EM.

(■): EM1; (▲): EM4. (a) influência dos fatores A e C quando o fator D

for igual a 9.500 rpm; (b) influência dos fatores A e C quando o fator D

for igual a 13.500 rpm e (c) influência dos fatores A e C quando o fator

D for igual a 17.500 rpm

3.3. Aparência

A aparência corresponde à avaliação visual da superfície das par-

tículas através das fotos obtidas por MEV. Da mesma forma que para a

formação das micropartículas, foi estabelecida uma escala de 1 a 5 para

classificação das formulações. A figura 43 mostra fotomicrografias de

formulações classificadas como grau 1 e como grau 5 no critério apa-

rência.

Na tabela 28 é possível verificar que a interação entre os fatores

A e D é significativa, assim como a influência do fator C. Conforme é

aumentada a concentração do polímero (fator A), melhora-se a aparência

das MCP obtidas, sendo esta influência mais significativa em velocida-

des mais elevadas (fator D). O aumento da concentração do extrato tam-

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 129

bém permite a melhora da aparência das mesmas, independente do tipo

de extrato utilizado (EM ou ED, fator B). A figura 45 permite a visuali-

zação da interação AD, sendo que o mesmo perfil foi observado para os

diferentes extratos.

Figura 45. Gráfico de interação entre os fatores concentração de políme-

ro (A) e velocidade de agitação da 1° emulsão (D) para avaliação da

aparência das MCP, utilizando os EM4. (■): velocidade de agitação

9.500 rpm; (▲): velocidade de agitação 17.500 rpm

3.4. Tamanho de partícula

Todas as formulações apresentaram diâmetro médio de partícula

entre 66 e 135 m. Considerando que estas formulações destinam-se à

administração oral, o intervalo de tamanhos pode ser considerado ade-

quado.

Na análise de variância dos resultados do tamanho de partícula,

de acordo com a tabela 28 não há nenhuma interação entre os fatores. A

quantidade de polímero, a quantidade de extrato e a velocidade de agita-

ção (fatores A, C e D, respectivamente) atuam de forma isolada, sem

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 130

influência do tipo de extrato (fator B), indicando que este não interfere

nos resultados de tamanho de partícula.

A figura 46 apresenta os resultados de tamanho de partícula. Os

fatores A, C e D, à medida que aumentam promovem o aumento do

tamanho das MCP. Desta forma obtém-se o maior tamanho de partículas

com a maior concentração do polímero, a maior concentração do extrato

e maior velocidade de agitação da 1° emulsão.

Figura 46. Representação em cubo da influência dos fatores concentra-

ção do polímero (A), concentração do extrato (C) e velocidade de agita-

ção da 1° emulsão (D) sobre os resultados de tamanho de MCP.

3.5. Eficiência de encapsulação

Várias metodologias têm sido descritas na literatura para a deter-

minação da eficiência de encapsulação em micropartículas. A mais utili-

zada tem sido baseada na CLAE. Considerando que o polímero Eudra-

git

RS100 é um polímero catiônico e da dificuldade em separá-lo do

meio onde foi dissolvido, neste trabalho foi feita a opção por utilizar a

técnica de espectrofotometria para esta determinação. O ACF foi utili-

zado como padrão por apresentar o máximo de absorção no comprimen-

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 131

to de onda da grande maioria dos compostos fenólicos, objetos desse

estudo. A figura 47 apresenta a curva analítica do ácido cafeico utilizada

para o cálculo da eficiência de encapsulação. A curva apresenta como

equação da reta, y = 0,0748x + 0,0024 e coeficiente de correlação, r =

0,9992.

Figura 47. Curva analítica média do ácido cafeico obtida por espectrofo-

tometria UV/Vis. Detecção: 328 nm. Coeficiente de correlação, 0,9992;

equação da reta: y = 0,0748x + 0,0024

O branco utilizado consistiu nas MCP brancas dissolvidas em a-

cetonitrila. O cálculo baseou-se, por conseguinte na diferença entre as

absorções obtidas da solução de MCP e o branco. Os resultados são

apresentados na tabela 27.

Através da análise de variância é possível observar a interação

dos fatores B e C nos resultados de eficiência de encapsulação. A figura

48 apresenta de que maneira ocorre esta interação. Para os EM quanto

maior a concentração do extrato, menor a eficiência de encapsulação. O

mesmo ocorre para os ED, com a diferença de que as MCP preparadas

com ED apresentam eficiências de encapsulação mais próximas. Ainda

é possível verificar que a concentração do polímero e a velocidade de

agitação da 1° emulsão não interferem nos resultados de EE.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 5 10 15 20 25

Absorvância (UA)

Concentração (µg/mL)

Curva Analítica -ACF

Capítulo 4 – Desenvolvimento - 132

Figura 48. Gráfico de interação entre os fatores tipo de extrato (B) e

concentração do extrato (C) para avaliação da eficiência de encapsula-

ção das MCP, utilizando os EM. (■): EM1; (▲): EM4

Conclusões

Conclusões - 134

 Os delineamentos elaborados para preparação e avaliação da

influência dos fatores de formulação sobre as características das solu-

ções extrativas obtidas por maceração e decocção foram adequados para

todas as análises realizadas;

 Um maior teor de fenólicos totais é obtido com a utilização da

maceração como método extrativo, sendo influenciado pelo teor de eta-

nol do líquido extrator. Nos ED, o aumento da temperatura e do tempo

promovem aumento deste teor;

 Durante a avaliação do teor do marcador químico por CLAE foi

identificada nos extratos obtidos por maceração a presença de ácido

cafeico, um ácido fenólico ainda não relatado para esta espécie na litera-

tura, passando a ser considerado como um segundo marcador químico;

