( PDF ) Proteínas HMGB1 (High Mobility Group B1) de Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum: Estudos de interação e regulação conformacional do DNA

Download PDF

ads:

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

Proteínas HMGB1 (High Mobility Group B1) de Schistosoma mansoni

e Schistosoma japonicum: Estudos de interação e regulação

conformacional do DNA

Francisco Meirelles Bastos de Oliveira

Dissertação de Doutorado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química

Biológica, Instituto de Bioquímica Médica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários à

obtenção do título de Doutor em Química

Biológica.

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

Rio de Janeiro

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

DE OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos

Proteínas HMGB1 (High Mobility Group B1) de Schistosoma mansoni e

Schistosoma japonicum: Estudos de interação e regulação conformacional do DNA /

Francisco Meirelles Bastos de Oliveira. – 2007.

137f.: il.

Dissertação (Doutorado em Química Biológica) – Universidade Federal do Rio

de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, 2007.

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

1. High Mobility Group B1 (HMGB1). 2. Schistosoma mansoni. 3. Schistosoma

japonicum. 4. Regulação conformacional do DNA. – Teses

I. Fantappié, Marcelo Rosado (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica.

III. Título.

ads:

iii

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica e Biologia

Molecular do Schistosoma mansoni, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade

Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, sob orientação do Prof. Marcelo Rosado Fantappié, na

vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico (CNPq-PROFIX No. 540002/01-1 e Bolsa de Doutorado No.

141027/2004-5), UNDP/World Bank/World Health Organization/TDR e Coordenação

de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Bolsa PDEE No.

BEX0518/05-0).

Proteínas HMGB1 (High Mobility Group B1) de Schistosoma mansoni e Schistosoma

japonicum: Estudos de Interação e Regulação Conformacional do DNA

Francisco Meirelles Bastos de Oliveira

Orientador: Marcelo Rosado Fantappié

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica,

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.

Aprovada em Dezembro de 2007 por:

Orientador: Dr. MARCELO ROSADO FANTAPPIÉ

Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBqM/UFRJ

Dr. ALEXANDRE AFRÂNIO PEIXOTO

Pesquisador Titular do Instituto Oswaldo Cruz – IOC/FIOCRUZ

Dr. CARLOS AUGUSTO GOMES SOARES

Prof. Adjunto do Depto. de Genética, Instituto de Biologia da Universidade Federal do

Rio de Janeiro – IB/UFRJ

Dr. LUIS MAURICIO TRAMBAIOLI DA ROCHA E LIMA

Prof. Adjunto do Depto. de Medicamentos, Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio de Janeiro - UFRJ

Suplente externo: Dra. ANA LUCIA MORAES GIANNINI

Profa. Adjunta do Depto. de Genética, Instituto de Biologia da Universidade Federal do

Rio de Janeiro – IB/UFRJ

Revisor/Suplente interno: Dr. MARCUS FERNANDES DE OLIVEIRA

Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de

Janeiro – IBqM/UFRJ

AGRADECIMENTOS

Aos Drs. Marcelo Rosado Fantappié e Franklin David Rumjanek, sem distinções, pela

participação e orientação fundamentais na minha formação pessoal e científica e pela

paciência e companheirismo paternais dispensados ao longo dos últimos oito anos.

A minha família, pelo apoio incondicional independentemente das minhas escolhas.

A Simone Caldas e Luca Caldas Buonocore, por todo o carinho.

A Isabel Caetano de Abreu, pela ajuda, dedicação e maturidade demonstradas na

consolidação desse trabalho.

Aos Drs. Sérgio Verjovski-Almeida e Emmanuel Dias Neto, por terem gentilmente

cedido as sondas de DNA que possibilitaram o isolamento da SmHMGB1 e pela valiosa

contribuição na idetificação das isoformas SmHMGB2 e SmHMGB3.

Ao Dr. Michal Štros, pela atenção e contribuição minuciosa ao longo do

desenvolvimento e finalização do projeto envolvendo as proteínas HMGBs.

Ao Dr. Philip T. LoVerde, pelo reconhecimento ao meu trabalho e valiosa experiência

proporcionada ao longo de um interminável ano em seu laboratório, na Southwest

Foundation for Biomedical Research em San Antonio, Texas.

Ao Dr. Marcus Fernandes de Oliveira, pela atenção e tempo dispensados na revisão

dessa tese e pelas sugestões e questionamentos pertinentes que contribuiram de forma

decisiva para uma melhor interpretação dos resultados obtidos.

Aos diversos companheiros de pesquisa que, de uma forma ou de outra, contribuíram

para a feliz consolidação desse ciclo, em especial, aos amigos Daniel Rodrigues

Furtado, PhD; Paulo Roberto de Azevedo Castro, PhD; José João Mansure, PhD e

Ahmed Osman Egiza, PhD.

RESUMO

DE OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos. Proteínas HMGB1 (High Mobility Group

B1) de Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum: Estudos de interação e

regulação conformacional do DNA. Tese (Doutorado em Química Biológica) – Instituto

de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

Nesse trabalho foram clonados 2 diferentes cDNAs correspondentes às proteínas

HMGB1 de S. mansoni (SmHMGB1) e S. japonicum (SjHMGB1) e identificadas duas

isoformas homólogas à SmHMGB1, denominadas SmHMGB2 e SmHMGB3. Os genes

da SmHMGB1 e SjHMGB1 possuem três exons e dois introns, enquanto o gene da

proteína homóloga humana apresenta quatro exons e três introns. O alinhamento das

proteínas HMGBs de S. mansoni e S. japonicum com HMGB1 de outros organismos,

apresentou um alto grau de similaridade na porção que compreende os domínios box A

e box B (~60%). Em contrapartida, a região que compreende a extremidade carboxi-

terminal, apresentou uma baixa similaridade (~16%). Essa diferença parece ser

decorrente de uma tendência ao aumento do número de resíduos ácidos na extremidade

carboxi terminal das proteínas HMGB1 de acordo com o grau de complexidade dos

organismos analisados. Além da existência de uma única cópia do gene da HMGB1 no

genoma do S. mansoni foi demonstrado que a SmHMGB1 é constitutivamente expressa

em ambos os sexos dos estágios adulto e imaturo de desenvolvimento do parasito.

Estudos funcionais utilizando a proteína SmHMGB1 recombinante, demonstraram sua

capacidade de interagir com maior especificidade com moléculas de DNA que

apresentam estrutura superenovelada e estruturas planares cruciformes de DNA do tipo

“four-way-junction” (4WJ). Estudos comparativos demonstraram que, assim como a

proteína HMGB1 humana, a SmHMGB1, quando na presença de topoisomerase I, é

capaz de induzir o superenovelamento negativo de moléculas de DNA circular. Através

de ensaios de circularização de fragmentos lineares de DNA, foi demonstrada uma

maior eficiência da SmHMGB1 em relação a HMGB1 humana. Além disso, a ausência

da cauda ácida na SmHMGB1 acarreta em uma diminuição considerável na capacidade

de circularização em relação à proteína full length. Finalmente, ao contrário do que já

havia sido observado com a HMGB1 humana, foi demonstrado que a região que

compreende o domínio box A da SmHMGB1 não é capaz de promover a circularização

de moléculas de DNA. Considerando o envolvimento da proteína HMGB1 em eventos

biológicos de replicação, transcrição, recombinação e particularmente, na mediação de

respostas inflamatórias em células de mamíferos, estudos adicionais sobre as proteínas

HMGBs de

Schistosoma poderão trazer respostas capazes de elucidar aspectos

importantes relacionados à complexa biologia desse parasito.

vii

ABSTRACT

DE OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos. Schistosoma mansoni e Schistosoma

japonicum HMGB1 proteins (High Mobility Group B1): Studies of DNA interaction

and conformational regulation. Thesis (Doctorate in Biological Chemistry) – Instituto

de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.

This work describes the cloning of 2 different cDNAs corresponding to HMGB1

proteins from S. mansoni (SmHMGB1) and S. japonicum (SjHMGB1). We also

identified two isoforms from the homologous SmHMGB1. They were called

SmHMGB2 and SmHMGB3. The genes corresponding to SmHMGB1 and SjHMGB1

display 3 exons and 2 introns, while the homologous human gene displays 4 exons and

3 introns. Alignment of the HMGB proteins from S. mansoni and S. japonicum with

HMGB1 from other organisms, shows a high degree of similarity in the portion

comprising the A box and B box domains (~60%). In contrast, the region comprising

the C-terminal portion shows a low similarity (~16%). This difference seems to derive

from the tendency to increase the number of acid residues in the C-terminal portion of

HMGB1 proteins in proportion to the biological complexity of analyzed organisms. The

Schistosoma mansoni HMGB1 gene consists of a single copy and is constitutively

expressed in similar levels both in mature and immature male and female worms.

Functional studies using recombinant SmHMGB1 protein, had demonstrated its capacity

of interacting with high specificity supercoiled DNA and planar DNA “four-way-

junction” (4WJ) molecules. Comparative studies showed that, as well as human

HMGB1, the SmHMGB1, induces negative supercoiling of circular DNA molecules in

the presence of topoisomerase I. SmHMGB1 displays higher efficiency in promoting

mini circles formation comparing to the human HMGB1. Moreover, the absence of the

acidic tail in the SmHMGB1 causes a considerable reduction in the capacity of

circularization compared with the wild type protein. Finally, we demonstrate that the A

box domain from the SmHMGB1 is not able to promote the circularization of linear

DNA fragments. Considering the important role of HMGB1 in DNA replication,

transcription, recombination, and in particularly, the mediation of inflammation

responses in mammalian cells, further studies on schistosome HMGB proteins may

provide valuable information related to the complex biology of the parasite.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Micrografia eletrônica de varredura de um casal de vermes adultos de S.

mansoni........................................................................................................................ 16

Figura 2 – Principais estágios de desenvolvimento do Schistosoma.......................... 18

Figura 3 – A patologia da esquistossomose ............................................................... 20

Figura 4 – Distribuição global da esquistossomose ................................................... 21

Figura 5 – O impacto associado a infecções em populações de áreas rurais de baixa

renda ............................................................................................................................ 24

Figura 6 – Modelagem estrutural das histonas nucleossomais e nucleossomo.......... 28

Figura 7 – Estrutura da cromatina não compactada ................................................... 29

Figura 8 – Modelo Zig-Zag de compactação e organização dos nucleossomos ........ 30

Figura 9 – Topologias equivalentes assumidas pelo DNA superenovelado............... 33

Figura 10 – Topologias não-equivalentes assumidas pelo DNA superenovelado ..... 34

Figura 11 – Superenovelamento positivo e negativo ................................................. 35

Figura 12 – Regulação da interação entre fatores transcricionais mediante alterações

conformacionais do DNA............................................................................................ 39

Figura 13 – Esquema estrutural modular das HMGs ................................................. 41

Figura 14 – Regulação da estrutura do DNA nucleossomal pelas HMGs ................. 42

Figura 15 – Modelagem estrutural dos domínios box A e box B da proteína HMGB1

humana..........................................................................................................................44

Figura 16 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da

SmHMGB1 .................................................................................................................. 67

Figura 17 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da

SjHMGB1 .................................................................................................................... 69

Figura 18 – Alinhamento das seqüências deduzidas de resíduos de aminoácido das

proteínas HMGB1 de S. mansoni/S. japonicum e HMGB2 e HMGB3 de S. mansoni

com as seqüências de resíduos de aminoácido das HMGB1s de outros organismos.. 70

Figura 19 – Comparação da composição de resíduos de aminoácidos na região que

compreende a cauda ácida nas proteínas HMGB1 de S. mansoni/S. japonicum e

HMGB2 e HMGB3 de S. mansoni com a composição de resíduos de aminoácido das

HMGB1s de outras espécies........................................................................................ 72

Figura 20 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da

SmHMGB2 .................................................................................................................. 74

Figura 21 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da

SmHMGB3 .................................................................................................................. 76

Figura 22 – Análise da expressão gênica da SmHMGB1 por Northern Blot ............. 77

Figura 23 – Southern Blot da SmHMGB1 .................................................................. 78

Figura 24 – Amplificação dos cDNAs e genes das HMGB1s de S. mansoni e S.

japonicum .................................................................................................................... 79

Figura 25 – Esquema comparativo entre a estrutura do gene SmHMGB1 e gene

HMGB1 humano.......................................................................................................... 80

Figura 26 – Purificação das proteínas Sm/SjHMGB1 recombinantes e seus diferentes

domínios ...................................................................................................................... 82

Figura 27 – Interação da SmHMGB1 com DNA 4WJ ............................................... 84

Figura 28 – Interação da SmHMGB1 com DNAs de diferentes topologias............... 85

Figura 29 – Superenovelamento de DNA plasmidial relaxado induzido pela

SmHMGB1 .................................................................................................................. 86

Figura 30 – Determinação e comparação do “tipo” de superenovelamento induzido

pelas Sm/SjHMGB1 em relação a HMGB1 humana................................................... 87

Figura 31 – Determinação e comparação da atividade de circularização de DNA

induzido pela SmHMGB1 em relação a HMGB1 humana.......................................... 89

Figura 32 – Modelagem molecular do DNA do tipo Four-Way-Junctions (4WJs)... 97

Figura 33 – Modelo de topologia assumida pelo DNA nos sítios de iniciação de

transcrição gênica em eucariotos................................................................................. 99

Figura 34 – Experimento de microscopia eletrônica demonstrando a formação de

complexos entre o domínio box B da proteína HMGB1 humana e o DNA...............102

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Sítios convergentes doadores e aceptores de splice..................................81

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C – grau Celsius

µCi – microcurrie (s)

µg – micrograma (s)

µl – microlitro (s)

µM - micromolar

Ǻ – angstrom (s)

ATP – adenosina tri-fosfato

BLASTN – Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide

pb – pares de base

cDNA – DNA complementar

cm – centímetro (s)

dCTP – desoxicitidina-trifosfato

DEPC – dietilpirocarbonato

DNA – ácido desoxirribonucléico

DTT – ditiotreitol

EDTA – ácido etileno diamino tetra-acético

EST – Expressed Sequence Tags

g – grama (s)

X g – gravidade

GAPDH – gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GST – glutationa S-transferase

h – hora (s)

hHMGB – Human High Mobility Group Box

IL – Interleucina

IPTG – Isopropil-tio-ß-D-galactosideo

Kd – constante de dissociação

kDa – quilodalton (s)

LB – Luria Bertani

LEF-1 – Lymphoid enhancer-binding factor

Lk – linking number

M – molar

xii

mg – miligrama 9s)

min – minuto (s)

MIP-1α. – Macrophage infectivity potentiator 1α.

ml – mililitro (s)

mm – milímetro (s)

mM – milimolar

mRNA – RNA menssageiro

nM – nanomolar

– número

N-terminais – amino terminais

O.D. – optical deviation

ORF – Open Reading Frame

PCR – Polymerase Chain Reaction

RMN – ressonância magnética nuclear

RNA – ácido ribonucléico

rpm – rotações por minuto

RT-PCR – Reverse Translation Polymerase Chain Reaction

SDS – dodecil sulfato de sódio

SREBP – Sterol Regulatory Element Binding Protein

SSC – Standard Saline Citrate

TBE – tampão tris-borato-EDTA

TBP – TATA-binding protein

TFIIH – General transcription factor IIH

TGF-ß – Transforming Growth Factor ß

TNFα – Tumor Necrosis Factor α

TIGR – The Institute for Genome Research

Tris – 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

U – unidade (s)

UV – ultravioleta

V – volt (s)

V – volume (s)

X – vez concentrado

WHO – World Health Organization

L – litro (s)

xiii

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS.................................................................................................v

RESUMO.....................................................................................................................vi

ABSTRACT................................................................................................................vii

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................viii

LISTA DE TABELAS..................................................................................................x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................................................xi

SUMÁRIO.................................................................................................................xiii

1. INTRODUÇÃO .....................................................................................................16

1.1 - A Esquistossomose ........................................................................................16

1.1.1 – O Ciclo de Vida do Parasito e a Patologia da Doença............................. 17

1.1.2 – Agentes Etiológicos e Distribuição Geográfica....................................... 21

1.1.3 – Epidemiologia e Controle........................................................................ 22

1.2 – Regulação da Expressão Gênica..................................................................27

1.2.1 – Estrutura e Função do Genoma Eucariótico............................................ 27

1.2.2 – Estrutura e Função do DNA Superenovelado.......................................... 32

1.2.3 – Estrutura e Função do Bending DNA....................................................... 37

1.3 - Proteínas do Tipo High Mobility Group (HMG) .......................................40

1.3.1 – Proteínas High Mobility Group B (HMGB) ............................................ 45

1.3.2 – HMGs: Modulação Específica ou Constitutiva? ..................................... 47

2. OBJETIVOS..........................................................................................................49

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...............................................................................50

4. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................51

4.1 - Isolamento dos cDNAs e Genes da SmHMGB1 e SjHMGB1 ...................51

4.2 – Sequenciamento e Análise das Seqüências.................................................53

4.3 – Marcação Radioativa de Sondas de DNA ..................................................54

4.4 – Manutenção do Ciclo de Vida do S. mansoni e Obtenção de

Vermes Adultos por Perfusão...............................................................................54

4.5 – Infecções Unissexuais de S. mansoni...........................................................55

4.6 – Extração de DNA Genômico........................................................................55

xiv

4.7 – Extração de RNA Total................................................................................56

4.8 – Síntese de cDNA............................................................................................56

4.9 – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)....................................................57

4.10 – Southern Blot..............................................................................................57

4.11 – Northern Blot..............................................................................................58

4.12 – Construção dos Plasmídeos para Expressão de Proteínas

Recombinantes.......................................................................................................59

4.13 – Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes............................60

4.14 – Purificação de DNA Superenovelado Através de Gradiente em CsCl ..61

4.15 – Ensaio de Retardamento da Mobilidade Eletroforética em Gel de

Agarose Utilizando DNA Superenovelado ..........................................................62

4.16 – Ensaio de Retardamento da Mobilidade Eletroforética em

Gel de Poliacrilamida Utilizando DNA do Tipo Four-Way-Junctions (4WJs) 63

4.17 – Ensaio de Superenovelamento de DNA....................................................63

4.18 – Ensaio de Sign para Determinação do Tipo de

Superenovelamento Induzido pela Sm/SjHMGB1 .............................................64

4.19 – Ensaio de Circularização Mediado por T4 Ligase ..................................65

5. RESULTADOS......................................................................................................66

5.1 – Identificação e Isolamento dos cDNAs da HMGB1 de S. mansoni

e S. japonicum (SmHMGB1 e SjHMGB1)...........................................................66

5.2 – Homologia das Sm/SjHMGB1 com Proteínas HMGB1 de Outras

Espécies...................................................................................................................69

5.3 – Identificação dos cDNAs e Comparação das Seqüências das

Isoformas SmHMGB2 e SmHMGB3 com a SmHMGB1...................................72

5.4 – Análise da Expressão Gênica do gene SmHMGB1 em Vermes

Adultos e Imaturos, Machos e Fêmeas................................................................76

5.5 – Análise do Número de Cópias do Gene SmHMGB1 por Southern Blot..77

5.6 – Isolamento por PCR e Comparação do Mapa Estrutural dos

Genes SmHMGB1 e SjHMGB1 com o Gene HMGB1 Humano.........................79

5.7 – Purificação das Proteínas Recombinantes Sm/SjHMGB1........................81

5.8 – SmHMGB1 Interage com DNA Sintético do Tipo

Four-Way-Junctions (4WJs).................................................................................83

5.9 – SmHMGB1 Interage com DNA Superenovelado Circular.......................84

5.10 – Sm/SjHMGB1 Induzem o Superenovelamento Negativo do DNA

Plasmidial Relaxado na Presença da Topoisomerase I......................................85

5.11 – SmHMGB1 Induz a Circularização de Fragmentos de DNA Linear

de 123 e 66 pb........................................................................................................88

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................90

7. CONCLUSÕES....................................................................................................106

REFERÊNCIAS ......................................................................................................110

ANEXO I – TRABALHO RELACIONADO À TESE PUBLICADO EM

PERIÓDICO DE CIRCULAÇÃO INTERNACIONAL - Cloning the

genes and DNA binding properties of High Mobility Group B1 (HMGB1)

proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni and Schistosoma

japonicum. Gene, v. 377, p. 33-45, Mar. 3, 2006....................................................123

ANEXO II - Currículum Vitae................................................................................137

1. INTRODUÇÃO

1.1 - A Esquistossomose

A esquistossomose também conhecida como Bilharzíase é uma doença

parasitária tropical causada pela infecção de um verme trematódeo pertencente ao

gênero Schistosoma.

Vermes adultos do gênero Schistosoma são brancos ou acinzentados,

apresentando um corpo cilíndrico de aproximadamente 7-20 mm de comprimento

com duas ventosas terminais, tegumento, trato digestivo cego, e órgãos reprodutores.

A. B.

Figura 1 - Micrografia eletrônica de varredura de um casal de vermes adultos de S. mansoni

(A) Casal em cópula com a fêmea alojada no canal ginecóforo do macho. Adaptado de

http://www.nhm.ac.uk/research-curation/projects/schistosomes/>. Acesso em Fev., de 2007. (B)

Detalhe da ventosa bucal que auxilia em sua fixação. Adaptado de

http://visualsonline.cancer.gov/details.cfm?imageid=1762>. Acesso em Mar., 2007.

Ao contrário dos outros trematódeos, o gênero Schistosoma é dióico, exibindo sexos

separados. O corpo do verme macho apresenta uma invaginação longitudinal

denominada “canal ginecóforo” no qual a fêmea, de corpo mais estreito, permanece

alojada (Figura 1).

1.1.1 – O Ciclo de Vida do Parasito e a Patologia da Doença

As fêmeas adultas produzem de centenas (no caso das espécies africanas) a

milhares (no caso de outras espécies) de ovos por dia. Esse ovos atingem a corrente

sanguínea do hospedeiro vertebrado depositando-se em diversos órgãos,

principalmente na parede dos intestinos, baço e fígado. Cada ovo (Figura 2 A) contém

uma larva ciliada denominada miracídio (Figura 2 B) que, acredita-se, secretam

enzimas proteolíticas que ajudam na migração dos ovos para a luz da bexiga (S.

heamatobium) ou do intestino (outras espécies). Os ovos são excretados junto com a

urina ou fezes do hospedeiro vertebrado (dependendo da espécie) permanecendo

viáveis por até sete dias. Em contato com a água, os ovos eclodem e liberam os

miracídios que, em função de estímulos químicos e luminosos, deslocam-se através de

batimentos ciliares a procura de seus hospedeiros intermediários, os caramujos de

água doce. Após penetrar o caramujo, o miracídio multiplica-se assexuadamente e se

diferencia em esporocistos multicelulares que, por sua vez, vão originar a segunda

forma larval da esquistossomose, as cercária (Figura 2 C). Nesta fase de reprodução,

cada miracídio é capaz de produzir aproximadamente três mil cercárias.

As cercárias começam a ser liberadas pelos caramujos quatro a seis semanas

após a infecção. Nessa ocasião, passam a ser capazes de se deslocar na água doce

através de batimentos caudais circulares à procura de seu hospedeiro definitivo. A

liberação das cercárias é condicionada a estímulos luminosos ocorrendo,

principalmente, durante o dia.

Ao encontrar seu hospedeiro definitivo a cercária libera enzimas proteolíticas

armazenadas em glândulas acetabulares e que facilitam sua penetração através da pele

do hospedeiro vertebrado. Durante o processo de penetração, as cercárias perdem sua

cauda e o glicocálice e passam a ser denominadas esquistossômulos (Figura 2 D). Os

esquistossômulos atingem a circulação linfática ou sanguínea do hospedeiro e

migram, via pulmões, para o sistema porta-hepático transformando-se em vermes.

B. D.

Figura 2 - Principais estágios de desenvolvimento do Schistosoma

(A) Da esquerda para a direita, respectivamente, ovos de S. mansoni, S. haematobium e S. japonicum.

Adaptado de: GRYSEELS, 2006, p. 1111. (B) Micrografia eletrônica de varredura de um miracídio

recém saído de um ovo. Retirado de

http://www.path.cam.ac.uk/~schisto/SchistoLife/Miracidium.html>. Acesso em Mar., 2007. (C)

Microscopia de uma cercária. Retirado de

http://www.bact.wisc.edu/foodsafety/parasite/schisto.html.> Acesso em Mar., 2007. (D) Microscopia

de fluorescência de um esquistossômulo. Retirado de

http://www.path.cam.ac.uk/~schisto/SchistoLife/Schistosomule.html>. Acesso em Mar., 2007.

Finalmente, entre o 23º e 35º dia pós-infecção, ocorre o pareamento entre

machos e fêmeas, que a partir daí, passam a conviver em cópula constante. Uma vez

pareados, os vermes migram para os plexos venosos da bexiga, próstata e útero (S.

haematobium) ou veias mesentéricas (demais espécies) produzindo ovos que, ao

serem excretados juntamente com as fezes, reiniciam o ciclo de infecção

(GRYSEELS, 2006).

Nem todos os ovos de Schistosoma são eliminados. Até metade deles pode ser

direcionada para outras áreas do organismo como fígado, pulmões, sistema nervoso

central e rins.

A patologia da esquistossomose não está relacionada diretamente com a

presença do parasito, mas sim, com a deposição de seus ovos nos tecidos dos

hospedeiros vertebrados. Esses ovos secretam substâncias que provocam reações

inflamatórias eosinofílicas e granulomatosas e que são progressivamente substituídas

por depósitos fibrosos (Figura 3 A e B). Os doentes crônicos, nos quais ocorre uma

obstrução por fibrose do sistema porta-hepático, podem desenvolver

hepatoesplenomegalia, lesões vasculares, hipertensão do sistema porta e ascite, que é

o acúmulo de líquido no abdômen, razão pela qual a doença também é conhecida

como “barriga d’água” (Figura 3 C). Em casos extremos, a hipertensão pode até

mesmo matar o hospedeiro em decorrência do sangramento de varizes gastresofágicas

que se formam para compensar a circulação intra-hepática comprometida

(CHEEVER, 2000). No caso de infecção crônica por S. haematobium, a ulceração das

paredes uretrais pode levar à hematúria (GRYSEELS, 1989) (Figura 3 D).

Figura 3 – A patologia da esquistossomose

(A) Granulôma agudo ao redor de um ovo de S. mansoni em um fígado de camundongo infectado

experimentalmente. Na reação podem ser observados muitos eosinófilos e linfócitos além de alguns

macrófagos e hepatócitos ainda intactos (cor avermelhada). (B) Granulôma crônico ao redor dos restos

de ovo de S. mansoni em um fígado de camundongo com um tecido fibroso dominante (cor azulada).

retardamento no crescimento é possível notar outras anomalias físicas decorrentes da

hepatoesplenomegalia e ascite. (D) Hematúria devido a ulcerações na bexiga decorrentes da

esquistossomose urinária. Adaptado de: GRYSEELS, 2006, pág. 1110.

A média de vida de um verme adulto é de aproximadamente três a cinco anos,

mas em alguns casos, podem alcançar até 30 anos, sendo que a capacidade

reprodutiva teórica de um par de vermes adultos ao longo de sua vida pode chegar a

mais de 600 bilhões de indivíduos (GRYSEELS, 2006).

1.1.2 – Agentes Etiológicos e Distribuição Geográfica

As principais espécies de Schistosoma capazes de infectar os humanos são: S.

mansoni, transmitido por caramujos do gênero Biomphalaria e causador da

esquistossomose hepática e intestinal na África, Península Arábica, América do Sul e

Caribe; S. haematobium, transmitido por caramujos do gênero Bulinus e causador da

esquistossomose urinária na áfrica e península arábica; e o S. japonicum, transmitido

por caramujos anfíbios do gênero Oncomelania e causador da esquistossomose na

China, Filipinas e Indonésia.

Figura 4 - Distribuição global da esquistossomose

Regiões em verde correspondem aos 74 países onde a doença é endêmica. Adaptado de:

http://www.who.int/tdr/diseases/schisto/default.htm>. Acesso em Nov., 2007

O S. intercalatum e S. mekongi são transmitidos respectivamente, pelos

caramujos Bulinus e Neotricula e são causadores da esquistossomose

respectivamente, na África Ocidental e na Ásia, somente nos arredores do rio

Mekong. Essas duas últimas espécies são menos disseminadas apresentando

importâncias locais em suas áreas endêmicas (Figura 4).

A distribuição das diferentes espécies depende, em grande parte, da ecologia

de seus hospedeiros intermediários. Ambientes de água doce como lagos, córregos e

rios são as principais vias de infecção, mas ao longo das últimas décadas,

reservatórios de água e sistemas de irrigação têm contribuído para a disseminação da

esquistossomose. A disseminação da doença ocorre, principalmente, em áreas rurais,

mas focos urbanos já podem ser encontrados em muitas das áreas endêmicas (MOTT,

1990).

A população de caramujos, densidade de cercárias liberadas e os padrões de

contato humano com a água infectada apresentam uma forte variação temporal e

espacial, resultando em distribuições específicas da infecção ao longo das áreas

endêmicas (GRYSEELS, 1988).

1.1.3 – Epidemiologia e Controle

Desde o final dos anos 80, quando a comunidade internacional de pesquisa re-

estabeleceu prioridades no ônus relativo às doenças parasitárias, a esquistossomose

começou a perder importância na agenda global de saúde. Comparada a tratamentos

preventivos de doenças consideradas mais letais como malária, AIDS e tuberculose, o

controle da esquistossomose vem deixando de ser prioridade, apesar das 200-300

milhões de pessoas infectadas e com possibilidades de virem a vivenciar episódios

recorrentes da infecção (CHITSULO, 2000).

Apesar da prevalência da esquistossomose, as mortes associadas ainda são

consideradas baixas, gerando um grande debate a respeito da aplicação de

investimentos para o combate à doença. Essa discussão vem sendo revivida diante da

necessidade de renovação, priorização e alocação de recursos perante estimativas

mundiais precisas que levem em conta a mortalidade e deficiência resultante de cada

tipo de doença. Para isso, foi desenvolvido pela WHO/World Bank Global Burden of

Disease Initiative uma lista para combate prioritário de doenças baseado, dentre

outros, em um índice denominado Disability-Adjusted Life Years (DALY) (LOPEZ,

2006a; LOPEZ, 2006b). O DALY é calculado a partir da prevalência, mortalidade e

incapacidade decorrentes da doença, sendo que o estudo do ônus global para a

esquistossomose atribui, atualmente, um valor relativamente baixo e uma mortalidade

de 14.000 indivíduos por ano. Hoje, a esquistossomose representa 0.1% do ônus

global mundial por doenças equiparando-se, portanto, a doenças como Leishmaniose

e Tripanossomíase (KING, 2005; VAN DER WERF, 2003).

Levando-se em conta a limitação de dados regionais utilizados na obtenção

dos valores vigentes de DALY, um dos principais pontos na discussão a respeito do

ônus global da esquistossomose, sugere novas formas de estudos para a validação dos

índices atuais (HAGAN, 2004; KING, 2006).

Qualquer déficit de desempenho associado a doenças desencadeia impactos

relevantes nas atividades diárias de um indivíduo. Em áreas endêmicas, a

incapacidade média decorrente da infecção por esquistossomose tem sido ignorada e

considerada pouco importante. Mas levando-se em conta o cenário dessas populações

onde uma família precisa investir totalmente seu capital físico e humano para garantir

sua sobrevivência anual, mesmo um baixo valor de 2-3% para a incapacidade

associada a infecções parasitárias crônicas

(GUYATT, 2000) pode tornar-se

extremamente relevante para a sustentabilidade dessas populações (Figura 5).

Figura 5 - O impacto associado a infecções em populações de áreas rurais de baixa renda

Em economias de subsistência, famílias devem investir anualmente todo o seu capital físico e humano a

fim de obter, na média, um retorno de investimentos que possibilite sua sustentabilidade (linha média

de quadrados vermelhos). Nessas áreas, doenças infecciosas crônicas são comuns, gerando déficits

físicos e econômicos capazes de serem medidos em calorias produzidas e/ou dinheiro acumulado. Uma

redução da incapacidade associada à esquistossomose, poderia em última instância gerar um

significativo aumento na produção com potencial suficiente para quebrar o ciclo de pobreza (linha

superior de losangos azuis). Por outro lado, qualquer risco de progressão da doença associado a um

aumento na incapacidade das populações infectadas pode acarretar em aumento na pobreza e provável

diminuição na expectativa de vida (linha inferior de triângulos cinza). Adaptado de: KING, 2006, pág.

576.

Nas últimas décadas, uma série de medidas para controle da esquistossomose

tem sido colocadas em prática. Assim como para outros parasitos, o controle da

transmissão da doença tem sido substituído pelo controle da morbidade através de

tratamentos em massa utilizando quimioterápicos. Apesar de favorecer o surgimento

de resultados imediatos, essa estratégia necessita de planejamentos em longo prazo

Tradução do autor para a expressão disability associated with chronic parasitic infection

para garantir a sustentabilidade e progressão do controle para os demais estágios de

transmissão da doença.

O controle dos hospedeiros intermediários através de moluscicidas é caro e

logisticamente complexo. Populações de caramujos podem ser facilmente reduzidas,

mas raramente eliminadas. Além disso, o uso de moluscicidas acaba por gerar

problemas de ordem ecológica e econômica devido a sua toxicidade a outros

organismos aquáticos. A utilização de controle biológico através da introdução de

espécies predadoras é outra alternativa proposta, mas de difícil implantação e grandes

riscos ecológicos (ZHANG, 2003).

A esquistossomose, a princípio, poderia ser eliminada através de medidas para

sanificação das fontes de água e de programas educacionais para mudanças de hábitos

populacionais. No Japão, tais medidas possibilitaram a erradicação da doença em

1982.

O tratamento a base de quimioterápicos tem sido utilizado em larga escala e

reduzido, consideravelmente, o impacto da esquistossomose na saúde pública de

países como: Egito, China, Brasil, Filipinas, Porto Rico, Tunísia, Marrocos e Arábia

Saudita (HAGAN, 2004; KING, 2006). No entanto, países mais pobres como os

países da África Subssaariana apresentam muita dificuldade em implantar e sustentar

estratégias de controle epidemiológicos baseadas em quimioterapia. Projetos pilotos

para diminuição da morbidade em Mali, Congo, Madagascar e Malawi demonstraram

resultados promissores em curto prazo, mas acabaram sucumbindo diante do término

de suporte internacional (CHITSULO, 2000; GRYSEELS, 1987).

A ineficácia no tratamento de doenças epidêmicas, muitas vezes é indicativa

de resistência adquirida à droga utilizada. No caso do praziquantel, uma droga

amplamente utilizada contra a esquistossomose, registros na falha do tratamento, em

1995, são atribuídos à eficácia estágio-específico da mesma (PICQUET, 1998;

STELMA, 1995). O praziquantel é efetivo contra o esquistossômulo dentro de uma

janela temporal que compreende os dois primeiros dias pós-infecção. Após esse

período, o parasito perde sua susceptibilidade, podendo continuar seu

desenvolvimento. A ovoposição por vermes que se desenvolveram durante repetidos

tratamentos com o praziquantel é uma das indicações de falha na eficácia da droga

(GRYSEELS, 2001; PICQUET, 1998). Registros de isolamento de parasitas

resistentes ao praziquantel no Egito (ISMAIL, 1996; ISMAIL, 1994; ISMAIL, 2002)

e Senegal (ROCHA, 1995), somados ao desenvolvimento experimental de

esquistossômulos resistentes in vitro (FALLON, 1997) confirmam a preocupação

relativa a uma possível emergência e disseminação de espécies resistentes à

quimioterápicos.

A diminuição observada na eficácia do praziquantel vem estimulando uma

busca por novas abordagens de controle a esquistossomose (BERGQUIST, 2002;

BRINDLEY, 2005; MCMANUS, 2001; REYNOLDS, 1994). Recentemente,

utilizando a GST28 recombinante de S. haematobium como antígeno, Capron e

colaboradores demonstraram um significante efeito anti-helmíntico da vacina em

testes clínicos com humanos (BRINDLEY, 2005). Em 2006, Tran e colaboradores

isolaram uma proteína de superfície em S. mansoni denominada tetraspanina (Sm-

TSP-2). Através de ensaios de “desafio” em camundongos inoculados com a proteína

antigênica, os autores obtiveram uma eficácia de 57%, 64% e 65%, respectivamente,

na diminuição do número de vermes adultos, ovos depositados no fígado e ovos

liberados nas fezes (TRAN, 2006). A eficácia acima de 40% apresentada nos ensaios

de imunização com animais experimentais, coloca a Sm-TSP-2 no grupo de vacinas

autorizadas pela Organização Mundial de Saúde a candidatar-se para as primeiras

fases de ensaios clínicos.

Desde 1986, quando Carter e Colley publicaram uma revisão pioneira

compilando dados sobre a biologia molecular do S. mansoni (CARTER, 1986), novas

informações vêm sendo agregadas ao tema. O andamento do projeto genoma

(

http://www.tigr.org/tdb/e2k1/sma1/ e http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/),

a recente publicação do genoma funcional (VERJOVSKI-ALMEIDA, 2003), o

projeto proteoma dos diferentes estágios de desenvolvimento do parasito

(

http://www.york.ac.uk) e o desenvolvimento de chips de microarranjos para a

determinação de genes diferencialmente expressos (

http://bioinfo.iq.usp.br/schisto)

vem promovendo novas discussões e configurando ferramentas importantes de

pesquisa para o desenvolvimento de formas alternativas de controle da doença.

1.2 – Regulação da Expressão Gênica

1.2.1 – Estrutura e Função do Genoma Eucariótico

O genoma dos organismos eucarióticos encontra-se organizado sob a forma de

uma estrutura nuclear denominada cromatina. Na cromatina são processados os sinais

endógenos e exógenos que, por sua vez, são transformados em instruções

operacionais para a execução da maioria das funções biológicas.

A cromatina foi identificada pela primeira vez em 1882, por Walther

Flemming, através de experimentos de refração e afinidade por corantes. Em 1974,

Oudet e colaboradores, obtiveram evidências bioquímicas que demonstravam o

genoma eucariótico claramente organizado e distribuído sob a forma de unidades

repetidas de tamanho uniformes denominadas nucleossomos (OUDET, 1975).

Figura 6 - Modelagem estrutural das histonas nucleossomais e nucleossomo

(A) Tetrâmero formado pela histona H3 (verde) e H4 (amarela). (B) Dímero formado pelas histonas

H2A (vermelho) e H2B (rosa). As porções amino e carboxi-terminais são representadas

respectivamente pelas letras N e C. (C) Cada uma das fitas de DNA é mostrada em diferentes

tonalidades de azul. O DNA perfaz 1.7 voltas em torno do octâmero de histonas formando uma

estrutura discóide. As histonas estão representadas com as mesmas cores descritas em (A) e (B).

Adaptado de: KHORASANIZADEH, 2004, págs. 260 e 261.

Os nucleossomos são constituídos pelo DNA genômico associado a um

octâmero protéico que, por sua vez, é formado por dois conjuntos de quatro histonas

nucleossomais denominadas H2A, H2B, H3 e H4. A composição linear do octâmero

nucleossomal pode ser resumida como (H2A-H2B)-(H4-H3)- (H3`-H4`)-(H2B`-

H2A`) em torno do qual, um segmento de dupla hélice de DNA composto por 147

pares de bases, perfaz 1.7 voltas, enrolando-se como uma linha em torno de um

carretel (Figura 6 C).

Uma célula de mamífero acomoda em torno de 2-3 bilhões de pares de bases

em seu núcleo, o que implica em uma compactação eficiente do seu material genético.

A estrutura isolada dos nucleossomos, no entanto, não é suficiente para compactar

todo o material genético presente na célula. Oudet e colaboradores provaram, pela

primeira vez, a importância das histonas de ligação H1 na compactação da cromatina

(OUDET, 1975). Foi demonstrado que, quando ocorre a depleção das histonas H1, a

estrutura fibrilar observada assume uma configuração menos compacta, semelhante à

de um “colar de contas” (OUDET, 1975) (Figura 7 B). Nesse arranjo, os

nucleossomos estariam conectados de forma espaçada por um segmento de DNA não

associado a histonas, também chamado de DNA de ligação

(Figura 7 A).

A. B.

DNA de

Ligação

Octâmero

de Histonas

Figura 7 - Estrutura da cromatina não compactada

(A) Nucleossomos constituídos pelo octâmero de histonas (amarelo) e DNA (azul) encontram-se

conectados em intervalos regulares através do DNA de ligação (azul) ao longo da cromatina. (B)

Microscopia eletrônica da fibra de cromatina na ausência das histonas H1 assumindo uma configuração

de “colar de contas”. Adaptado de: NELSON & COX, 2000, pág. 923.

Tradução do autor para o termo linker DNA

De uma forma geral, os mecanismos de compactação da cromatina convergem

para o estabelecimento de um modelo padrão onde os nucleossomos estariam

dispostos ao longo da fibra de DNA de forma alternada, assumindo um modelo de

compactação em “zig-zag” (BEDNAR, 1998; RYDBERG, 1998) (Figura 8).

Figura 8 - Modelo Zig-Zag de compactação e organização dos nucleossomos

(A) Ilustração esquemática da estrutura assumida pela fibra de cromatina, demonstrando a

compactação dos nucleossomos. (B) Microscopia eletrônica da fibra de cromatina compactada.

Retirado de: NELSON & COX, 2000, pág. 926.

Oudet e colaboradores fizeram as primeiras observações relacionando a

estrutura dos nucleossomos e a função do genoma eucariótico.

“É tentador fazer a correlação entre a fração da cromatina na qual a maior

parte do DNA está empacotada nos nucleossomos, com a fração do genoma que

nunca é expressa… É possível que… o DNA livre possa de fato corresponder à fração

do DNA que oportunamente se expressa num determinado tipo de célula.”

As observações feitas por Oudet em 1975, continuam atuais, sendo

corroboradas até hoje em experimentos que demonstram a desestruturação do

nucleossomo em regiões promotoras de genes ativamente transcritos (BOEGER,

2003). Hoje, sabe-se que o acesso dos fatores e maquinaria de transcrição ao DNA é

regulado por diversos mecanismos capazes de alterar a estrutura dos nucleossomos.

A acessibilidade do DNA nucleossomal depende da dissociação transitória das

histonas que o compõe, o que expõe regiões previamente oclusas, viabilizando assim

o acesso e ligação de proteínas reguladoras. De uma forma geral, in vivo, a estrutura

dos nucleossomos pode ser regulada por três principais mecanismos: modificações

pós-traducionais nas porções amino-terminais das histonas, alterações na composição

do octâmero de histonas e pelo reposicionamento do octâmero de histonas ao longo

do DNA nucleossomal (SAHA, 2006).

Se pudéssemos dividir em duas etapas o intrincado processo de regulação da

expressão gênica, poderíamos considerar a desestruturação dos nucleossomos como

uma primeira etapa, na qual toda a informação contida na cromatina estaria sendo

disponibilizada através de seu desempacotamento. A partir daí, a modulação estrutural

do DNA desempacotado seria considerada uma segunda etapa, que em última

instância direcionaria as interações entre os fatores e a maquinaria basal de transcrição

às suas regiões de atuação.

Dentro do contexto de regulação transcricional e levando-se em conta a função

nuclear desempenhada pelas proteínas do tipo HMGB, será dada ao longo das

OUDET, 1975

próximas sub-seções uma maior atenção aos eventos de regulação gênica associados à

modulação estrutural e topológica do DNA.

1.2.2 – Estrutura e Função do DNA Superenovelado

O DNA é capaz de sofrer modificações estruturais em resposta a forças físicas

aplicadas a ele durante determinados processos biológicos. Mais especificamente,

podemos citar o enovelamento e desenovelamento da dupla hélice do DNA através da

ação da maquinaria basal de transcrição e de fatores transcricionais. Esse tipo de ação,

acarreta a geração transitória de forças que, por sua vez, atuam indiretamente no

processo de regulação gênica (KOUZINE, 2007).

No DNA, o número de voltas periódicas em torno do seu eixo central é

determinado pela estrutura planar estabelecida entre seus pares de base e pelas rígidas

ligações fosfodiésteres entre seus fosfatos. Essa configuração favorece a formação de

uma estrutura helicoidal estável denominada DNA do tipo B

. Nesse caso, a fita dupla

de DNA apresenta voltas periódicas constituídas por 10.5 pares de base e de diâmetro

equivalente a 20Ǻ, sendo caracterizada, do ponto de vista topológico, como um

arranjo estrutural “relaxado”. Entretanto, se imobilizarmos uma das extremidades da

dupla fita de DNA, e promovermos uma rotação na outra extremidade livre,

dependendo da direção dessa rotação, estaremos introduzindo ou desfazendo voltas e,

dessa forma, favorecendo um rearranjo estrutural da molécula. Esse rearranjo é

decorrente de uma redistribuição de forças atuantes na estrutura do DNA e acarreta,

em última instância, na formação de uma estrutura terciária superenovelada. Se

considerarmos a sequência de desoxirribonucleotídeos que constituem o DNA como

Tradução do autor para o termo B type DNA

uma estrura primária e o arranjo helicoidal determinado por essas unidades como uma

estrutura secundária, poderíamos considerar que as diferentes conformações

assumidas pela dupla hélice de DNA estariam caracterizando uma espécie de estrutura

terciária. O DNA superenovelado nesse caso, seria uma estrutura terciária capaz de

assumir duas formas topologicamente equivalentes: a estrutura helicoidal toroidal (ou

solenóide), na qual o eixo da molécula encontra-se enrolado como se estivesse em

torno de um cilindro (Figura 9 A) e a estrutura plectonêmica, na qual o eixo da

molécula encontra-se torcido em torno de si mesmo (Figura 9 B e C).

Figura 9 – Topologias equivalentes assumidas pelo DNA superenovelado

(A) A estrutura toroidal (ou solenóide) assume a conformação de voltas em torno de uma estrutura

cilíndrica imaginária. (B) A estrutura plectonêmica é caracterizada pela torção em torno do seu próprio

eixo. (C) Imagem obtida através de microscopia eletrônica demonstrando a progressão do

superenovelamento em uma molécula de DNA circular que passa assumir uma conformação

plectonêmica. Adaptado de: NELSON & COX, 2000, págs. 917 e 923.

O superenovelamento do DNA pode ainda ser classificado através de

formações topológicas não-equivalentes: positiva, quando a fita dupla de DNA é

torcida em torno seu próprio eixo no sentido horário, aumentando o número de voltas

em um determinado período e negativo, quando a fita dupla de DNA é torcida em

torno do seu próprio eixo no sentido anti-horário, diminuindo o número de voltas em

um determinado período (Figura 10).

Figura 10 – Topologias não-equivalentes assumidas pelo DNA superenovelado

As moléculas de DNA que apresentam maior ou menor número de voltas por período em relação à sua

forma relaxada, assumem uma conformação superenovelada positiva ou negativa, respectivamente.

Adaptado de: NELSON & COX, 2000, págs. 918.

Matematicamente, o superenovelamento do DNA pode ser traduzido através

da equação ∆Lk = Lk - Lk

onde: Lk corresponde ao número de vezes em que uma das

fitas de DNA envolve a outra em um mesmo plano. O valor de Lk é determinado a

partir da divisão do número total de pares de bases da molécula de DNA

superenovelada, pelo número de pares de bases presentes em uma volta completa ao

redor do seu eixo. O valor de Lk

é determinado a partir da divisão do número total de

pares de bases da molécula de DNA superenovelada, pelo número de pares de bases

presentes em uma volta completa ao redor do eixo do DNA “relaxado” (forma B,

~10.5 pb). Portanto, os valores de ∆Lk>0 e ∆Lk<0 caracterizam, respectivamente,

superenovelamentos positivo e negativo (Figura 11).

Figura 11 – Superenovelamento positivo e negativo

Os superenovelamentos positivo e negativo são caracterizados matematicamente pelo

∆Lk>0 e ∆Lk<0 e fisicamente, pela formação de conformações terciárias

plectonêmicas no sentido anti-horário e horário. Adaptado de: NELSON & COX,

2000, págs. 920.

Conforme mencionado anteriormente na seção 1.2.1, a regulação da

transcrição gênica ocorre, secundariamente, através de modificações estruturais na

molécula de DNA “desempacotada”.

Em eventos de ativação da transcrição gênica a abertura transitória da

molécula de DNA, a presença de fatores transcricionais e o deslizamento da RNA

polimerase, promovem a propagação de torções na fita dupla. A literatura sobre o

tema sugere que o acúmulo ou dissipação de torque ao longo da molécula de DNA

seria capaz de desempenhar importante papel na modulação da temperatura de

anelamento em regiões promotoras de determinados genes (KOUZINE, 2007).

A atividade transcricional em regiões promotoras localizadas próximas umas

das outras, desencadeia a propagações de torques capazes de influenciar diretamente

suas funções (DUNAWAY, 1993; OPEL, 2001). Trinklein e colaboradores

demonstraram que a energia contida em determinadas regiões de transcrição ativa, são

capazes de diminuir a temperatura de anelamento em regiões promotoras próximas,

favorecendo a separação da dupla fita, independentemente da ação da helicase TFIIH

(TRINKLEIN, 2004). O FUSE (Far UpStream Element) é uma seqüência de

nucleotídeos presente no promotor do protooncogene c-myc caracterizada como uma

SIDD (Stress Induced Duplex Destabilization). As SIDDs podem ser teoricamente

determinadas a partir de um algoritmo que calcula a estabilidade termodinâmica e a

probabilidade de determinadas seqüências em assumirem condições de fita simples

mediante estresse induzido por propagação de torque (KOUZINE, 2007).

Apesar de nenhuma teoria ou experimento ter conseguido, até o momento,

estabelecer um padrão na dinâmica de propagação vetorial do torque ao logo das

moléculas de DNA, sabe-se que a combinação e alternância dessas forças é capaz de

favorecer a formação de estruturas não canônicas de DNA, como o DNA – Z e o

DNA – H. Acredita-se que a formação dessas estruturas possa estar relacionada com

eventos de instabilidade genética como translocações, inserções e deleções

(BACOLLA, 2006; NAPIERALA, 2005), mas não se sabe até que ponto essas

estruturas podem estar envolvidas em outros eventos celulares e tampouco se, in vivo,

elas existem apenas transitoriamente ou se perduram estabilizadas por períodos

maiores.

1.2.3 – Estrutura e Função do Bending DNA

Um fator de transcrição pode regular a expressão de um determinado gene

mesmo que ambos estejam localizados em regiões distantes umas das outras ao longo

da molécula de DNA.

Scheleif e colaboradores demonstraram em bactérias que, a repressão do

operon araBAD depende da interação da proteína araC com uma região do DNA

localizada 200 pares de bases a montante ao sítio de iníciação de transcrição. Os

autores sugeriram que a proteína araC seria capaz de interagir com outra proteína

localizada em uma região próxima ao sítio de iniciação de transcrição através de

dobras assumidas pela molécula de DNA (HAHN, 1986; MARTIN, 1986).

Outro exemplo para esse tipo de regulação pode ser encontrado no promotor

do vírus SV40 (simian vírus 40). O promotor SV40 regula a expressão de genes

específicos a partir da cooperação entre proteínas presentes em 3 diferentes regiões do

DNA: uma região TATA, um segmento intermediário e uma região ativadora

localizada a montante ao sítio de iniciação de transcrição. A interação e consequente

cooperação entre essas regiões é dependente de rearranjos estruturais da molécula de

DNA que favorecem suas aproximações espaciais. Para confirmar a hipótese de que

modificações na estrutura “primária” da molécula de DNA poderiam ser responsáveis

pela alteração na estrutura “terciária” e no conseqüente desalinhamento de regiões

reguladoras, Takahashi e colaboradores demonstraram uma diminuição na atividade

transcricional através da inserção de pequenas sequências aleatórias entre as 3 regiões

reguladoras do promotor SV40. Nesse contexto, a diminuição da transcrição em

função do espaçamento das regiões do promotor sugere que a interação entre as

proteínas reguladoras possa ser dependente de uma estrutura terciária assumida pela

molécula de DNA (TAKAHASHI, 1986).

Hochschild e Ptashne demonstraram, em 1986, que duas proteínas reguladoras

de fago λ eram capazes de regular cooperativamente a transcrição de genes

específicos através da formação de um heterodímero capaz de ligar-se a sequências

adjacentes presentes no DNA bacteriano (Figura 12 A).

De forma contrária ao que foi observado por Takahashi, os autores

demonstraram que os níveis de expressão gênica obtidos nesse sistema, poderiam ser

reproduzidos mediante a inserção de uma longa sequência de nucleotídeos entre as

regiões reguladoras adjacentes. A inserção dessa sequência compreende uma estrutura

helicoidal composta por 7 voltas e que, devido a sua flexibilidade, favorece a

formação do heterodímero regulador (Figura 12 B) através de uma dobra na molécula

de DNA.

Figura 12 – Regulação da interação entre fatores transcricionais mediante alterações

conformacionais do DNA

(A) Cooperação entre dois fatores transcricionais localizados em regiões adjacentes ao longo do DNA.

(B) Cooperação entre dois fatores transcricionais localizados em pontos distantes na molécula de DNA.

molécula de DNA devido ao desalinhamento de suas posições ao longo da molécula. As formas ovais

azul clara e escura representam os dois diferentes fatores transcricionais enquanto a estrutura longilínea

cinza representa a molécula de DNA. Adaptado de: Ptashne, 2005, pág. 276.

Hochschild e Ptashne complementaram os resultados obtidos por Takahashi

agregando a idéia de que, independentemente do comprimento da sequência inserida

entre as regiões reguladoras, a posição dessas regiões precisam ser preservadas em

torno do eixo da molécula de DNA. Caso isso não aconteça, mesmo através de

modificações na estrutura “terciária” da dupla fita de DNA, o contato entre as

proteínas reguladoras não será estabelecido devido ao desalinhamento de seus sítios

de ligação (Figura 12 C) (PTASHNE, 1986).

1.3 - Proteínas do Tipo High Mobility Group (HMG)

Além das histonas, um outro grupo de proteínas encontra-se frequentemente

associado aos nucleossomos. São elas as proteínas do grupo de alta mobilidade

(HMG) responsáveis pela re-estruturação conformacional e remodelamento do DNA

(BIANCHI, 2005). As proteínas do tipo HMG representam uma superfamília de

proteínas nucleares descobertas a mais de 30 anos atrás. Essas proteínas foram

identificadas inicialmente como componentes ácidos presentes em extratos nucleares,

sendo facilmente caracterizadas devido a sua alta mobilidade quando submetidas à

cromatografia por eletroforese (GOODWIN, 1973). Recentemente as HMGs foram

re-agrupadas recebendo, inclusive, nova nomenclatura. Apesar de apresentarem

funções similares, essas proteínas encontram-se agrupadas de acordo com suas

organizações estruturais em três diferentes famílias: a HMGA compreende quatro

isoformas, a HMGA1a, HMGA1b, HMGA1c e HMGA2 (previamente denominadas

HMG-I, HMG-Y, HMG-I/R e HMG-C). A família das HMGNs compreende a

HMGN1, HMGN2 (previamente denominadas HMG14 e HMG17), HMGN3,

HMGN3a e a HMGN4. Finalmente, as HMGBs incluem a HMGB1, HMGB2,

HMGB3 (previamente denominadas HMG1, HMG2 e HMG2a) e a HMGB4 (HOCK,

2006).

As HMGs também recebem a denominação de proteínas arquitetônicas devido

a sua capacidade em alterar a estrutura da cromatina através de suas ligações

dinâmicas e reversíveis ao DNA genômico, nucleossomo e complexos protéicos

constituídos por fatores transcricionais. As HMGs são relativamente pequenas,

apresentando uma massa molecular não maior do que 30 kDa, além disso, são

caracterizadas por apresentar uma região carboxi-terminal rica em resíduos de

Tradução do autor para High Mobility Group

aminoácidos ácidos, sendo que cada família apresenta um motivo funcional

característico capaz de induzir modificações específicas em seus sítios de ligação

(Figura 13).

A. B. C.

Figura 13 – Esquema estrutural modular das HMGs

(A) Todas as HMGAs apresentam três domínios do tipo “ganchos AT” (verde) e uma extremidade

carboxi-terminal negativa (azul), com exceção da HMGA1c, que apresenta apenas 2 “ganchos AT”. (B)

Todos os membros da família das HMGBs apresentam dois “HMG boxes” (amarelo) e uma

extremidade carboxi-terminal negativa estendida (azul). (C) Proteínas da família das HMGNs

apresentam um domínio de ligação ao nucleossomo carregado positivamente (NBD, vermelho) e uma

extremidade carboxi-terminal negativa denominada domínio desestruturado de cromatina (CHUD,

azul). Adaptado de: HOCK, 2006.

As proteínas HMGs, de uma forma geral, ligam-se a cromatina

independentemente de seqüências específicas. Sua funcionalidade pode depender da

interação com determinados fatores reguladores ou da sua capacidade em estabilizar

determinadas conformações no DNA. Recentemente, experimentos de microscopia

demonstraram que a interação dessas proteínas com a cromatina é extremamente

dinâmica. As moléculas de HMG estão constantemente alternando seus sítios de

ligação ao DNA através de uma dinâmica denominada stop and go, onde o tempo de

residência da proteína é maior no estágio de ligação do que no estágio de transição

para outro sítio de ligação. Pode-se dizer que proteínas do tipo HMG encontram-se

associadas à cromatina, in vivo, durante a maior parte do tempo (HOCK, 2006).

Entretanto, existe uma reciclagem contínua de proteínas HMGs ao longo dos pontos

de ligação à cromatina e cada molécula de HMG compete pelo seu sítio de ligação

com outros membros da mesma família e com as histonas H1. Apesar das

semelhanças estruturais entre os membros das diferentes famílias, experimentos com

camundongos nocautes demonstram que cada um dos diferentes grupos de HMGs são

responsáveis pelo controle de determinadas atividades celulares e que, aparentemente,

suas funções biológicas não são tão redundantes assim (BIANCHI, 2005).

Figura 14 – Regulação da estrutura do DNA nucleossomal pelas HMGs

As proteínas HMGs são capazes de alterar a estrutura da cromatina através de diferentes mecanismos.

(A) Proteínas HMGs (forma oval verde) são capazes de alterar a estrutura da cromatina ligando-se às

regiões de “linker DNA” ou (B) dentro do nucleossomo facilitando a ligação de proteínas reguladoras

(formas circulares e ovais de diferentes cores). (C) As HMGs, em alguns casos, facilitam a formação de

complexos reguladores multi-protéicos capazes de interagir com a cromatina. (D) As proteínas HMGs,

favorecem a transição estrutural em determinadas regiões da cromatina favorecendo a ligação de

proteínas reguladoras específicas. (E) As HMGs podem, ainda, desestruturar a cromatina compactada e

(F) competir com outras proteínas nucleares por sítios de ligação específicos presentes na cromatina.

Os cilindros cinza representam os octâmeros de histonas nucleossomais e a linha preta o DNA

genômico. Adaptado de: HOCK, 2006.

As HMGs, de uma forma geral, apresentam uma função de regulação global

do genoma, estabelecendo domínios ativos ou inativos da cromatina (BIANCHI,

2005) e controlando, dessa forma, a transcrição de determinados genes através de

diferentes mecanismos (Figura 14).

1.3.1 – Proteínas High Mobility Group B (HMGB)

Estima-se que as células de mamíferos contenham aproximadamente uma

molécula de HMGB para cada 10–20 nucleossomos presentes em seu núcleo

(THOMAS, 2001). No entanto, apesar da abundante concentração em relação às

demais proteínas celulares, a HMGB permaneceu por muito tempo sem uma função

biológica claramente definida.

As HMGBs são caracterizadas, principalmente, por apresentar dois domínios

do tipo HMG box organizados em tandem e seguidos por uma seqüência de

aminoácidos negativos presentes na porção carboxi-terminal denominada “cauda

ácida” (Figura 13 B). Enquanto a cauda ácida encontra-se aparentemente

desestruturada, os domínios HMG box são estruturados sob a forma de três α-hélices

dispostas em forma de L (Figura 15) (THOMAS, 2001).

A. B.

Figura 15 – Modelagem estrutural dos domínios box A e box B da proteína HMGB1 humana

Estrutura por RMN dos domínios box A e box B da proteína HMGB1 humana. (A) Domínio box A.

(B) Domínio box B. As numerações I, II e III correspondem, respectivamente, às α hélices dispostas ao

longo dos domínios. As letras N e C correspondem respectivamente às extremidades amino e carboxi

terminais. É possível distinguir uma diferença entre as estruturas dos dois domínios, principalmente na

orientação das hélices I e II. Adaptado de: THOMAS, 2001, pág. 396.

Os domínios HMG box são extremamente conservados ao longo de diferentes

espécies, encontrados em uma série de outros fatores transcricionais e independente

de estarem presentes isoladamente ou em tandem, são capazes de promover alterações

conformacionais no DNA através de suas ligações ao sulco menor da molécula. Além

de promover dobras e distorções, a HMGB também é capaz de ligar-se

preferencialmente a moléculas de DNA que assumem conformações específicas,

como o DNA cruciforme sintético mimetizando a estrutura do tipo Four-Way-

Junction (4WJs) (BIANCHI, 1989; BIANCHI, 1992; POHLER, 1997).

Além das estruturas cruciformes a HMGB1 exibe uma interação preferencial

por moléculas de DNA superenoveladas (SHEFLIN, 1989; STROS, 1998b; STROS,

2001). Scaffidi e colaboradores demonstraram, in vivo, que a HMGB1 é a proteína

nuclear com maior mobilidade, sendo capaz de atravessar todo o compartimento

nuclear da célula em menos de 1.5 segundos. A literatura descreve que cada

nucleossomo pode interagir com uma molécula de HMGB1 diferente a cada 2

segundos, o que sugere um padrão de ligação saltatório entre a proteína e as fibras de

cromatina (SCAFFIDI, 2002). Esse padrão de interação e movimentação da HMGB1

garante a ligação da mesma aos seus alvos através de um mecanismo simples de

difusão no compartimento nuclear. Nesse contexto, o encontro entre uma HMGB1 e

uma proteína ou nucleossomo em particular, torna-se um evento aleatório. Esse

mecanismo estocástico parece determinar implicações óbvias no processo de

transcrição gênica.

A transcrição de um gene requer interações seqüenciais de determinadas

proteínas para a formação de complexos reguladores. A estruturação desses

complexos é influenciada pela disponibilidade e tempo de residência de cada um de

seus componentes junto à molécula de DNA. Se um determinado fator não estiver

presente em um determinado local, dentro de uma janela temporal em que um

intermediário também esteja disponível, a estruturação do complexo regulador será

desfeita e o processo de transcrição não ocorrerá. Um exemplo claro são os receptores

glicocorticóides que se associam ao DNA permanecendo ligados por apenas alguns

segundos (MCNALLY, 2000). Se nenhum dos fatores a jusantes ao processo de

estruturação do complexo regulador estiverem presentes durante esses poucos

segundos, os receptores glicocorticóides se dissociarão de seus sítios de ligação. Em

artigo publicado na Science, em 2002, Dundr sugere que apenas uma pequena fração

dos complexos transcricionais ocorrem, já que a eficiência na estruturação dos

mesmos é dependente de eventos sequênciais, concetranção e localização espacial de

diversas proteínas (DUNDR, 2002). Dessa forma, a HMGB1 estaria contribuindo

como uma espécie de chaperona, participando de forma decisiva na estruturação de

complexos reguladores transcricionais.

As HMGBs podem regular positivamente o processo de transcrição gênica

através de diferentes mecanismos. O primeiro deles sugere uma alteração

conformacional no DNA nucleossomal através da inserção de dobras na molécula

(Figura 12) ou torções, conforme descrito nas seções 1.2.3 e 1.2.2, respectivamente.

Essa alteração estrutural induziria rearranjos das regiões de DNA reguladoras

favorecendo a interação de fatores transcricionais e proteínas da maquinaria basal de

transcrição, desencadeando ou reprimindo a expressão de genes específicos (Figura

14 D e E) (AGRESTI, 2003; BONALDI, 2002; TRAVERS, 2003; WU, 2004).

Outro mecanismo seria a capacidade da HMGB em interagir com fatores

transcricionais basais como a TBP (DAS, 2001; DASGUPTA, 2003) e fatores

transcricionais específicos como os receptores nucleares esteróides de classe I,

proteínas HOX e POU, p53 e p73, diversas subunidades do complexo NF-κB e

SREBPs facilitando, assim, seu acesso e interação com sítios específicos na molécula

de DNA (Figura 14 C) (AGRESTI, 2003; NAJIMA, 2005).

Em embriões de camundongos as HMGB1, HMGB2 e HMGB3 apresentam

uma alta expressão. Em células de vertebrados adultos, com exceção dos neurônios, a

expressão de HMGB1 é constitutiva enquanto a HMGB2 e 3 são expressas apenas nos

testículos e órgãos linfóides. A maior parte dos camundongos Hmgb1

-/-

morrem

imediatamente após o nascimento enquanto camundongos Hmgb2

-/-

, apesar de

viáveis, apresentam uma redução severa na produção de esperma (AGRESTI, 2003).

Camundongos nocautes duplos para HMGB1 e HMGB2 são letais. A expressão da

HMGB3 em células hematopoiéticas da medula óssea está relacionada à diferenciação

das mesmas, além disso, camundongos nocautes para HMGB3 apesar de viáveis, são

deficientes na produção de eritrócitos.

A HMGB também encontra-se envolvida na regulação de processos de reparo

ao DNA (REEVES, 2005). A HMGB1 é capaz de ligar-se a estruturas assumidas pelo

DNA decorrentes da incorporação de análogos de nucleotídeo (KRYNETSKI, 2003),

modificações covalentes (OHNDORF, 1999) e exposição a UV (PASHEVA, 1998).

A HMGB1 também promove a “blindagem” de DNAs modificados por cisplatina

inviabilizando o acesso da maquinaria de reparo (HE, 2000; NAGATANI, 2001).

Finalmente, camundongos Hmgb1

-/-

sobreviventes apresentam um aumento na

instabilidade cromossomal (CHAU, 2005), uma observação que relaciona níveis de

expressão aberrantes de HMGB1 às instabilidades cromossomais frequentemente

encontradas em células tumorais.

1.3.2 – HMGs: Modulação Específica ou Constitutiva?

Apesar das inúmeras atividades celulares influenciadas pelas HMGs, não se

sabe exatamente se essas proteínas atuam de forma específica ou se atuam,

simplesmente, como co-fatores gerais capazes de afetar a homeostase celular. Os

dados disponíveis até o momento sugerem que as HMGs são capazes de afetar os

níveis de transcrição de uma série de genes mas, ao mesmo tempo, também são

capazes de atuar como co-fatores específicos em diferentes vias celulares. A HMGB1,

por exemplo, estabiliza a ligação dos receptores glicocorticóides à cromatina

(BIANCHI, 2005), a HMGA1 facilita a estruturação de complexos reguladores na

região promotora do gene do interferon- β (MERIKA, 2001) e a HMGN1 é recrutada

pela proteína A da síndrome de Cockayne em função de danos no DNA decorrentes

de radiação UV (FOUSTERI, 2006).

Uma das propriedades comuns às HMGs é o fato de terem sua expressão

gradualmente reduzida ao longo do desenvolvimento do organismo. Em diversos

sistemas experimentais, reduções ou aumentos na expressão das HMGs resultam em

mudanças significativas nos fenótipos, sugerindo que diferenciações específicas

requerem a regulação dos níveis de expressão das HMGs. Curiosamente, até o

momento, a análise de camundongos nocautes para HMG sugere que, em alguns

casos, a perda de uma isoforma de HMG

não seja o suficiente para comprometer

totalmente o processo de desenvolvimento de um organismo. Uma redundância

funcional entre membros de uma mesma sub-família, talvez seja capaz de compensar

a perda de uma variante de HMG durante o processo de embriogênese (HOCK, 2006).