 A metodologia por CLAE desenvolvida para o doseamento dos

marcadores químicos (ácido clorogênico e ácido cafeico) nas soluções

extrativas obtidas por maceração e por decocção foi validada de acordo

com ICH (2005) e BRASIL (2003), sendo capaz de separar e quantificar

simultaneamente os dois marcadores químicos;

 Os extratos obtidos por decocção a 80 °C por 20 minutos apre-

sentam os maiores teores de ACG. Nos EM a maior concentração foi

obtida no extrato 6d50;

 Os extratos obtidos por maceração com 20 % de etanol apresen-

tam os maiores teores de ACF, sendo estes inexpressivos nos ED;

 A ação do ACG na redução da glicemia mostrou-se dose-

dependente tanto em animais hiperglicêmicos quanto diabéticos, suge-

rindo-se uma ação secretagoga;

 Os extratos obtidos por maceração com 20 % de etanol apresenta-

ram ação na redução da glicemia em ratos hiperglicêmicos, não sendo

observada esta atividade em animais diabéticos. Este resultado indica

uma atividade anti-diabética nos extratos obtidos ainda não relatada para

a espécie. A associação do ácido clorogênico e do ácido cafeico apresen-

tou uma atividade semelhante aos EM obtidos com 20 % de etanol;

 Todos os extratos apresentaram uma atividade vasorrelaxante no

ensaio de reatividade vascular em aorta toráxica isolada em ratos, sendo

Conclusões - 135

os EM efetivos em uma concentração inferior aos ED. Porém todos os

extratos foram efetivos em concentrações inferiores às encontradas na

literatura para outras plantas, evidenciando uma atividade anti-

hipertensiva bastante interessante nos extratos brutos, em consonância

com resultados anteriores publicados para frações obtidas com solventes

orgânicos;

 Os delineamentos elaborados para avaliação da interferência da

temperatura e da presença de conservante no processo extrativo apresen-

tam modelos significativos para o doseamento de ACG e ACF;

 No delineamento que contempla a interferência da temperatura,

ocorre interação entre os fatores concentração de etanol e tempo e entre

concentração de etanol e temperatura, tanto no doseamento do ACG

quanto do ACF;

 No delineamento que contempla a interferência da presença de

conservante ocorre interação entre os fatores concentração de etanol e

tempo, tanto no doseamento do ACG como do ACF;

 No delineamento que contempla o estudo de formulação das mi-

cropartículas, o modelo é significativo para todos os ensaios realizados.

As MCP contendo ED apresentam melhor rendimento. As formulações

contendo EM resultam em micropartículas mais bem formadas. A me-

lhor aparência é conseguida com o aumento da concentração do políme-

ro e do extrato;

 O diâmetro médio das micropartículas variou entre 66 e 135 µm;

 A eficiência de encapsulação nas micropartículas variou de 35 –

72 %, sendo inversamente proporcional à concentração do extrato. A

eficiência de encapsulação pode ser considerada satisfatória consideran-

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Anexos / Apêndices

Anexos / Apêndices - 158

ANEXO 1. Laudo de identificação da matéria-prima vegetal Cecropia

glaziovii Sneth.

Anexos / Apêndices - 159

ANEXO 2. Protocolo PP 00085/CEUA

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Pró-Reitoria de Pesquisa

Comissão de Ética no Uso de Animais

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Ofício nº 021/03/CEUA/PRPe

Florianópolis, 19 de março de 2007.

Da: Presidente da Comissão de Ética no Uso de Animais-CEUA

Ao(à): Prof(a) Dr(a) Ângela Machado de Campos

Departamento de Ciências Farmacêuticas - CCS

Prezado(a) Professor(a),

Em relação ao protocolo de pesquisa sob sua responsabilidade,

cadastrado sob o número PP00085/CEUA e intitulado "Desenvolvimen-

to de sistemas poliméricos microestruturados de administração oral

contendo extrato otimizado de Cecropia glaziovii Sneth (embaúba) vi-

sando o tratamento do diabetes mellitus e da hipertensão arterial", a

Presidente da CEUA deliberou o seguinte:

Em reunião ordinária da CEUA realizada em 14/03/2007, APROVOU o

ad referendum do Protocolo PP00085, envolvendo o uso de 152 ratos

Wistar para o período de dois anos.

Por ocasião do término desse protocolo, DEVERÁ SER APRESENTA-

DO RELATÓRIO detalhado relacionando o uso de animais no Projeto

desenvolvido aos resultados obtidos, conforme formulário ON LINE

CEUA.

Atenciosamente,

Anexos / Apêndices - 160

ANEXO 3. Avaliação in vivo da atividade anti-diabética

Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos adultos entre 50–54 dias

de idade (180-250g), mantidos em gaiolas plásticas com alimento e água

à vontade até o início dos tratamentos. A temperatura da sala foi manti-

da entre 21 ± 2 ºC e com ciclo de 12 horas claro/12 horas escuro. Ani-

mais, descritos como “jejum” foram privados de comida por 16 horas,

mas com acesso livre à água. Os animais foram mantidos em concor-

dância com as recomendações do Conselho Brasileiro de Medicina Ve-

terinária e do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, Protocolo

PP 00085/CEUA.

Animais diabéticos induzidos com aloxana

O diabetes foi induzido através de uma única injeção intravenosa de

monohidrato de aloxano (Sigma) 5% em soro fisiológico, na dose de 50

mg/kg de peso corporal, em animais sob anestesia etérea. Esta solução

foi sempre preparada imediatamente antes do uso. Três dias depois,

foram coletadas amostras de sangue e os níveis de glicose foram deter-

minados para confirmar o desenvolvimento do diabetes. Foram conside-

rados diabéticos apenas ratos que apresentavam glicemia entre 350-450

mg/dL (DE SOUSA, 2004; CAZAROLLI, 2006). As coletas de sangue

foram realizadas nos tempos zero, 1, 2 e 3 horas, após o tratamento

para a determinação da glicemia.