Por outro lado é concebível que os mecanismos celulares envolvendo funções

redundantes das HMGs não sejam tão eficientes em tecidos totalmente diferenciados,

onde os níveis de expressão dessas proteínas são relativamente baixos. Diversos

trabalhos vem demonstrando que todas as HMGs são capazes de interagir com uma

grande variedade de proteínas nucleares. Portanto, os efeitos biológicos causados pela

ausência de um dos tipos de HMG podem depender da especificidade de sua interação

com parceiros que variam numericamente ou temporalmente entre os tipos célulares

dos diferentes tecidos em desenvolvimento.

Por exemplo, a perda da HMGB1 em detrimento da HMGB2

2. OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho é identificar, isolar e caracterizar estruturalmente os

genes e cDNAs correspondentes à proteína HMGB (High Mobility Group B) de S.

mansoni e S. japonicum assim como, caracterizar a atividade das proteínas

recombinantes através de ensaios de interação com ácidos nucléicos.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Isolar o cDNA e gene homólogo à proteína High Mobility Group B (HMGB) em

S. mansoni e S. japonicum

• Identificar, in sílico, possíveis isoformas da HMGB1 em S. mansoni

• Mapear a estrutura do gene HMGB1em S. mansoni e S. japonicum.

• Determinar diferenças no nível transcricional do gene HMGB1 nos estágios

adultos e imaturos em ambos os sexos do S. mansoni.

• Testar, através de ensaios funcionais com a proteína recombinante, a capacidade e

especificidade de ligação da SmHMGB1 ao DNA plasmidial circular

superenovelado, circular e linear relaxado e à sonda de DNA sintética do tipo

Four-Way-Junctions (4WJs).

• Testar, através de ensaios funcionais com a proteína recombinante e seus

diferentes domínios, a capacidade da Sm/SjHMGB1 em promover modificações

conformacionais no DNA, comparando-a com a proteína HMGB1 humana

recombinante.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 - Isolamento dos cDNAs e Genes da SmHMGB1 e SjHMGB1

A sonda homóloga ao cDNA da SmHMGB1 foi obtida a partir de uma busca no banco

de dados do Projeto Genoma de ESTs do Schistosoma mansoni VERJOVSKI-

ALMEIDA, 2003. Utilizando-se a seqüência de nucleotídeos da HMGB1 humana (n

de acesso no GenBank

NM_002128), foi efetuado um BLASTN (ALTSCHUL, 1990)

contra este banco de dados, através do qual, foi identificada a seqüência respectiva ao

clone SmAE 701186.1.

A EST respectiva ao clone SmAE 701186.1 foi retirada do plasmídeo pGEM

T-easy (Promega) através de uma reação de clivagem utilizando a enzima de restrição

EcoRI (Promega) segundo as instruções do manual do fabricante. O produto da

digestão foi fracionado em gel de agarose a 1% e o fragmento respectivo à EST foi

purificada através do kit de purificação Illustra GFX

™

(GE Healthcare) segundo

instruções do manual do fabricante. O fragmento respectivo à EST purificada foi

marcado radioativamente (seção 2.3) e utilizado como sonda na varredura de uma

biblioteca de cDNA de S. mansoni preparada com o kit Uni-ZAP

(Vector Lambda

ZAP II e ZAP-cDNA Synthesis Kit, Stratagene). O procedimento experimental foi

executado segundo as instruções do manual do fabricante, através de duas varreduras

seguidas utilizando-se os clones positivos da primeira varredura para a realização da

segunda varredura.

Após a titulação para determinação da concentração de fagos da biblioteca, o

plaqueamento foi executado, as placas de petri foram incubadas por cerca de 12 horas

a 37º C e as placas de lise foram transferidas, por contato, para discos de membranas

de nylon Hybond-N

(GE Healthcare). No momento da transferência, as membranas

foram marcadas através de perfurações assimétricas em três diferentes pontos com

uma seringa contendo tinta nanquim, de forma a permitir a futura identificação nas

placas de petri originais do local exato das placas de lise positivas transferidas.

Após o tratamento das membranas, segundo instruções do manual do

fabricante, o DNA dos fagos foi fixado por 2 h, a 80º C. As membranas foram então

pré-hibridadas, por pelo menos 2 h, em uma solução de pré-hibridação contendo

caseína a 1% p/v; gelatina a 3% p/v; Tween 20 a 0,05%; 0.5 M NaCl e 0.1 M Tris-

HCl pH 7,5. Em seguida, a membrana foi incubada a 42º C por 12 h em solução de

hibridação contendo SSC 5X; formamida a 50%; Dextran Sulfato a 10%; SDS a 1%;

solução de Denhardt 10X e a sonda radioativa previamente desnaturada por 5 min a

100º C e 3 min no gelo.

Em seqüência à hibridação, as membranas foram lavadas uma vez por 5 min e

uma vez por 15 min à temperatura ambiente em uma solução de SSC 2X e SDS a

0.1%. Em seguida, foram lavadas novamente, duas vezes, por 30 min a 50º C em uma

solução de SSC 0,1X e SDS a 0,1% e finalmente, na varredura terciária, foram

submetidas a uma lavagem adicional de 30 min a 55º C em uma solução de SSC 0,1X

e SDS a 0,1%. Após as lavagens, as membranas foram expostas a filmes de raios-X

(Kodak) por 24 h a –70º C.

As perfurações das membranas foram reproduzidas nos filmes de raios-X e os

mesmos foram alinhados com as placas de petri correspondentes, permitindo a

identificação das placas de lise positivas. As mesmas foram marcadas e recuperadas

das placas de petri com um bisturi estéril e transferidas para microtubos de 1.5 ml

contendo 1 ml de tampão SM (1 M Tris-HCl pH 7,5; maltose 20% e 0.5 M MgSO

Após o isolamento dos fagos, foi realizada a excisão do fagemídeo pBluescript

-SK

utilizando o kit Rapid Excision (Stratagene), de acordo com as instruções do manual

do fabricante.

O gene da SmHMGB1 foi isolado e amplificado a partir do DNA genômico

total de S. mansoni utilizando primers específicos baseados na seqüência do cDNA

previamente isolado.

Tendo como referência a seqüência da HMGB1 do S. japonicum (n

. de acesso

no GenBank AY914896) identificada através do Projeto Genoma do S. japonicum,

foram desenhados primers específicos para a amplificação do respectivo cDNA e

Gene que, depois de amplificados, foram clonados através do kit de clonagem

pGEM

T-easy (Promega). O cDNA total e DNA genômico de S. japonicum foram

cedidos, respectivamente, pelo Dr. Karl Hoffmann (University of Cambridge) e Dra.

Matty Knight (Biomedical Research Institute, Maryland).

4.2 – Sequenciamento e Análise das Seqüências

Todos os clones foram seqüenciados em triplicata nos sentidos 5’ e 3’ pela

Macrogen Inc., Coréia do Sul

(

http://www.macrogen.com/eng/macrogen/macrogen_main.jsp). Antes de serem

enviados para sequenciamento, os clones em plasmídeos ou fagemídeos, foram

purificados através do kit Wizard

SV minipreps

(Promega), de acordo com as

instruções do manual do fabricante.

As seqüências foram analisadas através da ferramenta Contig Express, parte

integrante do software Vector NTI

™

Advance 10 (Invitrogen).

4.3 – Marcação Radioativa de Sondas de DNA

A marcação radioativa dos fragmentos de DNA utilizados na varredura de

biblioteca de cDNA, Southern Blot e Northern Blot, foi realizada utilizando-se o kit

Ready-To-Go

™

DNA Labeling Beads

(GE Healthcare) e 50 µCi de [α-

P]-dCTP (GE

Healthcare) segundo instruções do manual do fabricante. A marcação radioativa dos

DNAs do tipo Four-Way-Junction (utilizados no ensaio de retardamento em gel de

eletroforese) e dos fragmentos de DNA de 123 e 66 pb (utilizados nos ensaios de

circularização), foi realizada utilizando-se a enzima T4 polinucleotídeo cinase

(Promega) e 30 µCi de [γ-

P]-dCTP (GE Healthcare), segundo instruções do manual

do fabricante. Os DNAs do tipo Four-Way-Junction (BIANCHI, 1989) e os

fragmentos de 123 e 66 pb (PAULL, 1993; PIL, 1993) utilizados nos ensaios de

circularização foram gentilmente cedidos pelo Dr. Michal Štros.

4.4 – Manutenção do Ciclo de Vida do S. mansoni e Obtenção de Vermes Adultos

por Perfusão

O ciclo de vida do parasito é mantido em nosso laboratório através de infecção

dos hospedeiros intermediários, o gastrópode Biomphalaria glabrata, e dos

hospedeiros definitivos, camundongos da estirpe BALB/c ou hamsters dourados. As

cercárias liberadas, transformadas em esquistossômulos através de estímulos

mecânicos, são injetadas subcutaneamente nos roedores. Após 45 dias, os vermes

adultos são recuperados pela perfusão do sistema porta hepático das cobaias. Os ovos

são extraídos das fezes e do fígado dos roedores e expostos a condições ideais de

luminosidade e osmolaridade para a liberação dos miracídios, possibilitando, dessa

forma, a infecção dos caramujos e o conseqüente re-início do ciclo.

4.5 – Infecções Unissexuais de S. mansoni

Infecções unissexuais são aquelas em que o hospedeiro definitivo possui uma

população de parasitos do mesmo sexo. Como o sexo do S. mansoni é determinado de

forma heterogamética, os parasitos, ao eclodirem dos ovos como miracídios, já

possuem sexo definido. Desta forma, os caramujos são infectados com um único

miracídio e este, ao reproduzir-se assexuadamente, gera uma população clonal de

cercárias. Estas cercárias, todas do mesmo sexo, são utilizadas na infecção dos

hamsters ou camundongos. Após o período de desenvolvimento dos parasitos, os

mesmos são recuperados através da perfusão do sistema porta-hepático dos roedores

para a determinação do sexo.

4.6 – Extração de DNA Genômico

Vermes adultos, machos e fêmeas, foram macerados em tampão de extração

(100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM EDTA; 150 mM NaCl; SDS a 2% e proteinase K

a 100 µg/ml) em um homogeneizador do tipo Potter e incubados a 56º C por 2 horas.

O DNA foi extraído sequencialmente com 1 volume de fenol tamponado, 1 volume de

fenol-clorofórmio e 1 volume de clorofórmio. A fase aquosa foi posteriormente

submetida à precipitação com 2,5 volumes de etanol absoluto e 4 M KOAc pH 5,2 a

1:10 por 30 min a -70º C. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 14.400 X g por 15

min. a 4º C. O DNA precipitado foi lavado 1 vez em etanol 70% e re-centrifugado a

14.400 X g por 5 min. a 4º C. Após descarte do sobrenadante e completa evaporação

do etanol, o DNA foi ressuspenso em H

O Milli-Q estéril.

4.7 – Extração de RNA Total

Vermes adultos e imaturos (provenientes de infecções unissexuais), machos e

fêmeas de S. mansoni foram congelados no N

líquido, macerados em um graal e

transferidos para um microtubo de 2 ml. Foram adicionados 5 volumes de uma

mistura de fenol tamponado e solução de NETS (200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 20

mM Tris-HCl pH 7,8 e SDS a 1%) a 1:1 pré-aquecido a 85º C. Após centrifugação a

10.000 X g, a fase aquosa foi reservada e a fase fenólica re-extraída com 1 volume de

NETS. As duas fases aquosas foram misturadas e extraídas uma última vez com fenol

tamponado a temperatura ambiente e precipitadas com 2,5 volumes de etanol absoluto

e 4 M KOAc pH 5,2 a 1:10 por 1 h a -70º C. Após uma centrifugação a 10.000 X g

por 10 min a 4º C, a mistura de DNA e RNA foi lavada com etanol 70%. Após a

evaporação completa do etanol, o DNA e RNA foram dissolvidos em 10 mM de

HEPES pH 7,5. Após a solubilização da mistura de DNA/RNA, foram adicionados 3

volumes de 4 M LiCl e o RNA foi precipitado por 12 h a 4º C. Finalmente, após uma

centrifugação de 10 min a 10.000 X g, o RNA precipitado foi lavado com etanol 70%

e após a evaporação completa do etanol, foi dissolvido em H

O Milli-Q estéril tratada

com DEPC.

4.8 – Síntese de cDNA

O RNA total utilizado na reação de síntese de cDNA foi préviamente tratado

com uma DNAse I

(Amplification Grade, Invitrogen) de acordo com as instruções do

manual do fabricante. O cDNA de S. mansoni foi sintetizado a partir de 3 µg do RNA

total utilizando-se a enzima SuperScript

™

II RNAse H- Transcriptase Reversa

(Invitrogen) e oligonucleotídeo dT, de acordo com as instruções do manual do

fabricante.

4.9 – Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

As reações de PCR e RT-PCR foram executadas utilizando-se um

termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems), DNA Taq polimerase

(Phoneutria) e oligonucleotídeos (Invitrogen, IDT). Os protocolos de amplificação

consistiram, basicamente, em uma fase de desnaturação a 94º C por 5 min, uma fase

de amplificação dividida em três etapas, 94º C por 1 min para desnaturação, 50-55º C

por 1 min para anelamento e 72º C por 1 min para cada 1 kb a ser extendido e

finalmente, uma fase de extensão final a 72º C por 10 min.

4.10 – Southern Blot

O DNA genômico do S. mansoni foi clivado isoladamente com diferentes

enzimas de restrição (Promega) segundo instruções do manual do fabricante e

fracionadas através de gel de agarose a 0.8% em tampão TBE 0.5 X. O DNA foi

desnaturado por 30 min através da incubação do gel de agarose em tampão de

desnaturação contendo 0.4 M NaOH e 1 M NaCl. O DNA foi transferido por

capilaridade para uma membrana de nylon Hybond-N

(GE Helhtcare) e hibridado

com uma sonda marcada radioativamente (seção 3.3) compreendendo a seqüência do

cDNA da SmHMGB1. A membrana foi lavada por 15 min duas vezes a temperatura

ambiente em SSC 0.1 X e SDS a 0.1% e em seguida, lavada uma última vez por 30

min a 68º C. A membrana foi exposta e revelada através do sistema Storm 860

Phosphorimager (Molecular Dynamics). O padrão de peso molecular utilizado

consiste em DNA de λ digerido com HindIII e marcado radioativamente com [α-

P]-

dCTP.

4.11 – Northern Blot

20 µg do RNA total de vermes adultos e imaturos, machos e fêmeas, foram

fracionados em gel de agarose a 1% contendo formamida a 12% por 6 horas a 30 V. O

RNA foi transferido por capilaridade para uma membrana de nylon Hybond-N

(GE

Healthcare) por 12 h em tampão SSC 10 X. Após a transferência, o RNA foi fixado a

membrana por 2 h a 80º C. A membrana foi pré-hibridada por, pelo menos, 2 h a 42º

C na solução de hibridação (SSC 5 X; formamida a 50%, Dextran Sulfato a 10%, SDS

a 1%, solução de Denhardt 10 X). Após a pré-hibridação, foi adicionada a sonda

marcada radioativamente (seção 3.3) compreendendo a seqüência do cDNA da

SmHMGB1. Após a hibridação, a membrana foi lavada uma vez por 5 min. e uma vez

por 15 min. à temperatura ambiente em solução de SSC 2 X e SDS a 0.1% e,

posteriormente, uma vez por 15 min a 55º C em solução de SSC 0,1 X e SDS a 0,1%.

Por fim, a membrana foi exposta e revelada através do sistema Storm 860

Phosphorimager (Molecular Dynamics). Após revelar o resultado obtido, a mesma

membrana foi dehibridada e o processo repetido utilizando uma sonda radioativa.

Essa sonda foi amplificada a partir dos oligonucleotídeos senso G1 (5’-

GGCTTGTGCCATCAGCGAAGTC-3’) e anti-senso G2 (5’-

TGGTTGTTGGGACGCGGAAAG-3’) baseados na seqüência do gene constitutivo

da GAPDH de S. mansoni, para o controle e normalização das concentrações de RNA

utilizadas no experimento.

4.12 – Construção dos Plasmídeos para Expressão de Proteínas Recombinantes

Os cDNAs do S. mansoni correspondentes as proteínas recombinantes

SmHMGB1 (aa 1-176), SmHMGB1 box A, (aa 1-83), SmHMGB1 box B (aa 84-169)

e SmHMGB1 ∆ cauda ácida (aa 1-169) foram amplificados através de RT-PCR

utilizando o oligonucleotídeo senso F1 (5′-

GGATCCATGGCTGAAGACAAGGGTAAG-3′) (O sítio de restrição para BamHI

encontra-se em negrito e o códon de iniciação encontra-se sublinhado) e o

oligonucleotídeo anti-senso F2 (5’-AAGCTT

CTAATCGTCAGACTCTGAAATC-

3’) para a SmHMGB1, A1 (5′-AAGCTT

CTATTCGTCGGCAGGGGGTTC-3′) para

a SmHMGB1 box A e C1 (5′-AAGCTT

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′) para a

SmHMGB1 ∆ cauda ácida (O sítio de restrição para HindIII encontra-se em negrito e

o códon de terminação encontra-se sublinhado). A SmHMGB1 Box B foi amplificada

utilizando o oligonucleotídeo senso B1 (5′-

GGATCCGGCCGCAGCAAGAAAAGGAAA-3′) e o oligonucleotídeo anti-senso

C1 (O sítio de restrição para BamHI encontra-se em negrito). Os cDNAs do S.

japonicum cDNAs correspondentes as proteínas recombinantes SjHMGB1 (aa 1–

176), SjHMGB1 box A (aa 1–83), SjHMGB1 box B (aa 84–169) e SjHMGB1 ∆ cauda

ácida (aa 1–169) foram amplificados através de RT-PCR utilizando o

oligonucleotídeo senso F3 (5′-GGATCC

ATGGCTGAAGAGAAAGGTAAG-3′) (O

sítio de restrição para BamHI encontra-se em negrito e o códon de iniciação encontra-

se sublinhado) e o oligonucleotídeo and anti-senso F4 (5′-

AAGCTT

CTAATCGTCGGATTCTGAGTC-3′) para a SjHMGB1, A2 (5′-

AAGCTTCTATTCATCTGCAGGCTC-3′) para a SjHMGB1 box A e C2 (5′-

AAGCTT

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′) para a SjHMGB1 ∆ cauda ácida (O

sítio de restrição para HindIII encontra-se em negrito e o códon de terminação

encontra-se sublinhado). A SjHMGB1 Box B foi amplificada utilizando o

oligonucleotídeo senso B2 (5′-GGATCCGGCCGCAGCAAGAAAAGGAAA-3′) e o

oligonucleotídeo anti-senso C2 (O sítio de restrição para BamHI encontra-se em

negrito).

Os produtos obtidos através dos RT-PCRs foram sub-clonados utilizando-se o

kit pCR2.1 TOPO (Invitrogen) de acordo com as instruções do manual do fabricante e

seqüenciados de acordo com o descrito na seção 3.2. Após a confirmação das

seqüências, os fragmentos foram clivados através de enzimas de restrição apropriadas

(Promega) e clonados no vetor de expressão pQE-80L (Qiagen) utilizando-se T4

ligase (Promega) de acordo com as instruções do manual do fabricante.

4.13 – Expressão e Purificação de Proteínas Recombinantes

A proteína Sm/SjHMGB1, Sm/SjHMGB1 box A, Sm/SjHMGB1 box B e

Sm/SjHMGB1 ∆ cauda ácida foram expressas fusionadas, através da sua região N-

terminal, a uma extensão constituída por 6 histidinas dispostas em seqüência.

Linhagens de células BL21(DE3) (Novagen) foram transformadas por eletroporação

utilizando-se um eletroporador modelo Gene Pulser II (Bio-Rad). Além das

construções citadas na seção 3.12, foi utilizada, também, uma construção contendo o

cDNA da HMGB1 Humana (pQE-80L–Humam HMGB1), para utilização como

controle nos ensaios funcionais descritos a partir da seção 3.14.

As células transformadas foram incubadas a 37º C em meio de cultura LB

contendo ampicilina a 100 µg/ml sob uma agitação de 200 rpm até atingirem a

densidade ótica (O.D.) de 0.6. Após a constatação da O.D. ótima, foi adicionado IPTG

na concentração final de 1 mM e dada continuidade a incubação por 5 h a 25º C sob

uma agitação de 200 rpm.

Encerrada a incubação, as células foram coletadas por centrifugação a 7700 X

g por 20 min., diluídas em tampão de lise gelado (50 mM NaH

pH 8,0; 300 mM

NaCl 300; 10 mM imidazol e 1 mM PMSF), sonicadas e centrifugadas a 20.000 X g

por 30 min. O sobrenadante coletado foi filtrado através de filtros de 0.45 µm e

submetido a uma coluna de Ni

- agarose Pro-Bond

™

(Invitrogen). Após lavagem da

coluna utilizando tampão de lise contendo imidazole a 10 mM, as proteínas de fusão

foram eluídas no mesmo tampão, contendo imidazol a 250 mM. Após a eluição, as

proteínas purificadas foram dializadas em tampão D (10 mM Tris-HCl pH 7,6; 50

mM KCl; 0.1 mM EDTA e 0.5 mM DTT) e tituladas através do “Bio-Rad Protein

Assay” (Bio-Rad). A pureza, assim como a concentração das proteínas, foram

analisadas através do fracionamento das amostras em gel de poliacrilamida

desnaturante SDS-PAGE a 15%. A proteína recombinante SmHMGB1 utilizada no

ensaio descrito na seção 3.16, foi expressa através do sistema pGEX-4T1

(Amersham), de acordo com as instruções do manual do fabricante.

4.14 – Purificação de DNA Superenovelado Através de Gradiente em CsCl

Para cada grama do plasmídeo pTZ19R (Fermentas) purificado através do kit

“QIAfilter Plasmid Giga” (Qiagen) foram adicionados 1.01 g de CsCl. Foram

adicionados para cada 5 g da mistura original de DNA 100 µl de brometo de etídio a

10 mg/ml. Utilizando um rotor Ti 70.1 (Beckman) a amostra foi fracionada a 60.000

rpm por 24 h a 22º C. Após a centrifugação, o tubo de centrífuga foi cuidadosamente

fixado em um suporte universal e utilizando-se uma seringa e uma agulha de 18G1/2,

foi extraída a fase respectiva ao DNA superenovelado. O DNA isolado foi

homogeneizado com álcool isopropílico a 1:1 e centrifugado a 10.000 X g a

temperatura ambiente para extração da fase orgânica contendo o brometo de etídio.

Após cinco repetições da etapa de extração do brometo de etídio, a fase aquosa

contendo o DNA plasmidial superenovelado foi dializada em TE 1 X pH 7,5 por 12

h. Finalmente, o DNA plasmidial superenovelado foi precipitado com 2,5 volumes de

etanol absoluto e 4 M KOAc pH 5,2 a 1:10 por 30 min a -70º C. Em seguida, a

amostra foi centrifugada a 14.400 X g por 15 min a 4º C. O DNA precipitado foi

lavado 1 vez em etanol 70% e re-centrifugado a 14.400 X g por 5 min a 4º C. Após

descarte do sobrenadante e completa evaporação do etanol, o DNA foi ressuspenso

em H

O Milli-Q estéril.

4.15 – Ensaio de Retardamento da Mobilidade Eletroforética em Gel de Agarose

Utilizando DNA Superenovelado

Para os ensaios de retardamento em gel de agarose, foram utilizadas

concentrações equimolares de uma mistura contendo o plasmídeo circularizado

pTZ19R (Fermentas) na sua forma super-enovelada, na forma relaxada e linearizado

através de digestão com HindIII. As proteínas recombinantes de interesse foram

adicionadas em concentrações crescentes de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 e 4 µM à uma

mistura contendo três diferentes topologias do pTZ19R (circular superenovelado,

circular relaxado e linear) , na concentração de 5 µg, em tampão específico (0.14 M

NaCl; 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 0.2 mM EDTA; 0.5 mM DTT), em um volume final

de 20 µl. Após a incubação, a amostra foi fracionada através de eletroforese em gel de

agarose a 1% em tampão 0.5X TBE a 3 V/cm por 15 -18 h a 4 °C. O gel foi corado

utilizando brometo de etídio a 0.5 µg/ml, descorado em água e fotografado através de

filtro vermelho em um trans-iluminador de UV (254 nm) utilizando filme 100 T-

MAX (Kodak).

4.16 – Ensaio de Retardamento da Mobilidade Eletroforética em Gel de

Poliacrilamida Utilizando DNA do Tipo Four-Way-Junctions (4WJs)

O experimento foi processado em tampão especifico (25 mM NaCl; 5 mM

KCl; 10 mM Hepes-KOH pH 8.0; 0.1 mM EDTA; 1 mM espermidine; 1mM DTT e

Ficoll a 3.5%) contendo aproximadamente 1.5 nM do DNA 4WJs marcado

radioativamente (segundo descrição na seção 3.3) e concentrações crescentes da

proteína recombinante (0.5, 1, 1.5 e 2 µM). Aos experimentos realizados na presença

de 2 µM de proteína, foram adicionadas concentrações crescentes do DNA linear não

marcado (10, 50 e 200 nM), derivado da construção do DNA 4WJ. Os complexos

obtidos foram fracionados em gel de poliacrilamida não desnaturante a 5.8% em 0.5

X TBE a 10 V/cm por 4-5 h a 4° C e visualizados através do Phosphorimager Storm

840 (GE Healthcare).

4.17 – Ensaio de Superenovelamento de DNA

O ensaio de super-enovelamento de DNA foi realizado como descrito

previamente por Štros & Muselikova, 2000 (STROS, 2000). 0,5 µg (ou ~ 10 nM) da

forma super-enovelada do plasmídeo pTZ19R (Fermentas) foi relaxada em tampão

específico (50 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA; glicerol a 20% e 1

mM DTT) na presença de 1 U de Topoisomerase I de trigo (Promega) a 37° C por 90

min. O DNA relaxado foi diluído em 140 mM de NaCl na presença de concentrações

crescentes da proteína recombinante (17 e 35 µM) em um volume final de 20ul. A

amostra foi incubada a 37° C por 60 min e a reação, inibida com a adição de SDS a

1% e 1 M NaCl. O complexo foi desnaturado, o DNA extraído através da adição de

clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e precipitado em 2.5 volumes de etanol na

presença de acrilamida linear a 0.02% como carreadora. A formação e distribuição

dos topoisômeros foi analisada através de fracionamento em gel de agarose a 1% em 1

X TBE a 3 V/cm por 18 horas. O gel foi corado com 0.5 µg/ml de brometo de etídio,

descorado em água e fotografado através de filtro vermelho em um trans-iluminador

de UV (254 nm) utilizando filme 100 T-MAX (Kodak).

4.18 – Ensaio de Sign para Determinação do Tipo de Superenovelamento

Induzido pela Sm/SjHMGB1

Os ensaios de Sign foram conduzidos segundo Štros, 2001 (STROS, 2001).

Após o término do fracionamento do DNA superenovelado em gel de agarose (como

descrito na seção 3.17), o gel foi incubado por 1 h em uma solução contendo

cloroquina a 2.5 µg/ml. O gel foi então devolvido à cuba de eletroforese sofrendo uma

rotação de 90º no sentido horário. As amostras foram submetidas a um segundo

fracionamento (desta vez paralela em relação aos poços de aplicação) a 5 V/cm por

10h em 0.5 X TBE contendo cloroquina. O gel foi corado com 0.5 µg/ml de brometo

de etídio, descorado em água e fotografado através de filtro vermelho em um trans-

iluminador de UV (254 nm) utilizando filme 100 T-MAX (Kodak).

4.19 – Ensaio de Circularização Mediado por T4 Ligase

O ensaio de circularização foram baseados em protocolos prévios de Štros,

1998, 2001 e 2004. Fragmentos de DNA de 123 pb e 66 pb (~1 nM) com

extremidades coesivas foram pré-incubados em gelo por 20 minutos com

concentrações crescentes da proteína recombinante (0.02-5 µM) em tampão de T4

ligase 1 X (30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl

, 10 mM DTT e 0.5 mM ATP;

Promega) em um volume final de 20 µl. O DNA foi incubado na presença de 0.05 U

de T4 ligase (Promega) a 30° C por 20 minutos e a reação, encerrada, através da

incubação das amostras a 65° C por 20 minutos. Como controle, algumas das reações

foram incubadas na presença de 20 U de exonuclease III (Promega) a 37° C por 30

minutos. O complexo foi desnaturado, o DNA extraído através da adição de

clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e precipitado em 2.5 volumes de etanol na

presença de acrilamida linear a 0.02% como carreadora. A amostra foi fracionada em

gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% (DNA 123 pb) e a 8% (DNA 66 pb) em

0.5 X TBE a 250 V por 2–3 h a 4° C. Depois de fracionado, o gel foi desidratado e

visualizado através do Phosphorimager Storm 840 (GE Healthcare).

5. RESULTADOS

5.1 – Identificação e Isolamento dos cDNAs da HMGB1 de S. mansoni e S.

japonicum (SmHMGB1 e SjHMGB1)

Foram isolados, em S. mansoni e S. japonicum, dois cDNAs de 531 pb

(Figuras 16, 17 e 24) correspondentes as proteínas SmHMGB1 e SjHMGB1. Os dois

cDNAs apresentam, entre si, uma identidade de 86%.

A análise e comparação do cDNA da SmHMGB1 com o banco de dados do

Projeto Genoma do Schistosoma mansoni, revelou um “contig” constituído pelo

alinhamento de 76 ESTs derivados alternadamente de todos os estágios de

desenvolvimento do S. mansoni, incluindo: ovos, miracídios, cercárias, germ-balls,

esquistossômulo e vermes adultos machos e fêmeas. Esse “contig” recebeu a anotação

de SmAE 607928.1. apresentando 100% de identidade com o cDNA isolado da

SmHMGB1.

O cDNA correspondente a SjHMGB1, foi isolado através de RT-PCR

utilizando-se primers específicos baseados na ORF completa identificada no Projeto

Genoma de ESTs do S. japonicum.

LOCUS DQ005529 531 bp DNA linear INV 20JUL-2006

DEFINITION Schistosoma mansoni high mobility group B1 (HMGB1) gene, complete

cds.

ACCESSION

DQ005529 REGION: join(1..147,185..505,541..603)

VERSION DQ005529.1 GI:66275795

KEYWORDS .

SOURCE Schistosoma mansoni

ORGANISM

Schistosoma mansoni

Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea;

Strigeidida; Schistosomatoidea; Schistosomatidae; Schistosoma.

REFERENCE 1 (bases 1 to 531)

AUTHORS de Oliveira,F.M., da Silva,I.C., Rumjanek,F.D., Dias-Neto,E.,

Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., Stros,M. and Fantappie,M.R.

TITLE Cloning the genes and DNA binding properties of High Mobility Group

B1 (HMGB1) proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni

and Schistosoma japonicum

JOURNAL Gene 377, 33-45 (2006)

REFERENCE 2 (bases 1 to 531)

AUTHORS de Oliveira,F.M., da Silva,I.C., Rumjanek,F.D., Dias-Neto,E.,

Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., LoVerde,P.T., Stros,M. and

Fantappie,M.R.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (12-APR-2005) Instituto de Bioquimica Medica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundao, Rio de

Janeiro, R.J. 21941-590, Brasil

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..531

/organism="Schistosoma mansoni"

/mol_type="genomic DNA"

/db_xref="taxon:

6183"

gene <1..>531

/gene="HMGB1"

mRNA <1..>531

/gene="HMGB1"

/product="high mobility group B1"

/experiment="experimental evidence, no additional details

recorded"

CDS 1..531

/gene="HMGB1"

/experiment="experimental evidence, no additional details

recorded"

/codon_start=1

/product="high mobility group B1"

/protein_id="

AAY44045.1"

/db_xref="GI:66275796"

/translation="MAEDKGKPKGAMNAYAAFLQSMRADHKKKHPNVTLDFKSFSKEC

SEQWKNLSAKEKKKFKDLADKDKERYRCEMEHYEPPADEGRSKKRKRDPDAPKKALSA

FFLFCNDERPKVKSENPDWKVSEIAKELGKRWEHCKNKAKYESLAQVEKQRYEKAMQK

YKAGKKSKTEDSESDD"

ORIGIN

1 atggctgaag acaagggtaa gccaaaaggt gctatgaatg cttatgcggc attcttgcaa

61 tctatgcgtg ccgaccataa gaagaagcat cccaatgtca ctctagattt caagtctttt

121 tcaaaggagt gctcagaaca gtggaagaat ctatcggcta aagaaaagaa gaagttcaag

181 gacttagcag ataaggacaa agagcgttat cgatgtgaga tggaacatta tgaaccccct

241 gccgacgaag gccgcagcaa gaaaaggaaa cgagacccag atgcacctaa aaaggcactg

301 tcagcatttt tcctcttttg caatgatgaa cgacctaaag tcaagtcaga aaatcccgac

361 tggaaagtca gtgagattgc taaagagcta ggtaaaagat gggagcattg taaaaacaag

421 gcgaaatatg agagcttagc ccaggtagag aaacaacgtt atgagaaagc gatgcaaaaa

481 tacaaagccg gcaaaaagtc caagacagaa gattcagagt ctgacgatta g

Figura 16 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da SmHMGB1

LOCUS DQ005528 531 bp DNA linear INV 20-JUL-2006

DEFINITION Schistosoma japonicum high mobility group B1 (HMGB1) gene, complete

cds.

ACCESSION

DQ005528 REGION: join(1..147,179..499,540..602)

VERSION DQ005528.1 GI:66275793

KEYWORDS .

SOURCE Schistosoma japonicum

ORGANISM

Schistosoma japonicum

Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea;

Strigeidida; Schistosomatoidea; Schistosomatidae; Schistosoma.

REFERENCE 1 (bases 1 to 531)

AUTHORS de Oliveira,F.M., da Silva,I.C., Rumjanek,F.D., Dias-Neto,E.,

Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., Stros,M. and Fantappie,M.R.

TITLE Cloning the genes and DNA binding properties of High Mobility Group

B1 (HMGB1) proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni

and Schistosoma japonicum

JOURNAL Gene 377, 33-45 (2006)

REFERENCE 2 (bases 1 to 531)

AUTHORS de Oliveira,F.M., da Silva,I.C., Rumjanek,F.D., Dias-Neto,E.,

Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., LoVerde,P.T., Stros,M. and

Fantappie,M.R.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (12-APR-2005) Instituto de Bioquimica Medica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundao, Rio de

Janeiro, R.J. 21941-590, Brasil

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..531

/organism="Schistosoma japonicum"

/mol_type="genomic DNA"

/db_xref="taxon:

6182"

gene <1..>531

/gene="HMGB1"

mRNA <1..>531

/gene="HMGB1"

/product="high mobility group B1"

/experiment="experimental evidence, no additional details

recorded"

CDS 1..531

/gene="HMGB1"

/experiment="experimental evidence, no additional details

recorded"

/codon_start=1

/product="high mobility group B1"

/protein_id="

AAY44044.1"

/db_xref="GI:66275794"

/translation="MAEEKGKPKGRMNAYALFLQSMRADHKKKHPNATLDFKSFSKEC

SEQWKNLSAKEKKKFKDLAEKDKERYRCEMEHYEPPADEGRSKKRKRDPDAPKKGLSA

FFLFCNDERPKVKSENPDWKVSEVAKELGRRWEHCKNKAKYESLAQVEKERYEKAMEK

YKAGKKPKTEDSESDD"

ORIGIN

1 atggctgaag agaaaggtaa gccgaaaggc cgcatgaatg cttatgcatt attcctgcaa

61 tctatgcgtg ccgaccataa gaaaaagcat ccaaatgcta ctcttgactt caaatcattt

121 tcaaaggagt gctcagaaca atggaagaat ctttcggcta aagagaaaaa gaagttcaag

181 gacttagcag aaaaagataa ggaacgctat cgttgtgaaa tggaacatta tgagcctcct

241 gcagatgaag gccgcagcaa aaaacgaaaa cgagatccag atgcacctaa gaagggtctg

301 tcagcatttt tcctattttg caacgatgag cgacccaaag tcaaatcaga aaaccctgac

361 tggaaagtca gtgaagttgc taaggaacta ggtaggagat gggagcattg taaaaacaaa

421 gctaagtatg aaagtttagc ccaagtggag aaggaacgat atgaaaaagc gatggaaaaa

481 tacaaagccg gcaaaaagcc caagacagaa gactcagaat ccgacgatta g

Figura 17 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da SjHMGB1

5.2 – Homologia das Sm/SjHMGB1 com Proteínas HMGB1 de Outras Espécies

As proteínas SmHMGB1 e SjHMGB1 apresentam ~94% de identidade entre

si, sendo constituídas por 176 resíduos de aminoácidos e apresentando um peso

molecular estimado de 18 kDa.

Assim como as proteínas HMGB1 de vertebrados, as Sm/SjHMGB1

apresentam dois domínios do tipo box A e box B, além de uma porção carboxi

terminal constituída por uma seqüência intercalada de resíduos de aminoácidos ácidos

(cauda ácida) (Figura 18). O alinhamento e comparação da seqüência da região que

compreende os domínios box A e box B entre a Sm/SjHMGB1 e as proteínas HMGB1

de carrapato, sapo, truta, galinha e humano apresenta ~ 60% de identidade.

Figura 18 – Alinhamento das seqüências deduzidas de resíduos de aminoácido das proteínas

HMGB1 de S. mansoni/S. japonicum e HMGB2 e HMGB3 de S. mansoni com as seqüências de

resíduos de aminoácido das HMGB1s de outros organismos

A HMGB1 de S. mansoni (SmHMGB1, nº de acesso no GenBank

AAY44045), foi alinhada com a

HMGB2 e HMGB3 de S. mansoni (SmHMGB2 e SmHMGB3, nº de acesso no GenBank

CAJ29301 e

CAJ29302, respectivamente) e HMGB1 de: S. japonicum (SjHMGB1, No de acesso no GenBank

AAY44044); de Homo sapiens (humam, nº de acesso no GenBank NP_002119); Gallus gallus

(chicken, nº de acesso no GenBank

CAA76978); Xenopus tropicalis (frog, nº de acesso no GenBank

AAH61601); Salmo specie (trout, nº de acesso no GenBank S48708); e Dermacentor variabilis (tick,

nº de acesso no GenBank

AAO92280). Utilizando como referência a seqüência da proteína HMGB1

humana, as regiões respectivas ao domínio box A (1-78), ao domínio box B (86-162) e a cauda ácida

(186-215) foram delimitadas dentro de caixas. As marcações em preto, cinza escuro e cinza claro

representam, respectivamente, 100%, 80% e 60% de identidade entre as seqüências de aminoácidos das

proteínas alinhadas. A seta vermelha e as setas azuis e verdes correspondem, respectivamente, aos

resíduos de aminoácidos M13, K96, R97, N92 e A93 presentes nas proteínas alinhadas.

A diferença mais clara entre a proteína HMGB1 humana e as Sm/SjHMGB1,

reside na região que compreende a cauda ácida e a porção carboxi terminal

flanqueadora do domínio box B. A análise comparativa da seqüência de aminoácidos

dessa região, com as proteínas HMGB1 dos demais organismos, apresenta uma

identidade de ~17%. As Sm/SjHMGB1 apresentam uma cauda ácida composta por

cinco resíduos ácidos intercalados por duas serinas, enquanto a HMGB1 humana,

apresenta uma seqüência ininterrupta de trinta resíduos de aminoácidos ácidos na sua

extremidade carboxi-terminal (Figuras 18 e 19). Ambas as proteínas apresentam

resíduos de aminoácido conservados específicos (M13, K96, R97, N92 e A93) cujas

funções de interação e regulação da interação com moléculas de DNA já foram

descritos em outros organismos (Figura 18).

A comparação da região que compreende a cauda ácida da proteína HMGB1

de diversos organismos, demonstra uma clara tendência a um aumento no número de

resíduos ácidos de acordo com o aumento na complexidade biológica desses

organismos (Figura 19).

“

auda

cida

”

Figura 19 – Comparação da composição de resíduos de aminoácidos na região que compreende a

cauda ácida nas proteínas HMGB1 de S. mansoni/S. japonicum e HMGB2 e HMGB3 de S.

mansoni com a composição de resíduos de aminoácido das HMGB1s deoutras espécies

A região que compreende a cauda ácida nas proteínas HMGB1 de S. mansoni e S. japonicum teve sua

composição de resíduos de aminoácido comparadas à HMGB2 e HMGB3 de S. mansoni e HMGB1 de:

G. gallus; D. Variabilis; X. Tropicalis; H. Sapiens; S. specie; Danio rerio (zebrafish, nº de acesso no

GenBank

AAQ97791) e Caernohabditis elegans (C.elegans, nº de acesso no GenBank AAK67238). A

marcação em cinza destaca os resíduos de aminoácidos ácidos, enquanto a numeração que flanqueia as

seqüências indica a exata posição dos resíduos de aminoácidos na proteína. O asterisco indica o número

de resíduos de aminoácidos ácidos presentes na cauda ácida de cada organismo.

5.3 – Identificação dos cDNAs e Comparação das Seqüências das Isoformas

SmHMGB2 e SmHMGB3 com a SmHMGB1

Análises adicionais no banco de dados do Projeto Genoma do Schistosoma

mansoni, revelaram outros dois “contigs” que traduzem duas isoformas da proteína

SmHMGB1 (Figuras 20 e 21).

Cada um desses “contigs” é constituído, respectivamente, pelo alinhamento de

15 ESTs derivados de todos os estágios de desenvolvimento do S. mansoni, exceto,

cercária (SmAE 604202.1) e pelo alinhamento de 12 ESTs derivados de todos os

estágios de desenvolvimento do S. mansoni, exceto, miracídio e cercária (SmAE

608982.1). As seqüências de nucleotídeos derivadas desses “contigs” traduzem,

respectivamente, ORFs de 226 e 246 aminoácidos, recebendo a denominação de

SmHMGB2 e SmHMGB3. A SmHMGB2 apresenta 56% de identidade e 72% de

similaridade quando comparadas a SmHMGB1, enquanto a SmHMGB3, apresenta

48% de identidade e 68% de similaridade. Ambas apresentam domínios box A e box

B e uma cauda ácida constituída por resíduos de aminoácidos ácidos intercalados

(Figuras 18 e 19).

LOCUS BN000821 681 bp mRNA linear INV 16-MAY-2006

DEFINITION TPA_inf: Schistosoma mansoni mRNA for putative high mobility group

B2 protein (hmgb2 gene).

ACCESSION

BN000821 REGION: 57..737

VERSION BN000821.1 GI:97976777

KEYWORDS Third Party Annotation; TPA; high mobility group B2 protein; hmgb2

gene; TPA:INFERENTIAL.

SOURCE Schistosoma mansoni

ORGANISM

Schistosoma mansoni

Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea;

somatoidea; Schistosomatidae; Schistosoma.

s-Neto,E., Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., Stros,M. and

ins from the human blood flukes Schistosoma mansoni

) Verjovski-Almeida S., Biochemistry,

Paulo, Av. Lineu Prestes 748, Sao Paulo, SP

CD120211.1 1-279

a mansoni"

e="mRNA"

Strigeidida; Schisto

REFERENCE 1

AUTHORS de Oliveira,F.M.B., de Abreu da Silva,I.C., Rumjanek,F.D.,

Dia

Fantappie,M.R.

TITLE Cloning the genes and DNA binding properties of high mobility grou

B1 (HMGB1) prote

and Schistosoma japonicum

JOURNAL (er) Gene DOI:10.1016/j.gene.2006.03.001

REFERENCE 2 (bases 1 to 681)

AUTHORS Verjovski-Almeida,S.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (25-AUG-2005

Universidade de Sao

05508-000, BRAZIL

PRIMARY TPA_SPAN PRIMARY_IDENTIFIER PRIMARY_SPAN COMP

1-279

218-666 CD134152.1 1-449

433-1000 CD075717.1 1-568

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..681

/organism="Schistosom

/mol_typ

/db_xref="taxon:

6183"

gene <1..>681

/gene="hmgb2"

CDS 1..681

/gene="hmgb2"

/function="association with chromatin structure"

ation of inflammation"

B2 protein"

29301.1

/function="medi

/codon_start=1

/product="putative high mobility group

/protein_id="

CAJ "

PMSAYACFVQVIREEHKKKHPGEQIVFSDFSK

RERFNREMCDYVPPDGMKKGKKRKGPKDPTVPAR

gaataaacct aaaggtccta tgtctgctta tgcttgtttt

aagtta ttcgagaaga gcacaaaaag aaacatcctg gtgaacaaat tgtattcagt

Figura 20 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da SmHMGB2

/db_xref="GI:97976778"

/translation="MNKTKDKNKPKG

KCAERWKLMTPKEKKRFEDLAVLD

AWSAFFFFCDEFRSKVRESNPDWKVADIAKELGRQWETCQDKAKYELLAQKDKQRYEE

DMIKYRAGTYVPREKKLAGAVSNSASIRTPETQNPDCTTVTSAGGDENGAELEDEDDG

EPDEGEEE"

ORIGIN

1 atgaataaga ctaaagataa

61 gtgc

121 gatttttcaa aaaagtgcgc tgaacgatgg aagttaatga caccaaaaga gaagaaacgt

181 ttcgaagatt tagctgtctt ggatagagaa cgattcaatc gtgaaatgtg tgattacgtg

241 ccaccagatg gtatgaaaaa gggaaagaaa cgcaagggtc ctaaggaccc cacagtacct

301 gcacgagcct ggtctgcttt ctttttcttt tgtgatgaat tccgttcaaa agtcagagaa

361 agtaatccgg attggaaagt cgcagatatt gctaaagagc ttggacgtca atgggaaact

421 tgtcaagata aagcaaagta tgaactgtta gctcaaaaag ataaacagcg ttatgaagag

481 gacatgataa aatatcgggc ggggacttat gttcctagag agaagaaact tgcaggtgct

541 gtgtcaaact ctgcatctat caggactcct gaaactcaga atccagattg cactacagtt

601 accagcgctg gaggtgatga aaacggtgcg gagttagaag atgaagatga tggggaacct

661 gatgagggtg aggaagagtg a

LOCUS BN000822 741 bp mRNA linear INV 16-MAY-2006

DEFINITION TPA_inf: Schistosoma mansoni mRNA for putative high mobility group

B3 protein (hmgb3 gene).

ACCESSION

BN000822 REGION: 90..830

VERSION BN000822.1 GI:97976794

KEYWORDS Third Party Annotation; TPA; high mobility group B3 protein; hmgb3

gene; TPA:INFERENTIAL.

SOURCE Schistosoma mansoni

ORGANISM

Schistosoma mansoni

Eukaryota; Metazoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea;

somatoidea; Schistosomatidae; Schistosoma.

s-Neto,E., Guimaraes,P.E., Verjovski-Almeida,S., Stros,M. and

ins from the human blood flukes Schistosoma mansoni

) Verjovski-Almeida S., Biochemistry,

Paulo, Av. Lineu Prestes 748, Sao Paulo, SP

CD079164.1 1-490

a mansoni"

e="mRNA"

Strigeidida; Schisto

REFERENCE 1

AUTHORS de Oliveira,F.M.B., de Abreu da Silva,I.C., Rumjanek,F.D.,

Dia

Fantappie,M.R.

TITLE Cloning the genes and DNA binding properties of high mobility grou

B1 (HMGB1) prote

and Schistosoma japonicum

JOURNAL (er) Gene DOI:10.1016/j.gene.2006.03.001

REFERENCE 2 (bases 1 to 741)

AUTHORS Verjovski-Almeida,S.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (25-AUG-2005

Universidade de Sao

05508-000, BRAZIL

PRIMARY TPA_SPAN PRIMARY_IDENTIFIER PRIMARY_SPAN COMP

1-490

477-728 CD069939.1 1-252

680-856 CD171320.1 2-178

FEATURES Location/Qualifiers

source 1..741

/organism="Schistosom

/mol_typ

/db_xref="taxon:

6183"

gene <1..>741

/gene="hmgb3"

CDS 1..741

/gene="hmgb3"

/function="association with chromatin structure"

ation of inflammation"

B3 protein"

29302.1

/function="medi

/codon_start=1

/product="putative high mobility group

/protein_id="

CAJ "

MTPYACFVQVIREEHRKKHPTENVIFSEFSKK

ERFNREMAHYIPPVGMKRGRRRRRIKDPSMPKRS

a caccatatgc atgtttcgtg

/db_xref="GI:97976795"

/translation="MMVKDKNRPKPP

CAEKWKLMNMEQRKCFEEMAKLDT

WSAFFFFCDAFRSKIRSEHPDWKVSDIAKELGRRWEECSDKEKYERRAQNDKLRYEQD

MEKYKAGLYVATKRARVGDQTKSNEILSCLHDQSHHKELGEASQISSDEVGRGRRTAN

VSKEPSMPKTFNGLHFSSFANAFRIKNS"

ORIGIN

1 atgatggtaa aagataagaa tcgtcctaaa ccaccgatg

61 caagtaatac gtgaggagca tcgaaaaaaa catccaacag agaatgttat tttcagtgaa

Figura 21 – Arquivo do GenBank contendo a seqüência integral do cDNA da SmHMGB3

5.4 – Análise da Expressão Gênica do gene SmHMGB1 em Vermes Adultos e

O mRNA de vermes machos e fêmeas, adultos e imaturos, foi fracionado e

121 ttttctaaga agtgcgcaga aaagtggaag ctcatgaata tggaacaacg aaagtgtttc

181 gaggaaatgg caaaattaga tacggagaga ttcaatcggg aaatggctca ttatatacca

241 ccagttggaa tgaagcgagg tcgtagacgg cgacgtatca aagatccaag tatgcctaaa

301 cgttcatggt ctgcattttt cttcttttgc gatgcatttc gatcaaagat tcgtagtgag

361 caccccgatt ggaaggttag tgatatcgcc aaggagttag gtagacgatg ggaagagtgt

421 tccgataaag agaaatacga aagacgcgca cagaatgata aattgcgtta tgaacaagat

481 atggagaaat acaaagctgg attgtatgta gcgaccaaac gtgctcgagt tggcgatcag

541 acaaaatcaa acgagatact gtcatgctta cacgatcagt cacatcataa ggagttaggt

601 gaggcaagtc aaatttcaag tgatgaagta ggacgaggtc gtagaacggc gaacgtatca

661 aaagaaccaa gtatgcctaa aacgttcaat ggtctgcatt tttcttcttt tgcgaatgca

721 tttcgaataa agaattcgta g

Imaturos, Machos e Fêmeas

hibridado com sondas radioativas específicas para SmHMGB1 e SmGAPDH, geradas

a partir de RT-PCR. Apesar do mRNA hibridado da SmHMGB1 migrar de forma

consistente com o seu peso molecular estimado, a visualização das marcações

radioativas (Figura 22 A) e quantificação de seus volumes, não demonstraram

diferenças significativas que pudessem estar relacionadas ao sexo ou estágio de

maturidade dos vermes (Figura 22 B).

Figura 22 – Análise da expressão gênica da SmHMGB1 por Northern Blot

(A) O RNA total de S. mansoni foi fracionado e hibridizado com sondas radioativas específicas para

SmHMGB1 (painel superior) e SmGAPDH (painel inferior) marcadas com α-

P. O RNA de vermes

adultos e imaturos é indicado através da letra M e I, respectivamente. (B) A quantificação relativa do

volume das marcações foi feita utilizando-se o Phosphorimager. O valor de intensidade obtido é

determinado pela divisão dos volumes relativos das marcações da SmHMGB1 pela SmGAPDH.

5.5 – Análise do Número de Cópias do Gene SmHMGB1 por Southern Blot

O DNA genômico de vermes machos e fêmeas adultos, foi fracionado e

hibridado com uma sonda radioativa específica para o gene SmHMGB1, gerada a

partir de RT-PCR. A análise da clivagem do gene da SmHMGB1 por enzimas de

restrição demonstra a presença de uma única marcação radioativa ao longo das

canaletas 1, 2 e 3 (Figura 23). Essas canaletas correspondem ao DNA genômico

fracionado após ser submetido a clivagem por 3 diferentes enzimas que não

apresentam especificidade para a seqüência do gene SmHMGB1. Na canaleta 4,

encontra-se fracionado o DNA genômico submetido a clivagem por uma enzima de

restrição que apresenta especificidade para uma seqüência interna ao gene

SmHMGB1. Nessa canaleta, podemos observar a presença de duas marcações,

decorrentes da hibridação da sonda radioativa com os dois fragmentos gerados após a

clivagem do gene. Esses resultados sugerem a presença de uma única cópia do gene

SmHMGB1 ao longo do genoma do S. mansoni. A “lavagem” da membrana foi

executada em condições de alta “estringência”, diminuindo as chances de haver

qualquer hibridação inespecífica entre a sonda e outras seqüências genômicas

homólogas.

Figura 23 – Southern Blot da SmHMGB1

As canaletas 1 a 3 correspondem ao DNA genômico fracionado clivado por 3 diferentes enzimas de

restrição que não apresentam especificidade para a seqüência da SmHMGB1. A canaleta 4 corresponde

ao DNA genômico fracionado digerido por uma enzima de restrição que apresenta especificidade por

uma única seqüência interna ao gene da SmHMGB1. A seta localizada a direita do painel destaca o

segundo fragmento de menor peso molecular gerado a partir da clivagem da SmHMGB1 e as

numerações a esquerda do painel correspondem ao padrão de peso molecular utilizado.

5.6 – Isolamento por PCR e Comparação do Mapa Estrutural dos Genes

SmHMGB1 e SjHMGB1 com o Gene HMGB1 Humano

Utilizando-se primers específicos baseados nas seqüências dos cDNAs

isolados das Sm/SjHMGB1 foram amplificados, a partir de DNA genômico,

fragmentos de 603 pb e 602 pb correspondentes aos genes SmHMGB1 e SjHMGB1,

respectivamente (Figura 24).

Figura 24 – Amplificação dos cDNAs e genes das HMGB1s de S. mansoni e S. japonicum

A canaleta 1 corresponde ao padrão de peso molecular de DNA de fago λ digerido pela enzima de

restrição HindIII; as canaletas 2 e 3 correspondem aos genes SjHMGB1e SmHMGB1 amplificados por

PCR (602 pb e 603 pb, respectivamente) e as canaletas 4 e 5 correspondem aos cDNAs SjHMGB1e

SmHMGB1 amplificados por RT-PCR (531 pb). Os números a esquerda do painel correspondem ao

peso molecular dos fragmentos do padrão λ HindIII.

O sequenciamento dos produtos de PCR obtidos a partir do DNA genômico do

S. mansoni e S. japonicum demonstrou que os genes Sm/SjHMGB1 apresentam

estruturas idênticas, encontrando-se organizados em três exons e dois introns (Figura

25), nos quais, os sítios doadores e aceptores de splice apresentam seqüências 5’ GT e

3’ AG, respectivamente (Tabela 4.1). Os pontos de convergência entre os exons e

introns nos genes Sm/SjHMGB1 e no gene da HMGB1 humana, ocorrem nas mesmas

posições ao longo de suas seqüências de aminoácidos, com exceção do exon E 2 dos

genes Sm/SjHMGB1 que, ao contrário do gene humano, não se encontra divido em

dois (E II e E III) (Figura 25).

Figura 25 – Esquema comparativo entre a estrutura do gene SmHMGB1 e gene HMGB1 humano

As posições e tamanhos relativos aos três exons, E 1, E 2 e E 3 e dois introns, 1 e 2 (apontados pelas

setas) do gene SmHMGB1 são indicados e comparados com as posições e tamanhos relativos dos

quatro exons e 3 introns do gene da HMGB1 humana. A comparação do posicionamento e alinhamento

dos pontos de convergência dos os exons e introns entre os genes de S. mansoni e humano encontram-

se demarcados na figura.

Tabela 1 – Sítios convergentes doadores e aceptores de splice

5.7 – Purificação das Proteínas Recombinantes Sm/SjHMGB1

As proteínas Sm/SjHMGB1 recombinantes, assim como seus diferentes

domínios, foram expressos em E. coli fusionadas a uma segmento de seis histidinas e

purificadas em cromatografia de afinidade.

A pureza e integridade das proteínas foram mensuradas através de seu

fracionamento, coloração e visualização em gel de poliacrilamida desnaturante. As

proteínas expressas apresentaram um padrão de migração de acordo com a dedução de

suas massas moleculares, não apresentando sinais de degradação (Figura 26).

Figura 26 – Purificação das proteínas Sm/SjHMGB1 recombinantes e seus diferentes domínios

(A) Diagrama representativo das proteínas Sm/SjHMGB1 recombinantes e seus fragmentos purificados.

O retângulo branco representa o domínio box A (aa 1 ao aa 83), o retângulo preto representa o domínio

box B (aa 93 ao 161) e o quadrado cinza representa a “cauda ácida” (aa 170 ao aa 176). As demais

porções representadas por uma linha preta correspondem a regiões “não estruturadas” das proteínas. A

abreviação “FL” representa a proteína inteira, “∆C” representa a proteína sem a “cauda ácida”, a letra

“A” representa o domínio box A e a letra “B” representa o domínio box B e suas regiões flanqueadoras

“não estruturadas”. (B) Fracionamento das proteínas Sm/SjHMGB1 recombinantes e seus fragmentos

em gel de poliacrilamida desnaturante SDS-PAGE 15%. As canaletas 1 e 2, 3 e 4, 5 e 6, 7 e 8

correspondem, respectivamente, as proteínas SmHMGB1 e SjHMGB1, proteínas SmHMGB1 e

SjHMGB1 sem a “cauda ácida”, domínio box A das proteínas SmHMGB1 e SjHMGB1 e domínio box

B das proteínas SmHMGB1 e SjHMGB1.

5.8 – SmHMGB1 Interage com DNA Sintético do Tipo Four-Way-Junctions

(4WJs)

DNAs sintéticos, mimetizando a estrutura conformacional conhecida como

Four-Way-Junctions, foram marcados radioativamente e utilizados como sonda em

um ensaio de retardamento de mobilidade eletroforética em gel de poliacrilamida não-

desnaturante.

A adição da SmHMGB1 à sonda de DNA 4WJs, acarreta a formação de um

complexo (I) que pode ser observado nas canaletas 3 a 9 na figura 27. A adição de

concentrações crescentes da SmHMGB1 à sonda de DNA 4WJs, promove a formação

de complexos adicionais com menor mobilidade eletroforética (II e III) (Figura 27,

canaletas 5 a 9). A presença de DNA linear não marcado, em concentrações até 100X

maior do que a do DNA 4WJs utilizado, apesar de diminuir a formação dos

complexos de menor mobilidade eletroforética (II e III), não é capaz de desfazer o

complexo de maior mobilidade (I).

Figura 27 – .Interação da SmHMGB1 com DNA 4WJs

Os experimentos de retardamento da mobilidade eletroforética foram realizados em gel de

poliacrilamida não desnaturante utilizando ~ 1.5 nM de DNA 4WJs e concentrações crescentes de 0.5,

1, 1.5 µM (canaletas 3 a 5) e 2 µM (canaletas 6 a 9) da proteína SmHMGB1 na presença ou ausência de

concentrações crescentes de 10, 50 e 200 nM (canaletas 7 a 9) de DNA linear competidor não marcado

radioativamente. Foram utilizados 1 µM de GST como controle negativo na canaleta 2. A canaleta 1

corresponde à sonda na ausência de proteína. As marcações “I”, “II” e “III” correspondem aos três

tipos de complexos observados ao longo do ensaio e o diagrama esquemático presente no lado direito

da figura, representa o DNA 4WJ na ausência da SmHMGB1 ou complexado a uma, duas ou três

moléculas da proteína.

5.9 – SmHMGB1 Interage com DNA Superenovelado Circular

DNAs circulares superenovelados, circulares relaxados e lineares, foram

utilizados na presença da proteína SmHMGB1, em ensaios de retardamento da

mobilidade eletroforética em gel de agarose.

A adição de concentrações crescentes da SmHMGB1 à mistura contendo

concentrações equimolares das três topologias de DNA, demonstra um retardamento

significativo na mobilidade do DNA superenovelado (I) quando comparado aos

demais (L e II) (Figura 28, canaletas 3 a 9).

Figura 28 – Interação da SmHMGB1 com DNAs de diferentes topologias

Foram utilizadas concentrações de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 e 4 µM (canaletas 2 a 9) da SmHMGB1 em

reações contendo uma mistura equimolar de DNA plasmidial circular superenovelado e relaxado e

DNA plasmidial linear. As canaletas 1 e 10 correspondem aos controles negativos. As indicações “I”,

“L” e “II” correspondem, respectivamente, ao DNA circular superenovelado, DNA linear e DNA

circular relaxado.

5.10 – Sm/SjHMGB1 Induzem o Superenovelamento Negativo do DNA

Plasmidial Relaxado na Presença da Topoisomerase I

Ensaios de superenovelamento conduzidos em condições fisiológicas de

concentração de NaCl demonstraram que, na presença de topoisomerase I, a

SmHMGB1 é capaz de induzir o superenovelamento de moléculas de DNA plasmidial

relaxadas (Figura 29, canaletas 3 e 4). A ausência da cauda ácida diminui a

capacidade da proteína em induzir o superenovelamento, principalmente, na

concentração de 35 µM (Figura 29, canaleta 6). Já o domínio box B, apesar de

apresentar uma menor capacidade de superenovelamento quando comparado à

proteína inteira (FL), também mostrou-se capaz de promover o superenovelamento de

DNA (Figura 29, canaletas 9 e 10). Finalmente, o domínio box A não demonstrou

qualquer atividade de superenovelamento nas concentrações experimentais de 17 e 35

µM (Figura 29, canaletas 7 e 8).

Não houve diferenças nos resultados obtidos entre a SjHMGB1 e a

SmHMGB1 (dado não demonstrado).

Figura 29 – Superenovelamento de DNA plasmidial relaxado induzido pela SmHMGB1

Plasmídeos circulares relaxados foram incubados na presença de topoisomerase I e concentrações

crescentes (17 µM e 35 µM) da SmHMGB1 e suas formas truncadas (canaletas 3 à 10). A canaleta 1

corresponde ao controle positivo do DNA superenovelado. A canaleta 2 corresponde ao controle

negativo do DNA superenovelado relaxado na presença da topoisomerase. A abreviação “FL”

representa a proteína inteira, “∆C” representa a proteína sem a cauda ácida, “A” representa somente o

domínio box A e “B” representa somente o domínio box B. Os sinais “+” e “-” representam,

respectivamente, a adição ou não de topoisomerase I à reação e os sinais “I” e “II” indicam,

respectivamente, as formas superenoveladas e relaxadas do DNA plasmidial.

Para a determinação do tipo de superenovelamento induzido pela SmHMGB1,

o gel de agarose contendo o DNA superenovelado fracionado longitudinalmente, foi

incubado em solução contendo cloroquina sendo submetido, posteriormente, a uma

rotação de 90º no sentido horário, seguido de um novo fracionamento longitudinal. A

cloroquina ao intercalar-se às bases nitrogenadas, diminui a velocidade de migração

do DNA superenovelado negativamente em relação ao DNA superenovelado

positivamente (STROS, 2001).

O resultado obtido demonstra que, assim como a HMGB1 humana, as

Sm/SjHMGB1 induzem o superenovelamento negativo de moléculas de DNA (Figura

30).

Figura 30 – Determinação e comparação do “tipo” de superenovelamento induzido pelas

Sm/SjHMGB1 em relação a HMGB1 humana

Plasmídeos circulares superenovelados foram relaxados na presença de topoisomerase I e incubados na

presença de 35 µM da HMGB1 humana e Sj/SmHMGB1. Após o fracionamento longitudinal em

primeira dimensão (Figura 29, canaleta 4), o gel foi incubado em uma solução contendo cloroquina e

submetido a um segundo fracionamento em segunda dimensão. A cloroquina reduz a velocidade de

migração do DNA superenovelado negativo em relação ao positivo. O esquema localizado à direita dos

painéis demonstra o padrão de migração dos DNAs superenovelados negativo e positivo em relação ao

relaxado. No fracionamento na segunda dimensão os DNAs superenovelados negativo e positivo

tendem a migrar, respectivamente, de forma mais lenta e mais rápida em relação ao DNA relaxado. Os

sinais “I” e “II” indicam, respectivamente, as formas superenoveladas e relaxadas do DNA plasmidial e

o asterisco indica a posição do DNA relaxado após o fracionamento longitudinal na segunda dimensão.

5.11 – SmHMGB1 Induz a Circularização de Fragmentos de DNA Linear de 123

e 66 pb

O ensaio de circularização baseia-se na capacidade da SmHMGB1 em

promover a dobra de fragmentos lineares de DNA, favorecendo o alinhamento e

ligação intramolecular de suas extremidades coesivas mediante a ação de T4 ligase. A

formação de mini-círculos de DNA decorrentes de ligações intramoleculares pode ser

comprovada através da sua resistência à enzima exonuclease III, capaz de digerir,

apenas moléculas de DNA lineares. Os ensaios de circularização com fragmentos de

66 pb demonstraram que, para concentrações de proteína entre 0.15 µM e 0.3 µM, a

SmHMGB1 apresenta uma capacidade de circularização ~ 3 vezes maior do que a

SmHMGB1 sem a cauda ácida (SmHMGB1∆C) (Figura 31 A, canaletas 4, 5, 7 e 8).

Nos ensaios com fragmentos de 123 pb, a SmHMGB1 e a SmHMGB1∆C

demonstraram capacidade muito semelhante em promover a circularização do DNA

linear (Figura 31 C, canaletas 3 à 8). O domínio box B da SmHMGB1 mostrou-se

capaz de promover a circularização dos fragmentos de 123 pb e 66 pb com

intensidade muito semelhante ao domínio box B da HMGB1 humana (Figura 31 B e

D, canaletas 7 à 10). Já o domínio box A da SmHMGB1, ao contrário do box A da

HMGB1 humana, não foi capaz de promover a circularização dos fragmentos de 66

pb e tampouco dos fragmentos de 123 pb (Figura 31, B e D, canaletas 3 à 6).

Finalmente, foi demonstrado que a SmHMGB1 apresenta maior capacidade de

circularização do que sua homóloga humana, sendo capaz de originar mini-círculos

em concentrações de 0.02 µM enquanto a HMGB1 humana apresenta atividade de

circularização a partir de 0.05 µM (Figura 31 E, canaletas 4, 5, 9 e 10).

A. C.

B. D. E.

Figura 31 – Determinação e comparação da atividade de circularização de DNA induzido pela

SmHMGB1 em relação a HMGB1 humana

As sondas radioativas de DNA linear de 66 pb (painéis A e B) e 126 pb (painéis C, D e E) foram

incubadas com concentrações crescentes de proteína recombinante (como indicado no topo dos painéis)

e em seguida, submetidas à T4 ligase. Nos painéis (A) e (B), a canaleta 13 corresponde ao controle

positivo dos mini-círculos obtidos através da incubação na presença de 0.05 µM da SmHMGB1

submetidos, posteriormente, à exonuclease III. A abreviação “FL” corresponde à proteína inteira, “∆C”

corresponde a proteína sem a cauda ácida, “A” corresponde ao domínio box A e “B” corresponde ao

domínio box B. Os sinais “+” e “-” correspondem, respectivamente, a adição ou não de T4 ligase ou

exonuclease III à reação e os sinais “LI” e “LII” indicam, respectivamente, os fragmentos de DNA

lineares e os mini-círculos.

6. DISCUSSÃO

Como mencionado anteriormente na seção 1.1.1, os parasitos do gênero

Schistosoma apresentam um ciclo de vida extremamente complexo, caracterizado por

uma marcante alteração morfológica e fisiológica ao longo de seu desenvolvimento.

Acredita-se que as transições entre os diversos estágios morfológicos do Schistosoma

estejam intimamente relacionadas aos estímulos e pressões adaptativas dos diferentes

habitats pelos quais transita ao longo de sua vida.

Nesse contexto, atribui-se uma grande relevância a estudos que visam mapear

os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos nos processos de diferenciação

e desenvolvimento do parasito através de questionamentos como: “De que forma os

estímulos ambientais disparam as respostas bioquímicas no parasito?” “Como é

controlado molecularmente o amadurecimento sexual do Schistosoma?” “Seria

possível intervir de forma específica no desenvolvimento do parasito impedindo sua

maturação e conseqüente ovoposição, patogênese e reinício do ciclo infeccioso?”