Teste oral de tolerância à glicose

Ratos em jejum foram divididos em três grupos de cinco animais

cada. Grupo I, controle não tratado; Grupo II, hiperglicêmico, recebeu

somente glicose (4 g/kg de peso corporal); Grupo III, tratado, recebeu

glicose (4g/kg de peso corporal) juntamente com o extrato ou marcador

(es) químico (s). A sobrecarga de glicose e o tratamento foram adminis-

trados por gavage. As coletas de sangue foram realizadas nos tempos 0,

15, 30, 60 e 180 min. após o tratamento.

Coleta de sangue e determinação da glicemia

Todos os animais estavam em jejum de 16 h antes da coleta de sangue.

O sangue foi coletado por capilaridade pelo plexo retro-orbital em tubos

de eppendorf. As amostras foram centrifugadas e imediatamente o soro

foi separado. Alíquotas de 10 l do soro (em duplicata) foram utilizados

para dosar a glicose pelo método enzimático da glicose oxidase (GLI-

COSE PP da Gold Analisa Diagnóstica). As amostras foram incubadas

Anexos / Apêndices - 161

por 10 minutos à temperatura ambiente (25 ºC) e as absorvâncias foram

lidas em um espectrofotômetro da marca GBC Scientific Equipment Pty

LTDA, em 500 nm. Os resultados foram expressos em mg/dL de glico-

se. Todos os animais foram previamente anestesiados em câmera de éter

antes da coleta de sangue. Após o término do experimento, os mesmos

foram eutanasiados por decapitação em guilhotina e as carcaças foram

mantidas em refrigerador até o momento do descarte no lixo hospitalar.

Análise estatística

Os resultados foram expressos como a média  E.P.M. As com-

parações estatísticas foram realizadas através da análise de variância de

uma via (ANOVA) seguida pelo pós-teste de Bonferroni pelo programa

INSTAT versão 3.0. As diferenças encontradas foram consideradas

estatisticamente significativas para um “p” igual ou menor que 0,05.

Para a análise comparativa entre dois grupos foi utilizado o teste “t” de

Student.

ANEXO 4. Avaliação ex vivo da atividade anti-hipertensiva

Montagem das preparações isoladas de anel de aorta torácica de

rato

Os animais foram sacrificados por aprofundamento da anestesia

com quetamina e cloridrato de xilazina, seguido de exsanguinação feita

pela secção da artéria carótida. Após a abertura da cavidade torácica, a

aorta foi delicadamente removida e transferida para uma placa de Petri

contendo solução de Krebs-Henseleit, com a seguinte composição

(mM): NaCl 118; KCl 4,7; CaCl

2,5; MgSO

1,2; KH

0,9; NaH-

25; glicose 11, e retirou-se os tecidos adiposos e conectivos adja-

centes (ANDRIAMBELOSON, 1997).

O vaso foi seccionado na forma de anéis de 3 a 4 mm de compri-

mento, os quais foram transferidos para cubas de vidro com volume

total de 5 mL contendo solução de Krebs-Henseleit, mantida à 37C,

pH 7,4 e aerada com uma mistura de 95% de O

e 5% de CO

2 .

Duas

hastes metálicas foram inseridas na luz dos mesmos, sendo uma delas

adaptada a um transdutor de tensão isométrica acoplado a um sistema de

aquisição de dados SOFT & SOLUTIONS (KitCad 8). A tensão de re-

pouso das preparações correspondeu a 1,0 g e a solução nutriente foi

substituída a cada 15 minutos.

Anexos / Apêndices - 162

Após o período de equilíbrio (60 minutos) as preparações foram

contraídas com fenilefrina (1 M) e a presença do endotélio funcional

foi avaliada pela capacidade da acetilcolina (ACh, 1 M) induzir ao

relaxamento das preparações. Somente as preparações que apresentaram

relaxamento igual ou superior a 75% foram consideradas com endotélio

íntegro. Após a realização do teste da integridade do endotélio, as prepa-

rações foram lavadas com solução fisiológica e mantidas em repouso

por 30 minutos.

Caracterização do efeito vasorrelaxante dos extratos de Cecropia

glaziovii (2 de maceração e 2 de decocção)

Após os 30 minutos de repouso, foram realizadas Curvas Concen-

tração Resposta (CCR) cumulativas (0,1 - 100 g/mL) aos extratos, na

presença do endotélio, em anéis previamente contraídos com fenilefrina

(1 M).

Anexos / Apêndices - 163

APÊNDICE 1. Artigo submetido à revista Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis – Elsevier e cópia da confirmação de submis-

são do mesmo por parte da revista

TITLE: EXPERIMENTAL DESIGN AS A TOOL TO EVALUATE CHLOROGENIC AND CAFFEIC ACIDS EX-

TRACTED FROM CECROPIA GLAZIOVII SNETH.

Daniela P. Arend

1,3

Diva Sonaglio

1,3

Ana Lúcia Gomes Dos Santos

2,3

Flávio H. Reginatto

1,3

Angela M. de Campos*

Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal

de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, Brazil

Laboratório de Farmacognosia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis,

Brazil

Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia para Inovação Farmacêutica (INCT_if) do CNPq, Universidade Federal de

Pernambuco, Avenida Moraes Rego N° 1235, Cidade Universitária,CEP 50670-901. Recife - PE

Address to correspondence: Angela Machado de Campos, Laboratório de Farmacotécnica, Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Universitário, Trindade, Florianópolis, SC, Brazil, Postal

Code: 88040-900.