Diante dessas questões, diferentes grupos de pesquisa em esquistossomose

voltaram-se para a caracterização e identificação de mecanismos de regulação da

expressão gênica e sinalização celular, como no caso da via de sinalização através do

fator de crescimento TGF-ß (BEALL, 2000; BEALL, 2001; CARLO, 2007; DAVIES,

1998; DAVIES, 1999; FREITAS, 2007; OSMAN, 2001, 2004; OSMAN, 2006) ou

através da identificação e caracterização de fatores transcricionais (FANTAPPIE,

2003; FANTAPPIE, 2000; FRANCO, 1997; NABHAN, 2001; SERRA, 1999;

ZEMZOUMI, 1996), receptores nucleares (DE MENDONCA, 2000; DE

MENDONCA, 2002; FREEBERN, 1999a; FREEBERN, 1999b; HU, 2006a, 2006b;

LU, 2006; WU, 2006; WU, 2007a, 2007b; WU, 2007c), co-reguladores nucleares

(BERTIN, 2006; DE MORAES MACIEL, 2004; MANSURE, 2005; OGER, 2006) e

regiões promotoras de genes virulentos (BOBEK, 1988).

Fatores transcricionais são definidos basicamente como: “...proteínas capazes

de iniciar ou regular o processo de expressão gênica...”

. Sendo assim, uma das

características apresentadas por muitos dos fatores transcricionais é a presença de

domínios de ligação ao DNA capazes de reconhecer, de forma específica,

determinadas seqüências de nucleotídeos.

As Sm/SjHMGB1 apresentam dois domínios de interação ao DNA (domínios

box A e box B) constituídos por seqüências de aminoácidos bastante similares às de

suas homólogas (Figura 18). O domínio box A da Sm/SjHMGB1 apresenta uma

metionina na posição 12 (MET12) conservada nas demais seqüências homólogas

analisadas. Pöhler e colaboradores, através de ensaios de interação e modelagem

computacional, definiram a MET12 como sendo essencial para a interação do

domínio HMG-box do fator transcricional LEF-1 ao DNA cruciforme do tipo Four-

Way-Junctions (4WJs) (POHLER, 1997). Já o domínio box B das Sm/SjHMGB1,

apresenta os resíduos K96 e R97 descritos na literatura como fundamentais para o

processo de interação da proteína com o DNA (KNAPP, 2004; STOTT, 2006). Como

veremos mais adiante, apesar dos domínios box A e B da Sm/SjHMGB1 não serem

capazes de ligar-se a seqüências específicas de nucleotídeos, são capazes de

reconhecer e ligar-se a moléculas de DNA que apresentam estruturas “terciárias”

características.

Além dos dois domínios box de ligação ao DNA, as Sm/SjHMGB1 apresentam

uma extremidade carboxi-terminal constituída por uma seqüência alternada de

resíduos de aminoácidos ácidos, denominada cauda ácida. A cauda ácida das HMGBs

ALBERTS, 2002

está envolvida em uma série de eventos como, estabilização das interações proteína-

DNA, retenção da proteína no núcleo celular e deslizamento do nucleossomo ao longo

da dupla fita de DNA durante processos de ativação da transcrição gênica (UEDA,

2004). Ueda e colaboradores observaram através de ensaios de ativação da transcrição

de genes repórteres que, a seqüência final de resíduos de aminoácidos

211

DDDDE

215

presente na cauda ácida da HMGB1 humana é essencial para a ativação do processo

de transcrição gênica.

Apesar da seqüência final das Sm/SjHMGB1 (

170

EDSESDD

176

) serem

diferentes da seqüência final da HMGB1 humana, mais a frente serão discutidos

aspectos funcionais observados apartir da utilização do mutante da SmHMGB1 sem a

cauda ácida, a SmHMGB1∆ (Figura 26).

Enquanto a cauda ácida das proteínas HMGB de vertebrados superiores possui

uma seqüência de até 30 resíduos de aminoácidos ácidos ininterruptos, as

Sm/SjHMGB1 apresentam em sua cauda ácida uma seqüência de apenas 5 resíduos

intercalados (Figuras 18 e 19). Avaliando a seqüência e composição das caudas ácidas

das HMGB1 isoladas nos demais organismos, foi possível identificar um padrão que

sugere um aumento na quantidade de resíduos ácidos de forma proporcional ao

aumento na “complexidade” biológica dos organismos analisados (Figura 19). Dessa

forma, quanto mais primitiva a classe do organismo, menor a quantidade de resíduos

ácidos serão encontrados nas caudas ácidas de suas respectivas HMGB1. Sessa e

colaboradores publicaram, em 2006, um artigo mencionando a seqüência de uma

HMGB de Porífera (S. domuncula) apresentando uma cauda ácida com 9 resíduos de

aminoácidos ácidos intercalados (nº de acesso no GenBank:

AAR08136). O autor

sugere que a cauda ácida teria surgido inicialmente entre as primeiras classes de

metazoários para, logo em seguida, se perder ao longo da evolução dos filos

Echinodermata, Platyhelminthes e Nematoda (SESSA, 2007). Talvez, diante disso,

possamos considerar a hipótese de que a reduzida cauda ácida presente na HMGB1 do

Schistosoma seja, na verdade, um vestígio decorrente de um processo de divergência

evolutiva no filo Platyhelminthes.

Conforme caracterizações feitas para outros genes isolados em Schistosoma

mansoni (MORALES, 2004; OSMAN, 2006), os genes SmHMGB1 e SjHMGB1

também apresentam seqüências intrônicas curtas, variando entre 31 e 40 pb (Tabela

1). Esses dois genes apresentam estruturas idênticas encontrando-se organizados

através de três exons e dois introns (Figura 25). Os sítios doadores e aceptores de

splice nos dois introns de ambos os genes (SmHMGB1 e SjHMGB1) apresentam as

seqüências consenso estabelecidas GT, na extremidade 5’ e AG, na extremidade 3’,

conforme revisão de Senapathy e colaboradores (SENAPATHY, 1990) (Tabela 1).

Ainda em relação a estrutura gênica da Sm/SjHMGB1, foi demonstrado que os

domínios box A e box B encontram-se divididos em 2 exons cada.

Sessa e colaboradores afirmam que o segmento gênico respectivo ao box B

teria sua estrutura formada por 3 exons e que a explicação para a origem evolutiva

dessa estrutura estaria na inserção de 2 introns ao longo de uma seqüência gênica

primitiva denominada ProtoBox B (SESSA, 2007). Segundo Sessa, esse evento teria

ocorrido no início da evolução dos metazoários e seria suficiente para explicar o

motivo pelo qual o box B apresenta 2 introns distribuídos nas mesmas posições ao

longo de todos os metazoários analisados por ele. De fato, dentre as seqüências de

genes codantes para HMGB1 publicadas até o momento em metazoários, os genes

Sm/SjHMGB1 são os únicos caracterizados pela presença de um único intron

posicionado na região respectiva à tradução do box B. Porém, até o momento, não

existe na literatura qualquer informação à respeito de outras sequências genômicas

codantes para HMGB em Platyhelminthes com exceção das Sm/SjHMGB1. Além

disso, também não existem dados relativos à sequências genômicas codantes para

HMGB1 em filos mais primitivos do que os Platyhelminthes.

Diante desse panorama, podemos sugerir que a inserção do segundo intron ao

longo da região codante para o box B poderia ter ocorrido em algum momento ao

longo do tronco evolutivo dos metazoários após a divergência do filo Platyhelminthes

e não no início da evolução dos metazoários, como sugere Sessa.

Nas últimas décadas, com o advento da biologia molecular, a busca por genes

diferencialmente expressos entre vermes machos e fêmeas de Schistosoma mansoni

tornou-se uma constante entre pesquisadores da área. A possibilidade de se

compreender os processos bioquímicos da patogênese através da determinação da

expressão diferencial de genes específicos culminou, dentre outros, na descoberta do

gene F10 (ou p14), um gene que codifica uma proteína precursora da casca de ovo em

fêmeas de S. mansoni (BOBEK, 1986; SIMPSON, 1986). Atualmente, técnicas

inovadoras de high throughput como, a análise de microarranjos e SAGE (Serial

Analysis of Gene Expression) vem permitindo com que outros genes do parasito

possam ter seus padrões de expressão caracterizados (HOKKE, 2007; OJOPI, 2007;

WAISBERG, 2007). Os ensaios de Northern blot não demonstraram diferenças

significativas de expressão entre os mRNAs respectivos à SmHMGB1 de vermes

machos e fêmeas adultos (Figura 22 A e B, canaletas 2 e 4).

Em S. mansoni a dependência do contato com o macho para o

amadurecimento sexual da fêmea já foi demonstrado em uma série de trabalhos,

constituindo uma característica relevante cujos mecanismos moleculares têm sido

estudados por pesquisadores da área (GIANNINI, 1995; TEMPONE, 1999). No caso

do gene SmHMGB1, podemos observar através do ensaio de Northern blot utilizando

mRNAs extraídos de vermes machos e fêmeas oriundos de infecções unissexuais que,

a ausência de contato entre os vermes machos e fêmeas, nesse caso, não caracteriza

qualquer diferença significativa na sua expressão (Figura 22 A e B, canaletas 1 e 2). O

fato do gene SmHMGB1 não apresentar níveis de expressão diferenciados entre

vermes machos e fêmeas imaturos, sugere que a proteína HMGB1 de S. mansoni

possa estar envolvida em algum evento fundamental para a biologia do parasito. Os

resultados mencionados acima corroboram as informações obtidas através do banco

de dados do genoma funcional do S. mansoni que demonstra a presença de ESTs

referentes à SmHMGB1 em todos os estágios de desenvolvimento do parasito.

Em relação as SmHMGB2 e SmHMGB3, as informações obtidas in sílico

demonstraram a presença de ESTs em todos os estágios de desenvolvimento com

exceção de cercária e esquistossômulo. Em muitos dos organismos nos quais a HMG

teve sua expressão avaliada, foi observado um padrão de maior expressão nos estágios

iniciais de desenvolvimento. A ausência de ESTs respectivas as SmHMGB2 e

SmHMGB3 nos estágios de cercária e esquistossômulo, pode ser decorrente de uma

baixa expressão dessas isoformas em relação a SmHMGB1 ou de uma menor

eficiência na extração do mRNA nesses estágios de desenvolvimento. Gnanasekar e

colaboradores demonstraram posteriormente que, a expressão do gene SmHMGB1

chega a ser 10 vezes menor nos estágios de cercária e esquistossômulo quando

comparada às formas adultas (GNANASEKAR, 2006).

Com o isolamento dos cDNAs respectivos as isoformas 2 e 3, será possível

avaliar, em trabalhos futuros, o nível de expressão desses transcritos em todos os

estágios de desenvolvimento do parasito através de ensaios de RT-PCR em tempo

real.

Através do banco de dados do projeto do genoma funcional do S. mansoni

Nas duas últimas décadas, foram caracterizadas uma série de proteínas

capazes de ligar-se a moléculas de DNA apresentando conformações específicas

denominadas Four-Way-Junctions (4WJs) (ZLATANOVA, 1998). As 4WJs foram

inicialmente identificadas como estruturas assumidas pelo DNA, in vivo, durante

eventos de recombinação homóloga e replicação gênica (LILLEY, 1993). Entre 1989

e 1992, Bianchi e colaboradores demonstraram que a HMGB1 de mamíferos ligava-se

seletivamente a estruturas sintéticas cruciformes do tipo 4WJs (BIANCHI, 1989;

BIANCHI, 1992).

Pöhler e colaboradores demonstraram, em 1998, que o domínio HMG box era

capaz de ligar-se com maior afinidade a conformações planares de 4WJs. Essas

estruturas planares apresentam uma maior exposição de sua superfície de contato

devido ao distanciamento entre suas cadeias de DNA induzidas pela ausência de

cátions divalentes (Figura 32 A).

A. B.

Figura 32 – Modelagem molecular do DNA do tipo Four-Way-Junctions (4WJs)

(A) Através da adição de cátion divalentes, a estrutura planar aberta do DNA 4WJ assume uma

conformação denominada “stacked X-structure”, induzida pela acomodação da estrutura e pela rotação

da molécula em torno de seu próprio eixo. A diminuição na simetria da molécula, nesse caso, passa a

ser caracterizada por organizações distintas das cadeias simples de DNA que a constituem. Duas das

cadeias dispõem-se continuamente (*) ao longo do eixo central da molécula, passando através do ponto

de interseção denominado “strand exchange” enquanto, de forma contrária, as outras duas cadeias

dispõem-se alternadamente, definindo o ponto de interseção entre as hélices a partir de seu cruzamento

na posição central do eixo da molécula. Na “stacked X-structure”, as cadeias simples de DNA

contínuas estão dispostas em direções contrárias, caracterizando uma estrutura antiparalela. Adaptado

de <

http://www.nature.com/nrm/journal/v2/n6/slideshow/nrm0601_433a_bx2.html >. Acesso em Set.,

de 2007. (B) Modelagem computacional do complexo formado pelo domínio HMG box do fator

transcricional LEF-1 e pelo DNA do tipo 4WJ. O HMG box liga-se a um dos “braços” da estrutura

através do sulco menor no ponto de “strand exchange”. O domínio HMG box está representado em

laranja, o DNA 4WJs em cinza. As alfa-hélices 1 e 2 do domínio HMG box, estão posicionadas sobre o

centro da estrutura do DNA 4WJs. Retirado de: PÖHLER, 1998, pág. 823.

Através de ensaios de retardamento na mobilidade eletroforética,

demonstramos que a HMGB1 de S. mansoni é capaz de ligar-se a estruturas sintéticas

de DNA planar/cruciforme. Apesar da ausência de dados relativos à constante de

afinidade (Kd), podemos assumir que a SmHMGB1 liga-se preferencialmente ao

DNA 4WJs do que ao DNA linear. A análise do sinal obtido na canaleta 10 da figura

26 demonstra que, mesmo na presença de concentrações cem vezes maiores de DNA

linear, o complexo primário (I) formado pela SmHMGB1 e pelo DNA 4WJ não é

desfeito. Apesar de muitas proteínas dependerem de mecanismos de oligomerização

para estabelecer interações com DNAs do tipo 4WJ (PARKINSON, 1997; POHLER,

1996; WHITE, 1996), o domínio HMG box A estabelece sua interação com o referido

substrato através de uma relação estequiométrica de 1:1. Isso ocorre devido ao

posicionamento das α-hélices 1 e 2 presentes no domínio box A que, dispostas sobre o

centro da estrutura do DNA 4WJs, acabam inviabilizando a acomodação de um

segundo domínio protéico de interação (Figura 32 B). Nesse contexto, a visualização

de complexos secundários (II) (Figura 27, canaletas 5 a 9) e terciários (III) (Figura 27,

canaleta 6), pode ser conseqüência de ligações inespecíficas da SmHMGB1 à outras

regiões do substrato ou da sua oligomerização através das proteínas GSTs fusionadas

às porções amino terminais na proteína recombinante. Apesar dos ensaios in vitro

demonstrarem uma alta afinidade dos domínios HMG box pela estrutura

planar/cruciforme de 4WJs, existem poucas evidências mostrando um envolvimento

direto das HMGs em processos biológicos de replicação ou recombinação gênica.

Uma possível interpretação para essa interação é a de que o reconhecimento do DNA

4WJs possa ser uma coincidência acidental decorrente da similaridade entre a

estrutura do 4WJs e a estrutura do verdadeiro substrato de interação dessas proteínas.

Além do mais, o fato de que a estrutura planar do DNA 4WJs ocorre exclusivamente

na ausência de Mg

, diminui consideravelmente a probabilidade dessa interação estar

ocorrendo em nível fisiológico. Contudo, a demonstração de uma interação específica

entre a SmHMGB1 e o DNA 4WJs revela um mecanismo de reconhecimento que

pode ser extrapolado para outros tipos de estruturas assumidas pelas moléculas de

DNA in vivo.

Diante da capacidade da SmHMGB1 em interagir com o DNA do tipo 4WJs

resolvemos testar, através de ensaios de mobilidade eletroforética em gel de agarose, a

sua especificidade de ligação com outros arranjos estruturais assumidos pelo DNA.

Na figura 28, apesar de observarmos um leve retardamento na migração das

bandas correspondentes ao DNA linear e circular relaxados, fica nítido um maior

retardamento por parte do DNA superenovelado plectonêmico na presença de

concentrações crescentes da SmHMGB1. Travers e Muskhelishvili em artigo recente

publicado no EMBO reports, associaram a função da HMGB à regiões de DNA

plectonêmicas originadas durante a desestruturação dos nucleossomos (TRAVERS,

2007).

Figura 33 – Modelo de topologia assumida pelo DNA nos sítios de iniciação de transcrição gênica

em eucariotos

A figura ilustra a formação de uma estrutura de DNA plectonêmica formada a partir da desestruturação

de dois nucleossomos. A estrutura azul e branca corresponde à cromatina, os dois círculos azuis

isolados correspondem aos octâmeros de histona dissociados do DNA, o círculo laranja corresponde a

HMGB e a forma oval verde corresponde à maquinaria basal de transcrição gênica. Adaptado de:

TRAVERS E MUSKHELISHVILI, 2007, pág. 149.

100

O desligamento do DNA toroidal que circunda as histonas nucleossomais faz

com que a energia decorrente do torque existente na dupla fita e a ausência da base

cilíndrica do octâmero, favoreça a transição do DNA para a conformação

plectonêmica (Figura 10 B e C e Figura 33). Nesse contexto, a HMGB atuaria através

da estabilização da estrutura superenovelada do DNA e/ou através da modulação

estrutural desse DNA de forma a favorecer sua interação com a maquinaria basal de

transcrição (Figura 14 A e D e Figura 33).

Além de ligar-se preferencialmente ao DNA superenovelado, a SmHMGB1 é

capaz de promover o superenovelamento do DNA relaxado na presença de

topoisomerase I (Figura 29, canaletas 3 e 4 e Figura 30). A topoisomerase I cataliza a

quebra transitória de uma ligação fosfodiéster em uma das fitas da cadeia dupla do

DNA possibilitando a sua livre rotação ao redor da fita íntegra. Na ausência da

SmHMGB1, a quebra de uma das fitas do DNA superenovelado circular favorece a

dissipação da energia contida na estrutura, permitindo o seu rearranjo em uma

estrutura estável “relaxada” (Figura 29, canaleta 2). O mecanismo pelo qual a

SmHMGB1 reverte o relaxamento do DNA circular baseia-se na rotação da fita

simples quebrada ao redor da fita íntegra, no sentido oposto ao do relaxamento da

molécula. Por serem forças contrárias, a equivalência na atividade da topoisomerase I

e da SmHMGB1 é experimentalmente representada através da formação de estruturas

superenoveladas intermediárias dispostas ao longo da matriz de agarose em um

padrão de “escada” (Figura 29, canaletas 3 a 6, 9 e 10).

Experimentos conduzidos com a proteína humana demonstraram uma redução

de até 4 vezes na atividade de superenovelamento da HMGB1 em relação a sua forma

∆C (sem a cauda ácida) (STROS, 1994). Nesse contexto, é sugerido que a grande

101

cauda ácida da proteína humana (30 resíduos de aa negativos) module negativamente

a atividade de superenovelamento da HMGB1.

Estudos de chemical-shift perturbation mapping em RMN demonstraram que

a dinâmica dessa inibição ocorre através da interação eletrostática intramolecular

entre a cauda ácida da HMGB1 e os resíduos N92 e A93 presentes no domínio box B

da proteína. Esses resíduos localizam-se próximos aos resíduos K96 e R97,

responsáveis pela interação do box B com a molécula de DNA. Através de uma

estrutura flexível denominada “região de conexão”, a cauda ácida é projetada sobre o

domínio box B, favorecendo sua interação com os resíduos N92 e A93, encobrindo os

resíduos K96 e R97 e inviabilizando espacialmente a ligação destes com o DNA

(Figura 18) (KNAPP, 2004; STOTT, 2006; WANG, 2007; WATSON, 2007).

Em relação a SmHMGB1, o domínio box B e a construção ∆C apresentam

uma menor atividade de superenovelamento quando comparados a proteína inteira

(Figura 29, canaletas 5, 6, 9 e 10). Curiosamente e de forma inversa ao demonstrado

para a proteína humana, a ausência da cauda ácida na SmHMGB1 promove uma

considerável diminuição na atividade de superenovelamento em função do aumento

na concentração de proteína. Em artigo publicado por Štros no periódico

Biochemistry, em 2001, foi demonstrado efeito similar apresentado por um mutante

da proteína HMGB1 humana (STROS, 2001). Anteriormente o autor havia

demonstrado, através de microscopia eletrônica que, em razões estequiométricas

acima de 250:1 entre HMGB/DNA, a proteína ligada ao DNA tende a associar-se

formando oligômeros que, por sua vez, tendem a associar-se cooperativamente em

complexos maiores (Figura 34) (STROS, 1998b).

102

A C

Figura 34 – Experimento de microscopia eletrônica demonstrando a formação de complexos

entre o domínio box B da proteína HMGB1 humana e o DNA

(A) DNA ciecular na ausência de proteína. (B) DNA circular na presença do domínio B da HMGB1

humana em uma razão estequiométrica de aproximadamente 500:1 entre proteína/DNA e (C) 1000:1

proteína/DNA. Adaptado de: ŠTROS, 1998b, pág. 432.

Diante disso, o autor sugere que a diminuição da atividade de

superenovelamento apresentada pelo mutante possa ser decorrente de um

favorecimento na formação de oligômeros que, em última instância, estariam

reduzindo a atividade de superenovelamento da proteína. Nesse caso, pode ser que a

ausência da pequena cauda ácida da SmHMGB1 esteja favorecendo a formação de

oligômeros e consequentemente, reduzindo a atividade de supernovelamento do DNA

relaxado. Em relação ao domínio box A da SmHMGB1, assim como descrito para a

HMGB1 humana, não foi detectado qualquer atividade de superenovelamento

intrínseca (Figura 29, canaletas 7 e 8).

103

Conforme mencionado na seção 1.2.2 os superenovelamentos positivo e

negativo do DNA distinguem-se, respectivamente, por um maior ou menor número de

voltas completas em torno do eixo central da molécula em um determinado período.

Dessa forma, uma molécula de DNA superenovelada negativamente, além de

apresentar uma maior exposição de sua bases nitrogenadas, apresenta uma maior

flexibilidade quando comparada ao DNA superenovelado positivamente (SELVIN,

1992). A SmHMGB1 e a SjHMGB1 assim como a proteína HMGB1 humana,

induzem a formação de um superenovelamento negativo (Figura 10 e 30).

Segundo Travers e Muskhelishvili, a rápida associação e dissociação da

HMGB ao DNA favorecem uma dinâmica de superenovelamento e relaxamento da

molécula capaz de modular a associação de outras proteínas reguladoras como a RNA

polimerase e fatores transcricionais (Figura 14 A e D) (TRAVERS, 2007).

Fisiologicamente postula-se que o superenovelamento negativo favoreça, em

relação ao positivo, a interação de proteínas reguladoras ao longo de diferentes

trechos da molécula de DNA (STROS, 2000). Diante disso poderíamos sugerir que a

atividade de superenovelamento induzida pela Sm/SjHMGB1 estaria modulando

positivamente a acessibilidade de proteínas reguladoras ao DNA.

Além da capacidade de ligar-se preferencialmente ao DNA 4WJ, ao DNA

superenovelado e da sua capacidade em promover o superenovelamento em moléculas

de DNA, proteínas da família HMGB apresentam a propriedade de promover dobras

na molécula de DNA (GRASSER, 2003; MURPHY, 1999; PAULL, 1993; PIL, 1993;

SHEFLIN, 1989; STROS, 1994; STROS, 1998a; THOMAS, 2001; TRAVERS,

2000). Foi demonstrado para as HMGB1 de diversas espécies, suas capacidades em

promover a dobra de moléculas de DNA através de ensaios de circularização

mediados pela enzima T4 ligase (PAULL, 1993; PIL, 1993; STROS, 1998a; TEO,

104

1995). Esse ensaio caracteriza-se pela capacidade de uma dada proteína em promover

a dobra de fragmentos de DNA menores do que 150 pb favorecendo a formação de

minicírculos através da atividade catalítica da T4 ligase.

Durante os ensaios de circularização utilizando sondas de 66 pb a

SmHMGB1∆C apresentou o mesmo padrão obtido nos ensaios de superenovelamento.

Ou seja, em relação à SmHMGB1, a construção sem a cauda ácida demonstrou uma

menor atividade de circularização em função do aumento na concentração de proteína

(Figura 31 A, canaletas 6 à 8). Essa mesma variação praticamente desapareceu nos

ensaios de circularização com fragmentos de DNA de 123 pb (Figura 31 C, canaletas

6 à 8). Nesse caso, a proteína sem a cauda ácida apresentou uma atividade muito

semelhante a demonstrada pela proteína nativa (Figura 31, canaletas 3 à 8). Talvez

essa diferença observada na atividade de circularização dos fragmentos de 66 e 123

pb entre o mutante sem a cauda ácida e a proteína nativa seja decorrente da diferença

na superfície de contato das sonda utilizadas. Nesse caso, a sonda de 66 pb

corresponde a uma redução de 50% na superfície de contato em relação à sonda de

123 pb. Essa redução na superfície de contato pode estar favorecendo a formação de

oligômeros e acarretando a diminuição da atividade de bending da proteína sem a

cauda ácida. Novamente, e assim como mencionado na discussão sobre os ensaios de

superenovelamento, esse resultado vai de encontro a observações feitas para a

HMGB1 humana que, na ausência da cauda ácida apresenta uma maior atividade de

circularização quando comparada à proteína nativa (GRASSER, 1998; STROS,

1998a). Assim como o domínio box B da proteína humana, o box B da SmHMGB1 é

capaz de promover a circularização de fragmentos de DNA de 66 e 123 pb (Figura 31

B e D, canaletas 7 à 10). O domínio box A da SmHMGB1, por sua vez, não apresenta

qualquer atividade de circularização quando comparado ao box A da proteína humana

105

(Figura 31 B e D, canaletas 3 à 6). Uma possível explicação para essa diferença

exigiria uma avaliação minuciosa no posicionamento dos 36 diferentes resíduos de

aminoácidos encontrados ao longo do domínio box A da SmHMGB1 em relação à

HMGB1 humana. A partir da identificação e escolha racional dos resíduos que

poderiam estar envolvidos com a atividade de circularização, seria necessário a

combinação de mutações pontuais e ensaios funcionais para a confirmação dos

resíduos determinantes na atividade de circularização da proteína.

Finalmente, comparações entre a capacidade de circularização da SmHMGB1

e da HMGB1 humana demonstraram uma maior eficiência da proteína do parasito que

foi capaz de promover a circularização de fragmentos de 123 pb a partir de uma

concentração 2.5 vezes menor do que a utilizada para a proteína humana (Figura 31 E,

canaletas 4, 5, 9 e 10).

Bianchi e Agresti demonstraram, in vivo, que a associação estável de

receptores glicocorticóides (GR) ao DNA é viabilizada através da presença local da

HMGB1 (BIANCHI, 2005). Os autores citam a possibilidade de que essa

estabilização seja decorrente de dobras introduzidas na molécula de DNA através da

sua interação com a HMGB1. O mesmo é sugerido em relação a regiões promotoras

que, ao serem dobradas favoreceriam a interação de uma série de proteínas associadas

à regulação de genes específicos (Figura 12 B e 14 A e D).

106

7. CONCLUSÕES

Apesar de proteínas do tipo HMGB1 já terem sido isoladas em uma série de

organismos como plantas, leveduras, invertebrados e vertebrados, apenas algumas

delas tiveram seus genes e funções caracterizadas. Estudos preliminares

desenvolvidos por Fantappié e colaboradores, em 1994, sugeriram a ocorrência de

proteínas do tipo HMG em Schistosoma mansoni, no entanto, dados correspondentes

ao isolamento do cDNA, organização do gene e função, ainda não haviam sido

investigados.

Nesse trabalho foi possível, através de informações disponibilizadas pelo

projeto do genoma funcional do Schistosoma mansoni e do genoma do Schistosoma

japonicum, isolar dois diferentes genes que traduzem uma proteína homóloga a

HMGB1 humana. As proteínas isoladas em S. mansoni e S. japonicum foram

denominadas, respectivamente, SmHMGB1 e SjHMGB1.

Além disso, foi possível a identificação, in sílico, de outras duas isoformas da

proteína HMGB1 em S. mansoni denominadas, respectivamente, SmHMGB2 e

SmHMGB3.

Além de encontrar-se presente em uma única cópia ao longo do genoma do S.

mansoni e de não apresentar diferenças significativas nos níveis de expressão entre

vermes machos e fêmeas, adultos e imaturos, a caracterização estrutural dos genes

Sm/SjHMGB1 demonstrou uma organização distinta daquela apresentada pelos

demais homólogos isolados em outros metazoários.

Enquanto os genes das Sm/SjHMGB1 apresentam um único intron na região

codante para o domínio box B, os demais metazoários caracterizados até o momento

apresentam dois introns presentes ao longo da mesma região.

107

Em relação à estrutura da Sm/SjHMGB1, observamos que a extremidade

carboxi terminal denominada cauda ácida apresenta uma baixa similaridade quando

comparada a suas homólogas (~16%).

Estudos funcionais utilizando a proteína SmHMGB1 recombinante

demonstraram sua capacidade em interagir com maior especificidade a moléculas de

DNA apresentando estrutura superenovelada. Além disso, a SmHMGB1 também

mostrou-se capaz de interagir com alta afinidade a estruturas planares cruciformes de

DNA do tipo Four-Way-Junctions (4WJs).

Estudos comparativos demonstraram que assim como a proteína HMGB1

humana as Sm/SjHMGB1, quando na presença da enzima topoisomerase I, são

capazes de induzir o superenovelamento negativo de moléculas de DNA circular

relaxado.

Em relação às proteínas nativas, a ausência da cauda ácida na Sm/SjHMGB1

acarreta em uma diminuição da atividade de superenovelamento em função do

aumento na concentração de proteína utilizada experimentalmente.

Resultados de circularização mediados por T4 ligase demonstraram uma maior

eficiência da Sm/SjHMGB1 na circularização de moléculas lineares de DNA de 123

pb quando comparada a HMGB1 humana. Além disso, em relação à proteína nativa, a

ausência da cauda ácida na Sm/SjHMGB1 acarretou, assim como no ensaio de

superenovelamento, em uma diminuição na capacidade de circularização em função

do aumento na concentração de proteína e do tamanho dos fragmentos de DNA

utilizados no experimento.

Os resultados de superenovelamento e circularização utilizando a construção

Sm/SjHMGB1∆C demonstraram que, apesar de pequena, a cauda ácida presente na

proteína do parasito desempenha papel relevante na função de regulação estrutural de

108

moléculas de DNA lineares e circulares relaxadas. A sugestão, portanto, é de que ao

contrário da HMGB1 humana que apresenta uma extremidade carboxi terminal capaz

de inibir as atividades de superenovelamento e circularização, a pequena extremidade

carboxi terminal da Sm/SjHMGB1 pode estar interferindo positivamente na

modulação de ambos os processos.

Finalmente, ao contrário do que já havia sido observado com a HMGB1

humana, demonstramos que a região que compreende o domínio box A da

SmHMGB1 não é capaz de promover a circularização de moléculas de DNA. Já o

domínio box B, parece estar envolvido tanto na atividade de superenovelamento

quanto de circularização.

A capacidade das Sm/SjHMGB1 em promover alterações estruturais nas

moléculas de DNA, pode ser a explicação mais plausível para o seu papel no processo

de regulação da transcrição gênica no parasito. Essa regulação seria explicada através

do favorecimento da interação de outras proteínas reguladoras entre sí ou com suas

sequências específicas ao longo da molécula de DNA.

Durante a execução desse trabalho e após a submissão de nosso paper,

Gnanasekar e colaboradores publicaram um trabalho demonstrando a transcrição,

expressão e secreção da SmHMGB1 em ovos de S. mansoni. Através de ensaios

utilizando macrófagos peritoneais de camundongos, Gnanasekar sugeriu um possível

papel pró-inflamatório da SmHMGB1 demonstrando a sua capacidade em induzir

citocinas como o TNFalpha, IL-1Ralpha, IL-2Ralpha, IL-6, IL-13, IL-13Ralpha1, IL-

15 e MIP-1alpha. Diante desses resultados o autor sugere que a SmHMGB1 possa

estar atuando como uma molécula chave no desenvolvimento da resposta imunológica

do hospedeiro em decorrência da infecção pelo parasito (GNANASEKAR, 2006).

109

O papel da Sm/SjHMGB1, seja como reguladora transcricional ou

imunomoduladora, ainda precisa ser mais bem estabelecido e relacionado aos

processos biológicos do S. mansoni e S. japonicum. O conhecimento gerado através

desse trabalho pode ser caracterizado, em última instância, como parte dos esforços

realizados para decifrar a complexa biologia desse parasito e sua associação com a

doença.

110

REFERÊNCIAS

AGRESTI, A.; BIANCHI, M. E. HMGB proteins and gene expression. Curr Opin

Genet Dev, v. 13, n. 2, p. 170-178, Apr, 2003.

ALTSCHUL, S. F.; GISH, W.; MILLER, W.; MYERS, E. W.; LIPMAN, D. J. Basic

local alignment search tool. J Mol Biol, v. 215, n. 3, p. 403-410, Oct 5, 1990.

BACOLLA, A.; WOJCIECHOWSKA, M.; KOSMIDER, B.; LARSON, J. E.;

WELLS, R. D. The involvement of non-B DNA structures in gross chromosomal

rearrangements. DNA Repair (Amst), v. 5, n. 9-10, p. 1161-1170, Sep 8, 2006.

BEALL, M. J.; MCGONIGLE, S.; PEARCE, E. J. Functional conservation of

Schistosoma mansoni Smads in TGF-beta signaling. Mol Biochem Parasitol, v. 111,

n. 1, p. 131-142, Nov, 2000.

BEALL, M. J.; PEARCE, E. J. Human transforming growth factor-beta activates a

receptor serine/threonine kinase from the intravascular parasite Schistosoma mansoni.

J Biol Chem, v. 276, n. 34, p. 31613-31619, Aug 24, 2001.