Phone: +55 (48) 3721 5067; e-mail: [email protected]

Fax: +55 (48) 3721 9350

ABSTRACT:

The effects of different parameters, including ethanol concentration, time of drug:solvent contact, temperature and the presence

of a preservative, on chlorogenic acid (CGA) and caffeic acid (CFA) yields in Cecropia glaziovii Sneth extracts were investi-

gated using an experimental design. In order to quantify the phenolic acids in these extracts a high-performance liquid

chromatography–diode array detection (HPLC–DAD) method was developed and validated. Extracts with 80% ethanol

presented a higher CGA content, but low amounts of CFA. Extracts with 20% ethanol showed a higher CFA concentration, but

a sharp reduction in CGA extraction yield. The presence of a preservative, under the same extraction conditions, resulted in a

slight difference or no difference in the CGA and CFA extraction yields. When the temperature was controlled at 4°C or 25°C,

a slight alteration in the concentrations of the phenolics studied was observed. The present approach can be applied in order to

determine the optimum conditions for the preparation of Cecropia glaziovii Sneth extracts based on CGA or CFA extraction

yield as a chemical marker.

KEYWORDS: Cecropia glaziovii; Chlorogenic acid; Caffeic acid; Validation; Stability; Factorial design.

1. INTRODUCTION

The analysis of plants and herbal formulations presents several problems arising from their complex nature and the inherent

variability of their constituents. Plants are complex mixtures of a variety chemicals, which poses a problem in terms of

standardization and quality control. However, this very fact is responsible for their feature of being therapeutically effective.

Consequently, the herbal drug preparation itself, as a whole, is regarded as the active substance. Hence, the extraction proce-

dure and the stability of the extract are important since they determine the quality and the yield of the individual constituents.

Also, the economical feasibility of an industrial process requires that it works in such a way that high efficiency values are

attained. Some factors can contribute to achieving this aim: (1) correctly choosing the raw materials to extract; (2) subjecting

these materials to appropriate pretreatment; and (3) optimizing the values of the variables which have a direct influence on the

process [1]. Cecropia species are extensively used in traditional medicine in Latin America as cardiotonic, diuretic, hypoten-

sive, and anti-inflammatory agents. Moreover chlorogenic acid (CGA), also found as a major compound in other plants, has

been related to the pharmacological properties of Cecropia sp. [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]. Although Cecropia glaziovii is

widely used in Brazilian folk medicine, there are no reports concerning the influence of its extraction conditions on the

phenolic acids content. In addition, little information is available on the quality evaluation and standardization methods for

both qualitative and quantitative determination of this component [12, 13, 14]. In addition, studies related to the intermediate

pharmaceutical products have been reported [15, 16, 17], and the results are not associated with the stability during the

extraction process. Extraction efficiency is commonly a function of the process conditions. Temperature, time of contact, and

plant:solvent ratio are some of the most important factors that influence the extraction efficacy in terms of quality and yield [1,

17, 18, 19, 20]. On the other hand, the role of each factor in the mass transfer of the process is not predictable since the

chemical characteristics of the solvent and the diverse structure and composition of the natural products lead to each material-

solvent system showing different behavior [1].

In the present study, a specific extraction condition allowed us to obtain caffeic acid (CFA), a substance not yet reported for

this species. Thus, we evaluated the extraction and stability of CGA and CFA during the extraction process using a 2

factorial

design. Ethanolic solvent concentration, extraction time and the use of temperature or a preservative were chosen as variables.

All data were obtained using a validated high performance liquid chromatography/diode array detection (HPLC/DAD) method

for analysis of the crude extract of Cecropia glaziovii Sneth leaves.

2. EXPERIMENTAL

Anexos / Apêndices - 164

2.1. Materials

2.1.1. Chemical reagents

Chemicals and reagents were obtained from the following commercial sources: chlorogenic acid and caffeic acid (Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO, USA), methanol and acetonitrile (HPLC grade) (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA), acetic acid

(Qhemis, São Paulo, Brazil), LC-grade water obtained with a Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA, USA), and Methylpa-

raben (DEG, São Paulo, Brazil). All samples and solutions were prepared from purified water. All other reagents and solvents

were analytical grade.

2.1.2. Raw Material Characterization. Plant material

Dried leaves of Cecropia glaziovii were obtained from the Pluridisciplinary Center of Chemical, Biological and Agronomic

Studies of the University of Campinas, SP, Brazil. The dry leaves were ground in a knife mill (Macmont) with a mesh of 3

mm. The ground material was submitted to a particle size distribution test, as described below.

2.2. Methods

2.2.1. Particle Size Distribution Test

Particle size distribution was evaluated by a standard sieving method, for a period of 15 minutes (Sieve shaker Bertel 1400),

with 30 g of the dried milled plant material, using a series of sieves with screen sizes corresponding to 180, 355, 500, 710,

1000 and 1700 μm. The average particle size was calculated by means of Probito’s evaluation [21, 22].

2.2.2. Preparation of Extracts

The extraction solutions (ES) were prepared by maceration at 5.0% (plant:solvent ratio; w/v) of crushed leaves (average

diameter 780 ± 410 µm). Three ethanol concentrations (20, 50, and 80%; v/v) and three extraction times (4, 6, and 8 days)

were evaluated. The extraction process was carried out at two different temperatures (4ºC ± 1 and 25ºC ± 2) and in the

presence or absence of the preservative (methylparaben, MP, 1.0 mg/mL). The design that evaluated the presence of the

preservative was carried out at 25°C ± 2. All extractions were prepared in duplicate in the dark.

2.2.3. Analytical procedures. Sample preparation

Three milliliters of the ES were diluted to ten milliliters with methanol:water solution (50:50; v/v). The samples were filtered

through a 0.45 µm HVLP membrane (Millipore).