BEDNAR, J.; HOROWITZ, R. A.; GRIGORYEV, S. A.; CARRUTHERS, L. M.;

HANSEN, J. C.; KOSTER, A. J.; WOODCOCK, C. L. Nucleosomes, linker DNA,

and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding

and compaction of chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 95, n. 24, p. 14173-

14178, Nov 24, 1998.

BERGQUIST, R.; AL-SHERBINY, M.; BARAKAT, R.; OLDS, R. Blueprint for

schistosomiasis vaccine development. Acta Trop, v. 82, n. 2, p. 183-192, May, 2002.

BERTIN, B.; OGER, F.; CORNETTE, J.; CABY, S.; NOEL, C.; CAPRON, M.;

FANTAPPIE, M. R.; RUMJANEK, F. D.; PIERCE, R. J. Schistosoma mansoni

CBP/p300 has a conserved domain structure and interacts functionally with the

nuclear receptor SmFtz-F1. Mol Biochem Parasitol, v. 146, n. 2, p. 180-191, Apr,

2006.

BIANCHI, M. E.; BELTRAME, M.; PAONESSA, G. Specific recognition of

cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science, v. 243, n. 4894 Pt 1, p. 1056-

1059, Feb 24, 1989.

BIANCHI, M. E.; FALCIOLA, L.; FERRARI, S.; LILLEY, D. M. The DNA binding

site of HMG1 protein is composed of two similar segments (HMG boxes), both of

which have counterparts in other eukaryotic regulatory proteins. Embo J, v. 11, n. 3,

p. 1055-1063, Mar, 1992.

111

BIANCHI, M. E.; AGRESTI, A. HMG proteins: dynamic players in gene regulation

and differentiation. Curr Opin Genet Dev, v. 15, n. 5, p. 496-506, Oct, 2005.

BOBEK, L.; REKOSH, D. M.; VAN KEULEN, H.; LOVERDE, P. T.

Characterization of a female-specific cDNA derived from a developmentally

regulated mRNA in the human blood fluke Schistosoma mansoni. Proc Natl Acad

Sci U S A, v. 83, n. 15, p. 5544-5548, Aug, 1986.

BOBEK, L. A.; REKOSH, D. M.; LOVERDE, P. T. Small gene family encoding an

eggshell (chorion) protein of the human parasite Schistosoma mansoni. Mol Cell

Biol, v. 8, n. 8, p. 3008-3016, Aug, 1988.

BOEGER, H.; GRIESENBECK, J.; STRATTAN, J. S.; KORNBERG, R. D.

Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter. Mol Cell, v.

11, n. 6, p. 1587-1598, Jun, 2003.

BONALDI, T.; LANGST, G.; STROHNER, R.; BECKER, P. B.; BIANCHI, M. E.

The DNA chaperone HMGB1 facilitates ACF/CHRAC-dependent nucleosome

sliding. Embo J, v. 21, n. 24, p. 6865-6873, Dec 16, 2002.

BRINDLEY, P. J. The molecular biology of schistosomes. Trends Parasitol, v. 21, n.

11, p. 533-536, Nov, 2005.

CARLO, J. M.; OSMAN, A.; NILES, E. G.; WU, W.; FANTAPPIE, M. R.;

OLIVEIRA, F. M.; LOVERDE, P. T. Identification and characterization of an R-

Smad ortholog (SmSmad1B) from Schistosoma mansoni. Febs J, v. 274, n. 16, p.

4075-4093, Aug, 2007.

CARTER, C. E.; COLLEY, D. G. The molecular biology of schistosomes. Parasitol

Today, v. 2, n. 3, p. 84, Mar, 1986.

CHAU, K. Y.; KEANE-MYERS, A. M.; FEDELE, M.; IKEDA, Y.; CREUSOT, R.

J.; MENOZZI, L.; COUSINS, D. J.; MANFIOLETTI, G.; FEIGENBAUM, L.;

FUSCO, A.; ONO, S. J. IFN-gamma gene expression is controlled by the architectural

transcription factor HMGA1. Int Immunol, v. 17, n. 3, p. 297-306, Mar, 2005.

CHEEVER, A. W.; HOFFMANN, K. F.; WYNN, T. A. Immunopathology of

schistosomiasis mansoni in mice and men. Immunol Today, v. 21, n. 9, p. 465-466,

Sep, 2000.

CHITSULO, L.; ENGELS, D.; MONTRESOR, A.; SAVIOLI, L. The global status of

schistosomiasis and its control. Acta Trop, v. 77, n. 1, p. 41-51, Oct 23, 2000.

DAS, D.; SCOVELL, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-

binding protein/TATA complex. J Biol Chem, v. 276, n. 35, p. 32597-32605, Aug 31,

2001.

112

DASGUPTA, A.; SCOVELL, W. M. TFIIA abrogates the effects of inhibition by

HMGB1 but not E1A during the early stages of assembly of the transcriptional

preinitiation complex. Biochim Biophys Acta, v. 1627, n. 2-3, p. 101-110, Jun 19,

2003.

DAVIES, S. J.; SHOEMAKER, C. B.; PEARCE, E. J. A divergent member of the

transforming growth factor beta receptor family from Schistosoma mansoni is

expressed on the parasite surface membrane. J Biol Chem, v. 273, n. 18, p. 11234-

11240, May 1, 1998.

DAVIES, S. J.; PEARCE, E. J. Atypical post-translational modification and targeting

of a Schistosoma mansoni surface receptor, a member of the transforming growth

factor beta receptor family of cell surface receptors. Mol Biochem Parasitol, v. 104,

n. 2, p. 299-310, Nov 30, 1999.

DE MENDONCA, R. L.; ESCRIVA, H.; BOUTON, D.; ZELUS, D.; VANACKER,

J. M.; BONNELYE, E.; CORNETTE, J.; PIERCE, R. J.; LAUDET, V. Structural and

functional divergence of a nuclear receptor of the RXR family from the trematode

parasite Schistosoma mansoni. Eur J Biochem, v. 267, n. 11, p. 3208-3219, Jun,

2000.

DE MENDONCA, R. L.; BOUTON, D.; BERTIN, B.; ESCRIVA, H.; NOEL, C.;

VANACKER, J. M.; CORNETTE, J.; LAUDET, V.; PIERCE, R. J. A functionally

conserved member of the FTZ-F1 nuclear receptor family from Schistosoma mansoni.

Eur J Biochem, v. 269, n. 22, p. 5700-5711, Nov, 2002.

DE MORAES MACIEL, R.; DE SILVA DUTRA, D. L.; RUMJANEK, F. D.;

JULIANO, L.; JULIANO, M. A.; FANTAPPIÂE, M. R. Schistosoma mansoni

histone acetyltransferase GCN5: linking histone acetylation to gene activation. Mol

Biochem Parasitol, v. 133, n. 1, p. 131-135, Jan, 2004.

DUNAWAY, M.; OSTRANDER, E. A. Local domains of supercoiling activate a

eukaryotic promoter in vivo. Nature, v. 361, n. 6414, p. 746-748, Feb 25, 1993.

DUNDR, M.; HOFFMANN-ROHRER, U.; HU, Q.; GRUMMT, I.; ROTHBLUM, L.

I.; PHAIR, R. D.; MISTELI, T. A kinetic framework for a mammalian RNA

polymerase in vivo. Science, v. 298, n. 5598, p. 1623-1626, Nov 22, 2002.

FALLON, P. G.; MUBARAK, J. S.; FOOKES, R. E.; NIANG, M.;

BUTTERWORTH, A. E.; STURROCK, R. F.; DOENHOFF, M. J. Schistosoma

mansoni: maturation rate and drug susceptibility of different geographic isolates. Exp

Parasitol, v. 86, n. 1, p. 29-36, May, 1997.

FANTAPPIE, M.; OSMAN, A.; NILES, E. G.; ERICSSON, C.; LO VERDE, P. T.

Cloning of Schistosoma mansoni Seven in Absentia (SmSINA) Homologue, a Gene

Required for Ubiquitination of SmRXR1 and SmRXR2. Mol Biochem Parasitol, v.

Submitted, 2003.

113

FANTAPPIE, M. R.; OSMAN, A.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. Identification

and functional characterization of a member of the PUR-alpha family from

Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol, v. 110, n. 2, p. 373-390, Oct, 2000.

FOUSTERI, M.; VERMEULEN, W.; VAN ZEELAND, A. A.; MULLENDERS, L.

H. Cockayne syndrome A and B proteins differentially regulate recruitment of

chromatin remodeling and repair factors to stalled RNA polymerase II in vivo. Mol

Cell, v. 23, n. 4, p. 471-482, Aug, 2006.

FRANCO, G. R.; GARRATT, R. C.; TANAKA, M.; SIMPSON, A. J.; PENA, S. D.

Characterization of a Schistosoma mansoni gene encoding a homologue of the Y-box

binding protein. Gene, v. 198, n. 1-2, p. 5-16, Oct 1, 1997.

FREEBERN, W. J.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. RXR-2, a member of the

retinoid x receptor family in Schistosoma mansoni. Gene, v. 233, n. 1-2, p. 33-38, Jun

11, 1999a.

FREEBERN, W. J.; OSMAN, A.; NILES, E. G.; CHRISTEN, L.; LOVERDE, P. T.

Identification of a cDNA encoding a retinoid X receptor homologue from

Schistosoma mansoni. Evidence for a role in female-specific gene expression. J Biol

Chem, v. 274, n. 8, p. 4577-4585, Feb 19, 1999b.

FREITAS, T. C.; JUNG, E.; PEARCE, E. J. TGF-beta signaling controls embryo

development in the parasitic flatworm Schistosoma mansoni. PLoS Pathog, v. 3, n. 4,

p. e52, Apr, 2007.

GIANNINI, A. L.; LINHARES, S. V.; CARIDE, E. C.; BRAGA, V. M.;

RUMJANEK, F. D. Molecular aspects of Schistosoma mansoni female maturation.

Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 90, n. 2, p. 179-184, Mar-Apr, 1995.

GNANASEKAR, M.; VELUSAMY, R.; HE, Y. X.; RAMASWAMY, K. Cloning and

characterization of a high mobility group box 1 (HMGB1) homologue protein from

Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol, v. 145, n. 2, p. 137-146, Feb, 2006.

GOODWIN, G. H.; SANDERS, C.; JOHNS, E. W. A new group of chromatin-

associated proteins with a high content of acidic and basic amino acids. Eur J

Biochem, v. 38, n. 1, p. 14-19, Sep 21, 1973.

GRASSER, K. D.; TEO, S. H.; LEE, K. B.; BROADHURST, R. W.; REES, C.;

HARDMAN, C. H.; THOMAS, J. O. DNA-binding properties of the tandem HMG

boxes of high-mobility-group protein 1 (HMG1). Eur J Biochem, v. 253, n. 3, p.

787-795, May 1, 1998.

GRASSER, K. D. Chromatin-associated HMGA and HMGB proteins: versatile co-

regulators of DNA-dependent processes. Plant Mol Biol, v. 53, n. 3, p. 281-295, Oct,

2003.

114

GRYSEELS, B.; POLDERMAN, A. M. The morbidity of schistosomiasis mansoni in

Maniema (Zaire). Trans R Soc Trop Med Hyg, v. 81, n. 2, p. 202-209, 1987.

GRYSEELS, B.; NKULIKYINKA, L. The distribution of Schistosoma mansoni in the

Rusizi plain (Burundi). Ann Trop Med Parasitol, v. 82, n. 6, p. 581-590, Dec, 1988.

GRYSEELS, B. The relevance of schistosomiasis for public health. Trop Med

Parasitol, v. 40, n. 2, p. 134-142, Jun, 1989.

GRYSEELS, B.; MBAYE, A.; DE VLAS, S. J.; STELMA, F. F.; GUISSE, F.; VAN

LIESHOUT, L.; FAYE, D.; DIOP, M.; LY, A.; TCHUEM-TCHUENTE, L. A.;

ENGELS, D. et al. Are poor responses to praziquantel for the treatment of

Schistosoma mansoni infections in Senegal due to resistance? An overview of the

evidence. Trop Med Int Health, v. 6, n. 11, p. 864-873, Nov, 2001.

GRYSEELS, B.; POLMAN, K.; CLERINX, J.; KESTENS, L. Human

schistosomiasis. Lancet, v. 368, n. 9541, p. 1106-1118, Sep 23, 2006.

GUYATT, H. Do intestinal nematodes affect productivity in adulthood? Parasitol

Today, v. 16, n. 4, p. 153-158, Apr, 2000.

HAGAN, P.; APPLETON, C. C.; COLES, G. C.; KUSEL, J. R.; TCHUEM-

TCHUENTE, L. A. Schistosomiasis control: keep taking the tablets. Trends

Parasitol, v. 20, n. 2, p. 92-97, Feb, 2004.

HAHN, S.; HENDRICKSON, W.; SCHLEIF, R. Transcription of Escherichia coli ara

in vitro. The cyclic AMP receptor protein requirement for PBAD induction that

depends on the presence and orientation of the araO2 site. J Mol Biol, v. 188, n. 3, p.

355-367, Apr 5, 1986.

HE, Q.; LIANG, C. H.; LIPPARD, S. J. Steroid hormones induce HMG1

overexpression and sensitize breast cancer cells to cisplatin and carboplatin. Proc

Natl Acad Sci U S A, v. 97, n. 11, p. 5768-5772, May 23, 2000.

HOCK, R.; FURUSAWA, T.; UEDA, T.; BUSTIN, M. HMG chromosomal proteins

in development and disease. Trends Cell Biol, Dec 12, 2006.

HOKKE, C. H.; FITZPATRICK, J. M.; HOFFMANN, K. F. Integrating

transcriptome, proteome and glycome analyses of Schistosoma biology. Trends

Parasitol, v. 23, n. 4, p. 165-174, Apr, 2007.

HU, R.; WU, W.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. SmTR2/4, a Schistosoma mansoni

homologue of TR2/TR4 orphan nuclear receptor. Int J Parasitol, v. 36, n. 10-11, p.

1113-1122, Sep, 2006a.

115

______. Isolation and characterization of Schistosoma mansoni constitutive

androstane receptor. Mol Biochem Parasitol, v. 148, n. 1, p. 31-43, Jul, 2006b.

ISMAIL, M.; METWALLY, A.; FARGHALY, A.; BRUCE, J.; TAO, L. F.;

BENNETT, J. L. Characterization of isolates of Schistosoma mansoni from Egyptian

villagers that tolerate high doses of praziquantel. Am J Trop Med Hyg, v. 55, n. 2, p.

214-218, Aug, 1996.

ISMAIL, M. M.; TAHA, S. A.; FARGHALY, A. M.; EL-AZONY, A. S. Laboratory

induced resistance to praziquantel in experimental schistosomiasis. J Egypt Soc

Parasitol, v. 24, n. 3, p. 685-695, Dec, 1994.

ISMAIL, M. M.; FARGHALY, A. M.; DYAB, A. K.; AFIFY, H. A.; EL-SHAFEI,

M. A. Resistance to praziquantel, effect of drug pressure and stability test. J Egypt

Soc Parasitol, v. 32, n. 2, p. 589-600, Aug, 2002.

KING, C. H.; DICKMAN, K.; TISCH, D. J. Reassessment of the cost of chronic

helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic

schistosomiasis. Lancet, v. 365, n. 9470, p. 1561-1569, Apr 30-May 6, 2005.

KING, C. H.; STURROCK, R. F.; KARIUKI, H. C.; HAMBURGER, J. Transmission

control for schistosomiasis - why it matters now. Trends Parasitol, v. 22, n. 12, p.

575-582, Dec, 2006.

KNAPP, S.; MULLER, S.; DIGILIO, G.; BONALDI, T.; BIANCHI, M. E.; MUSCO,

G. The long acidic tail of high mobility group box 1 (HMGB1) protein forms an

extended and flexible structure that interacts with specific residues within and

between the HMG boxes. Biochemistry, v. 43, n. 38, p. 11992-11997, Sep 28, 2004.

KOUZINE, F.; LEVENS, D. Supercoil-driven DNA structures regulate genetic

transactions. Front Biosci, v. 12, p. 4409-4423, 2007.

KRYNETSKI, E. Y.; KRYNETSKAIA, N. F.; BIANCHI, M. E.; EVANS, W. E. A

nuclear protein complex containing high mobility group proteins B1 and B2, heat

shock cognate protein 70, ERp60, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is

involved in the cytotoxic response to DNA modified by incorporation of anticancer

nucleoside analogues. Cancer Res, v. 63, n. 1, p. 100-106, Jan 1, 2003.

LILLEY, D. M.; CLEGG, R. M. The structure of the four-way junction in DNA.

Annu Rev Biophys Biomol Struct, v. 22, p. 299-328, 1993.

LOPEZ, A. D.; MATHERS, C. D. Measuring the global burden of disease and

epidemiological transitions: 2002-2030. Ann Trop Med Parasitol, v. 100, n. 5-6, p.

481-499, Jul-Sep, 2006a.

116

LOPEZ, A. D.; MATHERS, C. D.; EZZATI, M.; JAMISON, D. T.; MURRAY, C. J.

Global and regional burden of disease and risk factors, 2001: systematic analysis of

population health data. Lancet, v. 367, n. 9524, p. 1747-1757, May 27, 2006b.

LU, C.; WU, W.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. Identification and characterization

of a novel fushi tarazu factor 1 (FTZ-F1) nuclear receptor in Schistosoma mansoni.

Mol Biochem Parasitol, v. 150, n. 1, p. 25-36, Nov, 2006.

MANSURE, J. J.; FURTADO, D. R.; DE OLIVEIRA, F. M.; RUMJANEK, F. D.;

FRANCO, G. R.; FANTAPPIE, M. R. Cloning of a protein arginine

methyltransferase PRMT1 homologue from Schistosoma mansoni: evidence for roles

in nuclear receptor signaling and RNA metabolism. Biochem Biophys Res Commun,

v. 335, n. 4, p. 1163-1172, Oct 7, 2005.

MARTIN, K.; HUO, L.; SCHLEIF, R. F. The DNA loop model for ara repression:

AraC protein occupies the proposed loop sites in vivo and repression-negative

mutations lie in these same sites. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 83, n. 11, p. 3654-

3658, Jun, 1986.

MCMANUS, D. P.; WONG, J. Y.; ZHOU, J.; CAI, C.; ZENG, Q.; SMYTH, D.; LI,

Y.; KALINNA, B. H.; DUKE, M. J.; YI, X. Recombinant paramyosin (rec-Sj-97)

tested for immunogenicity and vaccine efficacy against Schistosoma japonicum in

mice and water buffaloes. Vaccine, v. 20, n. 5-6, p. 870-878, Dec 12, 2001.

MCNALLY, J. G.; MULLER, W. G.; WALKER, D.; WOLFORD, R.; HAGER, G. L.

The glucocorticoid receptor: rapid exchange with regulatory sites in living cells.

Science, v. 287, n. 5456, p. 1262-1265, Feb 18, 2000.

MERIKA, M.; THANOS, D. Enhanceosomes. Curr Opin Genet Dev, v. 11, n. 2, p.

205-208, Apr, 2001.

MORALES, M. E.; KALINNA, B. H.; HEYERS, O.; MANN, V. H.;

SCHULMEISTER, A.; COPELAND, C. S.; LOUKAS, A.; BRINDLEY, P. J.

Genomic organization of the Schistosoma mansoni aspartic protease gene, a

platyhelminth orthologue of mammalian lysosomal cathepsin D. Gene, v. 338, n. 1, p.

99-109, Aug 18, 2004.

MOTT, K. E.; DESJEUX, P.; MONCAYO, A.; RANQUE, P.; DE RAADT, P.

Parasitic diseases and urban development. Bull World Health Organ, v. 68, n. 6, p.

691-698, 1990.

MURPHY, F. V. T.; SEHY, J. V.; DOW, L. K.; GAO, Y. G.; CHURCHILL, M. E.

Co-crystallization and preliminary crystallographic analysis of the high mobility

group domain of HMG-D bound to DNA. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v.

55, n. Pt 9, p. 1594-1597, Sep, 1999.

117

NABHAN, J. F.; HAMDAN, F. F.; RIBEIRO, P. A Schistosoma mansoni Pad1

homologue stabilizes c-Jun. Mol Biochem Parasitol, v. 116, n. 2, p. 209-218, Sep 3,

2001.

NAGATANI, G.; NOMOTO, M.; TAKANO, H.; ISE, T.; KATO, K.; IMAMURA,

T.; IZUMI, H.; MAKISHIMA, K.; KOHNO, K. Transcriptional activation of the

human HMG1 gene in cisplatin-resistant human cancer cells. Cancer Res, v. 61, n. 4,

p. 1592-1597, Feb 15, 2001.

NAJIMA, Y.; YAHAGI, N.; TAKEUCHI, Y.; MATSUZAKA, T.; SEKIYA, M.;

NAKAGAWA, Y.; AMEMIYA-KUDO, M.; OKAZAKI, H.; OKAZAKI, S.;

TAMURA, Y.; IIZUKA, Y. et al. High mobility group protein-B1 interacts with

sterol regulatory element-binding proteins to enhance their DNA binding. J Biol

Chem, v. 280, n. 30, p. 27523-27532, Jul 29, 2005.

NAPIERALA, M.; BACOLLA, A.; WELLS, R. D. Increased negative superhelical

density in vivo enhances the genetic instability of triplet repeat sequences. J Biol

Chem, v. 280, n. 45, p. 37366-37376, Nov 11, 2005.

OGER, F.; BERTIN, B.; CABY, S.; DALIA-CORNETTE, J.; ADAMS, M.;

VICOGNE, J.; CAPRON, M.; PIERCE, R. J. Molecular cloning and characterization

of Schistosoma mansoni Ftz-F1 interacting protein-1 (SmFIP-1), a novel corepressor

of the nuclear receptor SmFtz-F1. Mol Biochem Parasitol, Mar 13, 2006.

OHNDORF, U. M.; ROULD, M. A.; HE, Q.; PABO, C. O.; LIPPARD, S. J. Basis for

recognition of cisplatin-modified DNA by high-mobility-group proteins. Nature, v.

399, n. 6737, p. 708-712, Jun 17, 1999.

OJOPI, E. P.; OLIVEIRA, P. S.; NUNES, D. N.; PAQUOLA, A.; DEMARCO, R.;

GREGORIO, S. P.; AIRES, K. A.; MENCK, C. F.; LEITE, L. C.; VERJOVSKI-

ALMEIDA, S.; DIAS-NETO, E. A quantitative view of the transcriptome of

Schistosoma mansoni adult-worms using SAGE. BMC Genomics, v. 8, p. 186, 2007.

OPEL, M. L.; HATFIELD, G. W. DNA supercoiling-dependent transcriptional

coupling between the divergently transcribed promoters of the ilvYC operon of

Escherichia coli is proportional to promoter strengths and transcript lengths. Mol

Microbiol, v. 39, n. 1, p. 191-198, Jan, 2001.

OSMAN, A.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. Identification and characterization of a

Smad2 homologue from Schistosoma mansoni, a transforming growth factor-beta

signal transducer. J Biol Chem, v. 276, n. 13, p. 10072-10082, Mar 30, 2001.

______. Expression of functional Schistosoma mansoni Smad4: role in Erk-mediated

transforming growth factor beta (TGF-beta) down-regulation. J Biol Chem, v. 279, n.

8, p. 6474-6486, Feb 20, 2004.

118

OSMAN, A.; NILES, E. G.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; LOVERDE, P. T.

Schistosoma mansoni TGF-beta receptor II: role in host ligand-induced regulation of

a schistosome target gene. PLoS Pathog, v. 2, n. 6, p. e54, Jun, 2006.

OUDET, P.; GROSS-BELLARD, M.; CHAMBON, P. Electron microscopic and

biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell, v. 4, n. 4, p.

281-300, Apr, 1975.

PARKINSON, M. J.; LILLEY, D. M. The junction-resolving enzyme T7

endonuclease I: quaternary structure and interaction with DNA. J Mol Biol, v. 270, n.

2, p. 169-178, Jul 11, 1997.

PASHEVA, E. A.; PASHEV, I. G.; FAVRE, A. Preferential binding of high mobility

group 1 protein to UV-damaged DNA. Role of the COOH-terminal domain. J Biol

Chem, v. 273, n. 38, p. 24730-24736, Sep 18, 1998.

PAULL, T. T.; HAYKINSON, M. J.; JOHNSON, R. C. The nonspecific DNA-

binding and -bending proteins HMG1 and HMG2 promote the assembly of complex

nucleoprotein structures. Genes Dev, v. 7, n. 8, p. 1521-1534, Aug, 1993.

PICQUET, M.; VERCRUYSSE, J.; SHAW, D. J.; DIOP, M.; LY, A. Efficacy of

praziquantel against Schistosoma mansoni in northern Senegal. Trans R Soc Trop

Med Hyg, v. 92, n. 1, p. 90-93, Jan-Feb, 1998.

PIL, P. M.; CHOW, C. S.; LIPPARD, S. J. High-mobility-group 1 protein mediates

DNA bending as determined by ring closures. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 90, n.

20, p. 9465-9469, Oct 15, 1993.

POHLER, J. R.; GIRAUD-PANIS, M. J.; LILLEY, D. M. T4 endonuclease VII

selects and alters the structure of the four-way DNA junction; binding of a resolution-

defective mutant enzyme. J Mol Biol, v. 260, n. 5, p. 678-696, Aug 2, 1996.

POHLER, J. R.; LILLEY, D. M. The interaction of HMG-box proteins with the four-

way DNA junction. Biochem Soc Trans, v. 25, n. 4, p. S647, Nov, 1997.

PTASHNE, M. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance. Nature,

v. 322, n. 6081, p. 697-701, Aug 21-27, 1986.

REEVES, R.; ADAIR, J. E. Role of high mobility group (HMG) chromatin proteins

in DNA repair. DNA Repair (Amst), v. 4, n. 8, p. 926-938, Jul 28, 2005.

REYNOLDS, S. R.; DAHL, C. E.; HARN, D. A. T and B epitope determination and

analysis of multiple antigenic peptides for the Schistosoma mansoni experimental

vaccine triose-phosphate isomerase. J Immunol, v. 152, n. 1, p. 193-200, Jan 1, 1994.

119

ROCHA, M. O.; PEDROSO, E. R.; LAMBERTUCCI, J. R.; GRECO, D. B.;

ROCHA, R. L.; REZENDE, D. F.; NEVES, J. Gastro-intestinal manifestations of the

initial phase of schistosomiasis mansoni. Ann Trop Med Parasitol, v. 89, n. 3, p.

271-278, Jun, 1995.

RYDBERG, B.; HOLLEY, W. R.; MIAN, I. S.; CHATTERJEE, A. Chromatin

conformation in living cells: support for a zig-zag model of the 30 nm chromatin

fiber. J Mol Biol, v. 284, n. 1, p. 71-84, Nov 20, 1998.

SAHA, A.; WITTMEYER, J.; CAIRNS, B. R. Chromatin remodelling: the industrial

revolution of DNA around histones. Nat Rev Mol Cell Biol, v. 7, n. 6, p. 437-447,

Jun, 2006.

SCAFFIDI, P.; MISTELI, T.; BIANCHI, M. E. Release of chromatin protein HMGB1

by necrotic cells triggers inflammation. Nature, v. 418, n. 6894, p. 191-195, Jul 11,

2002.

SELVIN, P. R.; COOK, D. N.; PON, N. G.; BAUER, W. R.; KLEIN, M. P.;

HEARST, J. E. Torsional rigidity of positively and negatively supercoiled DNA.

Science, v. 255, n. 5040, p. 82-85, Jan 3, 1992.

SENAPATHY, P.; SHAPIRO, M. B.; HARRIS, N. L. Splice junctions, branch point

sites, and exons: sequence statistics, identification, and applications to genome

project. Methods Enzymol, v. 183, p. 252-278, 1990.

SERRA, E. C.; LARDANS, V.; DISSOUS, C. Identification of NF-AT-like

transcription factor in Schistosoma mansoni: its possible involvement in the

antiparasitic action of cyclosporin A. Mol Biochem Parasitol, v. 101, n. 1-2, p. 33-

41, Jun 25, 1999.

SESSA, L.; BIANCHI, M. E. The evolution of High Mobility Group Box (HMGB)

chromatin proteins in multicellular animals. Gene, v. 387, n. 1-2, p. 133-140, Jan 31,

2007.

SHEFLIN, L. G.; SPAULDING, S. W. High mobility group protein 1 preferentially

conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry, v. 28, n. 13, p.

5658-5664, Jun 27, 1989.

SIMPSON, A. J.; KNIGHT, M. Cloning of a major developmentally regulated gene

expressed in mature females of Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol, v. 18,

n. 1, p. 25-35, Jan, 1986.

STELMA, F. F.; TALLA, I.; SOW, S.; KONGS, A.; NIANG, M.; POLMAN, K.;

DEELDER, A. M.; GRYSEELS, B. Efficacy and side effects of praziquantel in an

epidemic focus of Schistosoma mansoni. Am J Trop Med Hyg, v. 53, n. 2, p. 167-

170, Aug, 1995.

120

STOTT, K.; TANG, G. S.; LEE, K. B.; THOMAS, J. O. Structure of a complex of

tandem HMG boxes and DNA. J Mol Biol, v. 360, n. 1, p. 90-104, Jun 30, 2006.

STROS, M.; STOKROVA, J.; THOMAS, J. O. DNA looping by the HMG-box

domains of HMG1 and modulation of DNA binding by the acidic C-terminal domain.

Nucleic Acids Res, v. 22, n. 6, p. 1044-1051, Mar 25, 1994.

STROS, M. DNA bending by the chromosomal protein HMG1 and its high mobility

group box domains. Effect of flanking sequences. J Biol Chem, v. 273, n. 17, p.

10355-10361, Apr 24, 1998a.

STROS, M.; REICH, J. Formation of large nucleoprotein complexes upon binding of

the high-mobility-group (HMG) box B-domain of HMG1 protein to supercoiled

DNA. Eur J Biochem, v. 251, n. 1-2, p. 427-434, Jan 15, 1998b.

STROS, M.; MUSELIKOVA, E. A role of basic residues and the putative

intercalating phenylalanine of the HMG-1 box B in DNA supercoiling and binding to

four-way DNA junctions. J Biol Chem, v. 275, n. 46, p. 35699-35707, Nov 17, 2000.

STROS, M. Two mutations of basic residues within the N-terminus of HMG-1 B

domain with different effects on DNA supercoiling and binding to bent DNA.

Biochemistry, v. 40, n. 15, p. 4769-4779, Apr 17, 2001.

TAKAHASHI, K.; VIGNERON, M.; MATTHES, H.; WILDEMAN, A.; ZENKE,

M.; CHAMBON, P. Requirement of stereospecific alignments for initiation from the

simian virus 40 early promoter. Nature, v. 319, n. 6049, p. 121-126, Jan 9-15, 1986.

TEMPONE, A. J.; AFONSO, A. O.; NASCIMENTO, D.; RUMJANEK, F. D.

Dolichol phosphate is a rate-limiting factor in mannosyl transferase activity of adult

male worms of Schistosoma mansoni. Mol Cell Biochem, v. 198, n. 1-2, p. 187-191,

Aug, 1999.

TEO, S. H.; GRASSER, K. D.; THOMAS, J. O. Differences in the DNA-binding

properties of the HMG-box domains of HMG1 and the sex-determining factor SRY.

Eur J Biochem, v. 230, n. 3, p. 943-950, Jun 15, 1995.

THOMAS, J. O.; TRAVERS, A. A. HMG1 and 2, and related 'architectural' DNA-

binding proteins. Trends Biochem Sci, v. 26, n. 3, p. 167-174, Mar, 2001.

TRAN, M. H.; PEARSON, M. S.; BETHONY, J. M.; SMYTH, D. J.; JONES, M. K.;

DUKE, M.; DON, T. A.; MCMANUS, D. P.; CORREA-OLIVEIRA, R.; LOUKAS,

A. Tetraspanins on the surface of Schistosoma mansoni are protective antigens against

schistosomiasis. Nat Med, v. 12, n. 7, p. 835-840, Jul, 2006.

TRAVERS, A. Recognition of distorted DNA structures by HMG domains. Curr

Opin Struct Biol, v. 10, n. 1, p. 102-109, Feb, 2000.

121

TRAVERS, A.; MUSKHELISHVILI, G. A common topology for bacterial and

eukaryotic transcription initiation? EMBO Rep, v. 8, n. 2, p. 147-151, Feb, 2007.

TRAVERS, A. A. Priming the nucleosome: a role for HMGB proteins? EMBO Rep,

v. 4, n. 2, p. 131-136, Feb, 2003.

TRINKLEIN, N. D.; ALDRED, S. F.; HARTMAN, S. J.; SCHROEDER, D. I.;

OTILLAR, R. P.; MYERS, R. M. An abundance of bidirectional promoters in the

human genome. Genome Res, v. 14, n. 1, p. 62-66, Jan, 2004.

UEDA, T.; CHOU, H.; KAWASE, T.; SHIRAKAWA, H.; YOSHIDA, M. Acidic C-

tail of HMGB1 is required for its target binding to nucleosome linker DNA and

transcription stimulation. Biochemistry, v. 43, n. 30, p. 9901-9908, Aug 3, 2004.

VAN DER WERF, M. J.; DE VLAS, S. J.; BROOKER, S.; LOOMAN, C. W.;

NAGELKERKE, N. J.; HABBEMA, J. D.; ENGELS, D. Quantification of clinical

morbidity associated with schistosome infection in sub-Saharan Africa. Acta Trop, v.

86, n. 2-3, p. 125-139, May, 2003.

VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; DEMARCO, R.; MARTINS, E. A.; GUIMARÄAES,

P. E.; OJOPI, E. P.; PAQUOLA, A. C.; PIAZZA, J. P.; NISHIYAMA, M. Y., JR.;

KITAJIMA, J. P.; ADAMSON, R. E.; ASHTON, P. D. et al. Transcriptome analysis

of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet, v. 35, n. 2, p.

148-157, Oct, 2003.

WAISBERG, M.; LOBO, F. P.; CERQUEIRA, G. C.; PASSOS, L. K.; CARVALHO,

O. S.; FRANCO, G. R.; EL-SAYED, N. M. Microarray analysis of gene expression

induced by sexual contact in Schistosoma mansoni. BMC Genomics, v. 8, p. 181,

2007.