2.3. Chromatography Conditions (HPLC)

The chromatographic analysis was performed on a Perkin-Elmer chromatograph equipped with a Series 200 auto sampler,

Series 200 binary pump, Series 200 UV-Vis detector or Series 200 EP Diode Array Detector and Series 200 vacuum degasser.

A Zorbax C HP C18 column (5 μm, 150 x 4.6 mm, Agilent Technologies) was used. The gradient elution consisted of acetoni-

trile (A) – 1.0% acetic acid (B) with a flow rate of 1 mL/min and was programmed as follows: 0 – 15 min, 87% B; 15 – 25

min, 87 – 60% B; 25 – 34 min, 60% B. Detection was at 330 nm. The mobile phase was prepared daily and degassed by

sonication before use. The injection volume was 20 μL. The data were gathered using TotalChrom® Workstation software. All

chromatographic analyses were performed in triplicate.

2.4. Quantitative analysis

The quantification of chemical markers, CGA and CFA, was carried out by comparison of their retention times and by co-

injection of standard solutions. Standard curves were plotted for chlorogenic (2.5 to 200 μg/mL) and caffeic (2.5 to 100

μg/mL) acids. The quantification of the individual compounds was performed using a validated regression curve (r

> 0.9999).

All standard solutions were analyzed in triplicate and the ES were analyzed in duplicate. The average areas of the peaks were

calculated.

2.5. Validation of analytical procedures

The parameters were validated according to International Conference on Harmonization (ICH) guidelines [23]. The linearity

was determined for the calibration curves obtained by HPLC determination of CGA and CFA and for the extraction solution

curves [8 days 20% ethanol (8d20), 6 days 50% ethanol (6d50) and 8 days 80% ethanol (8d80)]. The slope and the other

statistics of the calibration curves were calculated by linear regression. The detection limit (DL) and quantification limit (QL)

were based on the standard deviation (SD) and the slope (S) of the calibration curves [23]. The precision of the method was

determined as repeatability and intermediate precision. To evaluate repeatability, the percent relative standard deviation

(%RSD) of three concentrations of the curve (maximum, average and minimum), with each injection carried out three times,

was considered. The intermediate precision was evaluated in triplicate over 3 days. Accuracy was determined by recovery,

adding measured amounts of CGA and CFA to the extraction solutions. The recovery experiment was performed for one

concentration of each phenolic acid level (25.0 µg/mL) in three different extraction solutions (8d20, 6d50 and 8d80) injected in

triplicate. The recovery was determined by subtracting the values obtained for the control matrix preparation from those

obtained for the samples that were prepared with the standards added, divided by the amount added and then multiplied by 100

[23].

2.6. Experimental design

Two 18-run 2

full factorial designs were used to evaluate 2 numerical variables at 2 levels and a central point (levels -1, 0 and

+1): ethanol concentration (A) (20, 50 and 80 %) and extraction time (B) (4, 6 and 8 days). To each design a categorical

variable (C) related to the stability was introduced. One design evaluated the effect of temperature (4 and 25°C) and the other

of preservative (absence and presence), using -1 as a coded value for 4°C or absence of preservative and +1 for 25°C or

presence of preservative. Two replicates of all experiments and the center point (level 0, i.e. 50% and 6 days) were run for both

stability conditions. The different factor settings of the trials are shown in Table 1. All factor level combinations were carried

Anexos / Apêndices - 165

out in a randomized order. The results were evaluated with the program Design-Expert

, Version 7.1.6. (StatEase, Minneapo-

lis, MN, USA).

The effects were calculated presuming a linear model with interaction among the factors. The equation model was defined as:

Y = M + aA + bB + cC + abAB + acAC + bcBC + abcABC (1)

where Y is the model response, M is the mean value, A, B, C are the main factors (A = ethanol concentration; B = extraction

time; C = temperature or presence of a preservative), AB, AC, BC, and ABC are the binary and ternary interactions between

the factors, and a, b, c or ab, ac, bc, and abc are the coefficients of the main factors and interaction factors, respectively,

employing a probability error of p < 0.05. The equation terms were determined by reverse hierarchical regression analysis.

Analysis of variance (ANOVA) was performed to support the polynomial equations and to identify the significance of single

factors and their interactions.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Analytical method validation

Reversed-phase high performance liquid chromatographic (HPLC) was proposed as a suitable method for the simultaneous

determination of CGA and CFA in ES. The method developed was then validated in terms of accuracy, precision, linearity,

quantification limit and detection limit, in accordance with the ICH guidelines [23]. The nature of the sample determines which

parameters should be evaluated, especially when the samples are complex biologic matrices, as in the case of plant extraction

solutions [24]. Figure 1 shows a typical chromatogram for the ES. The retention times investigated (3.5 min for CGA and 6.0

min for CFA) showed a sharp and symmetrical peak, with good baseline resolution and minimal tailing, thus facilitating the

accurate measurement of peak area ratios.

3.1.1. Precision and accuracy

The precision and accuracy were determined by spiking the sample with a known quantity of the standard. The mean recovery

was calculated on one assay for each standard. Good accuracy was observed with satisfactory recovery in the range of 98.00 –

102.30% (Table 2). Measurement of intra- and inter-day variability was used to determine the precision of the newly devel-

oped method. The intra-day variation (repeatability) was determined by analyzing in triplicate the mixed standard solution

three times within 1 day. While, for the inter-day variability test (intermediate precision), the solution was examined in

triplicate on 3 separate days. The percentage relative standard deviation (% RSD) was taken as a measure of precision. The

results for the precision showed low values (less than 5.0%) for intra and inter-day % RSD as shown in Table 3.