WANG, Q.; ZENG, M.; WANG, W.; TANG, J. The HMGB1 acidic tail regulates

HMGB1 DNA binding specificity by a unique mechanism. Biochem Biophys Res

Commun, v. 360, n. 1, p. 14-19, Aug 17, 2007.

WATSON, M.; STOTT, K.; THOMAS, J. O. Mapping Intramolecular Interactions

between Domains in HMGB1 using a Tail-truncation Approach. J Mol Biol, Oct 2,

2007.

WHITE, M. F.; LILLEY, D. M. The structure-selectivity and sequence-preference of

the junction-resolving enzyme CCE1 of Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol, v.

257, n. 2, p. 330-341, Mar 29, 1996.

WU, C.; TRAVERS, A. A 'one-pot' assay for the accessibility of DNA in a

nucleosome core particle. Nucleic Acids Res, v. 32, n. 15, p. e122, 2004.

122

WU, W.; NILES, E. G.; EL-SAYED, N.; BERRIMAN, M.; LOVERDE, P. T.

Schistosoma mansoni (Platyhelminthes, Trematoda) nuclear receptors: sixteen new

members and a novel subfamily. Gene, v. 366, n. 2, p. 303-315, Feb 1, 2006.

WU, W.; NILES, E. G.; HIRAI, H.; LOVERDE, P. T. Evolution of a novel subfamily

of nuclear receptors with members that each contain two DNA binding domains.

BMC Evol Biol, v. 7, p. 27, 2007a.

______. Identification and characterization of a nuclear receptor subfamily I member

in the Platyhelminth Schistosoma mansoni (SmNR1). Febs J, v. 274, n. 2, p. 390-405,

Jan, 2007b.

WU, W.; NILES, E. G.; LOVERDE, P. T. Thyroid hormone receptor orthologues

from invertebrate species with emphasis on Schistosoma mansoni. BMC Evol Biol, v.

7, n. 1, p. 150, Aug 29, 2007c.

ZEMZOUMI, K.; SERRA, E.; MANTOVANI, R.; TROLET, J.; CAPRON, A.;

DISSOUS, C. Cloning of Schistosoma mansoni transcription factor NF-YA subunit:

phylogenic conservation of the HAP-2 homology domain. Mol Biochem Parasitol, v.

77, n. 2, p. 161-172, May, 1996.

ZHANG, W.; WONG, C. M. Evaluation of the 1992-1999 World Bank

Schistosomiasis Control Project in China. Acta Trop, v. 85, n. 3, p. 303-313, Mar,

2003.

ZLATANOVA, J.; VAN HOLDE, K. Binding to four-way junction DNA: a common

property of architectural proteins? Faseb J, v. 12, n. 6, p. 421-431, Apr, 1998.

123

ANEXO I – TRABALHO RELACIONADO À TESE PUBLICADO EM

PERIÓDICO DE CIRCULAÇÃO INTERNACIONAL

DE OLIVEIRA, F. M. B.; DA SILVA, I. C. A.; RUMJANEK, F. D.; DIAS-NETO,

E.; GUIMARÃES; P. E. M.; VERJOVSKI-ALMEIDA, S.; ŠTROS, M.;

FANTAPPIÉ, M. R. Cloning the genes and DNA binding properties of High Mobility

Group B1 (HMGB1) proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni and

Schistosoma japonicum. Gene, v. 377, p. 33-45, Mar. 3, 2006.

Cloning the genes and DNA binding properties of High Mobility Group B1

(HMGB1) proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni

and Schistosoma japonicum

Francisco Meirelles Bastos de Oliveira

, Isabel Caetano de Abreu da Silva

Franklin David Rumjanek

, Emmanuel Dias-Neto

, Pedro Edson Moreira Guimarães

Sergio Verjovski-Almeida

, Michal Štros

⁎

, Marcelo Rosado Fantappié

⁎

Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, Rio de Janeiro, 21941-590, Brazil

Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 05403-010, São Paulo, Brazil

Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo, SP, Brazil

Laboratory of Analysis of Chromosomal Proteins, Academy of Sciences of the Czech Republic, Institute of Biophysics,

Královopolská 135, 61265 Brno, Czech Republic

Received 19 September 2005; received in revised form 2 March 2006; accepted 3 March 2006

Availble online 27 April 2006

Received by F. Salvatore

Abstract

The parasitic helminth Schistosoma mansoni contains three HMGB proteins, HMGB1, HMGB2 and HMGB3, of primary amino acid

sequences highly similar to vertebrate proteins. In this report we describe the characterization of the HMGB1 proteins and their genes from S.

mansoni and Schistosoma japonicum. The deduced amino acid sequences of HMGB1 proteins from both schistosome species are identical, and

comprise 176 residues. The proteins contain the two evolutionarily highly conserved HMG-box domains, A and B, exhibiting 60% similarity to

mammalian HMGB1. Unlike the human HMGB1 which contains an unbroken run of 30 glutamic or aspartic residues, the SmHMGB1 or

SjHMGB1 proteins possess unusually short acidic C-terminal tails (5 acidic residues interrupted by 2 serines). Southern hybridization and DNA

sequencing revealed a single copy HMGB1 gene, composed of 3 exons and two introns, in S. mansoni. The exon/intron boundaries are identical to

those of the human HMGB1 gene, with the exception that the second exon of the SmHMGB1 gene which is not split into two exons as in the

human HMGB1 gene. RNA blot analysis revealed that the SmHMGB1 gene is constitutively expressed in similar levels both in male and female

worms. The single-sized mRNA for SmHMGB1 is consistent with the size derived from the cDNA. Although DNA binding properties of

SmHMGB1 (or SjHMGB1) protein seem to be similar to those previously reported with human HMGB1, i.e., preferential binding to supercoiled

DNA over linear DNA, specific recognition of DNA four-way junctions, DNA-induced supercoiling in the presence of topoisomerase I, and DNA

bending, we have observed two important differences relative to those observed with the human HMGB1: (i) the inability of the isolated

SmHMGB1 domain A to bend DNA (as revealed by T4 ligase-mediated circularization assay), and (ii) higher DNA supercoiling and bending

potential of the SmHMGB1 protein as compared to its human counterpart. The latter finding may indicate that the long acidic C-tail of human

HMGB1 has much stronger repressive role on DNA bending or DNA supercoiling by topoisomerase I at physiological ionic strength than the

short C-tail of the SmHMGB1 protein. Considering the important role of HMGB1 in DNA replication, transcription, recombination, and in

Gene 377 (2006) 33 – 45

www.elsevier.com/locate/gene

Abbreviations: SmHMGB1, S. mansoni high mobility group B1; SjHMGB1, S. japonicum high mobility group B1, EST, expressed sequence tag; SmGAPDH, S.

mansoni glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PMSF, phenylmethylsulphonylfluoride; GST, glutathione S-transferase; RT-PCR, reverse transcriptase

polymerase chain reaction; DTT, dithiothreitol.

⁎

Corresponding authors. Fantappié is to be contacted at Instituto de Bioquímica Médica, CCS, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão, Rio de

Janeiro, 21941-590, Brazil. Tel.: +55 21 2562 6759; fax: +55 21 2270 8647. Štros, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic,

Královopolská, 135, 61265 Brno, Czech Republic. Tel.: +420 5 41517183; fax: +420 5 41211293.

E-mail addresses: [email protected] (M. Štros), [email protected] (M.R. Fantappié).

doi:10.1016/j.gene.2006.03.001

particularly, the mediation of inflammation responses in mammalian cells, further studies on schistosome HMGB proteins may provide valuable

information related to schistosomiasis, where inflammation plays a critical role in this disease.

Keywords: S. japonicum HMGB1 protein; S. mansoni HMGB1 protein; DNA binding; DNA bending; DNA supercoiling; Genomic structure

1. Introduction

Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum are the

causative agents of schistosomiasis in Brazil and Africa, and in

Asia, respectively. There is a continued transmission of

schistosomiasis in these countries despite effective control

programs that focus on the application of the drug praziquantel

(PZQ). Although there is not yet clear-cut evidence for the

existence of PZQ-resistant sc histoso me str ains, de creas ed

susceptibility to the drug has been observed in several countries

(McManus and Bartley, 2004). In addition, efforts on vacc ine

development against either S. mansoni or S. japonicum have

proved to be frustrating until now (McManus et al., 2004). In

this regard, the knowledge of the molecular biology of S.

mansoni and S. japonicum, by manipulating gene expression

and understanding gene function, should point to alternative

strategies for the control of schistosomiasis.

Studies conducted with many eukaryotic organisms have

shown that regulation of DNA metaboli sm such as transcrip-

tion, replication, recombination and DNA repair involves the

interplay of a number of nuclear proteins interacting with DNA

and/or other proteins.

The high mobility group (HMG) B1 protein is a highly

abundant protein in the nuclei of mammalian cells. It is estimated

that there is about one molecule per 10–20 nucleosomes (Thomas

and Travers, 2001). The protein contains two copies of

homologous DNA binding motifs known as the HMG-boxes, A

and B, which are found in a large number of proteins collectively

referred to as the HMG-box family of proteins (Thomas and

Travers, 2001). The HMG-box family includes many transcrip-

tion factors and factors involved in the control of development or

differentiation (Agresti and Bianchi, 2003). HMGB1 can facili-

tate the assembly of complexes involved in recombination and

transcription, as well as nucleosome remodeling (Bustin, 1999;

Bonaldi et al., 2002; Travers, 2003). HMGB1 were shown to

interact with a number of biologically important proteins, in-

cluding transcription factors and the B-form DNA, albeit with low

affinity. Interestingly, HMGB1 exhibits a remarkably high affinity

for distorted DNA conformations such as supercoiled DNA, four-

way DNA junction, DNA minicircles, cisplatin-modified DNA

and DNA bulges (reviewed by Travers, 2000; Thomas and

Travers, 2001; Grasser, 2003), but it can also actively distort DNA

by bending or looping and changing of DNA-topology (Paull et

al., 1993; Pil et al., 1993; Štros et al., 1994; Teo et al., 1995; Štros,

1998; Sheflin and Spaulding, 1989; Murphy et al., 1999). In

addition to the intracellular role of HMGB1 in association with

chromatin structure, the protein seems to have an important ex-

tracellular role as a mediator of inflammatory mechanisms (Wang

et al., 1999; Taguchi et al., 2000; Lotze and Tracey, 2005). In this

context the participation of schistosome HMGB1 during infection

might also provide valuable information related to the disease,

where inflammation plays a critical role in the pathology of

schistosomiasis and in particular to granuloma. While this paper

was submitted, a report has appeared (Gnanasekar et al., 2006)

describing cloning of the SmHMGB1 gene and characterization of

SmHMGB1 protein with emphasis on its putative role in granu-

loma mediated inflammation.

Although HMGB1 from several organisms (includin g plants,

yeast, protozoans, invertebrates, and vertebrates; see (Baxevanis

and Landsman, 1995) for classification and comparison of 121

primary amino acid sequences) have been identified, only few of

them have been characterized (reviewed by Grasser, 2003).

Preliminary studies have determined the occurr ence of HMGB1

proteins in schistosomes (Rabelo et al., 1992; Fantappié and

Rumjanek, 1994), but data corresponding to cDNA and genes

have been lacking so far. Here we describe the cloning, genomic

structure and DNA binding properties of HMGB1 prote ins in the

parasitic helminths S. mansoni and S. japoni cum , and discuss the

putative biological roles of these prote ins.

2. Materials and methods

2.1. Cloning of SmHMG B1 and SjHMGB1 cDNAs and genes

The available genomic sequences of S. mansoni and S.

japonicum

and that of putative HMG sequences (SmAE number

701186.1 for S. mansoni putative HMGB and GenBank accession

no. AY914896 for S. japonicum putative HMGB) allowed us to

isolate both genes and cDNAs. Total cDNA from S. japonicum

was kindly provided by Dr. Karl Hoffmann (University of

Cambridge) and the genomic DNA from S. japonicum was a

generous gift of Dr. Matty Knight (Biomedical Research Institute,

Maryland). In order to isolate the entire coding region of

SmHMGB1, the

P-labeled EST clone was used as a probe to

screen the S. mansoni adult worm cDNA library (DeMarco et al.,

2005; Verjovski-Almeida et al., 2003).The bacteriophage harbor-

ing the full-length SmHMGB1 was excised with helper

phage ExAssist™ (Stratagene) into recombinant phagemid

pSmHMGB1-BlueScript®-SK (Stratagene).

2.2. Plasmids

The S. mansoni cDNAs encoding recombinant SmHMGB1

full-length (aa residues 1–176), SmHMGB1 box A (aa residues

1–83), SmHMGB1 box B (residues 84–169) and SmHMGB1

lacking the acidic tail (residues 1–169) were amplified by RT-

PCR using sense primer F1 (5′-GGATCC

ATGGCTGAAGA-

CAAGGGTAAG-3′)(BamHI restriction site is in bold and

initiation codon is underlined) and anti-sense primers F2 (5′-

AAGCTT

CTAATCGTCAGACTCTGAAATC-3′)forthe

34 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

SmHMGB1 full-length, A1 (5′-AAGCTTCTATTCGTCGG-

CAGGGGGTTC-3′) for the SmHMGB1 box A and C1 (5′-

AAGCTT

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′)forthe

SmHMGB1 lacking the acidic tail (HindIII restriction site is in

bold, and the termination codon is underlined). The SmHMGB1

Box B was am plified by using sense primer B1 (5′-

GGATCCGGCCGCAGCAAGAAAAGGAAA-3′) and anti-

sense primer C1 (BamHI restriction site is in bold). The S.

japonicum cDNAs corresponding to the SjHMGB1 full-length

(residues 1–176), SjHMGB1 box A (aa residues 1–83),

SjHMGB1 box B (aa residues 84–169) and SjHMGB1 lacking

the acidic tail (residues 1–169) were amplified by RT-PCR using

sense primer F3 (5′-GGATCC

ATGGCTGAAGAGAAAGG-

TAAG-3′)(BamHI restriction site is in bold and initiation

codon is underlined) and anti-sense primers F4 (5′-AAGCTT

C-

TAATCGTCGGATTCTGAGTC-3′) for the SjHMGB1 full-

length, A2 (5′-AAGCTT

CTATTCATCTGCAGGCTC-3 ′)

for the SjHMGB1 boxAandC2(5′ -AAGCTT-

CTATGTCTTGGGCTTTTTGCC-3′) for the SjHMGB1 lacking

the acidic tail (HindIII restriction site is in bold, and the ter-

mination codon is underlined). The SjHMGB1 Box B was

amplified by using sense primer B2 (5′-GGATCCGGCCG-

CAGCAAGAAAAG GAAA-3 ′) and anti-sense primer C2

(BamHI restriction site is in bold). RT-PCR was performed on

S. mansoni and S. japonicum adult worm cDNAs, sub-cloned

into pCR2.1 TOPO plasmid (Invitrogen), and dideoxy-se-

quenced on both strands (Macrogen Inc., Korea). In order to

generate recombinant his-tag proteins, plasmids were digested

with the appropriate enzymes (Promega) and cloned into the

pQE-80L expression vector (Qiagen), according to the manu-

facturer's instructions.

2.3. Southern hybridizations

DNA from S. mansoni was digested with several restriction

enzymes (described in Fig. 2D) to completion, and resolved on

a 0.8% agarose gels in 0.5× TBE buffer. DNA was denaturated

by soaking the gel in the denaturation buffer containing 0.4 M

NaOH and 1 M NaCl for 30 min, transferred to a Nylon

membrane (Hybond-N+, Amersham Biosciences) by capillary

action, and hybridized with

P-labeled probe derived from the

SmHMGB1 cDNA. The membrane was washed twice in 1×

SSC/0.1 SDS at room temperat ure for 15 min, followed by a

final wash in 0.1× SSC/0.1 SDS at 68 °C for 30 min (high

stringency). The DNA was visualized in a Storm 860

PhosphorImager (Molecular Dynamics). DNA marker con-

sisted of

P-labeled λ DNA digested with HindIII.

2.4. Northern blot analysis of SmHMGB1 transcri pts

Total RNAs from sexually immature male, sexually immature

female, adult mature male and adult mature female worms were

extracted using t he TRIzol® R eagent (Invitrogen). The

SmHMGB1 531 bp cDNA was used as a probe for the Northern

blots, essentially as previously described (Fantappié et al., 1999).

The SmGAPDH 795 bp fragment was used as a constitutive

control and was obtained by RT-PCR using gene-specific primers

5′-GGCTTGTGCCATCAGCGAAGTC-3 (GAPDH_

Frw

) and

5′-TGGTTGTTGGGACGCGGAAAG-3′ (GAPDH1_

Rev

2.5. Expression and purification of recombinant proteins

HMGB1 proteins and domains used throughout the paper

were expressed as fusion proteins with (His)

-tag at their N-

termini. BL21(DE3) cells (Novagen) harboring the pQE-80L

constructs (Qiagen) encoding SmHMGB1, SjHMGB1, or rat

(human) HMGB1 were grown in the presence of ampicillin

(100 μg/ml) to OD

600

values of ∼ 0.6 at 37 °C. Cell cultures were

then cooled to 25 °C, then isopropyl-1-thio-β-

D-galactopyrano-

side (IPTG) was added to final 1 mM, and the cells were grown

for 5 h. After centrifugation at 7700 ×g for 20 min, the cell pellets

were re-suspended in ice-cold lysis buffer (50 mM NaH

pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole and 1 mM PMSF),

briefly sonicated and centrifuged at 20.000 ×g for 30 min. The

supernatants were then filtered through 0.45 μm filters, and

loaded onto Ni

–agarose columns (Pro-Bond™, Invitrogen).

Unbound proteins were eluted with lysis buffer containing

20 mM imid azol, and His-tagged HMGB1 proteins or peptides

were eluted in the same buffer bu t containing 250 mM

imidazole. The isolated p roteins or peptides were finally

dialysed against buffer D (10 mM Tris–HCl, pH 7.6, 50 mM

KCl, 0.1 mM EDTA and 0.5 mM dithiothreitol), and the

concentration of proteins was determined by the Bio-Rad

Protein Assay (Bio-Rad). The purity and amounts of the

HMGB1 proteins were also checked by resolution of the

samples on 15% SDS-PAGE, followed by Coomassie Blue R-

250 staining. Some of the DNA binding experiments were

carried out with both His-tagged Sm HMGB1 and SmHMGB1

fused with GST (cloning and protein expression were as in Štros,

1998) with similar results, indicating that the GST moiety had

very little, if any, effect on the DNA binding properties of the

SmHMGB1 protein. The full-length rat HMGB1 (aa residues 1–

215), HMGB1-ΔC (aa residues 1 –162), domain A (aa residues

1–88) and domain B (aa residues 85–180) were expressed with

(His)

-tag at their N-term ini as previously described (Štros et al.,

2004). As the primary amino acid sequences of rat and human

HMGB1 are absolutely identical, and as the genomic structure of

schistosome HMGB1 gene was compared with the human

counterpart (notice that genomic structure of the rat HMGB1

gene is so far not available), all figures showing DNA binding

experiments with recombinant rat HMGB1 are indicated in the

paper as human HMGB1 for better clarity.

2.6. Gel retardation assay with supercoiled DNA

Gel retardation experiments were carried out as using an

equimolar mixture of highly-purified negatively supercoiled

plasmid pTZ19R a nd the HindI II-linearized plasmid, as

previously described (Štros and Reich, 1998). Briefly, 0.5 μg

of plasmid DNAs was mixed with increasing amounts of

SmHMGB1 in buffer A (0.14 M NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7.5,

0.2 mM EDTA, 5 mM DTT) in a final volume of 20 μl and pre-

incubated on ice for 30 min. The DNA–protein complexes were

resolved by electrophoresis on 1% agarose gels in 0.5× TBE

35F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

buffer at 3 V/cm for 15–18 h at 4 °C. The gels were stained with

0.5 μg/m l ethidium bromide, distained in water and photo-

graphed through a red filter in an UV-transilluminator (254 nm)

using 100 T-MAX black and white negative film (Kodak).

2.7. DNA supercoiling assay

DNA supercoiling assays were carried out as previously

described (Štros and Muselíková, 2000). Briefly, CsCl-purified

negatively supercoiled plasmid pTZ19R was relaxed at a DNA

concentration ∼ 170 μg/ml in Topo I relaxation buffer (50 mM

NaCl, 50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 20% glycerol

and 1 mM dithiothreitol) with wheat germ topoisomerase I

(2 units/μg DNA; Promega) at 37 °C for 90 min. The relaxed

DNA (0.5 μg DNA) was then diluted to final 40 or 140 mM

NaCl, then the same amount of the topoisomerase I was added,

followed by the addition of recombinant HMGB1 proteins or

peptides (as indi cated in the Legends to Figures). The 20 μl

reactions were allowed to proceed at 37 °C for 60 min after

which they were terminated by addition of SDS and NaCl to

final 1% and 1 M, respectively. DNA was deprot einized by

chloroform/isoamyl alcohol (24:1) extraction in the presence of

0.02% linear acrylamide instead of carrier DNA. Deproteinized

DNA was then precipitated with 2.5 volume of ethanol, washed

with 70% ethanol, air-dried and finally dissolved in 0.1× TE

buffer. Distribution of DNA topoisomers was analyzed by

electrophoresis in 1% agarose gels in 1× TBE buffer at 3 V/cm

for 17 h. The gels were stained with 0.5 μg/ml ethidium

bromide, distained in water and photographed through a red

filter in an UV-transilluminator (254 nm) using 100 T-MAX

black and white negative film (Kodak).

2.8. Determination of sign of DNA supercoiling

To determine the sign of DNA supercoiling, the gels were

soaked after the first dimension electrophoresis (see Analysis of

DNA supercoiling) in chloroquine (2.5 μg/ml) for 1 h, turned

horizontally by 90° and resolved in the second dimension in

0.5× TBE buffer containing chloroquine at 5 V/cm for 10 h as

previously described (Štros and Muselíková, 2000). DNA was

then visualized by staining with 0.5 μg/ml ethidium bromide,

and the destained gels were photographed through a red filter in

an UV-transilluminator (254 nm) using 100 T-MAX black and

white negative film (Kodak).

2.9. T4 DNA ligase-mediated circularization assay

The circularization assay used was based on previous pro-

tocols (Štros, 1998, 2001; Štros et al., 2004). Briefly, the

P-

labeled 123-bp or 66-bp DNA fragments (∼ 1 nM) with

cohesive ends were pre-incubated on ice for 20 min with ap-

propriate amounts of recombinant proteins (typically 0.02–

5 μ M) in 1× T4 DNA ligase buffer (30 mM Tris–HCl, pH 7.8,

10 mM MgCl

, 10 mM dithiothreitol, and 0.5 mM ATP;

Promega) in a final volume of 20 μl. The DNA was then ligated

with T4 DNA ligase (0.05 unit/reaction ; Promega) at 30 °C for

20 min, and the ligation reactions were terminated by incubation

of samples at 65 °C for 20 min. Some of the ligation mixtures

were digested after termination of ligations with ∼ 20 units of

exonuclease III (Promega) at 37 °C for 30 min. Before elec-

trophoresis, all DNA samples were deproteinized as described

in the DNA supercoiling assay. The protein-free DNAs were

loaded on pre-run 6% (123-bp DNA) or 8% (66-bp DNA)

polyacrylamide slab gels in 0.5× TBE buffer, and finally

resolved at 250 V for 2–3 h at 4 °C. After electrophoresis, the

gels were vacuum-dried and visualized by autoradiography or

PhosphorImager STORM 860 (Molecular Dynamics) using

Image Quant 5.2 software.

2.10. Gel retardation with synthetic four-way junctions or

plasmid DNA

Synthetic DNA four-way junctions (4WJs) were constructed

as indicated earlier (Štros and Muselíková, 2000). Briefly, the

DNA bindi ng ex periments were carried out in the Mg

-free

DNA binding buffer (25 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Hepes-

KOH, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM spermidine, 1 mM DTT

and 3.5% Ficoll) with ∼ 1.5 nM

P-labeled 4WJs and

increasing amounts of GST–SmHMGB1 or GST alone (as in-

dicated in the legends to fig ures) in the absence or p resence o f

competitor linear DNA (of the length and sequences identical

to those of the 4WJs). The complexes were resolv ed on 5.8%

non-denaturing pol yacrylamide gels i n 0. 5× TBE at 10 V/cm

for 4–5 h and visualize d by PhosphorImaging (Štros and

Muselíková, 2000).

3. Results and discussion

3.1. Isolation of cDNAs and gen omic organization of

schistosome HMGB1 genes

We cloned two 531-bp open reading frames of S. mansoni

HMGB1 (SmHMGB1)andS. japo ni cum HMGB1 (SjHMGB1)

cDNAs. In both cases the lengths of t he HMGB1 sequences

consisted of 531-b p which are translated into pro te ins of

176 amino acids with estimated masses of about 18 kDa.

Like the vertebrate H MGB1 proteins, th e SmHMGB1 and

SjHMGB1 proteins contained two HMG-box domains, A and

B, and the acidic C-tail (Fig. 1A). Com pari so n of th e deduced

amino acid seq uenc e of SmHMGB1 with the S. mans oni tran-

scriptome database (Verjovski-Almeida et al., 2004) reveale d

thatacontighadbeenassembledwith76ESTsderivedfrom

all developmental stages (eggs, miracidia, cercariae, germ-

balls, schistosomula and male/female adults) and was an-

notated as coding for an unnamed protein (SmAE 607928.1). It

has 100% id ent ity and full-le n gth coverage of SmHMGB1.

Further ana ly ses revealed that two other isoforms of Sm-

HMGB1 are expressed in S. mansoni. T hus, we identified

contig SmAE 604202.1, assembled from 15 EST reads again

derived from all stages except cercaria, which codes for a

226 amino acids protein t hat has 56% identity and 74% sim-

ilarity with SmHMGB1 over 164 amino acids. Thus, we named

it SmHMGB2 (GenBank accession no. BN000821). Also,

contig SmAE 608982.1 was identified (derived from 12 EST

36 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

from all stages except cercaria and miracidium) which codes

for a 246 amino acids protein that has 48% identity and 68%

similarity with SmHMGB1 over 1 78 am in o acids . We named it

SmHMGB3 (GenBa nk accession no. B N00082 2). In addition,

this two other variant genes of t he HMGB-box family, Sm -

HMGB2 and SmHMGB3 have no significant similarity with

SmHMGB1 at the DNA level. In this paper, we analyzed in

details only the HMGB1 cDNAs and the corresponding pro-

teins from S. mansoni and S. japonicum.

Comparison of the deduced amino acid sequences of the

SmHMGB1 and SjHMGB1 proteins with HMGB1 proteins from

tick, trout, frog, chicken and human revealed ∼ 60% similarity to

Fig. 1. (A) Alignment of deduced amino acid sequences of HMGB1, HMGB2 and HMGB3 from Schistosoma mansoni (GenBank accession nos. DQ005529,

BN000821 and BN000822, respectively) and HMGB1 from Schistosoma japonicum (GenBank accession no. DQ005528) with HMGB1 proteins from Homo sapiens

(human), GenBank accession no. NP_002119; Gallus gallus (chicken), GenBank accession no. CAA76978; Xenopus tropicalis (frog), GenBank accession no.

AAH61601; Salmo specie (trout), GenBank accession no. S48708; and Dermacentor variabilis (tick), GenBank accession no. AA092280. Please notice that primary

amino acid sequences of human and rat HMGB1 proteins are identical. Sequences in boxes represent, respectively, the HMGB1 A domain (1–84), B domain (93–161)

and the acidic C-terminus (170–176). Percentages of similarities among all aligned sequences are shaded as black (100%), dark grey (80%) and light grey (60%).

(B) Comparison of amino acid sequences of the acidic C-tails from S. mansoni and S. japonicum with those from different species: Danio rerio (zebrafish), GenBank

accession no. AAQ97791; Naegleria fowleri (amoeba), GenBank accession no. AAL13284. Other aligned sequences are indicated in panel A. The accurate

positioning and lengths of the acidic C-tails within each of the compared sequences are indicated by numbers. Asterisk depicts a number of acidic residues (shaded as

grey) within each of the aligned C-tails (notice that the indicated numbers do not necessarily correspond to the size of the full-length acidic C-tail).

37F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

the A + B di-domain (designated as HMGB1-ΔC) of human

HMGB1, mainly displaying conservative substitutions among

schistosome and human HMGB1 domains A and B (Fig. 1A).

On the other hand, the most striking differences between schis-

tosome and rat HMGB1 proteins occurred within their C-

terminal flanking regions of domains B and the acidic C-tails

(only ∼17% similarity). The most obvious difference between

the human HMGB1 and the SmHMGB1 and SjHMGB1 proteins

is the presence of an unusually short acidic C-terminal tail (5

acidic residues interrupted by 2 serines) within the schistosome

HMGB1 proteins, as compared to an unbroken run of 30 glu-

tamic or aspartic residues found in rat HMGB1 (Fig. 1). From

Fig. 1B, it is suggestive that the length of the acidic C-tail within

the HMGB1 de creases with the complexity of the organism. In

other words, the acquisition of the acidic C-tail in HMGB1

proteins seems to have been a relatively recent evolutionarily

event.

Consistently, RNA blot analysis revealed that the

SmHMGB1 gene is constitu tively expressed in similar levels

both in male and female worms Fig. 2C), and a single-sized

SmHMGB1 mRNA was consistent with the size derived from its

cDNA (Fig. 2A).

Digestion of genomic S. mansoni DNA with restriction

enzymes not cleaving within the SmHMG B1 cDNA (BamHI,

EcoRI or Eco RV) revealed one band in each lane when probed

with

P-labeled full-length SmHMGB1 cDNA at high strin-

gency. This result indicated the existence of only one copy of the

HMGB1 ge ne in the S. mansoni genome (Fig. 2D).

PCR amplification of genomic schistosome DNA with

primers annealing to 5′- and 3′-ends of the SmHMGB1 and

SjHMGB1 cDNAs (513-bp) revealed DNA duplexes of 603-bp

(SmHMGB1) and 602-bp (SjHMGB1), suggesting the existence

of intron(s) wi thin the SmHMGB1 and SjHMGB1 genes.

Sequencing of the 603/602-bp PCR products indicated that

both SmHMGB1 and SjHMGB1 genes are organized into 3

exons tw o introns (Fig. 3).

The splice donor and acceptor sites of all SmHMGB1 and

SjHMGB1 exons conformed to the established consensus GT at

5′-end of the intron and AG at the 3′-end (Table 1). The exon/

intron boundaries of the schistosome HMGB1 genes were

Fig. 2. (A) Northern blot analysis of SmHMGB1 mRNA. Total RNA from mature and immature male and female worms was probed with a random primed

P-labeled

SmHMGB1 (top panel) and SmGAPDH (bottom panel) cDNA probes. (B) Quantitative analysis by phosphorimaging. The intensity indicates divided relative volumes

of SmHMGB1 and SmGAPDH bands. (C) Amplification of the open reading frames using the HMGB1 cDNA or genomic DNA from S. mansoni and S. japonicum by

RT-PCR and PCR, respectively. Lane 1, λ DNA digested with PstI DNA; lanes 2–3, genomic sequences of SmHMGB1 and SjHMGB1; lanes 4–5, cDNA sequences of

SmHMGB1 SjHMGB1 (open reading frame). (D) Southern blot analysis. S. mansoni DNA was digested with restriction endonucleases not cutting (BamHI, EcoRI and

EcoRV) or having one cutting site within the SmHMGB1 cDNA (TaqI), transferred by capillary blotting to the Hybond-N+ membrane and hybridized with

P-labeled

full-length SmHMGB1 cDNA. The membrane was then washed at high stringency and subjected to PhosphorImaging. The arrow indicates one of the two bands

obtained upon digestion with TaqI.

38 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

identical to those of the human HMGB1 gene, with the exception

that the exon E2 of the SmHMGB1 (or SjHMGB1) gene is not

split into two exons (EII and EIII) as in the human HMGB1 gene

(Fig. 3).

3.2. Structure and purification of recombinant SmHMGB1 and

SjHMGB1 proteins

For the purpose of DNA binding studies, S. mansoni and S.

japonicum HMGB1 proteins and domains were expressed in E.

coli with His-tag (or in some cases also with GST-tag) at their

N-termini and purified by affinity chromatography. The purity

of the HMGB1 prote ins was checked by electrophoresis on a

SDS/15%-polyacrylamide gel (Fig. 4).

3.3. Preferential binding of SmHMGB1 to DNA four-way

junctions and supercoiled DNA

Reports of Bianchi et al. (1989, 1992) indicated that HMGB1

could bind strongly and selectively to cruciform structures and

synthetic four-way junctions (4WJs). A clear preference in

HMGB1 binding to 4WJs was observed for the open, planar

conformation of 4WJs with maximal separation of the strands

which occurs in the absence of divalent cations (Pöhler et al.,

1998). Here we confirmed that schistosome HMGB1 binds to

the 4WJs (Fig. 5A), resulting in up to three retarded bands (I–

III). Competition experiments with linear DNA derived from

the 4WJs arms indicated that SmHMGB1, like human HMGB1,

preferentially and specifically binds to the DNA cross-over of

the 4WJs (band I).