3.1.2. Calibration curves, linearity and detection and quantification limits

The calibration curves were found to be linear over the range of 2.5 – 200 µg/mL for CGA and 2.5 – 100 µg/mL for CFA. The

ranges and correlation coefficients are given in Table 4. All calibration curves showed good linear regression in the range of r

= 0.999974 – 0.999990. The DL and QL values for CGA were found to be 0.3460 and 1.05µg/mL, and for CFA were 0.0732

and 0.22µg/mL, respectively (Table 4). In order to observe the presence of interference, extraction solution curves were used to

determine the amount of samples (8d20, 6d50 and 8d80) where linearity was found. The regression equations and the correla-

tion coefficients of the extraction solutions are shown in Table 5. Excellent linearity was obtained for both phenolic acids in

the extraction solution 8d20 and CFA in 6d50, demonstrated by the correlation coefficients of the curves. However, in the case

of 6d50 and 8d80, there was linearity deviation for the CGA curves with correlation coefficients of 0.9642 and 0.9229,

respectively (Table 5). On the other hand, for ES concentrations higher than 30% (6d50) and 22% (8d80), the correlation

coefficients were, respectively, 0.9917 and 0.9919 for CGA as shown in Table 6. In the case of CFA in 8d80 we could not

determine linearity. The reason for this result might be a combination of a low concentration of caffeic acid and a high

percentage of EtOH, changing the polarity of the sample.

3.2. Statistical analysis for stability study

Initially, CGA was chosen as the chemical marker because phenolic acid has been reported as the major compound in aqueous

and/or butanolic extracts of Cecropia species [6, 25, 26, 27, 28, 29]. However, in this study, mixtures of ethanol and water

were chosen as nontoxic and environmentally friendly solvents, which have been shown to be effective in the extraction of

polyphenolic compounds. Since the type and magnitude of the extraction variables can affect analyte recovery, a suitable

design (2

full factorial) design was used. The experimental parameters analyzed initially were ethanol concentration and time.

Surprisingly, in the 20% ethanolic extracts we observed a considerable amount of some other compound that was not detected

in the extracts with higher ethanolic concentrations. Later, we identified it from the DAD spectrum as being caffeic acid (Fig.

2), and confirmed this finding through it having the same retention time as the CFA standard solution. In addition, when

comparing CGA concentrations at 4d20 and 8d20 ES, a significant reduction in its yield from 4 to 8 days was observed. This

effect might be related to a chemical and/or enzymatic and microbiological degradation, considering that chlorogenic acid is an

ester of caffeic acid and quinic acid [30]. However, there are no reports of the degradation of CGA during the extraction

process. In order to investigate this possible degradation, the influence of temperature and the presence of a preservative on

CGA content in the extraction solutions were evaluated. For this, these two variables, each with two levels, were introduced

into the experimental design.

The experimental design allows the maximum amount of information to be obtained from the data collected in the smallest

number of experimental runs. The basic idea is to change all relevant factors simultaneously over a set of planned experiments

and then connect and interpret the results using mathematical models [31]. To provide a statistical verification of the response

curvatures, two center points were added to each design. Also, each experiment was repeated twice. This type of design was

used to provide additional degrees of freedom and to measure the experimental error [31]. The CGA and CFA content of the

18 runs of each experimental design are presented in Table 7. The experiments resulted in concentrations of CGA ranging from

62.76 to 173.59 µg/g and of CFA from 4.90 to 46.21 µg/g.

3.2.1. Influence of Extraction Temperature

Anexos / Apêndices - 166

The model chosen to analyze the factorial design was one with two-factor interactions (2FI), for both responses. In the case of

CFA, due to the considerable variation between the contents of the ES, a square-root transformation was required. The

adequacy of the model was verified by an F-test and the determination coefficient R

. The analysis of variance for the extrac-

tion temperature showed that this regression model was highly significant (p < 0.0001) for CGA and CFA responses (Table 8),

with values of 30.96 and 601.35, respectively. The R

values of 0.94 (CGA) and 0.997 (CFA) are in reasonable agreement with

the adjusted values Adj R

> 0.91 (CGA) and Adj R

> 0.99 (CFA). The lack-of-fit for two responses was not significant (p >

0.05) (Table 8), which implies adequacy of the model. Curvature was statistically significant for both CGA and CFA, suggest-

ing that three-dimensional plots for these responses are more curvilinear than linear in the design space.

Our results provide strong evidence of interaction between factors AB and AC for both CGA and CFA extraction yields (Table

8). This implies that, for a short extraction time (4 days) an increase in both the EtOH % and the temperature leads to an

increase in the CGA extraction yield (Figs. 3a and 3b), while with a long extraction time (8 days) with low EtOH % the CGA

extraction yield drops regardless of the temperature.

On the other hand, we observed an increase in the CFA content with lower EtOH % and at 8 days (Fig. 3c). Under these

conditions, a higher CFA extraction is obtained at 25ºC (Fig. 3d).

3.2.2. Influence of Extraction Preservative

In the same way as for the temperature design, the model chosen to analyze the factorial design had two-factor interactions

(2FI) for both responses. For CFA, also with a considerable variation in content, a transformation (Base 10 log) was required.

The ANOVA for the extraction preservative design indicates that the models for CGA and CFA responses are significant (p <

0.0001) (Table 8), with Model F-values of 74.79 and 636.56, respectively. The values of R

> 0.95 (CGA) and R

2 >

0.996

(CFA) were in reasonable agreement with Adj R

> 0.93 (CGA) and Adj R

> 0.99 (CFA). The lack-of-fit for two responses

was not statistically significant (p > 0.05), as observed in Table 8. Curvature was statistically significant for both CGA and

CFA.

The interaction between the factors A (EtOH %) and B (extraction time) are significant in terms of the CGA responses. The

behavior for CGA content for the AB interaction was the same as that in the previous temperature design. With an increase in

the EtOH % there was an increase in CGA concentration (fig. 4a). On the other hand with 20% ethanol after 8 days we

observed a decrease in the CGA content (Fig. 4a) as previously discussed. The C factor is not significant (Table 8), indicating

that the presence of a preservative does not modify the CGA concentration when compared to the ES without preservative

(Figs. 4a and 4b). This suggests that the decrease in CGA content in 8d20 when compared to 4d20 is not due to microbiologi-

cal degradation during the extraction period. For CFA content, the influence of both interactions AB and AC was observed.

Decreasing the EtOH % and increasing the extraction time, leads to an increase in the CFA concentration (Fig. 4c). For the AC

interaction a higher CFA extraction takes place at 20% EtOH in the absence of the preservative (Fig. 4c and 4d).

3.3. Optimization of extraction conditions

The final equations in terms of coded factors for CGA and CFA contents in the two experimental designs are:

Temperature CGA = 122.69 + 28.93 A - 8.69 B - 0.75 C + 8.69 AB + 6.37 AC (2)

Temperature Sqrt(CFA) = 4.00 - 1.64 A + 0.26 B + 0.32 C - 0.23 AB - 0.28 AC (3)

Preservative CGA = 119.97 + 33.14 A - 7.53 B + 10.08 AB (4)

Preservative Log

(CFA) = 1.14 - 0.39 A + 0.044 B - 0.032 C - 0.02 AB + 0.026 AC (5)

These equations allow us to establish excellent conditions of extraction for each one of the acids, or both. The mathematically

obtained conditions of extraction were applied and showed agreement with the theoretical data.

At this point the desired result must be clearly defined. Are we interested in obtaining an ES with a higher concentration of

CGA or of CFA? Alternatively, should both be maximized?

The optimization of the extraction conditions for the contents of CGA and CFA were determined as follows: on analyzing

Table 9 it can be noted that it would be impossible to obtain a maximum concentration of both phenolics in the same extract,

even if we give more importance to one than the other. If both are maximized having the same importance, the desirability is

0.541, but if CFA becomes the more important compound, even if both are maximized, we have an increased desirability of

0.696.

It is important to remember that the design space limits were the only ones used. In this way the extract that permits maximiza-

tion of only one phenolic acid has greater desirability but is also prepared under very different conditions. To obtain the

maximum of CGA, it will be necessary to use 80% ethanol for 4 days, with a desirability of 0.853. To obtain a maximum

concentration of CFA it will be necessary to use 20% ethanol for 8 days, with a desirability of 0.984 (table 9).

Table 10 shows predicted and experimental results for CGA and CFA for both conditions described above. We observed an

excellent reproducibility of the results ranging between 0.18 and 5.88%, suggesting good predictability of the established

model.

4. CONCLUSIONS

The extraction and HPLC-DAD methods described herein were applied to the determination of two phenolic acids extracted

from Cecropia glaziovii. An important result was the detection of CFA, considering that this compound has not yet been

reported for this species. The validated method is simple, selective, accurate, precise, specific and has the ability to separate

and quantify CGA and CFA from C. glaziovii hydroethanolic extraction solutions. These results are of great interest since

these phenolic acids show a broad spectrum of pharmacological activities and are widely distributed in nature. Therefore, the

developed method can give rational support to evaluating the extraction procedures of this and other medicinal plants, and

could also be used as a marker in studies for establishing dose-response relationships.

Anexos / Apêndices - 167

A statistical regression model allowed the determination of an optimized set of extraction conditions, in the design space

studied, in order to obtain a high quantity of CGA or CFA. The statistical model was experimentally validated, with the

variation observed between predicted and measured properties being below 6%.

In conclusion, it was verified that it is possible to obtain ES with high concentrations of CGA or CFA using specific extraction

conditions. Thus, it is necessary to clarify the intended use of the extracts obtained and the desired activity. In this regard, other

simultaneous biological and analytical assays are necessary in order to obtain better results.

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by grants from Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Santa Catarina (FAPESC – Grant

number 05798, edict 008/2006) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). The authors

also thank Felipe Augusto Tasca for collaboration with the graphical illustrations.

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Anexos / Apêndices - 168

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Table 1. Statistical experimental design for extraction temperature and preservative system

Temperature

Factor

Units

Low level

(-1)

Central level

(0)

High level

(+1)

EtOH (A)

% (v/v)

Time (B)

(t) days

Temperature (C)

(T) °C

4.0 ± 1.0

25.0 ± 2.0

Preservative

Factor

Units

Low level

(-1)

Central level

(0)

High level

(+1)

EtOH (A)

% (v/v)

Time (B)

(t) days

Preservative (C)

absence

presence

Anexos / Apêndices - 169

Table 2. Accuracy data for phenolic compounds

Extracts

Compound

Extract Concentration

Recovery

(µg/mL)

Mean (%)

RSD (%)

8d20

Chlorogenic Acid (25 μg/mL)

65.9

100.6

0.4

Caffeic Acid (25 μg/mL)

41.7

100.8

0.5

6d50

Chlorogenic Acid (25 μg/mL)

155.9

98.0

0.2

Caffeic Acid (25 μg/mL)

9.4

101.9

0.5

8d80

Chlorogenic Acid (25 μg/mL)

138.7

100.1

0.5

Caffeic Acid (25 μg/mL)

5.3

102.3

0.1

8d20 = extraction for 8 days with 20% ethanol; 6d50 = 6 days with 50% ethanol; 8d80 = 8 days with 80% ethanol

Recovery was determined by injection of spiked samples, in triplicate, with standard solutions

Table 3. Repeatability and intermediate precision data for phenolic standards

Compound

Repeatability

Intermediate precision

Concentration

RSD

Concentration

RSD

(µg/mL)