Although 4WJs are unlikely to represent the binding targets

of HMGB1 in the cell, structures similar to 4WJs such as DNA

cross-overs generated in plasmid DNA by supercoiling may be

one of the natural, albeit not yet identified, DNA binding sites

of this protein in the chromatin. In this context mammalian

HMGB1 proteins were previously shown to exhibit a pre-

ferential affinity to supercoiled DNA over nicked-circular or

linear double-stranded DNA (Sheflin and Spaulding, 1989;

Štros and Reich, 1998; Štros, 2001). In order to deter mine

whether schistosome HMGB1 proteins also bind preferentially

to supercoiled DNA, we have performed gel retardation assays

with complexes prepared by pre-incubation of SmHMGB1 with

a mixture of negatively supercoiled (∼ 45%), linearized

(∼ 45%) and relaxed closed-circular (∼ 10%) plasmid

pTZ19R. As shown in Fig. 5B, SmHMGB1 protein exhibited

a clear preference for bindi ng to supercoiled DNA over linear or

Table 1

Intron and exon boundaries, splice acceptor and splice donor sites in the gene encoding S. mansoni and S. japonicum HMGB1

Organism Exon Exon length (bp) Donor Intron Intron size (bp) Acceptor

Exon Intron Intron Exon

S. mansoni 1 147 TGGAGG gtatgttgt 1 37 atttctcag AATCTA

Trp Lys Asn Leu

S. mansoni 2 321 GAGAAA gtaggtttg 2 35 actttctag GCGATG

Glu Lys Ala Met

S. mansoni 360

S. japonicum 1 147 TGGAAG gtaagttat 1 31 atttttcag AATCTT

Trp Lys Asn Leu

S. japonicum 2 321 GAAAAA gtaagttcc 2 40 cttgtctag GCGATG

Glu Lys Ala Met

S. japonicum 360

Fig. 3. Genomic structure of S. mansoni HMGB1 gene as determined by PCR of genomic DNA from S. mansoni, and its comparison with published genomic

organization of human HMGB1 gene (Ferrari et al., 1996; GenBank accession no. U51677). A schematic of positions and relative sizes of the 3 exons (E1–E3) and 2

introns (arrowed) of the S. mansoni HMGB1 gene is indicated, and compared with positions and relative sizes of the 4 exons and 3 introns of the human HMGB1 gene

(the human exons EII and EIII correspond to the schistosome exon E2). Alignment of HMGB1-boxes and the acidic C-tail with exon/intron boundaries of the S.

mansoni and human HMGB1 genes is presented. Genomic structure and exon/intron boundaries of S. japonicum HMGB1 gene were identical (not shown).

39F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

relaxed closed-circular DNAs (similar results were obtained

with SjHMGB1, not shown).

3.4. DNA supercoiling by schistosome HMGB1 proteins

Vertebrate HMGB1 and its isolated HMG-box domains can

unwind and distort DNA by insertion of negative supercoils (in

the presence of topoisomerase I) in topologically closed domains

of DNA (Sheflin and Spaulding, 1989; Štros et al., 1994). Here we

have analyzed the ability of the full-length SmHMGB1 and its

truncated forms to induce DNA supercoiling, and compared the

results with those obtained under the same conditions with rat

HMGB1 which has the amino acid sequence identical to the

human HMGB1. The supercoiling results are presented mainly

with SmHMGB. However, indistinguishable results were also

obtained with the SjHMGB1 protein.

As DNA supercoiling of rat HM GB1 strongly depends on

ionic strength (Štros et al., 1994), all supercoiling experiments

were therefore carried out at low (50 mM) or high (150 mM)

ionic strengths (I.S). At ∼ 50 mM I.S., SmHMGB1 (Fig. 6A),

like human HMGB1 (Fig. 6C), can supercoil DNA in the

presence of topoisomerase I. While removal of the acidic C-tail

from human HMGB1 had at ∼ 50 mM I.S. no effect on the ability

of the truncated HMGB1 protein (designated as HMGB1-ΔCor

ΔC) to supercoil DNA (Fig. 6C), DNA supercoiling was

significantly decreased at higher amounts of SmHMGB1-ΔC

(Fig. 6A and C). Similarly, DNA supercoiling by SmHMGB1

domain B was significantly decreased at higher amounts of the

peptide but not by human HMGB1 domain B (Fig. 6A and C). In

contrast, HMGB1 domains A from both human and S. mansoni

could superc oil DNA to a similar extent at ∼ 50 mM I.S.

To determine the sign of DNA supercoiling by schistosome

HMGB1 proteins, the first dimension electrophoresis gels were

turned by 90° and further resolved in the second dimension in the

presence of the intercalative drug chloroquine. Chloroquine inter-

calation into DNA results in decreased mobility of negative super-

coils and increased mobility of positive supercoils. The results in

Fig. 7, show clearly that the sign of DNA supercoiling induced by

both SmHMGB1 and SjHMGB1 proteins was negative.

The impact of the acidic C-tail on the ability of HMGB1 to

supercoil DNA, as well as the differences between the full-length

proteins, was far more apparent when the DNA supercoiling by

schistosome HMGB1 and human HMGB1 were assessed at

∼150 mM I.S. (Fig. 6B and D). Whereas SmHMGB1 could fully

supercoil DNA, DNA supercoiling by the full-length human

HMGB1 was suppressed (Fig. 6D). On the other hand, the extent of

DNA supercoiling by both human and SmHMGB1 lacking the

Fig. 5. Preferential binding of schistosome HMGB1 protein to DNA four-way

junctions and supercoiled DNA. (A) Gel retardation experiments were carried

with ∼ 1.5 nM

P-labeled 4WJs and increasing amounts of GST-fused HMGB1

from S. japonicum (0.5, 1, 1.5 and 2 μM, left to right) in the absence or presence

of 5, 25 and 100-fold mass excess of competitor linear DNA (corresponding to

the size and sequences of the 4WJs arms) over 4WJs. The concentration of GST

was 1 μM. The DNA–protein complexes were resolved on 5.8% non-denaturing

polyacrylamid e gels and v isua lize d by autoradiography. The prop osed

compositions of each of the retarded bands are depicted on the right site of

the panel. (B) An equimolar mixture of supercoiled and linearized plasmid

pTZ19R (∼ 10 nM) was pre-incubated with increasing amounts of HMGB1

from S. mansoni (0.5–5 μM, from left to right) and the DNA–protein complexes

were resolved on an 1% agarose gel, followed by staining of the gel with

ethidium bromide. Form I, supercoiled DNA; L, linear DNA; form II, relaxed

open circular DNA.

Fig. 4. (A) Schematic structure of S. mansoni and S. japonicum HMGB1

proteins and the truncated HMGB1 proteins. (B) Purity of recombinant His-

tagged HMGB1 proteins and truncated HMGB1 proteins. The HMGB1 proteins

and peptides were expressed in E. coli, purified by affinity chromatography, and

resolved by electrophoresis on a SDS/15%-polyacrylamide gel. Proteins were

visualized by staining with Coomassie Blue R-250. Lanes 1 and 2: (wt), wild-

type HMGB; lanes 3 and 4: (ΔC), HMGB1 lacking the acidic C-tail; lanes 5 and

6: (A), domain A; lanes 7 and 8: (B), domain B. Sm and Sj stand for Schistosoma

mansoni and Schistosoma japonicum, respectively.

40 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

acidic C-tail (Fig. 6B and D) was very similar. Collectively these

results indicate that while the long acidic C-tail of human HMGB1

has a strong repressive role on the DNA supercoiling (possibly by

masking or destabilizing of the two DNA binding HMG-box

domains, as also reported earlier by Štros et al., 1994), the short C-

tail of SmHMGB1, on the other hand, exhibited very little, if any,

inhibitory effect on DNA supercoiling by this protein.

The acidic C-tails could clearly “ fine-tune” the DNA binding

properties of two HMG-box domains of different HMGB1

proteins as a function of their lengt h and perhaps also the in-

dividual sequences. It is not known whether in vivo the DNA

binding properties of HMGB1 are modulated by proteolytic

removal of the acidic C-tail, despite the frequently reported

cleavage of the acidic C-tail from HMGB1 in the course of the

Fig. 6. DNA supercoiling by schistosome and human HMGB1 proteins. Circular relaxed plasmid pTZ19R DNA (∼10 nM) was incubated in the presence of

topoisomerase I with HMGB1 (17 and 35 μM, left to right) and truncated forms at ∼ 50 or ∼ 150 mM ionic strength (I.S.). Deproteinized DNA topoisomers were

resolved on 1% agarose gels, followed by staining of the gels with ethidium bromide. Form I, supercoiled DNA; form II, relaxed circular DNA. FL, full-length

HMGB1; ΔC, HMGB1 lacking the acidic C-tail; A, domain A; B, domain B.

Fig. 7. Determination of sign of DNA supercoiling. Circular relaxed plasmid pTZ19R DNA (∼ 10 nM) was incubated in the presence of topoisomerase I with 35 μMof

human HMGB1, SmHMGB1 and SjHMGB1 at ∼ 50 mM I.S. After separation of the deproteinized DNA in the first dimension on a 1% agarose gel (1× TBE buffer),

the gel was soak in chloroquine, turned by 90°, and the DNA topoisomers resolved in the second dimension to determine the sign of DNA supercoiling. The presence

of chloroquine during electrophoresis in the second dimension will increase the mobility of positive DNA topoisomers, whereas the mobility of the negative DNA

topoisomers will be decreased as depicted in the right part of the panel. Upon completion of the electrophoresis in the second dimension, the gels were stained with

ethidium bromide.

41F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

protein isolation from tissues (Goodwin and Johns, 1977 )or

recombinant E. coli cultures (M.Š., unpublished). However,

interaction of the acidic C-tail of HMGB1 with a host of cellular

factors such as divalent cations (Štros et al., 1990) and other

nuclear proteins including histones H1 (Carballo et al., 1983;

Štros and Vorlíčková, 1990; Kohlstaedt and Cole, 1994; Hill et

al., 1999; Sheflin et al., 1993; Štros et al., 1994; Knapp et al.,

2004) may result in changes of the DNA binding properties of

HMGB1 similar to those observed in vitro upon removal of the

C-tail (Figs. 6 and 8).

Fig. 8. Comparison of DNA bending by schistosome and human HMGB1 proteins and truncated forms. The

P-labeled 66-bp (panels A and B) or 123-bp (panels C, D

and E) DNA fragments (∼ 1 nM) were pre-incubated with increasing amounts of recombinant proteins (as indicated), followed by ligation with T4 DNA ligase as

detailed in the Materials and methods. Exonuclease III was used to verify the identity of DNA minicircles. The deproteinized DNA ligation products were subjected to

electrophoresis on 5.8% non-denaturing polyacrylamide gels and visualized by autoradiography and/or PhosphorImaging. FL, full-length HMGB1; ΔC, HMGB1

lacking the acidic C-tail; A, isolated domain A; B, isolated domain B. L1, linear monomers; L2, linear dimers. Exo III, exonuclease III.

42 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

3.5. DNA bending by schistosome HMGB1

An intriguing property of proteins containing the HMG-box

domain, including HMGB1, is that these proteins not only bind

with high-affinity to non-B type DNA conformations (such as

supercoiled DNA, four-way DNA junction and DNA mini-

circles), but they also actively distort DNA by bending/looping

and unwinding but it can also actively distort DNA by bending

or looping and changing of DNA-topology (Travers, 2000;

Thomas and Travers, 2001; Grasser, 2003; Paull et al., 1993; Pil

et al., 1993; Štros et al., 1994; Teo et al., 1995; Štros, 1998;

Sheflin and Spaulding, 1989; Murphy et al., 1999).

HMGB1 from several species, including rat and human, has

previously been shown to bend DNA using the ligase-mediated

circularization assay (the DNA ring closure assay) (Paull et al.,

1993; Pil et al., 1993; Teo et al., 1995; Štros, 1998). This assay

measures the efficiency with which T4 DNA ligase forms circles

from DNA fragments shorter than the persistency length (∼150-

bp). In the absence of internal curvature, the stiffness of a short

DNA fragment prevents intramolecular alignments so that

minicircles are detected only by a protein that bends DNA.

Using the above assay it was previously shown that the efficien-

cy to form mini-circles is decreasing in the order: HMGB1-

ΔC≥ HMGB1N domain B ≫ domain A (Štros, 1998).

The T4 ligase-mediated cyclization assay was performed with

increasing amounts of schistosome or human HMGB1 and 66-bp

or 123-bp DNA fragments bearing sticky ends at low DNA

concentrations (∼ 1 nM) to promote intramolecular alignments at

the expense of intermolecular associations. The identity of DNA

minicircles was verified by their resistance to exonuclease III,

which digests only linear DNA molecules. Initial circularization

assays were carried out with a 66-bp DNA fragment. As shown in

Fig. 8A (FL), ligation of the 66-bp DNA by T4 DNA ligase in the

presence of SmHMGB1 (designated as FL) resulted in the

formation of DNA minicircles, the proportion of which 2–3-folds

were decreased when the cyclization experiments were carried out

with SmHMGB1 lacking the acidic C-tail, SmHMGB1-ΔC(Fig.

8A, ΔC). These results indicate that even the very short acidic C-

tail (5 acidic residues interrupted by 2 serines) could modulate the

ability of the DNA binding HMG-box domains of the

schistosome HMGB1 protein to promote DNA flexure of the

66-bp DNA duplex.

The formation of 66-bp minicircles obviously requires a

greater amount of DNA bending per bound HMGB1 than the

closure of larger DNA duplexes into minicircles (see also Yen e t

al., 1998). In agreement with this assumption, the importance of

the short acidic C-tail of SmHMGB1 was diminished when the

size of the DNA duplex to be circularized had been ∼ 2-fold

increased, as evidenced by formation of similar percentage of

minicircles from 123-bp DNA duplexes by both SmHMGB1 and

SmHMGB1-ΔC(Fig. 8C). This contrasted to earlier observations

(Štros, 1998; Grasser et al., 1998) demonstrating that removal of

the long acidic C-tail (an unbroken run of 30 glutamic or aspartic

residues) from rat (human) HMGB1 protein resulted in a

significant decrease of the amount of DNA circularized (87-bp

or 123-bp DNA duplexes) as a function of protein input. The latter

observation was a possible consequence of excessive binding of

the A + B di-domain (SmHMGB1-ΔC) to DNA resulting in more

compact, higher-order, structures (Štros et al., 1994, 2000)with

reduced flexibility which had prevented alignment of the two

DNA ends and/or reduced accessibility of the ligase.

While DNA bending (and partially also supercoiling)

properties of isolated domains B from human or schistosome

HMGB1 were very similar, significant differences were obtained

between the isolated A domains. As shown in Fig. 8B, the human

HMGB1 domain A could bend 66-bp DNA only at ∼ 10-fold

higher protein/DNA input relative to the domain B. The efficiency

of the human domain A to form minicircles was higher when a

longer DNA duplex was used for the circularization assay, 123-bp

(Fig. 8D). On the other hand, no DNA bending was observed with

schistosome HMGB1 domain A, irrespective of the length of

DNAduplexused(Fig. 8B and D). The inability of the schis-

tosome domain A to bend DNA (Fig. 8A–D) parallels to certain

extent with its inability to supercoil DNA (Fig. 6B) at ∼ 150 mM I.

S. similar to that used for DNA bending. The observed differences

in DNA bending properties between human and schistosome

HMGB1 domains A may be partially related to small changes

within their N-termini, in particularly due to two more basic

residues in human (and slightly longer sequence) and the presence

of phenylalanine at position 18 in human domain A relative to the

alanine in the schistosome domain A (Fig. 1A). However, the

most likely explanation is that while the recombinant human

HMGB1 domain A contained the C-terminal flanking sequence

TKKK

, the recombinant schistosome HMGB1 domain A used

for DNA binding studies did not possess the corresponding

natural C-terminal flanking sequence

RSKKR

.The

TKKK

sequence seems to be also a prerequisite for efficient DNA flexure

by this domain (M.Š., unpublished; see also Štros, 1998, 2001).

Similarly, lower DNA supercoiling by human HMGB1-ΔCat

∼ 150 mM I.S. (Fig. 6D) than that previously reported at similar

conditions (Štros et al., 1994) is also very likely related to the

absence of the C-terminal flanking sequence in the truncated

HMGB1 protein used in the present paper.

Direct comparisons of DNA bending properties of the human

and S. mansoni HMGB1 proteins revealed that the schistosome

HMGB1 was more efficient in circularization of the 123-bp

DNA than its human counterpart (Fig. 8E). These data might

suggest that the shorter acidic C-tail of the schistosome HMGB1

exhibited much weaker repressive effect on DNA bending than

the longer C-tail of the human HMGB1. However, definitive

conclusions are to be reached from the DNA circularization

experiments using schistosome A + B di-domain with attached

human or schistosome C-tails (the “switch-tail”) or vice versa.

Results presented in this report show for the first time that

parasitic helminths S. mansoni and S. japonicum contain HMGB1

proteins with primary amino acid sequences and DNA binding

properties related to the homologous vertebrate proteins. Our

study indicated higher DNA supercoiling and bending potentials

of these proteins as compared to their human counterpart.

Considering the high conservation of the HMGB-box domains

between human and schistosome HMGB1 proteins, the latter

differences are most likely to be explained by the presence of a

very short acidic C-tail in the schistosome HMGB1 proteins. This

is consistent with previous work of Lee and Thomas (2000) using

43F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

chimeric rat (human) HMGB1 and HMGB2 with switched acidic

C-tails. These authors have demonstrated that HMGB1 with the

longest acidic tail was less effective than HMGB2a and 2b with

shorter C-tails (at a given molar input ratio) in DNA supercoiling

and in inducing T4 ligase-mediated circularization of an 88-bp

DNA fragment. While removal of the acidic tails increased the

affinity of the HMG-boxes for DNA, it completely abolished the

differences between the three HMGB species (Lee and Thomas,

2000). Thus, the length and very likely also the sequence (Fig. 1B,

see also Payet and Travers, 1997; Ueda et al., 2004) of the acidic

tail appears to be the dominant factor in mediating the differences

in DNA binding properties among evolutionarily distinct

HMGB1 proteins to fulfill their different cellular roles. The

ability of HMGB1 protein to bend (and untwist) DNA, and to

physically interact with plethora of transcription factors and other

sequence-specific proteins, is the most plausible explanation of

functioning of HMGB1 in facilitation of DNA recombination and

transcription by promoting binding of these factors to their

cognate sites, and enabling communications of distant regulatory

elements by DNA looping (reviewed by Thomas and Travers,

2001; Agresti and Bianchi, 2003).

After this paper was submitted for publication, a report on

cloning and characterization of HMGB1 from S. mansoni and S.

haematobium was published (Gnanasekar et al., 2006). The

authors concluded that SmHMGB1 is a stage-specific protein,

being abundantly expressed in eggs and adult female stages, and

at moderate levels in skin-stage schistosomula. Whereas the main

focus of our paper is DNA binding properties of the SmHMGB1

protein, the paper of Gnanasekar et al. (2006) describes possible

pro-inflammatory functions of the parasite derived HMGB1

protein. SmHMGB1 was shown to be a potent inducer of a

number of pro-inflammatory cytokines such as TNFα,IL-1Rα,

IL-13 and MIP-1α from mouse peritoneal macrophages. Release

of pro-inflammatory cytokines by SmHMGB1 seemed to be

associated with the domain B of the protein, and anti-SmHMGB1

antibodies blocked the SmHMGB1-induced TNFα secretion from

mouse macrophages. As both TNFα and IL-13 represent critical

molecules in the development of egg-induced pathology of

schistosomias (e.g. Haseeb et al., 2001), it is likely that egg-

derived SmHMGB1 may have an important immunomodulatory

role in the development of egg-induced pathology and granuloma

responses in schistosomias.

The (nuclear and extracellula r) role of SmHMGB1 or

SjHMGB1 proteins (as well as other, not yet identified, proteins

of the HMGB-box family) remains to be established in the

complex cellular processes of the helminths S. mansoni and S.

japonicum. Knowledge about these processes would signifi-

cantly strengthen the ongoing efforts associated to functional

genomics with data derived from whole genome projects of S.

mansoni and S. japonicum which are near completion (El-Sayed

et al., 2004; Lukeš et al., 2005 ).

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Jennifer Fitzpatrick (University of

Cambridge) for preparing S. japonicum cDNA. The technical

assistance of Maria Marta Freire is also acknowledged. M.R.F. is a

recipient of CNPq fellowship. This research received financial

support from UNDP/World bank/World Health Organization/

TDR, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tec-

nológico, CNPq-PROFIX No. 540002/01-1 (CAPES — Coor-

denação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), by

the international collaboration program between Brazilian

Academy of Sciences and the Academy of Sciences of the

Czech Republic, and by grants to M.Š. from the Academy of

Sciences of the Czech Republic (AVOZ50040507: Biophysics of

dynamic structures of biological systems) and the Grant Agency

of the Czech Republic (204/05/2031). Finally, we would like to

thank an anonymous reviewer for his critical comments which

helped improve the quality of the final version of the manuscript.

References

Agresti, A., Bianchi, M.E., 2003. HMGB proteins and gene expression. Curr.

Opin. Genet. Dev. 13, 170–178.

Baxevanis, A.D., Landsman, D., 1995. The HMG-1box protein family:

classification and functional relationships. Nucleic Acids Res. 23, 1604–1613.

Bianchi, M.E., Beltrame, M., Paonessa, G., 1989. Specific recognition of

cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science 243, 1056–1059.

Bianchi, M.E., Falciola, F., Ferrari, S., Lilley, D.M., 1992. EMBO J. 11,

1055–1063.

Bonaldi, Q.T., Langst, G., Strohner, R., Becker, P.B., Bianchi, M.E., 2002. The

DNA chaperone HMGB1 facilitates ACF/CHRAC-dependent nucleosome

sliding. EMBO J. 21, 6865–6873.

Bustin, P.M., 1999. Regulation of DNA-dependent activities by the functional

motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins. Mol. Cell. Biol.

19, 5237–5246.

Carballo, M., Puigdomenech, P., Palau, J., 1983. DNA and histone H1 interact

with different domains of HMG 1 and 2 proteins. EMBO J. 2, 1759–1764.

DeMarco, R., Machado, A.A., Bisson-Filho, A.W., Verjovski-Almeida, S.,

2005. Identification of 18 new transcribed retrotransposons in Schistosoma

mansoni. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333, 230–240.

El-Sayed, N.M., Bartholomeu, D., Ivens, A., Johnston, D.A., LoVerde, P.T.,

2004. Advances in schistosome genomics. Trends Parasitol. 20, 154–157.

Fantappié, M.R., Rumjanek, F.D., 1994. Characterization of a HMG2-like

protein from Schistosoma mansoni. Parasitology 108, 43–50.

Fantappié, M.R., Correo-Oliviera, R., Caride, E.C., Geraldo, E.A., Agnew, A.,

Rumjanek, F.D., 1999. Comparison between site-specific DNA binding

proteins of male and female Schistosoma mansoni. Comp. Biochem.

Physiol. Biochem. Mol. Biol. 124, 33–40.

Ferrari, S., Finelli, P., Rocchi, M., Bianchi, M.E., 1996. The active gene that

encodes human high mobility group 1 protein (HMG1) contains introns and

maps to chromosome 13. Genomics 35, 367–371.

Gnanasekar, M., Velusamy, R., He, Y.-X., Ramaswamy, K., 2006. Cloning and

characterization of a high mobility group box 1 (HMGB1) homologue

protein from Schistosoma mansoni. Mol. Biochem. Parasitol. 145, 137–146.

Goodwin, G.H., Johns, E.W., 1977. The isolation and purification of the high

mobility group (HMG) nonhistone chromosomal proteins. Methods Cell

Biol. 16, 257–267.

Grasser, K.D., 2003. Chromatin-associated HMGA and HMGB proteins:

versatile co-regulators of DNA-dependent processes. Plant Mol. Biol. 53,

281–295.

Grasser, K.D., et al., 1998. DNA-binding properties of the tandem HMG boxes of

high-mobility-group protein 1 (HMG1). Eur. J. Biochem. 253, 787–795.

Haseeb, M.A., Shirazian, D.J., Preis, J., 2001. Elevated serum levels of TNF-alpha,

sTNF-RI and sTNF-RII in murine schistosomias correlate with schistosome

oviposition and circumoval granuloma formation. Cytokine 15, 266–269.

Hill, D.A., Pedulla, M.L., Reeves, R., 1999. Directional binding of HMG-I(Y)

on four-way junction DNA and the molecular basis for competitive binding

with HMG-1 and histone H1. Nucleic Acids Res. 27, 2135–2144.

Knapp, S., Muller, S., Digilio, G., Bonaldi, T., Bianchi, M.E., Musco, G., 2004.

The long acidic tail of high mobility group box 1 (HMGB1) protein forms an

44 F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

extended and flexible structure that interacts with specific residues within

and between the HMG boxes. Biochemistry 43, 11992–11997.

Kohlstaedt, L.A., Cole, R.D., 1994. Specific interaction between H1 histone and

high mobility protein HMG1. Biochemistry 33, 570–775.

Lee, K.B., Thomas, J.O., 2000. The effect of the acidic tail on the DNA-binding

properties of the HMG1,2 class of proteins: insights from tail switching and

tail removal. J. Mol. Biol. 30, 135–149.

Lotze, M.T., Tracey, K.J., 2005. High-mobility group box 1 protein (HMGB1):

nuclear weapon in the immune arsenal. Nat. Rev., Immunol. 5, 331–342.

Lukeš, J., Horák, A., Scholz, T., 2005. Helminth genome projects: all or nothing.

Trends Parasitol. 21, 265–266.

McManus, D.P., Bartley, P.B., 2004. A vaccine against Asian schistosomiasis.

Parasitol. Int. 53, 163–173.

McManus, D.P., Le, T.H., Blair, D., 2004. Genomics of parasitic flatworms. Int.

J. Parasitol. 34, 153–158.

Murphy IV, F.V., Sweet, R.M., Churchill, M.E., 1999. The structure of a

chromosomal high mobility group protein–DNA complex reveals sequence-

neutral mechanisms important for non-sequence-specific DNA recognition.

EMBO J. 18, 6610–6618.

Paull, T.T., Haykinson, M.J., Johnson, R.C., 1993. The nonspecific DNA

binding and — bending proteins HMG1 and HMG2 promote the assembly

of complex nucleoprotein structures. Genes Dev. 7, 1521–1534.

Payet, D., Travers, A., 1997. The acidic tail of the high mobility group protein

HMG-D modulates the structural selectivity of DNA binding. J. Mol. Biol.

266, 66–75.

Pil, P.M., Chow, C.S., Lippard, S.J., 1993. High-mobility-group 1 protein

mediates DNA bending as determined by ring closures. Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 90, 9465–9469.

Pöhler, J.R., Norman, D.G., Bramham, J., Bianchi, M.E., Lilley, D.M., 1998.

HMG box proteins bind to four-way DNA junctions in their open

conformation. EMBO J. 17, 817–826.

Rabelo, E.M., Campos, E.G., Fantappié, M.R., Rumjanek, F.D., 1992.

Extraction and partial characterization of non-histone nuclear proteins of

Schistosoma mansoni. J. Cell. Biochem. 49, 172–180.

Sheflin, L.G., Spaulding, S.W., 1989. High mobility group protei n 1

preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochem-

istry 28, 5658–5664.

Sheflin, L.G., Fucile, N.W., Spaulding, S.W., 1993. The specific interactions of

HMG 1 and 2 with negatively supercoiled DNA are modulated by their

acidic C-terminal domains and involve cysteine residues in their HMG 1/2

boxes. Biochemistry 32, 3238–3248.

Štros, M., 1998. DNA bending by the chromosomal protein HMG1 and its high

mobility group box domains. Effect of flanking sequences. J. Biol. Chem.

273, 10355–10361.

Štros, M., 2001. Two mutations of basic residues within the N-terminus of

HMG1-B domain with different effects on DNA supercoiling and binding to

bent DNA. Biochemistry 40, 4769–4779.

Štros, M., Muselíková, E., 2000. A role of basic residues and the putative

intercalating phenylalanine of the HMG-1 box B in DNA supercoiling and

binding to four-way DNA junctions. J. Biol. Chem. 275, 35699–35707.

Štros, M., Reich, J., 1998. Formation of large nucleoprotein complexes upon

binding of the high-mobility-group (HMG) box B-domain of HMG1 protein

to supercoiled DNA. Eur. J. Biochem. 251, 427–434.

Štros, M., Vorlíčková, M., 1990. Non-histone chromosomal protein HMG1

reduces the histone H5-induced changes in c.d. spectra of DNA: the acidic

C-terminus of HMG1 is necessary for binding to H5. Int. J. Biol. Macromol.

12, 282–288.

Štros, M., Bernuès, J., Querol, E., 1990. Calcium modulates the binding of high-

mobility-group protein 1 to DNA. Biochem. Int. 21, 891–899.

Štros, M., Štokrová, J., Thomas, J.O., 1994. DNA looping by the HMG-box

domains of HMG1 and modulation of DNA binding by the acidic C-terminal

domain. Nucleic Acids Res. 22, 1044–1051.

Štros, M., Cherny, D., Jovin, T.M., 2000. HMG1 protein stimulates DNA end

joining by promoting association of DNA molecules via their ends. Eur. J.

Biochem. 267, 4088–4097.

Štros, M., Muselíková-Polanská, E., Pospíšilová, Š., Strauss, F., 2004. High-

affinity binding of tumor-suppr essor protein p53 and HMGB1 to

hemicatenated DNA loops. Biochemistry 43, 7215–7225.

Taguchi, A., et al., 2000. Blockade of RAGE-amphoterin signalling suppresses

tumour growth and metastases. Nature 405, 354–360.

Teo, S.H., Grasser, K.D., Thomas, J.O., 1995. Differences in the DNA-binding

properties of the HMG-box domains of HMG1 and the sex-determining

factor SRY. Eur. J. Biochem. 230, 943–950.

Thomas, J.O., Travers, A.A., 2001. HMG1 and 2, and related ‘architectural’

DNA-binding proteins. Trends Biochem. Sci. 26, 167–174.

Travers, A., 2000. Recognition of distorted DNA structures by HMG domains.

Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 102–109.

Travers, R.A.A., 2003. Priming the nucleosome: a role for HMGB proteins?

EMBO Rep. 4, 131–136.

Ueda, T., Chou, H., Kawase, T., Shirakawa, H., Yoshida, M., 2004. Acidic C-tail

of HMGB1 is required for its target binding to nucleosome linker DNA and

transcription stimulation. Biochemistry 43, 9901–9908.

Verjovski-Almeida, S., et al., 2003. Transcriptome analysis of the acoelomate

human parasite Schistosoma mansoni. Nat. Genet. 35 (2), 148–157.

Verjovski-Almeida, S., Leite, L.C., Dias-Neto, E., Menck, C.F., Wilson, R.A.,

2004. Schistosome transcriptome: insights and perspectives for functional

genomics. Trends Parasitol. 20, 304–308.

Wang, H., et al., 1999. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice.

Science 285, 248–251.

Yen, Y.M., Wong, B., Johnson, R.C., 1998. Determinants of DNA binding and

bending by the Saccharomyces cerevisiae high mobility group protein

NHP6A that are important for its biological activities. Role of the unique N

terminus and putative intercalating methionine. J. Biol. Chem. 273,

4424–4435.

45F.M.B. de Oliveira et al. / Gene 377 (2006) 33–45

137

Nome: Francisco Meirelles Bastos e Oliveira

Nascimento: 28/09/1976

Naturalidade: Rio de Janeiro

Formação Acadêmica

- Faculdade de Ciências Biológicas – Modalidade Licenciatura pela Universidade Federal do Rio de Janeiro, 1999

– 2003.

- Mestrado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica – Universidade Federal do Rio de Janeiro,

2003 – 2004.

- Doutorado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica – Universidade Federal do Rio de Janeiro,

2004 – 2007.

Orientação de Estudante

1. Isabel Caetano de Abreu – iniciação científica, 2001 – 2006 (atualmente aluna de pós-graduação do

Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro).

Orientação de Monografia

1. “Caracterização da fosforilação da proteína do tipo High Mobility Group Box 1 de Schistosoma mansoni

(SmHMGB1)” - Isabel Caetano de Abreu, monografia apresentada na conclusão do curso de Graduação

em Ciências Biológicas – Universidade Federal Fluminense

Comunicação em Congresso

- 15 comunicações em congressos nacionais

- 03 comunicaçõs em congressos internacionais

Publicações

CARLO, Joelle ; OSMAN, Ahmed ; NILES, Edward ; WU, Wenjie ; FANTAPPIÉ, Marcelo Rosado ;

OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos de; LOVERDE, Philip Thomas . Identification and characterization of

an R-Smad ortholog (SmSmad1B) from Schistosoma mansoni. The FEBS Journal, v. 274, p. 4075-4093, 2007.

OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos de; SILVA, Isabel Caetano de Abreu da; RUMJANEK, FranklinDavid;

DIAS NETO, Emmanuel; GUIMARÃES, Pedro Edson Moreira; ALMEIDA, Sergio Verjovski;STROS, Michal;

FANTAPPIÉ, Marcelo Rosado. Cloning the genes and DNA binding properties of High Mobility Group B1

(HMGB1) proteins from the human blood flukes Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum. Gene, USA,

v. 377, p. 33-45, 2006.

MANSURE, José João; FURTADO, Daniel Rodrigues; OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos de;

RUMJANEK, Franklin David; FRANCO, Glória; FANTAPPIÉ, Marcelo Rosado. Cloning of a protein

arginine methyltransferase PRMT1 homologue from Schistosoma mansoni: Evidence for roles in nuclear receptor

signaling and RNA metabolism. Biochemical and Biophysical Research Communications, USA, v. 335, n. 4, p.

1163-1172, 2005.

MESQUITA, Rafael Dias; OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos de; SHUGAR, David; FANTAPPIÉ,

Marcelo Rosado; SILVA-NETO, Mario Alberto Cardoso da. Nitrophorin synthesis is modulated by casein kinase

II. Biochemical and Biophysical Research Communications, USA, v. 335, n. 3, p. 690-699, 2005.

OLIVEIRA, Francisco Meirelles Bastos de; SILVA, Isabel Caetano de Abreu da; RUMJANEK, Franklin David;

VALADÃO, Analina; FRANCO, Glória; MESQUITA, Rafael Dias; SILVA-NETO, Mario Alberto Cardoso da;

FANTAPPIÉ, Marcelo Rosado. Functional properties of Schistosoma mansoni single-stranded DNA binding

protein SmPUR-alpha. Description of the interaction between SmPUR-alpha and SMYB1. Molecular and

Biochemical Parasitology, USA, v. 135, n. 1, p. 21-30, 2004.

TEMPONE, Antônio Jorge; FURTADO, Daniel Rodrigues; GIMBA, Etel Rodrigues Pereira;

OLIVEIRA,Francisco Meirelles Bastos de; RUMJANEK, Franklin David. Dolichol phosphate mannose

synthase is differentially expressed in male and female worms of Schistosoma mansoni. Comparative

Biochemistry and Physiology, USA, v. 131, n. 3, p. 465-474, 2002.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 