(%)

(µg/mL)

(%)

Chlorogenic Acid

2.5

0.2

50.0

0.6

0.4

200

0.2

Caffeic Acid

2.5

0.4

25.0

0.7

0.3

100

0.2

Limits: RSD < 5%

Table 4. Calibration data of phenolic standards

Compound

Linearity Range (µg/mL)

Calibration equation

Correlation coefficient (r

)

(µg/mL)

Chlorogenic Acid

2.5 - 200

y = 54291x - 16595

0.999990

1.05

0.3460

Caffeic Acid

2.5 - 100

y = 91599x - 6746,9

0.999974

0.22

0.0732

Chlorogenic Acid and Caffeic Acid (n = 3)

QL: quantification limit; DL: detection limit

Anexos / Apêndices - 170

Table 5. Linearity of extraction solutions

Range (%)

Regression equation

Correlation coefficient

CGA

CFA

CGA

CFA

CGA

CFA

8d20

5 – 100

11 - 100

y = 463264x + 3435.5

y = 513506x + 1591.4

0.9987

0.9996

6d50

2.5 – 100

30 - 100

y = 581907x + 575133

y = 82114x + 7757.6

0.9642

0.9992

8d80

1.75 – 100

y = 509377x + 574127

0.9229

NP: not possible to determine

Table 6. Linearity of extraction solutions with higher lowest concentration

Range (%)

Regression equation

Correlation coefficient

CGA

6d50

30 - 100

y = 450489x + 1406787.3

0.9917

8d80

22 - 100

y = 345590x + 1427156.3

0.9919

Anexos / Apêndices - 171

Table 7. CGA and CFA content in Cecropia glaziovii extraction solutions using two full factorial designs

STD

EtOH (%)

t (days)

Stability conditions

CGA (µg/g)

CFA (µg/g)

112.24

21.38

116.12

18.95

152.89

5.60

139.65

4.94

84.81

31.32

90.32

30.95

145.86

5.45

145.56

5.59

97.01

32.65

T10

119.15

34.64

T11

173.59

6.17

T12

140.35

4.90

T13

62.76

46.21

T14

67.62

42.79

T15

155.19

5.90

T16

159.86

6.12

T17

160.75

7.85

T18

165.09

10.07

MP1

absence

119.15

34.64

MP2

absence

97.01

32.65

MP3

absence

173.59

6.17

MP4

absence

139.86

4.90

MP5

absence

62.76

46.21

MP6

absence

67.62

42.79

MP7

absence

155.19

5.90

MP8

absence

159.86

6.12

MP9

presence

100.18

25.82

MP10

presence

101.45

24.81

MP11

presence

140.15

4.92

MP12

presence

148.64

5.53

MP13

presence

72.04

34.53

MP14

presence

74.45

34.49

MP15

presence

155.14

6.02

MP16

presence

152.43

5.93

MP17

absence

165.09

10.07

MP18

presence

166.51

10.34

T1 – T18: Temperature (°C); MP1 - MP18: Preservative

Anexos / Apêndices - 172

Table 8. Analysis of variance: Temperature and Preservative

p - Value

Source

Temperature

Preservative

CGA

CFA

CGA

CFA

Model

< 0.0001

0.0071

< 0.0001

0.0072

< 0.0001

0.7782

< 0.0001

---

0.0009

0.0071

< 0.0001

0.0009

0.0176

0.0330

< 0.0001

---

0.0038

Curvature

0.0014

< 0.0001

0.0002

Lack of Fit

0.5863

0.4923

0.7574

0.8580

0.9393

0.9967

0.9452

0.9969

Adj R

0.9090

0.9950

0.9326

0.9953

Pred R

N/A

0.9025

N/A

Adeq Precision

13.939

52.884

19.359

50.012

Table 9. Process optimization

Goal

Importance

Solution

EtOH

Time

Storage

CGA

CFA

Desirability

(%)

(days)

(°C)

(µg/g)

CGA

maximize

111.15

0.541

CFA

maximize

27.99

CGA

maximize

90.53

0.696

CFA

maximize

37.52

CGA

maximize

157.25

0.853

CFA

within range

5.58

CGA

within range

69.26

0.984

CFA

maximize

45.22

Table 10. Extraction process optimization and statistical model validation

Maximum CFA (µg/mL)

Predicted properties

Experimental properties

Deviation (%)

CGA (µg/g) within range

69.26

65.19

5.88

CFA (µg/g) maximum

45.22

44.50

1.18

Maximum CGA (µg/mL)

CGA (µg/g) maximum

157.25

156.97

0.18

CFA (µg/g) within range

5.58

5.54

0.72

Anexos / Apêndices - 173

Figure 1. Typical UV chromatogram of Cecropia glaziovii Sneth extraction solution. Recorded at 330 nm

Figure 2. (a) DAD chromatogram of Cecropia glaziovii Sneth extraction solution. (b) DAD spectrum and chemical structure of

Chlorogenic acid (CGA). (c) DAD spectrum and chemical structure of Caffeic acid (CFA).

Figure 3. Influence of extraction Temperature. (a) 4°C influence in CGA extraction. (b) 25°C influence in CGA extraction. (c)

4°C influence in CFA extraction. (d) 25°C influence in CFA extraction.

Figure 4. Influence of extraction Preservative. (a) Absence of preservative influence in CGA extraction. (b) Presence of

preservative influence in CGA extraction. (c) Absence of preservative influence in CFA extraction. (d) Presence of preserva-

tive in CFA extraction.

Anexos / Apêndices - 174

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TOOL TO EVALUATE CHLOROGENIC AND CAFFEIC ACIDS

FROM CECROPIA GLAZIOVII SNETH" has been received by the

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